Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль эндотелиальной нитроксидсинтазы и магнийкальциевого баланса в формировании экспериментальных язв желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

0420145^30

ПОВЕТКИНА ВИКТОРИЯ НИКОЛАЕВНА

РОЛЬ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ НИТРОКСИДСИНТАЗЫ И МАГНИЙ-КАЛЬЦИЕВОГО БАЛАНСА В ФОРМИРОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЯЗВ ЖЕЛУДКА У СТРЕССУСТОЙЧИВЫХ

И СТРЕССНЕУСТОЙЧИВЫХ КРЫС

14.03.03 - патологическая физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: профессор, доктор медицинских наук, Л.Н. Рогова

Волгоград - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДК - двенадцатиперстная кишка

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

МСЛК - магнийсодержащая лекарственная композиция

ОКЛП - общий кишечный лимфатический проток

ОЯ - острая язва

ПО - подслизистая основа

СГДЯ - симптоматическая гастродуоденальная язва

СОЖ - слизистая оболочка желудка

ЭАЯ - экспериментальная ацетатная язва

ЯБ - язвенная болезнь

еМЭБ - эндотелиальная нитроксидсинтаза

N0 - оксид азота

Ур - портальная вена

Уб - подключичная вена

М§2+ - ионы магния

Са2+ - ионы кальция

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................12

1.1. Современные представления о механизмах формирования эрозивно-язвенных дефектов тканей ЖКТ........................................................12

1.2. Влияние оксида азота и эндотелиальной нитроксидсинтазы на механизмы формирования и развития эрозивно-язвенных дефектов ЖКТ...........................................................................................20

1.3. Магниевый и кальциевый гомеостаз, их регуляция и роль в патологии ЖКТ........................................................................................................................29

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............49

2.1. Характеристика этапов исследования и экспериментальных серий.......49

2.2. Метод моделирования экспериментальной ацетатной язвы и получения образцов биологического материала у крыс..........................................58

2.3. Метод оценки морфологических признаков.....................................59

2.4. Метод определения удельного числа еМЭБ -позитивных клеток в тканях желудка.......................................................................................59

2.5. Метод определения содержания магния в биологических средах.........60

2.6. Метод определения кальция в биологических жидкостях...................61

2.7. Методика применения магнийсодержащей лекарственной композиции на основе полиминерала бишофит у крыс с экспериментальной язвой желудка.......................................................................................62

2.8. Методы статистической обработки...............................................62

ГЛАВА 3. ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ НИТРОКСИДСИНТАЗЫ, СОДЕРЖАНИЕ МАГНИЯ И КАЛЬЦИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЯЗВ ЖЕЛУДКА У СТРЕССУСТОЙЧИВЫХ И СТРЕССНЕУСТОЙЧИВЫХ КРЫ......................................................64

3.1. Морофлогические изменения в тканях при экспериментальных эрозивно-язвенных дефектах желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс............................................................................................65

3.2. Экспрессия эндотелиальной нитроксидсинтазы в тканях эрозивно-язвенного дефекта при экспериментальных язвах желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс.....................................69

3.3. Магниевый и кальциевый баланс в условиях формирования эрозивно-язвенных дефектов желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс...........................................................................................77

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ МАГНИЙСОДЕРЖАЩЕЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ НА МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЯЗВ ЖЕЛУДКА У СТРЕССУСТОЙЧИВЫХ И СТРЕССНЕУСТОЙЧИВЫХ КРЫС...................................................96

4.1. Влияние магнийсодержащей лекарственной композиции на морфологические показатели и экспрессию эндотелиальной нитроксидсинтазы в тканях зоны эрозивно-язвенного дефекта и его площадь у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс...................................96

4.2. Влияние магнийсодержащей лекарственной композиции на магниевый и кальциевый баланс при экспериментальных эрозивно-язвенных повреждениях тканей желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых

крыс................................................................................................................105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................116

ВЫВОДЫ..................................................................................128

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................130

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................131

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ

Язвенная болезнь (ЯБ) желудка является широко распространенным хроническим рецидивирующим заболеванием, которое встречается у человека и практически у всех видов животных и опасно развитием осложнений, угрожающих жизни больного (Окороков А.Н., 2002; Антюнян В.В., 2008; Бредихина Н.А., 2008; Казимирова А.А. с соавт. 2010).

По статистическим данным язвенная болезнь распространена среди 5 -15% взрослого населения разных стран мира (в среднем от 7 до 10%) (Ивашкин В.Т.с соавт., 2004). В Германии, Великобритании, США ЯБ встречается у каждого десятого жителя, в Японии - каждого пятого, в Индии - каждого четвертого. В России зарегистрировано более 1,5 миллионов человек с диагнозом «язвенная болезнь» (Окороков А.Н., 2002; Ивашкин В.Т., 2006; Бредихина Н.А., 2008). При этом у жителей больших городов ЯБ встречается чаще, чем среди населения сельской местности (Окороков А.Н., 2002; Бредихина Н.А., 2008).

