Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль липопротеинов в нейтрализации патогенных эффектов эндотоксина при гранулематозном воспалении

На правах рукописи

ДАЛАЕВА Хандажаб Цыреновна

РОЛЬ ЛИПОПРОТЕИНОВ В НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ПАТОГЕННЫХ

ЭФФЕКТОВ ЭНДОТОКСИНА ПРИ ГРАНУЛЕМАТОЗНОМ ВОСПАЛЕНИИ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научный Центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Цырендоржиев Дондок Дамдинович

доктор биологических наук Усынин Иван Федорович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Трунов Александр Николаевич Шарапов Виктор Иванович

Ведущая организация:

IV Научно-исследовательский институт фармакологии Томского Научного Центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г Томск)"

Зашита состоится <х>13>> ииИ4/И& 2005 а заседании дис-

сертационного совета Д 001.048.01 в ГУ Научный Центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117 Тел./факс 8-(3832)-33-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан

<е& »

2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Н.А. Пальчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В проблеме хронического воспаления, несмотря на значительные достижения современной медицины, по-прежнему остаются актуальными задачи изучения патогенеза хронизации, персистенции и обострения воспалительных процессов. Наименее изученным из них являются вопросы о механизмах обострения воспалительного процесса (Ма-янский Д.Н., Урсов И.Г., 1997). Результаты многих клинических и научных исследований показали, что в качестве пусковых факторов обострения воспалительного процесса чаще всего выступает липополисахарид грамнега-тивных бактерий, более известный как эндотоксин, а также липотейхоевая кислота грампозитивных бактерий (Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д., 1990; Цырендоржиев Д.Д., 1997; Macdonald J. et al., 2003; Hotchkiss R.S., Karl I.E., 2003; Van Amersfoort E.S. et al., 2003).

По данным Д.Н. Маянского и Д.Д. Цырендоржиева (1990) развитие гра-нулематозного воспаления проходит через фазу гиперергии, когда резко возрастает чувствительность организма к эндотоксину и его дериватам. Это явление авторами было обозначено как феномен «фагоцитарной гиперчувствительности». Подобные результаты были получены при введении липо-полисахарида мышам с C.parvum-индуцированным гранулематозным воспалением (Jaeschke H. et al., 1992). Детальное исследование фагоцитарной гиперчувствительности показало, что в его основе лежит феномен прими-рования фагоцитов очага воспаления (Цырендоржиев Д. Д., 1997).

В настоящее время принято, что патогенный эффект эндотоксина вызван не его прямым действием, а опосредованно, через секреторные продукты многих мишенных клеток, в частности, макрофагов, например, цито-кинов, лейкотриенов, активных метаболитов кислорода и многих других медиаторов (Hotchkiss R.S., Karl I.E., 2003).

Ведущую роль, как в обезвреживании эндотоксина, так и в опосредовании их патогенных эффектов играют резидентные макрофаги печени -клетки Купфера. Известно также, что на биологический эффект липополи-сахарида существенное влияние оказывают компоненты сыворотки крови. Так, в плазме крови липополисахарид может образовывать комплекс с ЛПС-связывающим белком (Klein R.D. et al., 2000). Связывание этого комплекса с растворимым рецептором CD14 приводит к усилению секреторной функции мишенных клеток, в том числе эффекторов воспаления (Tobias et al., 1992; Ahmed A.F. et al., 2001; Su G.L., 2002). Взаимодействие липопо-лисахарида с еще одним компонентом плазмы, с BPI-белком (от англ. Bactericidal / Permeability Increasing белок) предотвращает повышение секреторной активности клеток (Ooi СЕ. et al., 1991; Marra et al., 1992; Schultz H. et al., 2001; Scott A. et al., 2004).

Еще в 60-х годах Скарнес (Skames R.C., 1966, 1968) впервые высказал предположение о том, что эндотоксин может взаимодействовать с липопро-теинами сыворотки крови. В настоящее время накоплен огромный массив данных, свидетельствующих о взаимосвязи между различными классами липопротеинов и липополисахаридом. Однако, эти результаты по многим аспектам противоречат друг другу (Усынин И.Ф. и соавт., 1999; Братусь В.В. и соавт., 2002; Шварц Я.Ш.., Душкин М.И., 2002; Würfel M.M. et al., 1994; Eggesbo J.B. et al., 1996; Park СТ., Wright S.D., 1996; Rose J.R. et al., 2000).

В связи с этим, поиск эффективных способов нейтрализации патогенных эффектов эндотоксина и путей его выведения из циркулирующей крови при различных патологических состояниях является одной из актуальных задач современной медико-биологической науки.

Цель исследования: изучить течение зимозан-индуцированного грану-лематозного воспаления в печени экспериментальных животных при введении липополисахарида E.coli 0127:В8 на пике его развития и выяснить роль различных классов липопротеинов в нейтрализации патогенных эффектов эндотоксина.

Задачи исследования:

1. Оценить морфологические изменения в печени, определить уровень маркерных ферментов деструкции (АлАТ, ЛДГ4,5) и лизосомальных ферментов (кислой фосфатазы и катепсина Д) в сыворотке крови животных при введении субтоксической дозы липополисахарида E.coli 0127:В8 на пике зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления печени.

2. Определить содержание холестерина, триглицеридов и оценить спектр различных классов липопротеинов в сыворотке крови на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления в печени.

3. Оценить изменение клеточного состава и окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток, уровней маркерных ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-lß при введении липополисахарида E.coli 0127:B8 в комплексе с различными классами липопротеинов и аполипопротеином A-I на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления in vivo.

4. В экспериментах in vitro оценить влияние комплексов ЛПС E.coli 0127:В8 с различными классами липопротеинов на продукцию активных метаболитов кислорода клетками Купфера, изолированных из печени ин-тактных и зимозан-индуцированных крыс и уточнить роль аполипопротеи-на A-I в нейтрализации патогенных эффектов эндотоксина.

Научная новизна. На основании результатов исследования при введении субтоксической дозы липополисахарида E.coli 0127:В8 на пике развития зимозан-индуцированого гранулематозного воспаления установлена

однотипная реакция у мышей и крыс, которая сопровождается гибелью животных в течение 12-24 часов.

Выявлено, что гибель животных сопровождается ростом активности маркерных ферментов деструкции АлАТ, печеночного изофермента ЛДГ4,5, уровня лизосомальных ферментов (кислой фосфатазы и катепсина D), повышением содержания провоспалительных цитокинов

усилением окислительно-метаболической функции нейтрофилов крови, макрофагов печени и легких с нарушением печеночной гемодинамики и деструкцией печени в зоне гранулем.

На пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления в печени впервые установлено: повышение триглицеридов и изменение спектра различных классов липопротеинов в сыворотке крови в сторону повышения липопротеинов низкой плотности и снижения липопротеинов высокой плотности.

Впервые показано, что 3-я фракция липопротеинов высокой плотности и его белковый компонент аполипопротеин A-I нейтрализуют патогенный эффект липополисахарида E.coli 0127:В8 со снижением уровня маркерных ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и активности окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток крови и легких.

В экспериментах in vitro впервые показано, что субтоксическая доза липополисахарида E.coli 0127:В8 приводит к гиперпродукции активных метаболитов кислорода клетками Купфера, изолированных из печени животных с зимозан-индуцированными гранулемами.

Впервые показано, что 3-я фракция липопротеинов высокой плотности ингибирует ЛПС-индуцированную продукцию активных метаболитов кислорода клетками Купфера in vitro. Установлено, что в механизмах связывания и нейтрализации патогенного эффекта липополисахарида прямое участие принимает аполипопротеин A-I - основной белковый компонент 3-й фракции липопротеинов высокой плотности.

