Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Роль факторов роста в дифференцировке фибробластов при постинфарктной репаративной регенерации миокарда

На правах рукописи

Каня Олег Витославович

РОЛЬ ФАКТОРОВ РОСТА В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ ПОСТИНФАРКТНОЙ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ МИОКАРДА

14.03.02 — патологическая анатомия

АВТОРЕФЕ PAT диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2014

Работа выполнена в научно-лабораторном отделе ФГБУ Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН (Иркутск) и в лаборатории цитологии и клеточной биологии ФГБУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск).

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

Официальные оппоненты:

Майбородип Игорь Валентинович, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории стволовой клетки ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

Кливер Евгений Эдуардович, доктор медицинских наук, заведующий патологоанатомическим отделением ФГБУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина МЗ РФ.

Ведущая организация:

ФГБУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, отдел общей патологии (Новосибирск).

Защита состоится: «_» _ 2014 г. в _ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru/

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Молодых Ольга Павловна

профессор

доктор биологических наук, профессор

Шурыгнн Михаил Геннадьевич

Лушникова Елена Леонидовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Увеличение среднего возраста населения привело к тому, что заболевания, сопровождающиеся нарушением кровоснабжения тканей, такие как атеросклероз и его варианты в виде ишемической болезни сердца и инсультов головного мозга, стали одной из наиболее актуальных проблем медицины. Эти заболевания являются ведущей причиной инвалидизации и смертности населения в развитых странах. Несмотря на определенные успехи в профилактике и лечении ишемических повреждений органов, в том числе и сердца, проблема все еще далека от разрешения (Avezum A. et al., 2005; Fox К. et al., 2006).

Изучение процессов репаративной регенерации миокарда и попытки управления этим процессом являются одними из основных научных направлений медико-биологических исследований в связи с высоким уровнем заболеваемости инфарктом миокарда, а также с быстрым развитием и прогрессированием сердечной недостаточности у лиц, перенесших инфаркт миокарда

Репаративные процессы в миокарде после перенесенного инфаркта обусловливают так называемое постинфарктное ремоделирование миокарда, для которого характерны развитие крупноочагового или диффузного мелкоочагового кардиосклероза и, как правило, гипертрофическое ремоделирование кардиомиоцитов. Изучению структурных основ и молекулярно-биологических механизмов постинфарктного ремоделирования миокарда посвящено большое количество работ (Вихерт A.M., 1974; Митин К.С., 1974; Нагорнев В.А., 1977; Непомнящих J1.M., 1991; Автандилов Г.Г. и др., 1984; Park T.-S. et al., 2008; Wende A.R. et al., 2012). В то же время следует отметить, что каждое десятилетие появляются новые подходы к исследованию механизмов регуляции репаративных процессов в миокарде и новые подходы к их стимуляции, что имеет большое практическое значение.

В последние годы достигнуты значительные успехи в разработке методов восстановления поврежденной^мышцы сердца с использованием достижений клеточных биотехнологий. Однако серьезная проблема заключается в том, что естественная репарация поврежденного миокарда происходит преимущественно за счет быстрого развития соединительнотканного рубца, который после своего формирования крайне медленно подвергается трансформации и существенно замедляет (или делает невозможным) восстановление контрактильной способности поврежденного миокарда (Chin М.Т., Muny С.Е., 2012).

В то же время ранее проведенными в Научном центре реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН и Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН исследованиями были показаны возможность активного влияния на развитие рубцовой ткани в очаге постинфарктного кардиосклероза, а также пролиферативный потенциал кардиомиоцитов и эндотелиоцитов при

изменении в крови и миокарде уровня таких факторов роста, как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF2) (Шурыгин М.Г. и др., 2007; Дремина H.H., Шурыгин М.Г., 2008; Дремина H.H. и др., 2009). В этих исследованиях были изучены возможности индукции регенераторных реакций миокарда в постинфарктный период и установлены основные морфогенетические эффекты фактора роста эндотелия сосудов и имплантированных в мышцу сердца клеток мононуклеарной фракции костного мозга (Ларионов П.М. и др., 2009; Непомнящих JI.M. и др., 2009, 2010).

С учетом данных о неоднородности популяции клеток фибробла-стического ряда, а также способности клеток мезенхимального происхождения при наличии определённых стимулов менять направление дифференцировки (Мао Q. et al., 2013), представляется актуальным исследование соотношения популяций клеток фибробластического ряда и их синтетических потенций при подобных воздействиях. Это позволит лучше понять механизмы репарации миокарда после инфаркта при естественном течении и при изменении уровня регуляторных пептидов из группы ростовых факторов.

Цель исследования - изучить взаимосвязь дифференцировки фибробластов и ренаративной регенерации миокарда в постинфарктный период с концентрацией в крови факторов роста FGF2 и VEGF.

Задачи исследования:

1. Определить роль в развитии постинфарктного кардиосклероза резидентных и гематогенных клеток-предшественников фибробластов.

2. Изучить соотношение различных форм клеток фибробластического ряда на разных стадиях репарации при инфаркте миокарда.

3. Определить роль основного фактора роста фибробластов и VEGF в дифференцировке клеток фибробластического ряда и их синтетической активности в процессе репарации при инфаркте миокарда.

4. Исследовать связь неоангиогенеза в зоне инфаркта миокарда с количественными изменениями пула клеток фибробластического ряда.

Научная новизна. Определен вклад резидентных и циркулирующих клеток-прсдшественников фибробластов в развитие репаративной регенерации миокарда в постинфарктный период. Впервые показано, что наряду с резидентными фибробластами повышение уровня фактора роста эндотелия сосудов обусловливает миграцию в очаг поражения гематогенных клеток-предшественников фибробластов с фенотипом CD34+CD45+, которые в качестве источников пластического материала способствуют репарации зоны инфаркта миокарда.

Впервые исследован процесс постинфарктной репарации миокарда с точки зрения популяционной динамики клеток фибробластического ряда. Установлено, что дифференцировка фибробластов в области формирования постинфарктного кардиосклероза в фиброкласты стимулируется при повышенном уровне VEGF. Дифференцировка в неактивные фиброциты

нарушается как при уменьшении, так и при увеличении уровня факторов роста фибробластов и эндотелия сосудов, при этом активные клетки подвергаются каспаз-зависимому апоптозу.

Впервые изучена синтетическая активность клеток фибробластиче-ского ряда (экспрессия проколлагена и матриксной металлопротеиназы) в области развития крупноочагового кардиосклероза при разных уровнях ростовых факторов. Продемонстрировано значительное усиление процесса ремоделирования формируемого рубца при увеличении уровня факторов роста, особенно УЕОР.