Общеизвестно, что язвенный дефект в слизистой оболочке развивается при нарушении баланса между факторами кислотно-пептической агрессии желудочного содержимого и протекторными свойствами слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, при этом Helicobacter pylori является ведущим этиологическим фактором (Окороков А.Н., 2002; Ивашкин В.Т., 2006; Циммерман Я.С., 2013; Couturier M. R.et al., 2006).

Помимо Helicobacter pylori в современной концепции патогенеза язвенной болезни желудка большое значение отводится состоянию регионарного кровотока, определяющего в значительной мере течение репаративных процессов (Маев И.В. с соавт., 2007).

В последние годы получено множество данных, доказывающих участие оксида азота (N0) в гастропротекции через улучшение кровоснабжения тканей желудка, так как к первому, реально установленному общему эффекту

N0 на функции органов относится релаксация кровеносных сосудов (Ивашкин В. Т., 2011).

Образование оксида азота может регулироваться через изменение активности или экспрессии фермента эндотелиальной нитроксидсинтазы (eNOS) (Кравченко H.A. с соавт., 2008).

Таким образом, способность тканей ЖКТ экспрессировать эндотелиальную нитроксидсинтазу как регулятора местного кровотока должна определять локальную резистентность тканей гастродуоденальной зоны и влиять на интенсивность и эффективность течения обменных и репаративных процессов в них.

Однако, eNOS может играть двоякую роль. С одной стороны, являясь источником NO как вазодилятатора и фактора резистентности, эндотелиальная нитроксидсинтаза при чрезмерной ее активации может становиться источником свободнорадикального повреждения тканей ЖКТ (Реутов В.П., 2000; Чеснокова Н.П. с соавт., 2006; Pacher P.A. et al., 2007).

Согласно современным представлениям eNOS обеспечивает постоянное образование оксида азота (Манухина Е.Б.с соавт., 2003; Жлоба A.A., 2006; Кравченко Н.А.с соавт., 2008; Ивашкин В. Т.с соавт., 2011).

Анализ литературных данных показывает, что до настоящего времени активно изучаются механизмы активации и инактивации эндотелиальной нитроксидсинтазы (Манухина Е.Б. с соавт., 2003; Жлоба A.A., 2006; Кравченко H.A. с соавт., 2008; Iwase К. et al., 2002; Davis М.Е. et al., 2003; Cattaruzza M. et al., 2004).

В современной литературе достаточно широко представлена информация об активности оксида азота и его влиянии на сосудистый тонус (Реутов В.П., 2000; Манухина Е.Б.с соавт., 2003; Ивашкин В. Т.с соавт., 2011; Motavkin P.A., 2004; Vallance Р. et al., 2004), однако локальные механизмы экспрессии eNOS в тканях зоны повреждения при формировании различных язвенных дефектов изучены явно недостаточно.

Известно, что еМЭБ является Са-зависимым ферментом, при этом роль магния как функционального антагониста кальция с одной стороны, и активатора более чем 300 ферментов, создающего более оптимальные условия для активации изучаемого фермента, с другой стороны все еще не достаточно изучены (Громова О.А. с соавт., 2010; Rayssiguier У. ^ а1., 2010; БЬес^ег М., 2010; НафЫауп Ь.8. а а1., 2010).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Установить закономерности нарушения экспрессии эндотелиальной нитроксидсинтазы в тканях желудка, магний-кальциевого баланса и их роль в механизмах формирования экспериментальных язв желудка, разработать способы коррекции развившихся нарушений у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить удельное число и интенсивность экспрессии е№Э8-позитивных клеток в тканях зоны изъязвления на фоне завершения формирования экспериментальной стрессовой и ацетатной язв желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс. Оценить корреляционные связи между удельным числом е!ЧО 8-позитивных клеток и интенсивностью ее экспрессии в тканях желудка и площадью язвенного дефекта.

2. Выявить особенности экспрессии эндотелиальной нитроксидсинтазы в тканях желудка и магниевого баланса у животных с ацетатной язвой, формирующейся на фоне острого стресса.

3. Выявить уровень магния и кальция в биологических средах на фоне сформировавшихся экспериментальной стрессовой, ацетатной язв желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых животных.

4. Оценить влияние магнийсодержащей лекарственной композиции на удельное число еМ08-позитивных клеток и интенсивность ее экспрессии в тканях эрозивно-язвенного дефекта разного генеза, морфологические показатели в зоне эрозивно-язвенного дефекта, содержание магния и кальция в крови, лимфе и моче у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые определено удельное число еЖЭБ-позитивных клеток и интенсивность экспрессии е!Ч08 в тканях зоны эрозивно-язвенного дефекта при различных экспериментальных моделях язвы желудка.

Показаны особенности экспрессии эндотелиальной нитроксидсинтазы у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс.

Выявлены особенности формирования ацетатной язвы после воздействия острого стресса.