Научно-практическая значимость работы. На основании результатов исследования дано теоретическое обоснование механизмов нейтрализации патогенного эффекта липополисахарида E.coli 0127:В8 3-й фракцией липо-протеинов высокой плотности при введении на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления.

Выделен основной механизм связывания и нейтрализации патогенных эффектов липополисахарида E.coli 0127:B8 белковым компонентом 3-й фракции липопротеинов высокой плотности аполипопротеином A-I.

Показано, что снижение уровня липопротеинов высокой плотности на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления определяет низкий эндотоксин-нейтрализующий потенциал сыворотки крови.

Результаты исследования используются в лекционном курсе кафедры патологической физиологии Новосибирской государственной медицинской

академии СР и МЗ РФ по темам: «Воспаление» и «Патофизиология шока и экстремальных состояний».

Положения, выносимые на защиту.

1. Введение субтоксической дозы липополисахарида E.coli 0127:В8 приводит к гибели экспериментальных животных с явлениями деструкции вокруг очагов воспаления в печени, что характеризуется повышением маркерных ферментов деструкции (АлАТ и ДДГ4,5), лизосомальных ферментов (кислой фосфатазы и катепсина D), активацией окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток крови, легких и печени.

2. Повышение уровня триглицеридов, р -липопротеинов и изменение спектра липопротеинов различной плотности с ростом содержания липо-протеинов низкой плотности и снижением липопротеинов высокой плотности на пике развития гранулематозного воспаления определяет низкий эн-дотоксин-нейтрализующий потенциал сыворотки крови.

3. Липопротеины высокой плотности 3-й фракции обладают нейтрализующим эффектом на липополисахарид-индуцированную продукцию активных метаболитов кислорода фагоцитирующими клетками крови, легких и печени, способствуют снижению уровня маркерных ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и провоспалительных цитокинов. Ключевым фактором в механизмах связывания и нейтрализации патогенного эффекта липополисахарида является белковый компонент 3-й фракции липопротеинов высокой плотности - аполипопротеин A-I.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», посвященной 50-летию Читинской государственной медицинской академии (Чита, 2003); на конкурсе-конференции студентов и молодых ученых «Ави-ценна-2004» (Новосибирск, 2004); на научно-практической конференции с международным участием «Медицина и образование XXI века» (Новосибирск, 2004); на научно-практической конференции по медицинской микологии (VII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2004); на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004); на П-й Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов, главы, содержащей результаты собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста, содержат 16 таблиц, 15 рисунков. Список лите-

ратуры включает 254 источника, из них 64 отечественных и 190 иностранных.

Работа выполнена в рамках темы НИР: «Изучить клеточно-молекулярные механизмы гранулематозного воспаления, роль бактериальных компонентов в обострении и хронизации процесса», выполняемой в лаборатории патофизиологии ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (№ гос. регистрации 01.200.2 00795, шифр 052).

Автор благодарит своих научных руководителей д.м.н., профессора Д.Д. Цырендоржиева и д.б.н И.Ф. Усынина, а также сотрудников лаборатории патофизиологии ГУ НЦКЭМ СО РАМН за содействие и помощь при проведении данной работы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 198 мышах-самцах CBAxC57Bl/Fl массой 20-25 г и 54 крысах-самцах Вистар массой 200-220 г, полученных из питомника НПО «Вектор» (г. Новосибирск).

Для моделирования гранулематозного воспаления (ГВ) использовали зимозановые гранулы (ЗГ), которые представляют собой нерастворимую часть оболочек дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae, состоящих, главным образом, из сложных полисахаридов - маннанов и глюканов (Олайнский завод «Биохимреактив») (Закенфельд Г.К., 1990). ЗГ вводили внутривенно, в дозе 100 мг/кг массы тела (Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д., 1990).

Липополисахарид (ЛПС) E.coli 0127:В4 («Sigma», США) вводили внутривенно в дозе 100 мкг/кг через 5 сут после индукции ЗГ-гранулем в печени (Цырендоржиев Д.Д., 1997). Контрольные животные получали равный объем 0,85% NaCl.

Для оценки влияния разных классов липопротеинов на биологические эффекты ЛПС E.coli 0127:В4 использовали следующие подходы в системе in vivo и in vitro:

1. Производили измерение продукции активных метаболитов кислорода (АМК) клетками Купфера различных групп животных при добавлении комплексов 5 мкг/мл ЛПС E.coli 0127:B8 преинкубированных с сывороткой крови, ЛПОНП (1 мг белка/мл), ЛПНП (1 мг белка/мл), ЛПВП2 (0,5 мг белка/мл) и ЛПВПЗ (0,5 мг белка/мл), а также с АпоА-I (1 мг белка/мл). Измерения проводили с помощью биохемилюминометра «СКИФ-0301» (СКТБ «Наука», Красноярск).

2. Комплексы ЛПС E.coli 0127:B8 (100 мкг/кг) после предварительной инкубации с теми же концентрациями липопротеинов и АпоА-I вводили животным на пике (5 сут) ЗГ-индуцированного ГВ in vivo. Затем оценивали

изменение клеточного состава и деструктивный потенциал фагоцитирующих клеток с помощью биохемилюминометра.

В качестве материала исследования были использованы сыворотка крови, нейтрофилы крови, клетки Купфера, изолированные из печени нормальных крыс и животных с ЗГ-гранулемами, макрофаги легких и перито-неальной полости.

Бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) проводили по методу Myrvik Q.N. et al. (1961) в модификации Д.Д. Цырендоржиева (1997).

Изолированные клетки печени получали ферментативным способом по методу Seglen P. (1976) в модификации И.Ф. Усынина (1980).

Липопротеины различных классов выделяли из сыворотки крови крыс методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr (Hatch F., Lees R., 1968). АпоА-I выделяли из липопротеинов высокой плотности методом гель-фильтрации на сефарозе 4В («Pharmacia», Швеция) по методу, описанному Л.Е. Паниным и соавт. (1992). Содержание белка во фракциях липопротеинов и АпоА-I определяли методом Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951).

Дифференциальный подсчет клеточных элементов крови, БАЛ жидкости и перитонеальной полости проводили на цитоцентрифужных препаратах. Общее количество лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева.

Исследование скорости выведения из крови частиц коллоидного угля проводили по методу, предложенному Biozzy G. et. al. (1953) и Benaceraff В. et. al. (1957).

На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, а также на полутонких срезах печени и легких, приготовленных по методу Виссе в модификации ВААлексеева и ВАПрохорова (1973) и окрашенных толуидиновым синим по Линну (Гайер Г., 1974), подсчитывали численность фагоцитарно-активных КК и интерстициальных макрофагов легких.

В сыворотке крови экспериментальных животных определяли общую активность кислой фосфатазы (КФ 23.1.3.2) и катепсина D (КД 3.4.23.5) (Покровский А.А., Тутельян ВА, 1976; Barrett A., 1972). Активность ала-нинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови определяли по стандартному методу Рейтмана и Френкеля (Лабораторные..., 1987). Активность печеночного изофермента ЛДГ4,5 в сыворотке крови определяли с помощью стандартного диагностического набора фирмы «Boehringer Mannheim» (ФРГ)- Содержание общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови определяли ферментативным методом с помощью стандартных наборов «Biocon» (ФРГ). Содержание -липопротеинов (суммарная фракция ЛПОНП и ЛПНП) в сыворотке крови определяли по методу Бурштейна.

Спектр липопротеинов плазмы крови оценивали методом диск-электрофореза в трехслойном полиакриламидном геле (Маграчева Е.Я., 1973) с последующей их оценкой (Поляков Л.М., Панин Л.Е., 1975).

Оценку окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток проводили с помощью хемилюминесцентного (ХЛ) метода исследования (Зенков Н.К. и соавт., 1993; Цырендоржиев Д.Д., 1993; Tono-oka T. et al., 1983).

Определение провоспалительных цитокинов ИЛ-ф (кат. № EIA1604) и ФНО-а (кат. № EIA1568) в сыворотке крови выполнялось иммунофермент-ным методом с использованием реагентов фирмы «DRG Int.» (ФРГ). Все измерения проводили с помощью автоматического вертикального фотометра «Multiscan MCC 340» при длине волны 450 нм. Количественное содержание ИЛ-ip И ФНО-а в сыворотке крови выражали в пкг/мл.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью лицензированных пакетов прикладных программ «Statistica 5.0» и «Microsoft Exel 7.0». При этом определяли среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего значения (m). Проводили оценку значимости различий двух средних арифметических значений по t-критерию Стъюден-та. Различия сравниваемых показателей считались достоверными при р<0,05. Корреляционный анализ проводили с вычислением коэффициента ранговых корреляции Спирмана (Реброва О.Ю., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При введении субтоксической дозы ЛПС E.coli 0127:В8 на пике развития ЗГ-индуцированного ГВ (5 сут.) в печени мышей и крыс Вистар соответственно 57% и 51% животных погибали в течение 12-24 часов, т.е. процент летальности у них практически совпадает. В связи с этим, в зависимости от поставленных задач, отдельные эксперименты были проведены либо на мышах или на крысах.

При определении активности маркерных ферментов деструкции и лизо-сомальных ферментов отмечено, что гибель животных сопровождается ростом активности АлАТ, ЛДГ4,5, катепсина D и кислой фосфатазы (КФ). Так, через 3 и 24 ч после введения ЛПС на пике ЗГ-индуцированного ГВ активность АлАТ в сыворотке мышей была соответственно в 5 и 14 раз, а активность печеночного изофермента ЛДГ4,5 в 1,7 и 3,5 раза выше, чем в норме. При этом абсолютные значения активности АлАТ и ЛДГ4,5 на максимуме соответственно составили 13,9±1,04х102 U/1 и 5,4±l,lxl03 U/1.

Одновременно с этим, при введении субтоксической дозы ЛПС, в сыворотке крови мышей с ЗГ-индуцированным ГВ повышалась активность катепсина D и КФ. Если в норме активность катепсина D практически не вы-

являлась, то через 3 ч после введения ЛПС она достигала до 0,12±0,07, а через 24 ч - до 0,44+0,03 мкмоль мин-1 мл сыворотки-1 (р<0,001). По сравнению с ЗГ-животными активность катепсина Б при введении ЛПС возрастает в 8,8 раза. Активность КФ, на соответствующих сроках исследования составила 35,4+3,56 и 64,3+7,3 при значениях в контроле 17,8+3,5 ммоль фосфора мин-1 г белка-1 (р<0,05).

В целом, рост активности вышеперечисленных ферментов свидетельствуют об усилении деструктивного процесса в печени, что было наглядно видно на их полутонких срезах. В печени мышей с ЗГ-индуцированным ГВ через 3 ч после введения субтоксической дозы ЛПС выявлялись острые нарушения гемодинамики с очаговым полнокровием синусоидов, диффузные и очаговые дистрофические изменения гепатоцитов и очаги некроза паренхимы. Дистрофически измененные и некротизирующиеся гепатоциты располагались преимущественно вокруг места локализации гранулем. Эти изменения были более выраженными через 24 ч после введения ЛПС. Очаги некроза становились обширными и располагались хаотично, чем в предыдущем сроке и занимали площадь 7-10 гепатоцитов. Одновременно с этим менялась структура самих гранулем, они теряли свои четкие границы или дискретность. При этом обращало внимание усиление лейкоцитарной инфильтрации, представленной преимущественно нейтрофилами (Нф).

Усиление нейтрофильной инфильтрации в печени при введении ЛПС животным с ЗГ-индуцированным ГВ, по-видимому, обеспечивается активным рекрутированием клеток в зону повреждения из циркулирующего пула. Об этом свидетельствуют результаты подсчета общего количества лейкоцитов, числа Нф и моноцитов крови после введения ЛПС ЗГ-индуцированным мышам. Так, через 3 ч после введения ЛПС, у ЗГ-индуциро-ванных мышей общее количество лейкоцитов периферической крови достоверно снижалось с 7,8±0,91х109/л до 2,9±0,14х109/л (р<0,05). Снижение общего количества лейкоцитов крови обеспечивалось, главным образом, достоверным снижением числаНф (с 2,45±0,04х109/л до 1,28±0,03х109/л) и в меньшей степени - моноцитов. Подобная картина крови сохранялась и на сроке 8 ч. Через 24 ч после введения ЛПС мышам с ЗГ-индуцированным ГВ общее количество Нф крови возрастало до уровня исходных значений, а число моноцитов даже превышало их, но недостоверно.

Дополнительным свидетельством усиления миграции Нф в ткани явился рост их числа в БАЛ жидкости. При введении ЛПС на пике ЗГ-индуцированного ГВ в БАЛ жидкости мышей количество Нф возросло в 13 раз (с 0,063±0,008х109/л до 0,82±0,1хю9/л, р<о,001).

Исходя из полученных результатов, встает вопрос о том, каковы же механизмы деструкции в зоне воспаления при введении субтоксической дозы ЛПС животным на пике развития ЗГ-индуцированного ГВ. В связи с этим, для выяснения механизма развития повреждения после введения ЛПС оце-10

нивали суммарный хемилюминесцентный (ХЛ) ответ Нф крови, КК, макрофагов легких и перитонеальной полости. Результаты исследования показали, что при введении субтоксической дозы ЛПС на пике развития ЗГ-гранулем суммарный ХЛ ответ фагоцитирующих клеток значительно возрастает, за исключением макрофагов перитонеальной полости. Так, суммарный ХЛ ответ Нф крови и легочных макрофагов при введении ЛПС животным с ЗГ-гранулемами соответственно растет в 3,48 раза и 2,25 раза. При этом абсолютные значения ХЛ ответа Нф составили 151,3+12,3 имп/102 клеток/30 мин (у ЗГ-животных - 43,4+3,5 имп/102 клеток/30 мин), а легочных макрофагов - 88,7+7,4 имп/102 клеток/30 мин (у ЗГ-животных -39,3+2,4 имп/102 клеток/30 мин) (р<0,001).

Для оценки деструктивного потенциала КК, изолированных из печени нормальных и животных с ЗГ-гранулемами добавляли ЛПС (5 мкг/мл) и оценивали их способность генерировать активные метаболиты кислорода (АМК) in vitro. При этом было показано, что ХЛ ответ КК, изолированных из печени животных с ЗГ-гранулемами при добавлении ЛПС был в 18 раз больше (2354,5+97,5 имп/103 клеток/30 мин), чем у клеток нормальных животных (130,8+14,5 имп/103 клеток/30 мин) (р<0,001). Эти результаты свидетельствуют о том, что при введении ЛПС животным, на пике гра-нулемогенеза, макрофаги печени (клетки Купфера) чрезвычайно активно генерируют АМК, причем, известно, что этот процесс запускается мгновенно (Зенков Н.К. и соавт., 2001).

Подтверждением того, что АМК, продуцируемые фагоцитирующими клетками, особенно in situ, играют ключевую роль в повреждении свидетельствуют данные корреляционного анализа между показателями ХЛ ответа фагоцитов и параметрами активности маркерных ферментов деструкции (АлАТ и ЛДГ4,5). Так, анализ корреляционных взаимосвязей выявил, что при введении субтоксической дозы ЛПС животным с ЗГ гранулемами наибольший вклад в развитие деструктивного процесса в печени вносят КК за счет усиленной генерации АМК. Об этом свидетельствуют достоверные прямые корреляционные взаимосвязи между показателями суммарного ХЛ ответа КК и параметрами активности маркерных ферментов деструкции: с АлАТ - r=+0,56 и с ЛДГ4,5 - r=+0,65 (р<0,05). Менее значимые корреляционные взаимосвязи были выявлены при анализе этих параметров с ХЛ ответом легочных макрофагов и Нф крови.

С другой стороны, кроме АМК, цитопатогенная активность макрофагов очага воспаления может быть связана с гиперсекрецией ими лизосомальных ферментов (Короленко ТА, 1983). Рост активности лизосомальных ферментов может быть результатом усиления секреторной активности фагоцитирующих клеток под действием ЛПС (Маянский Д.Н., Урсов И.Г., 1997), либо проявление их активности может быть обусловлено повреждением самих фагоцитов и/или паренхиматозных клеток в результате свободно-

радикальных реакции, пусковым фактором которых являются АМК. Свидетельством этого являются результаты корреляционного анализа. Так, при введении субтоксической дозы ЛПС животным с ЗГ-гранулемами на фоне высоких значений суммарного ХЛ ответа КК в сыворотке крови возрастают активность катепсина D и КФ. При этом коэффициенты корреляционных взаимосвязей между ними соответственно составили r=+0,54 и r=+0,72 (р<0,05). В этой же ситуации, в отличие от КФ, между ростом ХЛ ответа легочных макрофагов и активностью катепсина D не было достоверных корреляционных взаимосвязей. Отсюда повышение активности катепсина D в сыворотке крови в большей степени вероятности свидетельствует об их печеночном происхождении.

В полученных результатах особое внимание привлекает то, что уже через 3 ч после введения ЛПС, т.е. раньше, чем до роста маркерных ферментов деструкции в сыворотке крови мышей почти втрое возрастало содержание провоспалительных цитокинов ФНО-а И ИЛ-lß. Так, содержание ФНО-а возрастало с 79,1 + 13,2 пкг/мл до 183,3+14,5 пкг/мл, а ИЛ-lß - с 56,3+7,2 пкг/мл до 167,5± 12,3 пкг/мл (во всех случаях р<0,001) (рис. 1А и Б).

Отсюда значение провоспалительных цитокинов, вероятно, заключается не только в усилении экспрессии адгезивных молекул в мембране фагоцитов, эндотелиальных и паренхимных клеток печени (Симбирцев А.С., 2004), а также в формировании условия для полной активации фагоцитов. Как известно, полная активация макрофага предполагает приобретение ими высокой цитотоксичности (Adams D.O., Hamilton T.A., 1989). В очаге ГВ в результате как аутостимуляции, так и стимуляции другими медиаторами вновь поступающие моноциты/макрофаги приобретают готовность к ци-тотоксической реакции при дополнительной стимуляции. Такие макрофаги в настоящее время обозначают как «примированные» клетки, т.е. они готовы, но еще не реализуют цитопатогенные эффекты. Для реализации цитопа-тогенного потенциала требуется дополнительная стимуляция, в нашем случае - ЛПС (Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д., 1990; Adams D.O., Hamilton T.A., 1984,1986).

Таким образом, при введении субтоксической дозы ЛПС на пике развития ЗГ-индуцированного ГВ гибель животных, прежде всего, была обусловлена повреждением печени вокруг очага воспаления за счет гиперпродукции АМК, лизосомальных ферментов фагоцитами органа мишени и активированных Нф, смигрировавших из крови. Кроме того, выясняется, что макрофаги очага воспаления, вероятно, приобретают высокую цитопа-тогенную активность через этап примирования. В этом случае наиболее реальными примирующими медиаторами могут служить провоспалитель-ные цитокины уровень содержания которых значительно

возрастает на ранних сроках после введения ЛПС животным на пике развития ЗГ-гранулем. 12

В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на выяснение роли различных классов липопротеинов в нейтрализации патогенного эффекта ЛПС при его введении животным с ЗГ-гранулемами в печени. На начальном этапе данного исследования необходимо было выяснить содержание липопротеинов в сыворотке животных на пике развития ЗГ-индуцированного ГВ. Результаты исследования показали, что на пике развития ЗГ-индуцированного ГВ в печени отмечается повышение триглице-ридов и Р-липопротеинов, а также наблюдается изменение спектра различных классов липопротеинов в сыворотке крови в сторону повышения ЛПНП и снижения ЛПВПЗ (таблица 1). Так, на пике развития ЗГ-гранулем в печени крыс содержание липопротеинов достоверно превышало контрольные цифры почти в 1,3 раза. Процентное содержание ЛПОНП возрастало, но недостоверно, а ЛПНП - было вдвое выше, чем в контроле (р<0,05). Одновременно с этим отмечается снижение содержания ЛПВПЗ. Их процентное содержание составило 26,6±1,8%, что было в 1,6 раза ниже контрольных значений (р<0,05).

Таблица 1

Показатели липидного обмена и спектр липопротеинов в сыворотке крови крыс на пике развития ЗГ-индуцированных гранулем в печени (М+т)

Показатели Группы животных

Контроль ЗГ 5сут

Холестерин, ммоль/л 2,1±0,11(6) 2,4±0,15(5)

Триглицериды, ммоль/л 1,08±0,11(6) 1,84±0,12*(5)

Р-липопротеины, мг % 49,9±2,18(6) 63,1±2,1*(5)

Спектр липопротеинов, %

ЛПОНП 8,3±0,67 (6) 13,6±1,5 (5)

ЛПНП 15,5±0,43(б) 31,2±1,16*(5)

ЛПВП2 32,8±1,2(6) 28,6±1,6(5)

ЛПВПЗ 43,3±1,41 (6) 26,6±1,8* (5)

Примечание: В скобках - количество животных; достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,05.

Таким образом, повышение суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП (р-липопротеинов), триглицеридов и смещение спектра липопротеинов в сторону увеличения ЛПНП и снижения ЛПВПЗ свидетельствуют о нарушении липидного обмена у крыс на пике ЗГ-индуцированного ГВ.

С учетом изменения спектра липопротеинов дальнейшие эксперименты проводились введением ЛПС животным с ЗГ-индуцированным ГВ после его 30 минутной преинкубации с различными классами липопротеинов.

Результаты исследования показали, что наиболее заметное и достоверное снижение маркерных ферментов деструкции (АлАТ и ЛДГ4,5 изофермента) наблюдается при введении животным на пике развития ЗГ-гранулем ЛПС в комплексе с ЛПВПЗ, что свидетельствует о снижении процесса деструкции в печени. В этом же случае происходит достоверное снижение активности катепсина D в сыворотке животных. Одномоментно с этим при введении комплекса ЛПС+ЛПВПЗ, а также ЛПС+ЛПНП отмечено достоверное снижение содержания провоспалительных цитокинов ФНО-а И ИЛ-1Р (рис. 1А и Б).

При дифференцированном подсчете клеточных элементов крови, легких и перитонеальной полости было выявлено, что через 24 ч после введения комплексов ЛПС+ЛПВПЗ происходит нормализация количества лейкоцитов крови (в том числе и Нф) и снижение числа Нф в БАЛ жидкости.

Рис. 1. Содержание в сыворотке крови при введении

мышам с ЗГ-индуцированным ГВ в печени ЛПС Е.еоИ 0127:В8 преинкубированных с различными классами липопротеинов.

Примечание: К- контроль; I - группа ЗГ+(ЛПС+ЛПОНП); II - ЗГ+ (ЛПС+ЛПНП); III -ЗГ+(ЛПС+ЛПВП2) и IV- ЗГ+(ЛПС+ЛПВПЗ). Достоверность различий по сравнению с группой ЗГ+ЛПС: * - р<0,05 и • • - р<0,001.

Это свидетельствует о том, что при введении комплекса ЛПС+ЛПВГО Нф менее активно мигрируют в ткани различных органов (в печень и легкие), а в печени отмечается снижение зоны повреждения. Вероятно, это связано с тем, что ЛПВПЗ снижают ЛПС-индуцированную миграционную активность Нф за счет уменьшения градиента хемотаксиса в зоне воспаления и/или повреждения, в том числе хемотаксически активных цитокинов.

Что касается окислительно-метаболической функции Нф периферической крови, КК и макрофагов легких, то, судя по показателям их суммарного ХЛ ответа, происходит значительное снижение продукции АМК. Так, например, при введении комплекса ЛПС+ЛПВПЗ происходит достоверное снижение суммарного ХЛ ответа Нф крови в 2,24 раза, а легочных макрофагов - в 2,1 раза. При этом отмечено, что суммарный ХЛ ответ этих клеток также достоверно снижается при введении комплекса ЛПС+ЛПНП, но в меньшей степени, чем при введении комплекса ЛПС+ЛПВПЗ (таблица 2).

Таблица 2

Суммарный ХЛ ответ фагоцитирующих клеток крови, перитонеальной полости и БАЛ жидкости крыс при введении ЛПС E.coli 0127:В8 в комплексе с различными классами липопротеинов и АпоА-I на пике ЗГ-индуцированного гранулематозного воспаления (М±т)

Группы животных Суммарный ХЛ ответ (имп/102 клеток/30 мин)

Нейтрофилы крови Перитонеальные макрофаги Макрофаги БАЛ жидкости

Контроль (6) 36,7±2,7 23,7±1,3 27,8±1,6

ЗГ(7) 43,4±3,5 28,3±2,5 39,3±2,4*

ЗГ + ЛПС(5) 151,3±12,3*/х 32,1±2,3* 88,7±7,4*/х

ЗГ+(ЛПС+ЛПНП) (5) 127,2±11,6* 27,9±3,3 45,4±5,2*/**

ЗГ+(ЛПС+ЛПВПЗ) (5) 67,4±7,7*/** 25,7±3,8 42,5±3,6*/**

ЗГ+(ЛПС+АпоА-1) (5) 63,5±5,6*/** 24,9±4,4 41,7+2,6*/**

Примечание. В скобках - количество животных. Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001; по сравнению с ЗГ+ЛПС группой: ** - р<0,05; по сравнению с З Г -х - р<0,05.

Таким образом, введение комплекса ЛПС+ЛПВПЗ приводит к наиболее заметному снижению маркерных ферментов деструкции, активности лизо-сомальных ферментов, содержания провоспалительных цитокинов и ХЛ ответа фагоцитирующих клеток. Комплекс ЛПС+ЛПНП также способствовал снижению уровня провоспалительных цитокинов и окислительно-метаболической активности фагоцитов. Эти результаты свидетельствуют о том, что ЛПВПЗ обладают наибольшей способностью нейтрализовать пато-

генные эффекты Л ПС, о чем свидетельствует снижение деструктивных проявлений в печени животных с ЗГ-гранулемами.

Для объяснения механизмов нейтрализации патогенного эффекта ЛПС и роли белкового компонента ЛПВПЗ - АпоА-I в связывании ЛПС были проведены эксперименты на КК, изолированных из печени нормальных и животных с ЗГ-гранулемами in vitro. В этой серии экспериментов оценивали способность КК, изолированных от разных групп животных, продуцировать АМК под влиянием: а) ЛПС; б) комплекса ЛПС+сыворотка нормальных животных; в) комплексов ЛПС+липопротеины разных классов; в) комплекса ЛПС+АпоА-1. Кроме того, оценивали продукцию АМК КК под влиянием ЛПС после их 30-минутной преинкубации с различными классами липопротеинов.

Результаты исследования показали (рис. 2), что при добавлении ЛПС (5 мкг/мл) к КК нормальных крыс не оказывал достоверного эффекта на продукцию ими АМК. Однако добавление ЛПС к КК, изолированных из печени животных с ЗГ-гранулемами приводило к 18-кратному росту ХЛ ответа. Эти результаты явились дополнительным подтверждением экспериментов in vivo, т.е. того, что КК очага воспаления вносят основной вклад в развитии деструкции печени при введении ЛПС животным на пике развития ЗГ-гранулем. Дальнейшие исследования показали, что 30-минутная преинку-бация ЛПС с ЛПВПЗ приводила к снижению ХЛ ответа КК, изолированных из печени животных с ЗГ-гранулемами в 2,8 раза, по сравнению с эффектом одного лишь ЛПС (р<0,05).

Подобный, но менее выраженный эффект, как и в случае in vivo, вызывали ЛПНП (в 1,3 раза) и сыворотка крови интактных животных (в 1,2 раза). В этих условиях ЛПВП2 и ЛПОНП не оказывали достоверного влияния на ЛПС-индуцированную ХЛ КК (рис. 2). Отсюда, выявленный эффект сыворотки крови, по-существу, может быть связан с присутствием в ней ЛПВПЗ и ЛПНП.

Надо отметить, что снижение продукции АМК клетками Купфера при совместном добавлении ЛПС и ЛПВПЗ, вероятно, не связано с конкуренцией этих лигандов за рецептор на мембране макрофагов, а является результатом образования комплекса ЛПС+ЛПВПЗ. Об этом свидетельствуют результаты исследования, когда КК, изолированных из печени крыс с ЗГ-индуцированными гранулемами инкубировали с ЛПВПЗ в течение 30 мин, а затем добавляли ЛПС под контролем ХЛ исследования. В этом случае ЛПС не только не оказывал ингибирующее влияние на продукцию АМК клетками Купфера преинкубированных с ЛПВПЗ, а даже усиливал, но недостоверно (таблица 3).

С учетом того, что из всех фракции липопротеинов наиболее выраженный ингибирующий эффект на ЛПС-индуцированный ХЛ ответ КК, изолированных из печени крыс с ЗГ-гранулемами оказывал ЛПВПЗ было иссле-

довано влияние в этих условиях АпоЛЛ - его основного белкового компонента.

Рис. 2. Влияние различных классов липопротеинов и сыворотки крови на ХЛ ответ клеток Купфера, изолированных из печени нормальных (контроль) крыс и животных с ЗГ-гранулемами.

Примечание: К - контроль; ЗГ - крысы с ЗГ-индуцированными гранулемами, ЛПС - при добавлении ЛПС к клеткам нормальных животных; I - ЗГ+ЛПС; II - ЗГ+(ЛПС+сыворотка); III - ЗГ+(ЛПС+ЛПВПЗ); IV - ЗГ+(ЛПС+ЛПВП2); V - ЗГ+(ЛПС+ЛПНП) и VI -ЗГ+(ЛПС+ЛПОНП). Достоверность различий по сравнению с I группой крыс: * - р<0,05 и ** -р<0,001; по сравнению с контрольными (К) и ЗГ+ЛПС-крысами: *** - р<0,001

Таблица 3

Влияние 30-минутной преинкубации клеток Купфера с ЛПВПЗ на ЛПС-индуцированный ХЛ ответ (M±m; n = 5)

Условия опыта ХЛ ответ КК (имп/103 КК/30 мин)

Контроль (без добавок) 422+31

ЛПВПЗ 668+18*

ЛПС 1296+108*

ЛПВПЗ через 30 мин + ЛПС 1508+132*

Примечание: Достоверность различий по сравнению с контролем: * - р<0,001

Основанием проведения данного фрагмента работы явилось то, что до сих пор еще не уточнена роль структурных компонентов липопротеинов, особенно ЛПВПЗ, в нейтрализации патогенного эффекта ЛПС.

Некоторые авторы предполагают, что ЛПС-связывающая способность липопротеинов коррелирует с содержанием в них холестерина (Van Lenten B.J. et al., 1986) или липидов (Harris H.W. et al., 1990). По мнению Левина и

соавт. (Levine D.M. et al., 1993), для нейтрализации ЛПС необходимо встраивание липида А в фосфолипидный монослой ЛПВП. Имеются также факты, свидетельствующие об участии в этих процессах белкового компонента липопротеинов (Flegel W.A. et al., 1993).

Результаты исследования in vivo показали, что, в отличие от комплекса ЛПС+ЛПВПЗ, введение комплекса ЛПС+АпоА-I на пике развития ГВ оказывает больший эффект на снижение активности маркерных ферментов деструкции, содержания провоспалительных цитокинов и окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток.

В экспериментах in vitro показано, что ХЛ ответ КК при добавлении к ним ЛПС совместно с апоА-I был в 1,5 раза ниже, чем при инкубации клеток с одним ЛПС (таблица 4). Эти результаты, в целом, свидетельствуют об участии АпоА-1 в связывании ЛПС с ЛПВПЗ.

Таблица 4

Влияние АпоА-1 на ЛПС-индуцированный ХЛ ответ клеток Купфера, изолированных из печени крыс с ЗГ гранулемами (M±m; п = 5)

№ Условия опыта ХЛ ответ КК (имп/103КК/30мин) Р

1. Контроль(без добавок) 393+32

2. АпоА-1 637+25 P1-2<0,001

3. ЛПС 1315+39 p1-3<0,001

4. АпоА-1+ЛПС 883+20 рм . 3-4<0,001

р -достоверность различий между группами

Таким образом, обнаруженное значительное снижение ЛПС-индуци-рованной продукции АМК КК под влиянием ЛПВПЗ свидетельствует о том, что ЛПС преимущественно взаимодействует с данной фракцией плазменных липопротеинов. В этом процессе участвует белковый компонент липопротеинов - АпоА-1. Поскольку взаимодействие ЛПС с этими компонентами сыворотки крови приводит к снижению продукции АМК, можно предположить, что повреждение органов при эндотоксемии и бактериальных инфекциях существенно зависит от уровня ЛПВПЗ и АпоА-1 в крови.

При ГВ поступление эндотоксина несет риск развития деструкции в органе-мишени на фоне ослабления эндотоксин-нейтрализующего потенциала, особенно, если учесть то, что на пике гранулемогенеза содержание ЛПВПЗ в сыворотке крови было значительно сниженным.

выводы

1. Гибель животных при введении субтоксической дозы липополисаха-рида E.coli 0127:В8 на пике развития зимозан-индуцированного гранулема-тозного воспаления связана с нарушениями гемодинамики в печени с очаговым полнокровием синусоидбв, диффузным и очаговым повреждением гепатоцитов вокруг гранулем и сопровождается достоверным ростом активности АлАТ и печеночного изофермента ЛДГ4,5 в сыворотке крови.

2. Повреждение печени при введении липополисахарида на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления обусловлено повышением генерации активных метаболитов кислорода клетками Купфе-ра и нейтрофилами, мигрирующими в зону воспаления, ростом активности катепсина D и кислой фосфатазы, о чем свидетельствуют высокие прямые и достоверные их корреляционные взаимосвязи с активностью маркерных ферментов деструкции (АлАТ и ЛДГ4,5).

3. Достоверное повышение уровня провоспалительных цитокинов ФНО-

на ранних сроках (3 ч) после введения субтоксической дозы ли-пополисахарида животным с гранулематозным воспалением предшествует максимальной активности маркерных ферментов деструкции в сыворотке крови и свидетельствует об их участии в процессе повреждения печени в зоне воспаления.

4. На пике развития зимозан-индуцированного гранутематозного воспаления отмечено повышение триглицеридов, липопротеинов и изменение спектра различных классов липопротеинов в сыворотке крови с повышением процентного содержания липопротеинов низкой плотности и снижением 3-й фракции липопротеинов высокой плотности.

5. При введении субтоксической дозы липополисахарида в комплексе с 3-й фракцией липопротеинов высокой плотности животным с зимозан-индуцированным гранулематозным воспалением достоверно снижаются активность маркерных ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и содержание провоспалительных цитокинов ингибируется хемилюминесцентный ответ нейтрофилов крови и макрофагов легких.

6. При введении липополисахарида в комплексе с аполипопротеином A-I животным с зимозан-индуцированным гранулематозным воспалением снижение активности маркерных ферментов, уровня провоспалительных цитокинов и хемилюминесцентного ответа фагоцитирующих клеток, как in vivo, так in vitro были более выраженными, чем при введении в комплексе с 3-й фракцией липопротеинов высокой плотности.

7. Нейтрализация патогенных эффектов липополисахарида 3-й фракцией липопротеинов высокой плотности не связано с конкуренцией этих лиган-дов за рецептор на мембране макрофагов, а является результатом образования их комплекса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Макарова О.П. Реактивность альвеолярных макрофагов при развитии гранулематозного воспаления легких в условиях острой массивной кро-

. вопотери / О.П. Макарова, А.А. Зубахин, В.В. Курилин, Х.Ц. Далаева // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Матер. Всеросс. научно-практ. конф., посвященной 50-летию образования Читинской государственной медицинской академии. - Чита, 2003. -С. 289-291.

2. Далаева Х.Ц. Клеточные реакции и функциональная характеристика СМФ при фагоцитарной гиперчувствительности на пике гранулемогене-за / Х.Ц. Далаева, В.В. Курилин // Тез. докл. ежегод. конкурс-конференции студентов и молод. ученых «Авиценна-2004».- Новосибирск, 2004.-С. 217.

3. Курилин В.В. Характеристика реакции фагоцитов в динамике Candida-индуцированного гранулематозного воспаления / В.В. Курилин, Х.Ц. Далаева, М.А.Травин // Тез. докл. ежегод. конкурс-конференции студентов и молод. ученых «Авиценна-2004».- Новосибирск, 2004. - С. 219-220.

4. Цырендоржиев Д.Д. Роль различных классов липопротеинов в нейтрализации биологического эффекта липополисахаридов / Д.Д. Цырендор-жиев, И.Ф. Усынин, А.В. Харьковский, Х.Ц. Далаева, А.Н. Цибин // Медицина и образование в XXI веке: Тез. докл. научно-практ. конф. с межд. участием. - Новосибирск, 2004. - С. 152-155.

5. Цырендоржиев Д.Д. Реактивность макрофагов на разных фазах развития гранулематозного воспаления / Д.Д. Цырендоржиев, Х.Ц. Далаева, В.В. Курилин // Медицина и образование в XXI веке: Тез. докл. научно-практ. конф. с межд. участием.- Новосибирск, 2004. - С. 153-155.

6. Курилин В.В. Реакция фагоцитирующих клеток в динамике Candida albicans-индуцированного гранулематозного воспаления и при использовании комплексного противогрибкового препарата /В.В. Курилин, Х.Ц. Далаева, М.А. Травин, А.П. Надеев, В.А. Шкурупий, Д.Д. Цырен-доржиев // Проблемы лимфологии и интерстициального массопереноса: Тез. докл. научн. конф. с межд. участием, посвящ. 75-летию и 50-летию научно-педагогической деятельности академика РАМН Ю.И. Бородина. - Новосибирск, 2004. - С. 228-231.

7. Курилин В.В. Функциональное состояние фагоцитов в динамике Candida albicans - индуцированного гранулематозного воспаления / В.В. Курилин, Х.Ц. Далаева, М.А. Травин, Д.Д. Цырендоржиев // Проблемы медицинской микологии. - 2004. - Т. 6, № 2. - С. 90.

8. Далаева Х.Ц. Реакция фагоцитирующих клеток при введении липополи-сахарида в комплексе с липопротеинами различной плотности на фоне максимального роста гранулем в печени / Х.Ц. Далаева, В.В. Курилин // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: Матер. V-й молод. научн. конф. СО РАМН. - Новосибирск, 2004. - С. 14-16.

9. Далаева Х.Ц. Роль цитокинов и активных метаболитов кислорода механизмах фагоцитарной гиперчувствительности при гранулематозном воспалении печени / Х.Ц. Далаева // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: Матер. V-й молод. научн. конф. СО РАМН. - Новосибирск, 2004. - С. 13-14.

10. Курилин В.В. Влияние амфотерицина В на окислительно-метаболическую функцию фагоцитов при Candida albicans-индуцированном гранулематозном воспалении / В.В. Курилин, Х.Ц. Далаева // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: Матер. V-й молод. научн. конф. СО РАМН. - Новосибирск, 2004. - С. 22-23

И.Цырендоржиев Д.Д. Особенности формирования зимозан-индуциро-ванной гранулемы в печени преждевременно стареющих крыс OXYS / Д.Д. Цырендоржиев, С.Н. Кутана, Х.Ц. Далаева, В.В. Курилин, Н.Г. Колосова // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: Матер. II-й Всеросс. конф. -Новосибирск, 2004. - С. 82-83.

12. Цырендоржиев Д.Д. Роль липопротеинов различной плотности в клеточных реакциях фагоцитов при введении липополисахарида E.coli на фоне зимозан-ндуцированной гранулемы в печени / Д.Д. Цырендоржиев, И.Ф. Усынин, Л.М. Поляков, Х.Ц. Далаева // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: Матер. И-й Всеросс. конф. - Новосибирск, 2004. -С. 85-86.

Соискатель

Далаева Х.Ц.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМК - активные метаболиты кислорода

АпоА-I - аполипопротеин A-I

БАЛ - бронхо-альвеолярный лаваж

ГВ - гранулематозное воспаление

ЗГ - зимозан и/или зимозановые гранулы

ИЛ - интерлейкин(ы) -1, -4, -6, -8, -10 и т.д.

КК - клетка Купфера

КФ - кислая фосфатаза

ЛПВП2 - 2 фракция липопротеинов высокой плотности

ЛПВПЗ - 3 фракция липопротеинов высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ЛПС - липополисахарид

Нф - нейтрофил(ы)

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

ФГЧ - фагоцитарная гиперчувствительность

ФНО-а - фактор некроза опухоли-а

ХЛ - хемилюминесценция, хемилюминесцентный и т.д

Заказ 3. Тираж 100 экз. Печ. л. 1,0. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Типография СО РАМН, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2/12,2005 г.

i 2108

В проблеме хронического воспаления, несмотря на значительные достижения современной медицины, по-прежнему остаются актуальными задачи изучения патогенеза хронизации, персистенции и обострения воспалительных процессов. Наименее изученным из них являются вопросы о механизмах обострения воспалительного процесса (Маянский Д.Н., Урсов И.Г., 1997). Результаты многих клинических и научных исследований показали, что в качестве пусковых факторов обострения воспалительного процесса чаще всего выступает липопо-лисахарид (ЛПС) грамнегативных бактерий, более известный как эндотоксин, а также липотейхоевая кислота (ЛТК) грампозитивных бактерий (Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д., 1990; Цырендоржиев Д.Д., 1997; Macdonald J. et al., 2003; Hotchkiss R.S., Karl I.E., 2003; Van Amersfoort E.S. et al., 2003).

По данным Д.Н. Маянского и Д.Д. Цырендоржиева (1990) развитие гранулематозного воспаления (ГВ) проходит через фазу гиперер-гии, когда резко возрастает чувствительность организма к эндотоксину и его дериватам. Это явление авторами было обозначено как феномен «фагоцитарной гиперчувствительности» (ФГЧ). Подобные результаты были получены при введении ЛПС мышам с C.parvwn-индуцированным ГВ (Jaeschke Н. et al., 1992). Детальное исследование ФГЧ показало, что в его основе лежит феномен примирования фагоцитов очага воспаления (Цырендоржиев Д.Д., 1997).

В настоящее время принято, что патофизиологический эффект эндотоксина вызван не его прямым патогенным действием, а опосредованно, через секреторные продукты многих мишенных клеток, в частности, макрофагов, например, цитокинов, лейкотриенов, активных метаболитов кислорода (АМК) pi многих других медиаторов (Hotchkiss R.S., Karl I.E., 2003).

Ведущую роль, как в обезвреживании эндотоксина, так и в опосредовании их патогенных эффектов играют резидентные макрофаги печени - клетки Купфера (КЕС). Известно также, что на биологический эффект ЛПС существенное влияние оказывают компоненты сыворотки крови. Так, в плазме крови ЛПС может образовывать комплекс с ЛПС-связывающим белком (LPB) (Klein R.D. et al., 2000). Связывание этого комплекса с растворимым рецептором CD 14 приводит к усилению секреторной функции мишенных клеток, в том числе эффекторов воспаления (Tobias et al., 1992; Ahmed A.F. et al., 2001; Su G.L., 2002). Взаимодействие ЛПС с еще одним компонентом плазмы, с BPI-белком (от англ. Bactericidal/Permeability Increasing белок) предотвращает повышение секреторной активности клеток (Ooi С.Е. et al., 1991; Marra et al., 1992; Schultz H. et al., 2001; Scott A. et al., 2004).

Еще в 60-х годах Скарнес (Skarnes R.C., 1966, 1968) впервые высказал предположение о том, что ЛПС может взаимодействовать с липопротеинами сыворотки крови. В настоящее время накоплен огромный массив данных, свидетельствующих о взаимосвязи между различными классами липопротеинов и ЛПС. Однако, эти результаты по многим аспектам противоречат друг другу (Усынин И.Ф. и соавт., 1999; Братусь В.В. и соавт., 2002; Шварц Я.Ш., Душкин М.И., 2002; Wurfel М.М. et al., 1994; Eggesbo J.B. et al., 1996; Park C.T., Wright S.D., 1996; Rose J.R. et al., 2000).

В связи с этим, поиск эффективных способов нейтрализации патогенных эффектов эндотоксина и путей его выведения из циркулирующей крови при различных патологических состояниях является одной из актуальных задач современной медико-биологической науки.

Цель исследования: изучить течение зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления в печени экспериментальных животных при введении липополисахарида E.coli 0127:В8 на пике его развития и выяснить роль различных классов липопротеинов в нейтрализации патогенных эффектов эндотоксина.

Задачи исследования:

1. Оценить морфологические изменения в печени, определить уровень маркерных ферментов деструкции (АлАТ, ЛДГ4,5) и лизосо-мальных ферментов (кислой фосфатазы и катепсина Д) в сыворотке крови животных при введении субтоксической дозы ЛПС E.coli 0127:В8 на пике зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления печени.

2. Определить содержание холестерина, триглицеридов и оценить спектр различных классов липопротеинов в сыворотке крови на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления в печени.

3. Оценить изменение клеточного состава и окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток, уровней маркер-пых ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и провоспали-тельных цитокинов ФНО-а и ИЛ-lp при введении ЛПС E.coli 0127:В8 в комплексе с различными классами липопротеинов и АпоА-I на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления in vivo.

4. В экспериментах in vitro оценить влияние комплексов ЛПС E.coli 0127:В8 с различными классами липопротеинов на продукцию активных метаболитов кислорода клетками Купфера, изолированных из печени интактных и зимозан-индуцированных крыс и уточнить роль АпоА-1 в нейтрализации патогенных эффектов эндотоксина.

Научная новизна. На основании результатов исследования при введении субтоксической дозы ЛПС E.coli 0127:В8 на пике развития зимозан-индуцированого гранулематозного воспаления установлена однотипная реакция у мышей и крыс, которая сопровождается гибелью животных в течение 12-24 часов.

Выявлено, что гибель животных сопровождается ростом активности маркерных ферментов деструкции АлАТ, печеночного изофер-мента ЛДГ4,5, уровня лизосомальных ферментов (кислой фосфатазы и катепсина D), повышением содержания провоспалительных цито-кинов ФНО-а и ИЛ~1р, усилением окислительно-метаболической функции нейтрофилов крови, макрофагов печени и легких с нарушением печеночной гемодинамики и деструкцией печени в зоне гранулем.

На пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления в печени впервые установлено: повышение триглицери-дов и изменение спектра различных классов липопротеинов в сыворотке крови в сторону повышения липопротеинов низкой плотности и снижения липопротеинов высокой плотности.

Впервые показано, что 3-я фракция липопротеинов высокой плотности и его белковый компонент АпоА-I нейтрализуют патогенное влияние ЛПС E.coli 0127:В8 со снижением уровня маркерных ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и активности окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток крови и легких.

В экспериментах in vitro впервые показано, что субтоксическая доза ЛПС E.coli 0127:В8 приводит к гиперпродукции активных метаболитов кислорода клетками Купфера, изолированных из печени животных с зимозан-индуцированными гранулемами.

Впервые показано, что 3-я фракция липопротеинов высокой плотности ингибирует ЛПС-индуцированную продукцию активных метаболитов кислорода клетками Купфера in vitro. Установлено, что в механизмах связывания и нейтрализации патогенного эффекта ЛПС прямое участие принимает АпоА-1 - основной белковый компонент 3-й фракции липопротеинов высокой плотности.

Научно-практическая значимость работы. На основании результатов исследования дано теоретическое обоснование механизмов нейтрализации патогенного эффекта ЛПС E.coli 0127:В8 3-й фракцией липопротеинов высокой плотности при введении на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления.

Выделен основной механизм связывания и нейтрализации патогенных эффектов ЛПС E.coli 0127:В8 белковым компонентом 3 фракции липопротеинов высокой плотности АпоА-1.

Показано, что снижение уровня липопротеинов высокой плотности на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления определяет низкий эндотоксин-нейтрализующий потенциал сыворотки крови.

Результаты исследования используются в лекционном курсе кафедры патологической физиологии Новосибирской государственной медицинской академии CP и МЗ РФ по темам: «Воспаление» и «Патофизиология шока и экстремальных состояний».

Положения, выносимые на защиту.

1. Введение субтоксической дозы ЛПС E.coli 0127:В8 приводит к гибели экспериментальных животных с явлениями деструкции вокруг очагов воспаления в печени, что характеризуется повышением маркерных ферментов деструкции (АлАТ и ЛДГ4,5), лизосомальных ферментов (кислой фосфатазы и катепсина D), активацией окислительно-метаболической функции фагоцитирующих клеток крови, легких и печени.

2. Повышение уровня триглицеридов, p-липопротеинов и изменение спектра липопротеинов различной плотности с ростом содержания липопротеинов низкой плотности и снижением липопротеинов высокой плотности на пике развития гранулематозного воспаления определяет низкий эндотоксин-нейтрализующий потенциал сыворотки крови.

3. Липопротеины высокой плотности 3-й фракции обладают нейтрализующим эффектом на ЛПС-индуцированную продукцию активных метаболитов кислорода фагоцитирующими клетками крови, легких и печени, способствуют снижению уровня маркерных ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и провоспалительных цито-кинов. Ключевым фактором в механизмах связывания и нейтрализации патогенного эффекта ЛПС является белковый компонент 3-й фракции липопротеинов высокой плотности - АпоА-1.

Работа выполнена в рамках темы НИР: «Изучить клеточно-молекулярные механизмы гранулематозного воспаления, роль бактериальных компонентов в обострении и хронизации процесса», выполняемой в лаборатории патофизиологии ГУ НЦКЭМ СО РАМН (№ гос. регистрации 01.200.2 00795, шифр 052).

выводы

1. Гибель животных при введении субтоксической дозы ЛПС E.coli 0127:В8 на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления связана с нарушениями гемодинамики в печени с очаговым полнокровием синусоидов, диффузным и очаговым повреждением гепатоцитов вокруг гранулем и сопровождается достоверным ростом активности АлАТ и печеночного изофермента ЛДГ4,5 в сыворотке крови.

2. Повреждение печени при введении ЛПС на пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления обусловлено повышением генерации активных метаболитов кислорода клетками Купфера и нейтрофилами, мигрирующими в зону воспаления, ростом активности катепсина D и кислой фосфатазы, о чем свидетельствуют высокие прямые и достоверные их корреляционные взаимосвязи с активностью маркерных ферментов деструкции (АлАТ и ЛДГ4,5).

3. Достоверное повышение уровня провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1р на ранних сроках (3 ч) после введения субтоксической дозы ЛПС животным с гранулематозным воспалением предшествует максимальной активности маркерных ферментов деструкции в сыворотке крови и свидетельствует об их участии в процессе повреждения печени в зоне воспаления.

4. На пике развития зимозан-индуцированного гранулематозного воспаления отмечено повышение триглицеридов, p-липопротеинов и изменение спектра различных классов липопротеинов в сыворотке крови с повышением процентного содержания липопротеинов низкой плотности и снижением 3-й фракции липопротеинов высокой плотности.

5. При введении субтоксической дозы ЛПС в комплексе с 3-й фракцией липопротеинов высокой плотности животным с зимозан-индуцированным гранулематозным воспалением достоверно снижаются активность маркерных ферментов деструкции, лизосомальных ферментов и содержание провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1(3, ингибируется хемилюминесцентный ответ нейтрофилов крови и макрофагов легких.

6. При введении ЛПС в комплексе с АпоА-I животным с зимозан-индуцированным гранулематозным воспалением снижение активности маркерных ферментов, уровня провоспалительных цитокинов и хемилюминесцентного ответа фагоцитирующих клеток, как in vivo, так in vitro были более выраженными, чем при введении в комплексе с 3-й фракцией липопротеинов высокой плотности.

7. Нейтрализация патогенных эффектов ЛПС 3-й фракцией липопротеинов высокой плотности не связано с конкуренцией этих лиган-дов за рецептор на мембране макрофагов, а является результатом образования их комплекса.