На основании исследования уровня продукции эндотелина и состояния системы окислительного фосфорилирования выявлены новые патогенетические механизмы регуляции обеспечения трофики в зоне репаративной регенерации, связанные с уровнем стимуляции тирозинкиназных рецепторов УЕОР. Установлено значительное повышение продукции эндотелина при высоком уровне УЕОР. Гиперпродукция эндотелина при отсутствии гладкомышечных клеток в сосудах грануляционной ткани способна поддерживать повышенный объемный кровоток в области репарации за счет известного механизма повышенной выработки N0 при связывании эндотелина ЕТВ рецепторами.

Разработан способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда, основанный на оценке динамики клеточной и внеклеточной локализации матриксной металллопротеиназы в зоне ишемического повреждения.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы определяется получением новых знаний о роли факторов роста фибробластов и эндотелия сосудов в реализации фибробластической фазы репарации при инфаркте миокарда, регуляции синтетической функции фибробластов и изменении соотношений между пулами активных синтезирующих фибробластов, фиброкластов и фиброцитов. Большое значение имеет выявление повышенной продукции эндотелина и связанной с ним высокой активности системы окислительного фосфорилирования, что позволяет с учетом известных фактов о эффектах эндотелина предложить патогенетический механизм поддержания высокого уровня процессов энергообеспечения в области репаративной регенерации.

Установление факта наличия в зоне репарации при повышенном уровне вазоэндотелиального фактора роста плюрипотентных мезенхимальных клеток костномозгового происхождения, способных дифференцироваться, в том числе, и в кардиомиоцитарном направлении, открывает дополнительные перспективы разработки новых способов оптимизации репаративных процессов при инфаркте миокарда.

Для патологоанатомической практики важное значение имеет разработка способа определения давности инфаркта миокарда, основанная на оценке распределения матриксной металлопротеиназы внутри клеток и во внеклеточном матриксе в зоне инфаркта миокарда.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. При естественном течении инфаркта миокарда и при снижении концентрации факторов роста - FGF2 или VEGF - основным источником пластического материала для репаративного процесса являются резидентные фибробласты. При повышении уровня циркулирующего фактора роста эндотелия сосудов в зону формирования постинфарктного кардиосклероза в дополнение к резидентным клеткам мигрируют костномозговые клетки-предшественники фибробластов.

2. Локализация и уровень экспрессии матриксной металлопрогеи-назы ММР9 в зоне репарации позволяет определять давность инфаркта миокарда, в том числе и в случае рецидивирующего течения и повторных инфарктов миокарда.

3. Изменение естественной динамики факторов роста приводит к нарушению процесса трансформации фибробластов в фиброциты, с преимущественной их элиминацией путем апоптоза.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международной конференции «International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology» (Новосибирск, 2010); международной научной конференции «Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М.Кожова» (Иркутск, 2010); международной конференции «07,ВЮ2010 combined conferences» (Melbourne, 2010); международной конференции «Генетична i регенеративна медицина: проблеми та пер-спективи» (КиУв, 2010); международном конгрессе «Asian Congress on Biotechnology» (Shanghai, 2011); ежегодных научно-практических конференциях Иркутского отделения Российского общества патологоанатомов (Иркутск, 2010, 2011, 2012, 2013), конференциях Иркутского областного патологоанатомического бюро (2013, 2014), межлабораторной научной конференции в ФГБУ Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2014).

Внедрение результатов исследований. В рамках выполнения диссертационной работы разработан оригинальный способ патоморфологи-ческого определения давности наступления инфаркта миокарда (патент RU 2518333 от 06 декабря 2012 г. «Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда»; опубл. 10.06.2014 Бюл. № 16).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 6 в ведущих рецензируемых научных журналах по списку ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы, отражающей использованные в работе материал и методы исследования, главы с результатами собственных исследований, заключения и выводов. Список использованных источников включает 194 работы отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено патологоанатомическое исследование миокарда людей, умерших вследствие инфаркта миокарда, и миокарда экспериментальных животных, у которых воспроизводили инфаркт миокарда.

Патологоанатомический материал получен от 29 наблюдений умерших от трансмурального инфаркта миокарда и одного случая постинфарктного кардиосклероза. Вскрытия умерших производили в централизованной прозектуре ГБУЗ «Иркутское областное патологоанатомическое бюро» (нач. бюро — к.м.н. Гришина Г.П.). Оценку давности инфаркта миокарда проводили на основании анамнеза и гистологических критериев (некроз кардиомиоцитов, нейтрофильная инфильтрация и характер ее распределения, инфильтрация лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, пролиферация кровеносных сосудов, фибробластов, коллаге-новые волокна).

Моделирование ишемического повреждения миокарда. Инфаркт-миокарда моделировали методом диатермокоагуляции околоконусной межжелудочковой артерии крысы. Эксперимент выполняли в соответствии с нормами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) согласно протоколу, одобренному Комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «НЦРВХ» СО РАМН.

Исследован материал от 250 самок крыс линии Вистар, массой 220 -250 г, в возрасте 9 мес:

• контрольная группа (50 животных) - моделирование инфаркта миокарда;

• группа животных FGF - моделирование инфаркта миокарда, введение FGF2 (Sigma, Cat. N F0291, Lot 124К0797) внутрисердечно в полость левого желудочка в дозе 100 нг однократно через 1,5 ч после операции по моделированию инфаркта миокарда (50 животных);

• группа животных анти-FGF - моделирование инфаркта миокарда, введение блокатора активности FGF2 (моноклональных антител к FGF2 -Sigma, Cat. N F6162, Lot 025К4835) в дозе 2 мкг внутрисердечно в полость левого желудочка трехкратно через 1,5, 6 ч и 3 сут после моделирования инфаркта миокарда (50 животных).

• группа животных VEGF - моделирование инфаркта миокарда, введение VEGF (VEGF 164 rat recombinant, Sigma, Cat. N V3638-10UG, Lot 064K1239) внутрисердечно в полость левого желудочка в дозе 100 нг (однократно через 1,5 ч после операции по моделированию инфаркта миокарда (50 животных);

• группа животных анти-VEGF - моделирование инфаркта миокарда, введение блокатора активности VEGF (моноклональных антител к VEGF -Sigma, Cat.N V1253, Lot 044К1711)вдозе 1 мкг внутрисердечно в полость

левого желудочка трехкратно через 1,5, 6 ч и 3 сут после моделирования инфаркта миокарда (50 животных).

Выведение животных из эксперимента осуществляли в сроки 2,6, 12 ч, 1,3, 7, 14 и 30 сут после моделирования инфаркта миокарда.

Морфологические и морфометрические исследования. Для гистологического исследования материал фиксировали в забуференном растворе 10% нейтрального формалина в течение суток, затем проводили в автоматическом процессоре Tissue-Tek VIP6. Заливали образцы сердца в гистомикс с применением системы заливки Tissue-Tek VIP5. Микротомию образцов с толщиной срезов 5мкм выполняли на санных и ротационных микротомах (Leica). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону.

Морфометрические исследования осуществляли с помощью программы ImageJ (США) с набором модулей для медицинской морфометрии от Wayne Rasband. Использовали планиметрический метод. Подсчет проводили на микрофотографиях (объектив 40х, фоторегистрирующая система Nikon с 5 МПикс сенсором размером 2/3").

Иммуногистохимическое исследование. Срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли-Ь-лизином. Депарафинирова-ли препараты в толуоле (5 мин), затем гидратировали в серии спиртов нисходящей концентрации по 1 мин. Выдерживали в дистиллированной воде 10 мин. Для демаскирования антигенов использовали технологию микроволнового процессинга в цитратном буфере (рН=6,0). Нормализовали pH с применением фосфатно-солевого буфера с твином (рН=7,6). Для предотвращения смешивания реактивов образец ткани обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002). Иммуногистохимическое окрашивание выполняли с использованием набора Novolink Polymer Detection Kit по рекомендованному производителем протоколу.

В качестве первичных антител применяли:

1) антитела к ММР9 rabbit monoclonal antibody IgG (Epitomics, Clone ID : EP1254, Cat. N 2551-1, Lot YG 113001P), разведение 1:200;

2) антитела к эндотелину ET-1/2/3 (Н-38) rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz, Cat. N Sc-98727, Lot #G2209), разведение 1:300;

3) антитела к проколлагену I типа Col 1А1 (D-13) goat polyclonal IgG (Santa Cruz, Cat. N Sc-25974, Lot # ВОЗ10), разведение 1:300.

Срезы докрашивали 0,02% раствором гематоксилина, дегидратировали и заключали в среду Permanent Slide Mounting Medium (Novocastra, R£F=7137, Lot 713708). Микроскопическое исследование проводили с использованием светового микроскопа Nikon 80i.

Иммунофлюоресцентное исследование. Срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли^-лизином. Препараты депарафи-нировали, затем с использованием микроволнового процессора в цитратном буфере (рН=6,0) проводили демаскирование антигенных структур. Нормализовали pH с применением фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с

твином (рН=7,6). Участки с образцами ткани ограничивали гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002). Для уменьшения фонового свечения использовали Image-iT FX signal enhancer (Invitrogen. Cat. N I 36933, Lot #681688). После промывки применяли 2% раствор нормальной сыворотки козы (Normal goat serum, Invitrogen, REF PCN 5000, Lot 757418A) для блокировки неспецифического окрашивания.

Наносили первые первичные антитела в рабочем разведении, инкубировали во влажной камере при температуре 25°С 60 мин, затем двукратно промывали в ФСБ с твином (рН=7,6). Наносили вторичные антитела, инкубировали во влажной камере при температуре 25°С 30 мин, после чего следовала промывка в ФСБ с твином (рН=7,6).

В случае двойного мечения наносили вторые первичные антитела в рабочем разведении, инкубировали во влажной камере при температуре 25°С 60 мин. После промывки в ФСБ с твином (рН=7,6) на образец ткани наносили вторичные антитела с отличной от использованного при первом мечении спектральной характеристикой связанного флюорофора и инкубировали во влажной камере при температуре 25°С 30 мин. Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7,6) - 2 раза по 5 мин.

Для визуализации ядер наносили DAPI (Biotium, Cat. N 40011, Lot 8D 0605), разведение 1:50, инкубировали 10 мин, после чего двукратно промывали в ФСБ с твином (рН=7,6) и заключали в Fluoromount (Diagnostic Biosystems, REF K.024, Lot P 939-B).

В качестве первичных антител использовали:

1) антитела к CD34 (ICO 115) mouse monoclonal IgG (Santa Cruz, Cat. N Sc-7324, Lot # С 0909), разведение 1:300;

2) антитела к CD45 (OX 30) mouse monoclonal IgG 2a (Santa Cruz, Cat. N Sc-53047, Lot #B 2409), разведение 1:300;

3) anti-OxPhos Complex IV subunit 1 monoclonal antibody (Invitrogen, Cat. N D 0589, Lot 459600), разведение 1:200;

4) pro-Caspase-3 rabbit monoclonal antibody IgG (Epitomics, Cat.N 1061-s Lot YF041501 ), разведение 1:500;

В качестве вторичных антител использовали:

1) AlexaFluor488 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11029, Lot 898236), разведение 1:300;

2) AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11031, Lot 822389), разведение 1:300;

3) AlexaFluor 568 goat anti-rabbit IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N A-11036 Lot 757102), разведение 1:300.

Визуализацию специфического свечения флюорохромных меток проводили на исследовательском микроскопе Nikon Eclipse 80i с приставкой для эпифлюоресценции DIH-M. В качестве фильтров для выделения требуемых диапазонов флюоресценции использовали Nikon DAPI (возбуждение 325 - 375 нм, дихроичное зеркало 400 LP, эмиссия 435 - 485 нм), Nikon В-2А (возбуждение 450 - 490 нм, дихроичное зеркало 505 LP,

эмиссия >515 нм), Nikon TRITC (возбуждение 528 - 553 нм, дихроичное зеркало 565 LP, эмиссия 590 - 650 нм). В качестве регистратора применяли камеру Nikon DS-Filc, подключенную к контроллеру Nikon DS-U2, с использованием программного обеспечения Nikon Elements. Сведение каналов выполняли в программе ImageJ (N1H, USA) с использованием плагина Stacks - Multi-D.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием критерия Стыодента. Различия считали значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ экспрессии маркеров дифферснцировки фибробластов при инфаркте миокарда. Среди умерших от грансмурального инфаркта миокарда преобладали мужчины (18 случаев). В 15 (50%) случаях возраст умерших был старше 65 лет (средний возраст — 63,7 года). Все случаи возникновения инфаркта миокарда распределены по группам: до 1 сут - 4 случая, 24 - 47 ч - 11 случаев, 2 - Зсут - 2 случая, 4-6 сут - 3 случая, 7-13 сут - 5 случаев, 2-3 нед - 2 случая, 3-4 недели - 1 случай, постинфарктный кардиосклероз - 1 случай.

Инфаркт миокарда давностью до 6 ч характеризовался неравномерным кровенаполнением сосудов, лейкостазами, контрактурными повреждениями и глыбчатым распадом миофибрилл в кардиомиоцитах, исчезновением поперечно-полосатой исчерченности. В сроки 6 - 23 ч присоединялся некроз кардиомиоцитов со слабой нейтрофильной инфильтрацией.

При давности инфаркта миокарда 24 - 47 ч морфологические изменения характеризовались некрозом кардиомиоцитов с полным и неполным кариолизисом, диффузной нейтрофильной инфильтрацией в зоне некроза.

Морфологические изменения при инфаркте миокарда давностью 2-3 сут характеризовались некрозом кардиомиоцитов, формированием лейкоцитарного вала на границе с неизмененным миокардом. При давности инфаркта миокарда 4-6 сут на границе некротизированного миокарда наряду с нейтрофильной, макрофагальной и лимфоцитарной инфильтрацией регистрировалась пролиферация фибробластов. Инфаркт миокарда давностью 7—13 сут характеризовался инфильтрацией лимфоцитами, плазматическими клетками, пролиферацией фибробластов, замещающих некротическую ткань.

Морфологические изменения при давности инфаркта миокарда 2-3 нед характеризовались замещением зоны некроза грануляционной тканью с созреванием сосудов синусоидального типа. Клеточная инфильтрация была представлена лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками. Через 3-4 нед зона некроза замещалась соединительной тканью со слабой инфильтрацией лимфоцитами, i-емосидерофагами. В соединительной ткани наблюдались пучки коллагеновых волокон; отмечался отек межклеточного пространства.

Динамику клеточных популяций в зоне инфаркта миокарда оценивали по экспрессия С034, СР45, ММР9, проколлагена (Со11А1).

Фенотип С034 ' характерен для клеток со слабой дифференциров-кой, плюрипотентных клеток и эндотелиоцитов кровеносных сосудов, С045+ - для клеток, имеющих костномозговое происхождение, в то же время фенотип С034+СЭ45+ отмечается у прогениторных клеток фибро-бластического ряда и предшественников кроветворных клеток. Так как предшественники мегакарио-, лейко-, лимфо- и эритроцитарных ростков локализуются в костном мозге и не попадают в периферический кровоток, то выявление клеток с таким фенотипом в зоне инфаркта означает миграцию прогениторных клеток, служащих в дальнейшем одним из пулов для пролиферации фибробластов в зоне повреждения.

При выявлении маркеров СЭ34 и СП45 установлено, что в зоне инфаркта миокарда СЭ45' -клетки появлялись с первых суток патологического процесса и регистрировались до 10-14 сут. В более поздние сроки (до 21 сут) выявлялись единичные положительно окрашенные клетки. С 034'-клетки в зоне инфаркта не выявлялись, соответственно, не регистрировались и клетки, несущие одновременно маркеры С034+ и СЕ)45Н.

ММР9 в высоких концентрациях присутствует в нейтрофилах. В нашем исследовании в ранние сроки (до 3 сут) в зоне ишемического повреждения во всех исследуемых группах регистрировались окрашенные положительно на ММР9 нейтрофилы. Причем при летальных исходах, развившихся в течение нескольких часов после инфаркта миокарда, регистрировались ярко окрашенные нейтрофилы в сосудах периинфарктной зоны, а также ярко окрашенные нейтрофилы в зоне инфаркта.

При давности инфаркта от 1 до 2 сут фиксировали дегрануляцию ней-трофилов, потерю окраски цитоплазмы нейтрофилов. Параллельно с этим было зафиксировано появление яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта, что отражает диффузию ММР9 из выделенных нейтро-филами гранул в ткани. В более поздние сроки (3 - 30 сут) появлялась специфическая окраска клеток в пограничной зоне, при этом ММР9+-клетки имели фенотипические признаки фибробластов. Наличие ММР9 в фибробластах связывают с необходимостью перестройки внеклеточного матрикса при образовании и созревании соединительной ткани. Максимальная выраженность окраски отмечена нами через 7-14 сут. После 30 сут специфическая окраска в зоне постинфарктного кардиосклероза не регистрировалась.

Таким образом, окрашивание на ММР9 в разные сроки после развития инфаркта миокарда отражает динамику цитолитического процесса и выход ММР9 в зону повреждения в ранние сроки патологического процесса. В ранние сроки основным источником ММР9 в зоне повреждения являются нейтрофилы, мигрирующие в очаг ишемического повреждения в нейтро-фильную фазу воспаления. В поздние сроки окраска на ММР9 в зоне инфаркта обусловлена формированием пула фиброкластов с функциональной

активностью, направленной на ремоделирование фибриллярных белков в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза. Максимальная окраска фиброкластов выявляется через 7 -14 сут. В дальнейшем происходит снижение активности данного процесса, вплоть до минимального уровня специфической окраски.

В связи с выраженной стадийностью применение окраски на ММР9 при инфаркте миокарда удобно использовать для определения давности возникновения инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании.

Для исследования синтетической активности фибробластов (продукции новых соединительнотканных волокон) изучена экспрессия прокол-лагена в зоне некроза и пограничных зонах.

Единичные клетки, экспрессирующие проколлаген IA1, в зоне инфаркта миокарда впервые выявлялись через 3 су г патологического процесса. Такая картина сохранялась до 4 - 6-х суток. Количество активно синтезирующих фибробластов нарастало к 7 - 13-м суткам, а с 14-х до 30-х суток сохранялось большое количество таких клеток в зоне формирования постинфарктного кардиосклероза, однако интенсивность окраски этих клеток несколько снижалась. Тем не менее, слабо выраженную положительную окраску удавалось выявлять в зоне постинфарктного кардиосклероза через 1 мес и более. Это свидетельствовало о сохраняющейся - пусть и незначительной - синтетической активности фибробластов в области постинфарктного кардиосклероза и о продолжающемся ремоделировании постинфарктной зоны.

При отсутствии циркулирующих клеток-предшественников эндоте-лиоцитов в зоне инфаркта миокарда нами исследована синтетическая функция резидентных клеток, принимающих участие в формировании новых сосуды из предсуществующих. Так как оценить синтез N0 в случае исследования патологоанатомического материала невозможно, то был выбран относительно стабильный белок эндотелии, синтезируемый эндотелием кровеносных сосудов и выполняющий роль регулятора кровотока путем активации ЕТа и ЕТЬ рецепторов. Эндотелиальные клетки увеличивают продукцию эндотелина в ответ на гипоксию, оксидированные формы липопротеидов низкой плотности, провоспалительные цитокины. Эффекгы эндотелина зависят от взаимодействующего с ним рецептора и особенностей их локализации. Рецепторы типа ЕТА расположены на мембранах гладкомышечных клеток сосудов, и их взаимодействие с лигандом вызывает развитие сокращений клеток, приводя в итоге к выраженному спазму сосудов. В противоположность этому рецепторы типа ЕТВ расположены на эндотелиоцитах, и их активация стимулирует повышение активности NO-синтазы.

В отсутствие в сосудах гладкомышечных клеток, имеющих доминирующие ЕТА рецепторы, выделяемый эндотелии связывается с ЕТВ рецепторами на эндотелиоцитах, что приводит к активации синтеза и экскреции NO и вазодилатации посткапиллярного русла.

Повышение синтеза эндотелина может быть важным патофизиологическим механизмом поддержания повышенного объемного кровотока в области роста грануляционной ткани и активного фибропластического процесса, а также поддерживать обеспечение контрактильной функции близлежащих кардиомиоцитов.

При инфаркте миокарда в первые сутки при окраске на эндотелии зарегистрирована контурированность сосудов в зоне некроза миокарда. В остальные сроки сохранялась окраска эдотелиоцитов, в основном в периинфарктной зоне. При этом максимальная интенсивность окраски отмечалась через 7-13 сут.

Совокупность этих факторов (особенностей строения сосудов в зоне репарации и специфичности эффектов эндотелина в зависимости от типа связываемых рецепторов) может служить механизмом обеспечения повышенных метаболических потребностей в зоне активного репаративного процесса.

Влияние факторов роста на фибробластическую фазу воспаления при экспериментальном инфаркте миокарда. Гак как нами не были выявлены плюрипотентные клстки-предшественники фибробластов и эндотелиоцитов при естественном течении инфаркта миокарда, то была поставлена задача изучить эти вопросы в отношении репаративного процесса при изменении концентрации факторов роста FGF2 и VEGF, что возможно только в условиях эксперимента.

Ранее было показано влияние измененных концентраций VEGF на процессы ремоделирования миокарда (Дремина H.H., 2008). Нами дополнительно изучены источники фибробластов в зоне формирования кардиосклероза, их синтетическая активность, соотношение с вазоэндоте-лиальным компонентом, а также эти особенности при изменении уровня основного фактора роста фибробластов. Для оценки динамики клеточных популяций в зоне ишемического повреждения при экспериментальном инфаркте миокарда и влиянии на этот процесс вазоэндотелиального и фибробластического факторов роста нами оценена экспрессия CD34, CD45, ММР9, проколлагена (Col 1А1).

У животных контрольной группы CD34+ и С045+-клетки в зоне ишемического повреждения впервые выявлялись через 1 сут после моделирования инфаркта миокарда. Причем если на 1-е и 3-й сутки CD344-клетки были немногочисленными, то CD4.V-клетки были единичными. Сочетание CD34+CD45+ обнаружить не удалось. На 7-е, 14-е и 30-е сутки регистрировалось небольшое число С034+-клеток, единичные CD45+-клетки выявлялись на 7-е и 14-е сутки.

При искусственном повышении уровня VEGF в периинфарктной зоне с 1-х по 14-е сутки выявлялось большое число клеток, несущих маркеры CD344 и CD454. Причем клетки, одновременно экспрессирующие оба маркера, выявлялись с 1-х по 14-е сутки с максимумом на 14-е сутки. При искусственном подавлении активности VEGF СЮ34+-клетки в зоне ишемического повреждения регистрировались с 1-х по 7-е сутки с макси-

мумом на 3-й сутки. СЭ45+-клетки были немногочисленными и выявлялись только на 3-й и 7-е сутки. Одновременного наличия обоих кластеров дифференцировки на клетках в очаге ишемического повреждения при его репарации у этой группы животных не выявлено.

Выявленные особенности источников клеток в зоне репаративной регенерации после ишемического повреждения миокарда свидетельствуют о том, что в обычных условиях практически все клетки имеют тканевый генез, а при активации пролиферативной активности происходит их частичная дедифференцировка. В условиях значительного повышения уровня ростовых факторов в участке репарации появляются клетки с фенотипом С034+СЭ45+, описанные в литературе как прогениторные клетки фибробластического ряда с достаточно низким уровнем дифференцировки (в зависимости от направления дифференцировки могут выступать в качестве предшественников тканей мезенхимального происхождения).

Для изучения влияния факторов роста на процессы дифференцировки фибробластов при экспериментальном инфаркте у крыс проводили исследование синтетической функции фибробластов в динамике процесса формирования постинфарктного рубца При этом оценивали активность синтеза компонентов межклеточного матрикса по уровню экспрессии проколлагена 1А1 и активацию дифференцировки в фиброкластическом направлении по наличию в цитоплазме клеток матриксных металлопротеиназ.

При изучении морфологической картины выявлено, что у животных фибробластическая фаза начиналась с 3-х суток, когда в зоне некроза формировалась грануляционная ткань. На 7-е сутки в зоне некроза происходило замещение некротизированных тканей молодой соединительной тканью. На 14 - 30-е сутки наблюдали созревание рубца. При этом интенсивность пролиферации фибробластов и сроки максимальной выраженности фибробластической фазы, а также трансформация активных фибробластов в фиброциты в группах значительно различались.

В большинстве групп максимальная численная плотность фибробластов (количес тво на единицу площади зоны инфаркта миокарда) приходилась на 7-е сутки. В контрольной группе она составила 202 [176 - 211 ] клетки на поле зрения. В группе УЕОР в этот срок она определена как 295 [249 - 340] клеток, достоверно превышая показатель группы контроля (р=0,0046). В фуппе антиУЕСР этот показатель также достоверно превышал данные контрольной группы - 306 [272 - 369] клеток (р=0,0025). В группе антиРОР при пиковой выраженности количества фибробластов на 7-е сутки имелась тенденция к снижению плотности фибробластов на единицу площади по сравнению с группой контроля (167 [151 - 215]) клеток, однако различия были недостоверными.

В группе РСР отмечено длительное сохранение в зоне репарации высокой плотности фибробластов - на 7-е и 14-е сутки, при этом если на 7-е сутки плотность не отличалась от показателей в контрольной группе - 205 [192 - 275] клеток, то сохранение высокой плотности и на 14-е

h02 hoe »12 П24 s03 s07 S14 530

-*- Group

CpoiffiJ antiVEGF

Рис. 1. Динамика плотности активных фибробластов в зоне репаративной регенерации при экспериментальном инфаркте миокарда.

сутки - 204,5 [179 - 246] приводило к достоверным отличиям от группы контроля в этот срок (95,5 [83,5 - 108J, р=0,00009).

Изменение концентрации VEGF существенно влияло на длительность обнаружения в зоне репарации высокой плотности активных фибробластов. Так, если в контрольной группе после пиковых значений на 7-е сутки в последующие сроки количество фибробластов значительно снижалось (на 14-е сутки - 95,5 183,5 - 108] клеток, на 30-е сутки — 80 [70,5 - 84] клеток), то в группе VEGF этот показатель превышал значения контрольной группы: на 14-е сутки-252,5 [220-282 клеток] (р=0,00009), на 30-е сутки - 132 [125 - 148 клеток] (р=0,00009). Аналогичная картина наблюдалась и в группе anTHVEGF: на 14-е сутки - 250,5 [233-260 клеток] (р=0,00009), на 30-е сутки - 195,5 [ 139 - 237 клеток] (р=0,00009) (рис. 1).

Для установления, какой из факторов роста в большей степени влияет на пролиферацию фибробластов в зоне репарации, нами было проведено сравнение групп VEGF и FGF2, aHTuVFXiF и anTHFGF между собой.

В нашем исследовании повышение VEGF в системном кровотоке в большей степени стимулировало рост фибробластов по сравнению с FGF2. Так, плотность фибробластов в зоне репарации в группе VEGF во все сроки наблюдения превышала значения в группе FGF2. Различия были достоверны на 7-е (295 [249 - 340] клеток в сравнении с 205 [192 - 275] клетками, р=0,0257) и 30-е сутки (132 [125 - 148] клетки в сравнении с 88 [81 — 122] клетками, р=0,0036).

Однако при снижении содержания факторов роста за счет введения антител, фибробластические клетки большую чувствительность демон-

стрировали к снижению уровня FGF2. Плотность фибробластов в зоне репарации в группе aHraVEGF во все сроки наблюдения достоверно превышала показатели группы aHraFGF: на 3-й сутки 299 [130-481] клеток и 132,5 [92 - 148] клетки, р=0,0257; на 7-е сутки - 306 [272 - 369] клеток и 167 [151 - 215] клеток, р= 0,0008; на 14-е сутки-250,5 [233-260] клеток и 131,5 [121 - 147] клетки, р=0,0002; на 30-е сутки - 195,5 [139 - 237] клетки и 88,5 [81 - 96] клеток, р= 0,0003.

Проанализировано влияние факторов роста на динамику трансформации фибробластов в фиброциты в зоне репарации. Так, в группе контроля, начиная с 14-х суток, в зоне репарации превалировали фиброциты. Применение как факторов роста, так и антител к ним нарушало трансформацию фибробластов в фиброциты, в результате чего до конца наблюдения в данных группах активные фибробласгы превалировали. При попарном сравнении с группой контроля во всех случаях зафиксирована достоверность отличий как на 14-е, так и на 30-е сутки наблюдения.

Наблюдаемые изменения в снижении количества фиброцитов могут быть объяснены тем, что механизмы выведения активных фибробластов через запуск апоптоза при нарушении естественного уровня стимуляции ростовыми факторами превалирует над трансформацией фибробластов в фиброциты. Свидетельством тому служит повышение в клетках уровня экспрессии каспазы 3, выявленное нами в случаях изменения концентраций ростовых факторов.

Синтетическую активность фибробластов, обеспечивающую образование внеклеточного матрикса вновь образуемой соединительной ткани, оценивали по экспрессии Col 1А1. У контрольных животных наблюдали положительную окраску клеток фибробластического ряда на 3-й и 7-е сутки. Применение антител к факторам роста снижало интенсивность окраски на Col 1А1.

В нашем исследовании в ранние сроки (до 3 сут) в зоне ишемического повреждения во всех исследуемых группах регистрировались окрашенные положительно на ММР9 нейтрофилы. В более поздние сроки отмечалась окраска клеток фибробластического ряда. Так, в контрольной группе с 3-х по 30-е сутки наблюдалась окраска единичных клеток фибробластического ряда.

При искусственном повышении уровня факторов роста положительные на ММР9 клетки фибробластического ряда также регистрировались с 3-х по 30-е сутки, однако их количество было значительно выше, чем в контрольной группе. При искусственном подавлении активности факторов роста удавалось зафиксировать лишь единичные положительно окрашенные на ММР9 клетки фибробластического ряда в зоне ишемического повреждения. Это свидетельствует о том, что при высокой активности факторов роста в начальные периоды после эпизода ишемического повреждения формируется программа репарации, при которой за счет длительного существования клеток соединительной ткани с достаточно высоким

уровнем экспрессии матриксных металлопротеиназ и коллагена длительно сохраняется высокая скорость ремоделирования формирующегося рубца.

Связь неоангиогенеза с динамикой фибробластов в условиях измененной концентрации факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда. По данным литературы, VEGF и FGF2 запускают процессы ремоделирования существующих сосудов и истинного ангио-генеза - формирования новых сосудов [Carmeliet Р., 2005].

При оценке количества эндотелиоцитов на единицу площади в зоне инфаркта миокарда установлено, что у животных контрольной группы в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда (от 2ч- 50,0 [43,0 - 54,0] клеток до 1 сут- 38,0 [29,0 - 43,0] клеток) наблюдалось снижение количества эндотелиоцитов в зоне инфаркта миокарда. К 3-м суткам с началом роста грануляционной ткани в зоне ишемического повреждения отмечалось увеличение количества эндотелиоцитов (124,5 [68,0 - 144,0] клеток). К 7-м суткам количество эндотелиоцитов в зоне некроза достигало максимума (167,5 [118,0- 185,0] клеток).

При искусственном повышении в крови концентрации основного фибробластического фактора роста динамика численной плотности эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения в сроки от 2 ч до 7 сут не отличалась от показателей контрольной группы. Однако на 14-е сутки в этой группе сохранялась высокая плотность эндотелиоцитов (151,5 [99,0 — 161,0] клеток), в то время как в контрольной группе к этому сроку плотность эндотелиоцитов снижалась (96,0 [93,5 -103,5] клеток, р=0.044). К 30-м суткам различия нивелировались.

При повышении уровня VEGF отмечена тенденция повышения выживаемости эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения. К 1-м суткам после начала эксперимента количество эндотелиоцитов на единицу площади в группе VEGF (65,5 [40,0 - 91,0] клеток) достоверно превышало показатели группы контроля (38,0 [29,0-43,0] клеток) (р=0.0099). Кроме того, как и при повышении уровня FGF2, на 14-е сутки в этой группе сохранялась высокая численная плотность эндотелиоцитов.

При искусственном снижении уровня FGF2 за счет введения блокирующих антител резко снижалась выживаемость эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда по сравнению с группой контроля. Так, через сутки после моделирования патологического процесса плотность эндотелиоцитов в зоне некроза (7,5 [1,0 - 22,0] клеток) была в 5 раз ниже, чем в группе контроля (38,0 [29,0-43,0] клеток, р=0.0017). Эта же тенденция отмечена на 3-й и 7-е сутки. На 14-е и 30-е сутки численная плотность эндотелиоцитов в зоне ишемического повреждения не отличалась от показателей контрольной группы.

Искусственное снижение уровня VEGF приводило к достоверному снижению количества эндотелиоцитов на 3-й (51,0 [41,0 - 62,0] клеток по сравнению с 124,5 [68,0 - 144,0] клетками в контрольной группе, р=

Рис. 2. Динамика плотности эндотелиоцитов в зоне репаративной регенерации при экспериментальном инфаркте миокарда.

0.0012) и 7-е сутки патологического процесса (61,5 [51,0 - 83,0] клеток по сравнению с 167,5 [118,0 - 185,0] клетками в контрольной группе, р=0.00004). Пик численной плотности эндотелиоцитов приходился на 14-е сутки (129,0 [83,0 - 139,0] клеток), недостоверно превышая в этот срок показатели контрольной группы. Однако на конечную точку наблюдения данный показатель у животных группы aHTHVBGF был достоверно ниже, чем в группе контроля (57,0 [42,0-92,0] клеток и 96,5 [90,0 - 104,0] клеток соответственно, р= 0.044) (рис. 2).

При исследовании взаимосвязи роста сосудов в очаге репарации при инфаркте миокарда в контрольной группе не выявлено достоверной корреляции между количеством эндотелиоцитов, отражающим активность ангиогенеза, и показателями динамики клеток фибробластического ряда. Однако в случае изменения концентрации факторов роста наблюдалась статистически достоверная связь этих показателей. При этом выявленные зависимости носили неоднозначный характер. В группах FGF2 и VEGF наблюдалась закономерная положительная сильная корреляционная связь между количеством фибробластов и эндотелиоцитов. При введении антител к VEGF не выявлено достоверных зависимостей. Но определялась сильная корреляция количества эндотелиоцитов и фибробластов в группе анти-FGF. Это можно объяснить тем, что на 3-й сутки заканчивается отрицательная динамика эндотелиоцитов, вызванная снижением выживаемости клеток в условиях гипоксии при отсутствии фактора роста, и идет параллельная пролиферация сосудистого и соединительнотканного компонентов.

Учитывая полученные нами данные о характере экспрессии эндо-телина при инфаркте миокарда у людей, а также данные литературы о таких эффектах эндотелина, как регуляция роста и выживаемости самих синтезирующих эти пептиды эндотелиоцитов и окружающих их клеток, нами исследована продукция эндотелинов при экспериментальном инфаркте миокарда.

Выявлено, что у животных контрольной группы наблюдалась нежная окраска на эндотелии в зоне инфаркта миокарда и периинфарктной зоне, начиная с 1-х суток после моделирования патологического процесса. Пик окраски наблюдался на 3-й сутки, когда выявлялась хорошо регистрируемая окраска в области грануляций. К 7-м суткам интенсивность окраски значительно снижалась, в этот срок отмечалась подчеркнутость сосудов в периинфарктной и инфарктной зонах. В более поздние сроки специфическая окраска не регистрировалась. В «интактной» зоне миокарда специфическая окраска не регистрировалась в течение всего периода наблюдения.

Применение факторов роста резко усиливало окраску периинфарктной и инфарктной зон уже через 1 сут после моделирования инфаркта миокарда. К 3-м суткам интенсивность окраски резко нарастала, затем медленно снижалась и регистрировалась до 14-х суток. Причем в группе УЕвР в сроки 1 и 3 сут регистрировалась окраска сосудов в «интактном» миокарде.

Применение антител к факторам роста снижало интенсивность окраски инфарктной и периинфарктной зон в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда (с 1-х по 3-й сутки), особенно это было характерно для животных группы анти-УЕСР. К 7-м суткам интенсивность окраски резко нарастала, достигая максимума, а к 14-м суткам вновь снижалась. Причем у животных группы анти-УЕйР зафиксирована окраска сосудов в зоне «интактного» миокарда.

Изменение динамики выработки эндотелина в ответ на введение факторов роста свидетельствует о сдвиге и повышении экспрессии этого рс1улятора на более ранние этапы репарации миокарда после факта его ишемического повреждения. Это можно объяснить, с одной стороны, большей сохранностью клеток в зоне ишемического повреждения при высоких концентрациях ростовых факторов, способностью их к ответу на стимуляцию в условиях гипоксии, а с другой стороны - повышением готовности генного аппарата клеток к ответу на стимулы, активирующие транскрипцию генов в ответ на экстрацеллюлярные сигналы. С учетом эффекта взаимодействия данного лиганда с ЕТВ-рецепторами эндоте-лиальных клеток, приводящего к вазодилатации, выявленная динамика свидетельствует об увеличении объемного кровотока в зоне повреждения и прилежащих к ней областях миокарда.

Влияние факторов роста на уровень окислительного фосфори-лирования при экспериментальном инфаркте миокарда. Для оценки сохранности и уровня окислительного фосфорилирования нами методом иммунофлюоресценции исследована морфологическая картина распреде-

ления комплекса OxPhos в динамике процесса репаративной регенерации после экспериментального инфаркта миокарда

Окраска на OxPhos Complex IV subunit I выявила изменение распределения окраски в зоне ишемического повреждения по сравнению с зоной «интактного» миокарда. У животных контрольной группы уже через 2 ч после моделирования инфаркта миокарда наблюдалась неравномерность окраски в зоне инфаркта миокарда Вследствие ишемии в кардиомиоцитах происходило формирование участков с неравномерным распределением выявляемого в данной окраске цитохрома с, локализующегося в митохондриях. С 1 -х суток наблюдались неравномерность окраски кардиомиоцитов периинфарктпой зоны и отсутствие окраски в зоне инфаркта миокарда, свидетельствующие о резком уменьшении содержания ферментов, обеспечивающих окислительно-восстановительные реакции. Неравномерность окраски сохранялась до 14-х суток наблюдения.

В то же время в группе VEGF, начиная с 2 ч после моделирования инфаркта миокарда и в дальнейшие сроки наблюдения, зарегистрирована «глыбчатость» окраски в зоне ишемического повреждения. Ее интенсивность достигала максимума к 7-м суткам. Неравномерность и «глыбчатость» окраски сохранялись в последующие сроки наблюдения.

Выявленные особенности косвенно подтверждают предположение о влиянии связанной с концен трацией факторов роста экспрессии эндоте-лина на метаболическое обеспечение миокарда. Неравномерность распределения выявляемого цитохрома с, вероятно, связана с изменением условий функционирования и перестройкой структуры клеток.

ВЫВОДЫ

1. Повышение в крови уровня фактора роста эндотелия сосудов и основного фактора роста фибробластов обусловливает миграцию в очаг поражения гематогенных клеток-предшественников фибробластов с фенотипом CD34+CD45+, которые в качестве источников пластического материала способствуют репарации зоны инфаркта миокарда. При экспериментальном инфаркте миокарда максимальная миграция костномозговых клеток отмечается 14-м суткам. Повышение уровня фактора роста эндотелия сосудов стимулирует дифференцировку фибробластов в направлении фиброкластов. Дифференцировка в неактивные фиброциты нарушается как при уменьшении, так и при увеличении уровня факторов роста фибробластов и эндотелия сосудов, при этом активные клетки подвергаются каспаз-зависимому апоптозу.

2. Выраженность неоангиогенеза в зоне репарации миокарда при ишемическом повреждении коррелирует с количественными характеристиками пула клеток фибробластического ряда, однако при снижении выживаемости эндотелиоцитов и их медленном росте в условиях недостаточности VEGF нарастание пула фибробластов не нарушается.

3. При инфаркте миокарда у людей в эндотелиоцитах в зоне формирующегося рубца активируется экспрессия эндотелина с максимальной интенсивностью в периинфарктной зоне на 7 -13-е сутки. При естественном течении экспериментального инфаркта миокарда у крыс выработка эндотелина в зоне репарации активируется с 3-х суток. Увеличение концентрации факторов роста значительно усиливает экспрессию эндотелина в периинфарктной и инфарктной зонах уже через 1 сут после моделирования инфаркта миокарда с максимумом на 3-й сутки. Снижение стимуляции клеток факторами роста при использовании антител, особенно к VEGF, снижает продукцию эндотелина клетками вновь образующихся сосудов и смещает максимум экспрессии эндотелина к 7-м суткам.

4. Уровень факторов роста определяет активность перестройки соединительнотканного каркаса в зоне формирования рубца при инфаркте миокарда. Повышение концентрации FGF2 и VEGF способствует увеличению числа фиброкластов и повышению экспрессии ММР9 (с 3-х по 30-с сутки). Снижение концентрации FGF2 и VEGF способствует подавлению дифференцировки фибробластов в фиброкласты.

5. При естественном течении процесса репарации миокарда после инфаркта миокарда у людей экспрессия проколлагена в очаге формирования рубца регистрируется с 3-х суток, достигая максимума к 7 - 13-м суткам и в незначительной степени регистрируется в период постинфарктного кардиосклероза, свидетельствуя о продолжающемся ремоделировании постин-фаркгной зоны. Снижение уровня факторов роста при экспериментальном инфаркте миокарда приводит к уменьшению экспрессии проколлагена 1А1.

6. В ранние сроки (до 3 сут) постинфарктного ремоделирования миокарда ММР9-позитивные нейтрофилы присутствуют в зоне ишемического повреждения. В поздние сроки (7-14 сут) в зоне инфаркта происходит формирование пула ММР9-позитивных фиброкластов с функциональной активностью, направленной на ремоделирование фибриллярных белков в зоне постинфарктного кардиосклероза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Каня О.В. Факторы роста как индукторы ангиогенеза// Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М.Кожова: Тезисы докл. между нар. научн. конф. - Иркутск, 2010. - С. 347.

2. Shuiygin M.G., Shurygina I.A., DreminaN.N., KanyaO.V. Regulatory cffects of fibroblast and vasoendothelial growth factors in experimental myo-cardial infarction // International Conférence on Bioinformatics of Genome Régulation and Structure/Systems Biology (BGRS/SB-2010) in Novosibirsk, Russia, 20-27 June 2010. - http://conf.nsc.ru/files/conferences/BGRSSB2010/ abstracts/6532/6533/Shurygin Jgf_NSC_2010.doc

3. Шурыгин М.Г., ШурыгинаИ.А., Каня О.В. Динамика плотности рецепторов к фактору роста фибробластов при экспериментальном инфаркте миокарда // Сибирский медицинский журнал. - 2010. - № 2. - С. 20-22.

4. Shurygin M.G., Shurygina I.A., Dremina N.N., Kanya O.V. Cardioprotective effect of vasoendothelial growth factor at myocardial infarction // OZBI02010 combined conferences. - Melbourne, 2010. - P. 219.

5. Shurygin M.G., Dremina N.N., Shurygina J.A., Kanya O.V. Modulation of postinfarction cardiosclerosis by changes of FGF2 and VEGF level in early stages of myocardial infarction // Asian Congress on Biotechnology. - Shanghai, 2011.-P. 238.

6. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г., Аюшинова Н.И., Каня О.В. Фи-бробласты и их роль в развитии соединительной ткани // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2012. - Т. 110, № 3. - С. 8-12.

7. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Экспрессия эндотелина при экспериментальном инфаркте миокарда в условиях измененной концентрации фибробластического и вазоэндотелиального факторов роста // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2013. - № 1 (89). - С. 125-129.

8. Шурыгин М.Г., Шурыгина И. А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Матрикс-ная мегаллопротеаза 9 и ремодслирование при инфаркте миокарда// Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. — 2013. — № 2-1 (90).-С. 138-141.

9. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Прекон-диционирование как защита от ишемического повреждения миокарда // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2013. - № 2-2 (90). - С. 206-210.

10. Шурыгин М.Г., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Каня О.В. Ангио-генез как адаптивный механизм при ишемии // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2013. - № 5 (93). - С. 192-195.

11. Шурыгина И.А., Шурыгин М.Г., Дремина Н.Н., Каня О.В. Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда // Патент RU 2518333; Заявка № 2012152730 от 06 декабря 2012 г.; опубл. 10.06.2014 Бюл. № 16.

Подписано в печать 10.10.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. иеч. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ № 21._

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

Соискатель

О.В.Каня

.U-1 33 8 5

20

4168218

2014158218