Установлена зависимость между удельным числом клеток, экспрессирующих еМЭБ, площадью язвенного дефекта и уровнем внутриэритроцитарного магния. У стрессустойчивых животных со стрессовой и ацетатной язвой, сформировавшейся после воздействия острого стресса, выявлены положительные корреляционные связи между площадью язв и удельным числом клеток, позитивных к эндотелиальной нитроксидсинтазе в слизистой оболочке желудка (СОЖ). При этом удельное число еЖ) 8-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка зависит от концентрации внутриклеточного магния при всех моделях экспериментальных язвенных дефектов.

В подгруппе стресснеустойчивых крыс определены положительные корреляционные отношения между удельным числом е!Ч08-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка и площадью ацетатной и стрессовой язв. При этом удельное число клеток, позитивных к еЖ)8, зависит от уровня внутриэритроцитарного магния при всех экспериментальных моделях язв.

Магнийсодержащая лекарственная композиция (МСЛК) вызывает увеличение числа и интенсивности экспрессии еМОБ в слизистой оболочке желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс и в подслизистой основе у стрессустойчивых животных при ацетатной язве желудка.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Получены новые сведения о роли эндотелиальной нитроксидсинтазы в механизмах формирования экспериментального язвенного дефекта разного генеза у стрессустойчивых и стресснеустойчивых индивидуумов.

Показана целесообразность применения магнийсодержащей лекарственной композиции для коррекции механизмов формирования язвенных дефектов желудка: применение МСЛК вызывает значительное уменьшение площади язвы на фоне увеличения числа еЖЖ-позитивных клеток и интенсивности экспрессии е1Ч08 в слизистой оболочке поврежденных тканей желудка, а у стрессустойчивых крыс - и в подслизистой основе.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

При стрессовой и ацетатной язве, сформировавшейся после воздействия острого стресса, у стрессустойчивых животных размер язвенного дефекта коррелирует с удельным числом еМ08-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка, которое, в свою очередь, зависит от уровня внутриэритроцитарного магния при всех видах экспериментальных язв.

У стресснеустойчивых крыс при ацетатной язве и стрессовом эрозивно-язвенном дефекте удельное число еМЭ8-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка коррелирует с площадью язвы и содержанием внутриклеточного магния.

При воздействии стресса в тканях желудка у стрессустойчивых крыс снижается удельное число клеток, экспрессирующих €N08 в слизистой оболочке желудка, но возрастает их число в подслизистой основе. У стресснеустойчивых животных под влиянием острого стресса наблюдаются снижение удельного числа €N08-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка и тенденция к снижению в подслизистой основе.

При ацетатной язве и ацетатной язве, сформировавшейся после воздействия острого стресса, у стрессустойчивых крыс возрастает удельное число еМО 8-позитивных клеток в слизистой оболочке желудка; при этом в

под слизистой основе их число остается неизменным или сниженным. У стресснеустойчивых животных в этих же экспериментальных сериях удельное число еЖ)8-позитивных клеток СОЖ остается неизменным либо отмечается тенденция к их снижению и в подслизистой основе - уменьшение числа клеток, позитивных к е>Ю8 до следовых величин.

На фоне применения МСЛК у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс отмечается уменьшение площади язвенного дефекта, сочетающееся с увеличением активности изучаемого фермента в слизистой оболочке желудка в обеих группах животных, а у стрессустойчивых животных - также и в подслизистой основе.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы представлены на IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009); на региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2009); на региональной научно-практической конференции профессорско-преподавательского коллектива ВолгГМУ (Волгоград, 2009); на научно-практической конференции, посвященной памяти члена-корреспондента РАМН, заслуженного деятеля науки РФ, д.м.н., профессора В.Б.Писарева (Волгоград, 2010); в материалах 7-й Научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2010); на межгородской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2010, 2011); на VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011); на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); на XI съезде хирургов Российской Федерации (Волгоград, 2011); на открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2009, 2010, 2011, 2012); в материалах

Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург -Гастро-2011»и «Санкт-Петербург - Гастро-2012»; в материалах международной медико-практической конференции «Моёегт уутогепозй Уеёу-2013» и «Efektivní Шейху е МоёегшсЬ Уёё-2013» (Прага, 2013); на XXII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертационного исследования было опубликовано 24 работы, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Внедрены результаты научного исследования «Роль эндотелиальной нитроксидсинтазы и магний-кальциевого баланса в формировании экспериментальных язв желудка у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс» в лекционный и практический курсы по дисциплине «Патологическая физиология» кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО Волгоградский ГМУ Минздрава России; в лекционный и практический курсы по дисциплине «Пропедевтика внутренних болезней» кафедры пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО Волгоградский ГМУ Минздрава России; в лекционный и практический курсы по дисциплине «Физиология человека» кафедры анатомии и физиологии ФГБОУ ВПО Волгоградская ГАФК.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 43 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического указателя, включающего в себя 213 источника литературы, в том числе 127 отечественных и 86 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУР