Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:РОЛЬ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ ПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОАПОПТОТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА НА ЛИМФОЦИТЫ КРОВИ

На правах рукописи

БИКТАСОВА

Ассль Кинжибулатовна

РОЛЬ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ ПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В

РЕАЛИЗАЦИИ ПРОАПОПТОТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА НА ЛИМФОЦИТЫ КРОВИ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2010

003492935

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Томск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Рязанцева Наталья Владимировна

доктор медицинских наук Жукова Оксана Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор

доктор медицинских наук

Сафронов Игорь Дмитриевич Потапов Алексей Валерьевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН (Новосибирск)

Защита состоится «{(■)» марта 2010 г. в Ш часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан </0>.фсвраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

д. б. н. ' Пальчикова Н.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Патогенез многочисленных заболеваний человека (иммунопатологические состояния, злокачественные новообразования, хронические инфекционные процессы и др.) тесно связан с нарушением клеточной гибели. Одной из ведущих причин дизрегуляции танатогенной программы клеток является изменение продукции клетками и/или модуляция биологических эффектов фактора некроза опухолей альфа (tumor necrosis factor a, TNFa) (Bazzoni F., Beutler В., 1996; Aggarwal B.B., 2000; Locksley R.M. et al., 2001; Joussen A.M. et al., 2009). В физиологических условиях TNFa участвует в эмбриогенезе, развитии разнообразных тканей, при патологии - играет ведущую роль в формировании воспалительных реакций и специфического иммунного ответа (Ройт А., 2000; MacEwan D.J., 2002; Хаитов P.M., 2006; Кулинский В.И., 2007). Действие TNFa на клетки-мишени осуществляется за счет связывания со своими высокоаффинными рецепторами, расположенными на плазматической мембране, что ведет к интрацеллюлярным реакциям, находящим свое отражение в изменении их функционального статуса, в том числе и посредством инициации клеточной гибели (MacEwan D.J., 2002; Gupta S. et al., 2005).

К настоящему времени выявлена способность TNFa инициировать как апоптотическую гибель клеток, опосредованную повышенной секрецией данного цитокина при воспалительных заболеваниях аутоиммунного и инфекционного генеза, так и некроз клеток паренхиматозных органов в условиях гиперпродукции TNFa при септических состояниях. При этом характер и интенсивность процесса гибели клеток определяется количеством воздействующего на них TNFa, что дает основание предположить дозозависимость влияния цитокина на реализацию танатогенной программы. (Faraco P.R. et al., 1999; Van den Berg W.B., 2001; Van Amersfoort E.S. et al., 2003; Lin Y. et al., 2004; Temkin V. et al., 2006; He S. et al., 2009). Однако экспериментальные факты, свидетельствующие в пользу указанного предположения, немногочисленны, что обуславливает целесообразность изучения действия различных концентраций рекомбинантного TNFa на инициацию того или иного вида TNFa-опосредованной клеточной гибели.

Накопленные к настоящему времени сведения о TNFa-зависимых механизмах запуска летальной программы достаточно детально, по сравнению с другими видами цитокиноопосредованного апоптоза, описывают события, происходящие в клетке при реализации TNFa-индуцированной апототической гибели. Однако вследствие использования исследователями разных клеточных моделей и экспериментальных условий возникают серьезные трудности в интеграции многочисленных разрозненных фактических результатов, касающихся указанной проблемы (Webster G.A., Perkins N.D., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003; Liu В. et al., 2008). Особенно остро данный вопрос стоит в отношении механизмов

мобилизации заключенных в межмембранном митохондриальном пространстве апоптогенных факторов, находящейся под контролем белков семейства Bcl-2 (Jiang P. et а!., 2006; Chen X. et al., 2007).

Образование и/или деградация анти- и проапоптотических членов семейства протеинов Bcl-2 регулируется транскрипционными факторами, в том числе NF-kB и Р53. Вовлеченность NF-kB и Р53, а также представителей семейства белков Bcl-2 в реализацию TNFa-индуцированной апоптотической гибели не вызывает сомнений. Однако отсутствие единой точки зрения о характере заинтересованности данных регуляторных молекул в TNFa-опосредованный апоптоз делает целесообразным проведение комплексного исследования указанных протеинов при действии на клетки рекомбинантного цитокина и при патологии, сопровождающейся повышенной продукцией лимфоцитами TNFa. Полученные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции патологических процессов и состояний, характеризующихся изменением продукции и рецепции TNFa, а также модуляцией его внутриклеточной сигналпередающей системы.

Цель исследования: установить роль белков-регуляторов программированной клеточной гибели (белки семейства Bcl-2 и факторы транскрипции) в регуляции апоптоза лимфоцитов крови при действии фактора некроза опухолей альфа.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Установить дозозависимость влияния фактора некроза опухолей альфа на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови in vitro.

2. Оценить причастность митохондриального пути (количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, внутриклеточный уровень активных форм кислорода) в регуляции апоптоза лимфоцитов крови, индуцированного фактором некроза опухолей альфа.

3. Определить содержание белков-регуляторов клеточной гибели

циклинзависимых киназ rzi f1/cip') протеины семейства Bcl-2) в лимфоцитах крови, полученных у здоровых доноров, при действии рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа и у пациентов с острым клещевым энцефалитом, характеризующимся измененной продукцией фактора некроза опухолей альфа.

4. Выявить общие закономерности и особенности влияния фактора некроза опухолей альфа на апоптоз лимфоцитов крови в условиях in vitro и при остром клещевом энцефалите.

Научная новизна. Впервые в условиях in vitro установлено, что рекомбинантный TNFa человека дозозависимо влияет на реализацию апоптотической и некротической гибели лимфоцитов крови. Получены новые данные о регулирующей роли транскрипционных факторов NF-kB и Р53, а также о характере изменения баланса белков семейства Bcl-2 при

(транскрипционные

NF-kB и Р53, ингибитор

реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток, индуцированного TNFa. Установлено, что при инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита, на фоне повышенного образования TNFa апоптоз лимфоцитов крови реализуется при участии митохондрий, активных форм кислорода и сопряжен с активацией транскрипционных факторов, а также с нарушением соотношения про- и антиапоптотических Bcl-2-белков. Установлено, что дизрегуляция апоптоза лимфоцитов крови как при действии рекомбинантного TNFa in vitro в дозе 0,050 нг/мл, так и при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией данного цитокина, обусловлена запуском однотипных молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе проведенного исследования фактические данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы участия транскрипционных факторов (NF-kB и Р53) и белков семейства Вс1-2 в TNFa-опосредованной регуляции программированной гибели лимфоцитов в условиях in vitro с применением рекомбинантной формы цитокина. Установлена роль данных участников внутриклеточного сигналинга в дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток при инфекционной патологии, сопровождающейся повышенной продукцией TNFa. Результаты настоящего исследования в дальнейшем могут способствовать раскрытию механизмов побочных эффектов анти-ТОТа-направленной терапии, а также послужить основой для разработки новых технологий коррекции нарушений программы клеточной гибели при заболеваниях, характеризующихся изменением продукции данного цитокина.

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (разделы «Основы цитофизиологии; старение, гибель клетки, взаимодействие клетки с окружающей средой», «Инфекционный процесс: острые инфекции») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа человека оказывает прямой регулирующий эффект на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови.

2. В условиях инфекционного процесса, сопровождающегося повышенной продукцией фактора некроза опухолей альфа (на примере клещевого энцефалита), и при культивировании клеток с рекомбинантным фактором некроза опухолей альфа регуляция апоптоза лимфоцитов крови осуществляется посредством молекулярных механизмов, связанных с активацией

митохондриального пути, участием активных форм кислорода и транскрипционных факторов (NF-kB и Р53), а также изменением соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2.

Апробация диссертации. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» (Кемерово, 2008), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), X Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009).

Исследования выполнены в рамках проектов РФФИ -«Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150_офи), «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (09-04-99025-р_офи), а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проект «Разработка технологических основ персонализированной терапии и профилактики социально-значимых бактериальных и вирусных заболеваний на основе идентификации молекулярно-генетических механизмов нарушений иммунореактивности системы крови», государственный контракт № 02.512.12.0013 от 01.08.2008 г.), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (государственный контракт № 02.740.11.0311 от 07.07.2009 г.), поддержаны грантом Совета при Президенте РФ (государственный контракт № 02.120.11.3842-МД от 24.09.2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них - 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка цитированной литературы, включающего 258 источников, из них - 42 отечественных и 216 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 13 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе были выделены два блока исследования: экспериментальный и клинический.

На первом этапе в условиях культивирования лимфоцитов здоровых доноров с рекомбинантным TNFa (rTNFa) в диапазоне концентраций от 0,015 до 0,150 нг/мл была проведена оценка дозозависимого влияния rTNFa на вовлеченность указанных клеток в апоптоз и некроз, идентифицирована заинтересованность в реализации TNFa-опосредованной апоптотической гибели активных форм кислорода, пермеабилизации митохондрий, транскрипционных факторов, белков семейства Вс1-2. На втором этапе была проведена проверка гипотезы об участии данных факторов в дизрегуляции агюптоза лимфоцитов при клещевом энцефалите, сопровождавшегося изменением продукции цитокина.

В основу работы положены результаты комплексного обследования 65-ти человек (30 мужчин и 35 женщин, средний возраст 31±3 года). Из них 20 здоровых доноров и 45 пациентов с клещевым энцефалитом (КЭ), включая 25 лиц с острым клещевым энцефалитом (ОКЭ) и 20 человек с хронической антигенемией вируса КЭ (более б мес после острого периода КЭ). Критериями исключения из исследования явились: возраст менее 18 или более 50 лет, наличие в анамнезе фактов злоупотребления алкоголем, наркотической зависимости, психических расстройств; обострение хронических соматических заболеваний, наличие инфекционных болезней другой этиологии, период проведения противовирусной, иммуномодулирующей, а также иной фармакотерапии.

Обследованные пациенты находились либо на диспансерном учете, либо на стационарном лечении в неврологическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач - H.H. Бартфельд), а также в инфекционном отделении МЛПУ «Городская больница №3» г. Томска (главный врач -М.А. Лукашов). Клинические группы были сформированы при непосредственном участии профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора Н.Г. Жуковой. У всех обследованных лиц было получено добровольное информированное согласие на проведение необходимых для исследования манипуляций.

Материалом исследования являлась кровь, взятая утром натощак путем пунктирования локтевой вены и стабилизированная гепарином (25 ЕД/мл).

Исследование проводилось на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководитель -канд. мед. наук O.E. Чечина).

Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом в соответствии с использованными методами исследования представлены в таблице 1.

Лимфоциты выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см3). Выделенные лимфоциты крови культивировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma Aldrich», США), 0,3 мг/мл L-глутамина и 2мМ/мл HEPES («Flow», GB), в течение 18 ч при 37°С и 5% С02 (Хаитов P.M. и др., 1995). При проведении экспериментального блока в инкубационную среду добавляли соответствующее количество рекомбинантного TNFa человека (rTNFa) в конечной концентрации 0,015; 0,025; 0,050; 0,100 и 0,150 нг/мл («Biosource», США).

Количество клеток в состоянии апоптоза и некроза оценивали с помощью FITC-меченного аннексина V и пропидий йодида («Beckman Coulter», Франция) на проточном цитофлюориметре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) (Pepper A. et al., 1998). Относительное число лимфоцитов со сниженным мембранным митохондриальным потенциалом определяли с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Уровень АФК в клетках оценивали с использованием красителя с заблокированной флюоресценцией - дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma Aldrich», США). Число лимфоцитов, презентирующих на своей поверхности TNF-RI (CD 120), определяли с помощью стандартных моноклональных антител к TNF-R1, меченных фикоэритрином («R&D», США),

Продукцию лимфоцитами крови TNFa оценивали путем твердофазного иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем тест-систем («Ргосоп», Россия).

,Для определения содержания транскрипционных факторов (NF-kB, р53) и белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Вах, Bad) был использован метод вестерн-блоттинга. Образцы для анализа получали путем лизйрования клеток. Белки разделяли по молекулярной массе методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле - 5%-ом концентрирующем (0,13 мМ Tris-HCl, рН=6,8) и 10%-ом разделяющем (375 мМ Tris-HCl, рН=8,8) под действием электрического поля (10 В/см пути). Далее белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) в течение 80-90 мин при силе тока 50-60 мА на дорожку. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали с первичными антителами к NF-kB RelA (р65), нефосфорилированному Р53, P21WAF,/Cipl, Вах, Bad, Bcl-2 и Bcl-xL («Sigma-Aldrich», США) в разведении 1:300, визуализировали зоны с помощью прицепитирующего субстрата пероксидазы на основе ТМБ (НПО «БиоТест Системы», Москва). Полученные блоты сканировали, изображение обрабатывали с помощью программного обеспечения («Carl Zeiss», Германия).

Таблица 1

Распределение здоровых доноров и пациентов в соответствии с использованными методами исследования

Методы исследования Условия исследования

Инкубирование лимфоцитов здоровых доноров крови с рекомбинантным TNFa в дозах 0.015; 0,025; 0,050; 0,100 и 0,150 нг/мл Оценка TNFa-опосредованного апоптоза у больных клещевым энцефалитом

Здоровые доноры Больные острым клещевым энцефалитом Пациенты с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Оценка апоптоза лимфоцитов крови с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидия иодида с использованием метода проточной лазерной цитометрии :15 15 25 20

Определение количества лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий . с использованием метода проточной лазерной цитометрии 12 12 16 17

Оценка концентрации TNFa в супернат'нтах лимфоцитов крови in vitro методом иммуноферментного анализа Не проводилось 14 17 15

Определение количества лимфоцитов крови, несущих на поверхности TNF-RI-рецепторы, методом проточной лазерной цитометрии Не проводилось 20 18 15

Исследование содержания активных форм кислорода в лимфоцитах крови с использованием метода проточной лазерной цитометрии 12 12 22 17

Определение содержания в лимфоцитах крови NF-kB, р53, р21, Bcl-2, Bcl-xL, Вах, Bad с использованием метода вестерн-блоттинга 12 12 12 12

Вывод о содержании исследуемого белка в клетке делали по отношению величины сигнала метки искомого белка к величине сигнала с белка нагрузки - фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа («Chemicon», США).

Результаты исследования были оценены с использованием методов статистического анализа. Характер закона распределения количественных показателей определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для каждой выборки вычисляли следующие характеристики: медиану (Me), 25% и 75% квартили (Q,-Q3). Для проверки гипотезы о значимости межгрупповых различий исследованных признаков был применен критерий Манна-Уитни (U-тест). Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. При проверке статистических гипотез вероятность ошибочного принятия неверной гипотезы (р) не превышала 0,05 (5%) (Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе эволюции в организме была сформирована сложнейшая многоуровневая система поддержания постоянства внутренней среды, одним из значимых механизмов которой является клеточная гибель путем апоптоза, направленная на устранение избыточных и/или аномальных клеток, а также необходимая для нормального эмбриогенеза (Белушкина H.H., Северин С.Е., 2001; Потапнев М.П., 2002; Фильченков A.A., 2003). Большой интерес исследователей в области молекулярной биологии привлекают механизмы цитокиновой регуляции клеточной гибели. Особое положение в ряду цитокинов занимает фактор некроза опухолей альфа (TNFa). TNFa отличается чрезвычайно широким спектром выполняемых функций и обладает собственным каскадом проведения внутриклеточного сигнала, отличным от других цитокинов. По отношению к апоптозу TNFa является мощнейшим стимулятором его рецепторного пути. Однако, несмотря на пристальное изучение в последнее десятилетие апоптоза клеток, опосредованного TNFa, все же остаются открытыми вопросы, касающиеся участия данного цитокина в активации иных механизмов реализации танатогенной программы, связанных с транскрипционными факторами и белками семейства Bcl-2 (MacEwan D.J., 2002). Кроме того, вследствие своей высокой биологической значимости система TNFa и его рецепторов, а также инициируемый ими внутриклеточный сигналинг зачастую становятся мишенью действия болезнетворных агентов (Железникова Г.Ф., 2005; 2006). Все вышесказанное и определило наш интерес к исследованию TNFa-индуцированного апоптоза лимфоцитов и молекулярных путей его модуляции.

Для решения поставленных задач по уточнению молекулярных механизмов проапоптотического эффекта TNFa на лимфоциты крови была

использована рекомбинантная форма данного цитокина. Рекомбинантный TNFa (rTNFa) обладает высокой степенью аффинности к рецепторам эндогенного TNFa I (TNF-R1) и И типа (TNF-RII). Связывание rTNFa с TNF-RI и TNF-RII ведет к тримеризации последних с последующим запуском внутри клетки биохимических превращений, идентичных индуцируемым эндогенным TNFa. Одним из проявлений данных интрацеллюлярных событий является реализация танатогенной программы (MacEwan D.J., 2002).

Фундаментальные и клинические исследования указывают на уникальную способность TNFa инициировать и апоптотическую гибель клеток, наблюдаемую при повышенной секреции данного цитокина, сопровождающей воспалительные заболевания аутоиммунного и инфекционного генеза, и некроз клеток паренхиматозных органов в условиях гиперпродукции TNFa при септических состояниях (Van den Berg W.B., 2001; Van Amersfoort E.S. et al., 2003).

Исследование лимфоцитов здоровых доноров, инкубированных в питательной среде, содержащей rTNFa в диапазоне конечных концентраций от 0,015 нг/мл до 0,150 нг/мл, выявило закономерность «доза-эффект» в проявлении того или иного вида клеточной гибели (рис. 1). Добавление в инкубационную среду rTNFa в конечной концентрации 0,015 нг/мл и 0,025 нг/мл не приводило к каким-либо значимым изменениям относительного количества клеток, вовлеченных в процессы апоптоза и некроза. Возможно, что данные дозы rTNFa недостаточны для возникновения необходимого количества эффективных столкновений лиганда и рецептора, лимитированных концентрацией участников реакции в единице объема и способствующих их взаимодействию (Бауков Ю.И., Тюкавкина H.A., 2008). Однако при дальнейшем повышении концентрации rTNFa в культуральной среде до 0,050 нг/мл и 0,100 нг/мл происходило достоверное увеличение численности аннексинположительных лимфоцитов (р<0,05) по сравнению с интактной культурой, причем доля некротизированных клеток существенно не отличалась от их количества в интактной культуре (р>0,05) (рис. 1).

Рекомбинантный TNFa в концентрации 0,150 нг/мл достоверно повышал по сравнению с интактной культурой относительное содержание лимфоцитов как в состоянии апоптоза, так и подвергшихся некротической гибели (см. рис. 1).

Феномен зависимости реализации того или иного вида клеточной гибели от дозы TNFa, да и цитокинов в целом, малоизучен, и вскрытие его молекулярных основ является предметом отдельного исследования. Анализ результатов проведенного нами эмпирического этапа лишь указывает на факт дозозависимого эффекта влияния rTNFa на танатогенную программу и позволяет заключить, что использование конечной концентрации rTNFa 0,050 нг/мл целесообразно для изучения молекулярных механизмов проапоптотического эффекта цитокина.

клепси

Конечная концентрация rTNFa, нг/мл

♦ АПОПТОЗ - - НЕКРОЗ

Рис. I. Изменение количества апоптотических и некротизированных клеток в культуре лимфоцитов крови в зависимости от концентрации рекомбинантного TN Fa (rTNFa) в инкубационной среде Примечание: здесь и на рис. 2,3

* - р<0,05 по сравнению с аналогичными показателями в интакгаой культуре лимфоцитов крови

На сегодняшний день установлено, что лиганд-рецепторные взаимодействия с участием TNFa приводят к активации каспазы-8, что инициирует различные пути реализации программы апоптоза, связанные, в том числе, и с формированием пор пермеабилизационного перехода в митохондриальной мембране (Zamzami N. et al., 2000; Zhao У. et al., 2001; Chen X. et al., 2007). В связи с этим нами была выполнена оценка количества лимфоцитарных клеток с деполяризованной мембраной митохондрий, выявившая увеличение доли лимфоцитов с нарушением целостности митохондриальной мембраны после инкубации с rTNFa в апоптогенной концентрации в 2 раза по сравнению с интактной культурой лимфоцитов (р<0,05) (табл. 2)

Нарушение структуры митохондриальной мембраны совместно с выходом цитохрома С в цитоплазму способствует накоплению АФК (Марри Р. и др., 1993; Бра М. и др., 2005). Возможность реализации данных механизмов повышенной продукции АФК при TNFa-опосредованном апоптозе подтверждается выявленным нами с помощью цитофлуориметрического исследования фактом повышения уровня в лимфоцитах крови, инкубированных с rTNFa в апоптогенной концентрации АФК в 4,4 раза по сравнению с интактными клетками(р<0,05) (см. табл. 2).

АФК совместно с элементами антиоксидантной защиты формируют, так называемое, редокс-состояние клетки, дисбаланс которого может приводить к изменению функционирования различных элементов клеточного сигналинга, активирующихся параллельно с апоптогенным механизмом, опосредованным каспазой-8 и связанным с деятельностью митогенактивируемых протеинкиназ (МАР-киназ) (Guicciardi М.Е., Gores

б.Е., 2003; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007). МАР-киназы, катализируя реакции фосфорилирования, осуществляют контроль функционирования белковых молекул, и наиболее значимой представляется модуляция образования активных форм ключевых регуляторов апоптоза - различных транскрипционных факторов, таких как Р53 и ОТ-кВ (Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007).

Таблица 2

Численность лимфоцитов со сниженным потенциалом мембраны митохондрий и внутриклеточный уровень активных форм кислорода при инкубации клеток с г ТА'Ра в концентрации 0,050 нг/мп (Ме (ОгОз))

Исследованный показатель Интактная культура лимфоцитов Лимфоциты, инкубированные с rTNFa (0,050 нг/мл)

Количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, % 2,24(1,34-2,89) 4,54(1,76-6,78) р<0,05

Уровень активных форм кислорода в клетке, усл. ед. 0,018(0,013-0,019) 0,079(0,076-0,326) р<0,05

Примечание:

р - достоверность различия показателя по сравнению с таковым в интактной культуре лимфоцитов

Опираясь на вышеописанные теоретические данные о возможной АФК-зависимой заинтересованности факторов транскрипции Р53 и NF-kB в реализации апоптоза, мы провели оценку их содержания в лимфоцитах крови, культивированных в среде с rTNFa в апоптогенной дозе. Было установлено, что при инкубировании лимфоцитов в среде, содержащей апоптозиндуцирующую концентрацию rTNFa 0,050 нг/мл, в указанных клетках в 2,1 раза увеличивается количество Р65 RelA-субъсдиницы NF-kB по сравнению с интактными (р<0,05) (рис. 2), что говорит о его TNFa-зависимой активации. Помимо этого, воздействие на лимфоциты крови rTNFa в дозе 0,050 нг/мл приводило к двукратному снижению уровня нефосфорилированной формы белка Р53 (р<0,05) (см. рис. 2).

Существует несколько путей утилизации нефосфорилированного Р53 (Liu В. et al., 2008), поэтому для оценки .-перехода Р53 в его транскрипционно активное фосфорилированное состояние необходимо было исследовать изменение количества какого-либо белка, ген которого находится под контролем Р53. Предъявляемым требованиям удовлетворяет относящийся к Cipl/Kip 1 -семейству белков-регуляторов клеточного цикла, протеин Р21 WAF1'CipI (Мушкамбаров H.H., Кузнецов С.Л., 2003; Weiss R.H., 2003), увеличение содержания которого в 1,4 раза было обнаружено в лимфоцитах при действии rTNFa (р<0,05) (см. рис. 2). По всей видимости,

зарегистрированное снижение количества нефосфорилированного Р53 в ответ на апоптогенное действие гТКРа является следствием его фосфорилирования.

Таким образом, вышеописанные факты свидетельствует в пользу возможного образования активных форм транскрипционных факторов кВ и Р53 при апоптозе клеток, вызванном действием ТКТа.

Рис. 2. Уровень NF-kB, Р53 и p2]WAb,x-ipl в лимфоцитах крови, культивированных с rTNFa в концентрации 0,050 нг/мл

NF-kB и Р53 опосредуют образование белков семейства Вс1-2, анти-(Bcl-2, Bcl-xL) и проапоптотические (Вах, Bad) члены которого принимают участие в регуляции целостности митохондриальной мембраны (Nouraini S. et al., 2000; Kuvvana Т. et al., 2005; Parikh N. et al., 2007). Проведенное нами исследование показало, что, по сравнению с интактной культурой, в клетках после культивирования в среде, содержащей rTNFa в конечной концентрации 0,050 нг/мл, уровень Bcl-2-протеина уменьшался практически вдвое (р<0,05), а количество другого антиапоптотического белка - Bcl-xL снижалось на 40% (р<0,05) (рис. 3).

1,6

усл. ед.

□ Интактная культура

В Клетки, инкубированные в среде, содержащей rTNFa (0,05( нг/мл)

2,0

1.6

О Интактная культура

■ Клетки, инкубированные в среде, содержащей rTNFa (0,050 нг/мл)

Рис. 3. Уровень белков Bct-2, Bcl-xL, Вах и Bad в лимфоцитах крови, культивированных с rTNFa в концентрации 0,050 нг/мл

На фоне выявленных изменений содержания Вс1-2 и Bcl-xL было также отмечено, что количество промотирующего апоптоз белка Вах в клетках, инкубированных с rTNFa, также снижено почти в 3 раза (р<0,05) (см. рис. 3). При добавлении в инкубационную среду rTNFa уровень в лимфоцитах другого белка с проапоптотическим действием - Bad достоверно увеличивался относительно аналогичного показателя в интактной культуре клеток (р<0,05) (см. рис. 3).

Зарегистрированные нами изменения содержания анти- и проапоптотических белков семейства Вс1-2 способны вызывать образование пор как в наружной мембране митохондрий, так и участвовать в формировании пор пермеабилизационного перехода, что ведет к выходу из межмембранного пространства данных органелл активаторов апоптоза и нарушает работу дыхательной цепи (Фильченков A.A., 2003). Поэтому можно предположить, что рассматриваемые нами белки семейства Вс1-2 (Bcl-2, Bcl-xL, Вах, Bad) участвуют в TNFa-опосредованной реализации танатогенной программы посредством функционального усиления апоптогенного действия на митохондрии каспазы-8.

Таким образом, подводя итог проведенного экспериментального блока, можно сказать, что TNFa является индуктором апоптотической гибели лимфоцитов и опосредует свое действие не только через рецепторные механизмы, но и через привлечение иных апоптогенных каскадов, связанных с митохондриями, АФК, транскрипционными факторами NF-кВ и Р53, а также представителями семейства белков Вс1-2 -Bcl-2, Bcl-xL, Вах и Bad (рис. 4).

Изучение участия данных регуляторов апоптоза, индуцированного TNFa, при заболеваниях, сопровождающихся усилением продукции указанного цитокина, а также проверка гипотезы об их становлении в качестве факторов, способствующих дизрегуляции танатогенной программы, опосредованной TNFa, явилось задачей второго этапа исследования. Для решения поставленной задачи выбор нозологической единицы осуществлялся по следующему критерию - инфекционный процесс должен сопровождаться как с усилением продукции лимфоцитами TNFa, так и с отсутствием изменения наработки лимфоцитарными клетками интересующего нас цитокина.

Данному требованию в полной мере отвечают инфекционные заболевания, вызванные различными лимфотропными вирусами семейства Flaviviridae, в том числе и вирусом клещевого энцефалита (КЭ) (Gritsun T.S. et аЦ 2003; Жукова Н.Г. и др., 2002; Жукова О.Б., 2006).

Анализ продукции TNFa лимфоцитами крови показал, что у больных, страдающих ОКЭ, продукция цитокина была повышена относительно контрольных значений (р<0,05) (рис. 5а). Исследование продукции TNFa лимфоцитами крови у лиц с хронической антигенемией вируса КЭ не выявило статистически значимых отличий от таковой у здоровых доноров (р>0,05) (см. рис. 5а).

Рис. 4. Представления о молекулярных механизмах проапоптотического эффекта TNFa (по данным D.J. MacEwan, 2002; J.S. Fridman, S. W. Lowe, 2003; A.A. Фильченков, 2003; J. Kucharczak et al„ 2003; S. Gupta et. AI., 2005; P. Jiang et ai, 2006 и результатам

собственных исследований (выделено цветомj) Примечание: f - повышение; | - снижение

пг/мл

□ Лимфоциты, полученные у здоровых доноров

■ Лимфоциты, полученные у пациентов с острым клещевым энцефалитом

И Лимфоциты, полученные у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Рис. 5. Концентрация TNF<x в супернатантах культур лимфоцитов (а), количество клеток, несущих на своей поверхности ТЫР-Ш-рецепторы, (б) и численность апоптотически измененных лимфоцитов (в) у пациентов с клещевым

энцефалитом Примечание: здесь и на рис. 6 и 7

* - р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем у здоровых доноров

Необходимым условием для реализации цитокинопосредованного апоптоза является наличие на плазматической мембране клеток специфических высокоаффинных рецепторов, поэтому с помощью проточной лазерной цитометрии нами был проведен подсчет ТКР-Я1-положительных лимфоцитов. Данное исследование позволило зафиксировать увеличение доли несущих на своей поверхности ТЫР-Ш лимфоцитарных клеток и у больных ОКЭ, и у пациентов с хронической антигенемией вируса КЭ (рис. 56).

Биологический смысл выявленных закономерностей, возможно, связан с адаптивной реакцией клеток в ответ на избыток или недостаток продукции ТЫРа. Указанное предположение может было подтверждено результатами корреляционного анализа. При ОКЭ была выявлена положительная связь между концентрацией цитокина в культуральной жидкости и количеством ЮТ-Ш-позитивных лимфоцитов (г=0,61, р<0,05), а у пациентов с длительным носительством вируса КЭ - отрицательная (г=-0,89, р<0,05).

Далее нами была проведена оценка доли претерпевающих апоптоз лимфоцитов в условиях повышенной продукции ТОТа (при ОКЭ), установившая увеличение количества данных клеток более чем в 10 раз (р<0,05) (рис. 5в). Полученные результаты могут являться следствием

проапоптотического эффекта цитокина, на что указывает выявленная корреляционная зависимость между количеством ТОТ-Ш-несущих лимфоцитов и процентом клеток в апоптозе (г=0,77, р<0,05).

Установление особенностей поведения внутриклеточных участников ТЫРа-ийициированного апоптоза на клинической модели явилось следующим шагом нашей работы по изучению молекулярных механизмов проапоптотического действия ТЫРа и путей их модуляции. Первоначально было проверено предположение о заинтересованности митохондрий и АФК в реализации апоптоза лимфоцитов, отмеченного в условиях повышенной продукции ТОТа. Нами было установлено, что у больных ОКЭ по сравнению со здоровыми донорами в 3 раза увеличено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и повышено содержание в лимфоцитах АФК (р<0,05) (табл. 3).

Таблица 3

Численность лимфоцитов со сниженнъш потенциалом мембраны митохондрий и внутриклеточный уровень активных форм кислорода в лимфоцитах крови у пациентов с клещевым энцефалитом (Ме (О.гО.з))

Исследованный показатель Характеристика обследованных

Здоровые доноры Больные острым клещевым энцефалитом Пациенты с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, % 2,24(1,34-2,89) 6,74(2,56-10,40) р,<0,05 8,48(7,08-9,06) р]<0,05 р2>0,05

Уровень активны* форм кислорода в лимфоцитах, усл. ед. 0,018(0,013-0,019) 0,038(0,025-0,055) Pi<0,05 0,015(0,014-0,019) Pi>0,05 Р2<0,05

Примечание:

pi - Достоверность различия показателя по сравнению с таковым у здоровых доноров; •

Р2 - достоверность различия показателя по сравнению с таковым у пациентов с острым клещевым энцефалитом

Выявленные особенности апоптоза при повышенной секреции TNFa могут являться следствием действия различных факторов. В частности, сам цитокин, как ранее обсуждалось, активируя каспазу-8, способствует образованию пор в наружной мембране митохондрий и пор пермеабилизационного перехода, что ведет к нарушению работы дыхательных комплексов и накоплению АФК, опосредуя запуск апоптогенной программы (Фильченков A.A., 2003). Помимо этого,

накопление в лимфоцитах АФК при острой вирусной инфекции может быть обусловлено развертыванием острофазной реакции (MacEwan D.J., 2002; Кулинский В.И., 2007). С другой стороны, обнаруженное увеличение в лимфоцитах уровня АФК может быть и нелимфоцитарного происхождения. Показано, что при «респираторном взрыве» в активированных TNFa фагоцитирующих клетках образуется большое количество перекиси водорода, способной проникать в другие клетки крови, в том числе и в лимфоциты, что ведет к запуску танатогенной программы последних (Плетюшкина ОЛО. и др., 2006; Старикова Е.Г., 2008).

Для сравнения нами была проведена оценка количества лимфоцитов с деполяризованной митохондриапьной мембраной при хронической антигенемии вируса КЭ, позволившая установить значения данного показателя, сопоставимые с его величинами в культуре лимфоцитов у больных ОКЭ (р>0,05) (см. табл. 3).

Зафиксированные изменения числа клеток с пермеабилизированной митохондриапьной мембраной при длительном носительстве антигена вируса КЭ не сопровождались повышением содержания в них АФК (как в лимфоцитах у пациентов с ОКЭ) (см. табл. 3). Отсутствие избыточного количества АФК в лимфоцитах у лиц с длительной персистенцией вируса КЭ, по всей вероятности, обусловлено особенностями продукции цитокинов данными клетками. Известно, что при хронической антигенемии вируса КЭ увеличена продукция IL-4 (Наследникова И.О. и др., 2005), угнетающего синтез мононуклеарами провоспалительных TNFa, IL-1 и 1L-12р40, что блокирует образование АФК в фагоцитирующих клетках и снижает их поступление в лимфоциты, с одной стороны (Paludan S.R., 1998; Плетюшкина О.Ю. и др., 2006), а, с другой, - дефицит секреции TNFa способствует ингибированию находящейся под контролем эйкозаноидов генерации АФК (MacEwan D.J., 2002; Кулинский В.И., 2007).

Полученные нами результаты и данные литературы позволяют заключить, что выявленная в условиях гиперсекреции TNFa при ОКЭ пермеабилизация мембраны митохондрий лимфоцитов, по всей видимости, обусловлена как действием на клетки самого цитокина, так и непосредственным воздействием возбудителя вследствие способности флавивирусов к чрезмерной активации каспазы-8, что приводит к запуску TNFa-подобного апоптоза (Prikhod'ko G.G. et al., 2002). Выявленное при острой вирусной нейроинфекции, сопровождающейся повышенной продукцией TNFa, накопление АФК является следствием эффекта цитокина как на лимфоциты, так и на клетки, обладающие фагоцитарной активностью.

Отмеченное при ОКЭ нарушение целостности митохондриальной мембраны и увеличение содержания в лимфоцитах АФК соответствуют найденным в экспериментальном блоке внутриклеточным событиям в ответ на действие рекомбинантной формы TNFa. В связи с этим можно предположить, что в условиях повышенной наработки TNFa лимфоцитами крови реализация апоптотической гибели клеток связана прежде всего с

выходом апоптогенных факторов из митохондрий и АФК-зависимой индукцией МАР-киназного каскада с последующей активацией транскрипционных факторов (Webster G.A., Perkins N.D., 1999).

С помощью метода вестерн-блоттинга нами было установлено, что на фоне повышенной продукции лимфоцитами TNFa, сопровождающей ОКЭ, в клетках увеличивается образование свободного транскрипционного фактора NF-кВ и снижается содержание нефосфорилированного Р53 (рис. 6). Обнаруженные изменения соответствуют картине экспериментального TNFa-индуцированного апоптоза, что позволяет сделать предположение о существовании связи между продукцией цитокина и активацией NF-кВ и Р53.

2,0 1,5

□ Лимфоциты, полученные у здоровых доноров

О Лимфоциты, полученные у пациентов с острым клещевым энцефалитом

S Лимфоциты, полученные у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Рис. 6. Содержание белков NF-kB и нефосфорилированного Р53 в лимфоцитах крови у пациентов с клещевым энцефалитом

Оценка уровня белков семейства Вс1-2, образование которых находится под контролем NF-кВ и Р53, показала, что лимфоциты у пациентов с ОКЭ содержат сниженное количество белков-ингибиторов клеточной гибели Вс1-2 и Bcl-xL в 2 и 4 раза, соответственно (р<0,05) (рис.7), Однако уровень способствующих реализации танатогенной программы Вах и Bad не отличался от такового в лимфоцитах у здоровых доноров (р>0,05) (см. рис. 7).

Обнаруженные различия в содержании указанных выше протеинов имеют неоднозначную интерпретацию. Во-первых, они свидетельствуют о смещении баланса анти- и проапоптотических белков в сторону последних. Преобладание промотирующих апоптоз представителей семейства Bcl-2, по всей вероятности, и определяет формирование пор пермеабилизационного перехода и выход в цитоплазму активаторов апоптоза (Фильченков A.A., 2003). Во-вторых, полученные результаты могут быть в некоторой степени опосредованы внутриклеточным действием инфекта (при хронической антигенемии вируса КЭ зафиксированы аналогичные результаты) (см. рис. 7). И, наконец, в-третьих, отсутствие зарегистрированных в экспериментальном блоке исследования закономерностей изменения белка

Вах при действии rTNFa может быть сопряжено с IL-2, усиление секреции которого отмечается при острой вирусной инфекции (Ройт А., 2000; Хаитов P.M., 2001; 2006). Установлено, что IL-2 способен через активацию киназ МЕК1 и Akt высвобождать Вах из комплекса с антиапоптотическими протеинами Вс1-2 и Bcl-xL и, тем самым, опосредовать пополнение пула несвязанных проапоптотических белков (Parikh N. et а!., 2004).

И Лимфоциты, полученные у пациентов с острым клещевым энцефалитом

ШЛимфоциты, полученные у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита

Рис. 7. Уровень белков ВЫ-2, Bcl-xL, Box и Bad в лимфоцитах крови у пациентов с клещевым энцефалитом

Таким образом, подводя итог проведенного нами исследования, можно отметить, что эксперимент in vitro с использованием рекомбинантной формы TNFa продемонстрировал дозозависимый эффект цитокина на реализацию программы клеточной гибели лимфоцитов путем апоптоза и некроза. Изучение молекулярных механизмов проапоптотического действия TNFa показало, что указанный цитокин способен вызывать активацию митохондриального и Р53-опосредованного путей инициации танатогенкой программы. Важнейшую роль в данных интрацеллюлярных событиях играют вторичные мессенджеры передачи сигнала - активные формы кислорода, благодаря которым осуществляется регуляция образования функциональных форм транскрипционных факторов NF-кВ и Р53. Однако апоптозиндуцирующее действие TNFa во многом предопределяется Р53, стимулирующего пополнение проапоптотического белка Bad и препятствующего синтезу ингибирующих апоптоз Вс1-2 и Bcl-xL, что способствует нарушению целостности митохондриальной мембраны.

Выявленные в экспериментальном блоке исследования механизмы TNFa-индуцированного апоптоза верифицированы и в условиях in vivo при повышенной продукции цитокина. Однако их реализация обусловлена не только действием TNFa, но и наличием ряда факторов, являющихся неотъемлемой частью реакций организма и связанных как с присутствием

2.0

1.6

усл. ед. 12__

□ Лимфоциты, полученные у здоровых доноров

болезнетворного агента, так и эффектами на клетку других регуляторных молекул.

Дальнейшие исследования механизмов апоптогенного действия TNFa на клетки, на наш взгляд, сопряжены с изучением влияния цитокина на регуляцию других транскрипционных факторов и в условиях изменения активности различных участников TNFa-индуцированной танатогенной программы. Полученные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции патологических процессов и состояний, характеризующихся изменением продукции TNFa и модуляцией его внутриклеточной сигналпередающей системы.

ВЫВОДЫ

1. Влияние TNFa на реализацию гибели лимфоцитов крови носит дозозависимый характер: рекомбинантный TNFa человека в диапазоне концентраций от 0,050 до 0,150 нг/мл вызывает рост числа клеток в состоянии апоптоза, при дозе 0,150 нг/мл - повышение количества лимфоцитов, претерпевающих некроз.

2. TNFa-индуцированный апоптоз в условиях in vitro и апоптоз лимфоцитов крови у пациентов с острым клещевым энцефалитом характеризуется увеличением количества лимфоцитарных клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и повышенным содержанием активных форм кислорода.

3. Апоптоз лимфоцитарных клеток крови, опосредованный рекомбинантным TNFa, в условиях in vitro, а также у больных острым клещевым энцефалитом, связана с активацией транскрипционных факторов NF-kB и Р53.

4. При культивировании лимфоцитов крови с рекомбинантным TNFa в апоптогенной концентрации (0,050 нг/мл) и в условиях повышенной продукции TNFa при остром клещевом энцефалите имеет место дисбаланс белков семейства Вс1-2, обусловленный снижением содержания антиапоптотических белков Вс1-2 и Bcl-xL.

5. При патологии, характеризующейся повышенной продукцией TNFa (острый клещевой энцефалит), и при действии на лимфоцитарные клетки рекомбинантной формы цитокина в конечной концентрации 0,050 нг/мл in vitro имеют место общие закономерности TNFa-опосредованного нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль цитокинов в редокс-зависимой регуляции апоптоза / O.E. Чечина, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова, Т.С. Прохоренко, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - №2. -С. 67-71.

2. Роль NF-kB, Р53 и Р21 в регуляции ФНОа-опосредоваииого апоптоза лимфоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова, Т.Т. Радзивил, А.Н. Вайс, Н.Ю. Часовских // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2010. - №1. - С. 5659.

3. Роль активных форм кислорода и белков семейства Вс1-2 в реализации ФНОа-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова, М.В. Белкина, Н.Ю. Часовских, З.К. Хаитова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2010. -№2. - С. 139-142.

4. Состояние TNFa-опосредованного пути регуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови при длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова. О.Б. Жукова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова // Науки о человеке: Материалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов г.Томск, 17-18 мая 2007. - Томск, 2007. - С. 168.

5. TNF-опосредованная регуляция программированной гибели лимфоцитов при антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова, Т.С. Прохоренко, А.Н. Вайс, Н.В. Кочакова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы Межгородской конференции молодых ученых- г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 13-14.

6. Клинико-иммунологическая характеристика клещевого энцефалита / И.Н. Удинцева, O.E. Чечина, Н.Г. Жукова, Л.В. Лукашова, Н.В. Рязанцева, A.M. Попонина, Л.А. Малышева, H.H. Бартфельд, З.С. Кемерова, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова // Медицина в Кузбассе: Материалы Межрегиональной научно-практическая конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» -2008. - № 5. -С. 152-156.

7. Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при дисбалансе Thl- и ТЬ2-цитокинов / Н.В. Рязанцева, O.E. Чечина, В.В. Новицкий, А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова, Т.Т. Радзивил // Российский иммунологический журнал: Материалы Объединенного иммунологического форума - г. Санкт-Петербург, 30 июня-5 июля 2008. -2008. - Т. 2(11), №2-3. - С. 259.

8. Дисбаланс белков семейства Вс1-2 в модуляции апоптоза лимфоцитов / А.Н. Марошкина, O.E. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, Т.С. Прохоренко, А.К. Биктасова. М.В. Белкина, Е.В. Сазонова, А.П. Зима, Т.Т. Радзивил // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Сборник статей. -Пущино, 2009. - Т.2 - С. 457-461.

9. Дозозависимые эффекты 1L-2 на программированную гибель лимфоцитарных клеток / Е.В. Сазонова, O.E. Чечина, А.К. Биктасова. О.Б. Жукова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы Межгородской конференции молодых ученых - г. Санкт-Петербург, 22-23 апреля 2009. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 96-97.

10. Изменение содержания транскрипционных факторов при TNFa-опосредованном апоптозе лимфоцитов крови / А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, O.E. Чечина, В.В. Новицкий // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: Материалы X Международного конгресса - г. Казань, 20-23 мая 2009. - Казань, 2009-С. 278.

11. Молекулярные механизмы цитокиновой регуляции апоптоза лимфоцитов / O.E. Чечина, А.К. Биктасова. Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Аллергология и иммунология: Материалы VII съезда аллергологов и иммунологов СНГ - г. Санкт-Петербург, 25-28 апреля 2009. - 2009. - Т. 10, №2.- С. 176.

12. Нарушение TNFa-опосредованного апоптоза лимфоцитов как механизм формирования хронической персистенции вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова. O.E. Чечина, Е.В. Сазонова, О.Б. Жукова // Актуальные проблемы патофизиологии: Материалы Межгородской конференции молодых ученых - г. Санкт-Петербург, 22-23 апреля 2009. — Санкт-Петербург, 2009.-С. 18-19.

13. Роль белков семейства Bcl-2 в регуляции IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови / Е.В. Сазонова, А.К. Биктасова. О.Б. Жукова, O.E. Чечина, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий 7/ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: Материалы X Международного конгресса - г. Казань, 20-23 мая 2009. - Казань, 2009 - С. 308.

14. Роль р53 и NFkB в реализации lL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов 1 Е.В. Сазонова, O.E. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, И.С. Лосенков, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Медицинская иммунология: Материалы XIII всероссийского форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» - г. Санкт-Петербург, 8-11 июня 2009. - 2009. -№ 4-5. - С. 334;

15. Система TNFa-TNF-RI и апоптоз лимфоцитов крови при хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.К. Биктасова. О.Б. Жукова, O.E. Чечина,' Е:В. Сазонова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, И.С. Лосенков // Медицинская иммунология: Материалы XIII всероссийского форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» - г. Санкт-Петербург, 8-11 июня 2009.-2009,- №4-5.-С. 380.

16. Участие транскрипционных факторов и белков семейства Вс1-2 в TNFa-опосредованном апоптозе лимфоцитов / А.К. Биктасова. О.Б. Жукова, O.E. Чечина, Е.В. Сазонова // Науки о человеке: Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов г. Томск, 28-29 мая 2009,- Томск, 2009-С. 71-72.

17. Молекулярные мишени проапоптотического действия ИЛ-2, ИЛ-4 и ФНОа при поляризации иммунного ответа по Thl- и Th2 пути / Н.В. Рязанцева, O.E. Чечина, В.В. Новицкий, Е.В. Сазонова, А.К. Биктасова // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с

международным участием г. Новосибирск, 27-29 октября 2009. -Новосибирск, 2009.- С. 226-227.

18. Р53 и NFkB - сигнальные трансдукторы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов / Е.В. Сазонова, O.E. Чечина, А.К. Биктасова, О.Б. Жукова, И.С. Лосенков, З.К. Хаитова // Науки о человеке: Материалы X конгресса молодых ученых и специалистов г. Томск, 28-29 мая 2009. - Томск, 2009-С. 101-102.

АФК - активные формы кислорода КЭ - клещевой энцефалит ОКЭ - острый клещевой энцефалит ПТС - флюоресцеинизотиоцианат интерлейкин

МАР-киназы - митогенактивируемые протешшшазы гЮТа- рекомбинантный фактор некроза опухолей альфа ТОТ-Ш - рецептор к фактору некроза опухолей альфа 1-го типа ТОТа- фактор некроза опухолей альфа

Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Соискатель

Биктасова А.К.

Подписано в печатъ02.02.20\0 г. Усл.печ.листов Ot (,S Печать на ризографе.

Заказ № 2.4

Тираж I0Ö экземпляров

Актуальность исследования. Патогенез многочисленных заболеваний человека (иммунопатологические: состояния; злокачественные новообразования,.хронические инфекционные процессы и др.) тесносвязанс нарушением клеточной гибели. Одной из ведущих причин дизрегуляции танатогенной программы клеток является: изменение продукции клетками и/или модуляция- биологических эффектов фактора некроза опухоли: альфа (tumor, necrosis factor a, TNFa) (Bazzoni F., Beutler В., 1996; Aggarwal B.B., 2000; Locksley R.M. et al., 2001; Joussen A.M. et al., 2009). В:физиологических условиях TNFa участвует в эмбриогенезе, развитии разнообразных тканей, 1 при патологии - играет ведущую роль в формировании воспалительных реакций и специфического иммунного ответа (Ройт А., 2000; MacEwan D.J., 2002; Хаитов P.M., 2006; Кулинский В.И., 2007). Действие TNFa на клетки-мишени осуществляется за. счет связывания- со своими- высокоаффинными рецепторами, расположенными; на плазматической мембране, что ведет к интрацёллюлярным реакциям, находящим свое отражение: в изменении; их функционального < статуса^ в том числе и посредством инициации клеточной гибели (MacEwan D.J., 2002; Gupta S. et al., 2005).

К настоящему времени выявлена способность TNFa инициировать^ как апоптотическую гибель, клеток, опосредованную повышенной секрецией; данного цитокина при воспалительных заболеваниях аутоиммунного и: инфекционного генеза, так и некроз клеток паренхиматозных органов, в; условиях гиперпродукции TNFa при септических состояниях. При: этом характер и интенсивность процесса гибели клеток определяется количеством;, воздействующего на них TNFa, что дает основание предположить, дозозависимость влияния;цитокина на.реализацию танатогенной программы. (Faraco P.R. et al., 1999; Van den Berg W.B., 200Г; Van Amersfoort E.S. et al., 2003; Lin Y. et al., 2004; Temkin V. et al., 2006; He S. et al., 2009). Однако экспериментальные факты, свидетельствующие, в пользу указанного предположения, . немногочисленны,, что обуславливает целесообразность изучения действия различных концентраций рекомбинантного TNFa на с инициацию того или иного вида TNFa-опосредованной клеточной гибели.

Накопленные к настоящему времени сведения о TNFa-зависимых механизмах запуска летальной программы достаточно детально, по сравнению с другими видами цитокиноопосредованного апоптоза, описывают события, происходящие в клетке при реализации TNFa-индуцированной апоптотической гибели. Однако вследствие использования исследователями разных клеточных моделей и экспериментальных условий возникают серьезные трудности в интеграции многочисленных разрозненных фактических результатов, касающихся указанной проблемы (Webster G.A., Perkins N.D:, 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003; Liu B. et al., 2008). Особенно остро данный вопрос стоит в отношении механизмов мобилизации заключенных в межмембранном митохондриальном пространстве апоптогенных факторов, находящейся под контролем белков семейства Вс1-2 (Jiang P. et al'., 2006; Chen X. et al., 2007).

Образование и/или деградация анти- и проапоптотических членов семейства протеинов Вс1-2 регулируется транскрипционными факторами, в том числе NF-kB и Р53. Вовлеченность NF-kB и Р53, а также представителей семейства белков ВЫ-2 в реализацию TNFa-индуцированной апоптотической гибели не вызывает сомнений. Однако отсутствие единой точки зрения о характере заинтересованности данных регуляторных молекул в TNFa-опосредованный апоптоз делает целесообразным проведение комплексного исследования указанных протеинов при действии на клетки рекомбинантного цитокина и при патологии, сопровождающейся повышенной продукцией лимфоцитами TNFa. Полученные знания могут быть положены в основу разработки технологии коррекции патологических процессов^ и состояний, характеризующихся изменением продукции и рецепции TNFa, а также модуляцией его внутриклеточной сигнал передаю щей системы.

Цель исследования: установить роль белков-регуляторов программированной клеточной гибели (белки семейства Вс1-2 и факторы транскрипции) в регуляции апоптоза лимфоцитов крови при действии фактора некроза опухоли альфа.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Установить дозозависимость влияния фактора некроза опухоли альфа на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови in vitro.

2. Оценить причастность митохондриального пути (количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, внутриклеточный уровень активных форм кислорода) к регуляции апоптоза лимфоцитов крови, индуцированного фактором некроза опухоли альфа.

3. Определить содержание белков-регуляторов клеточной гибели (транскрипционные факторы NF-kB и Р53, ингибитор циклинзависимых киназ p2iWAF1/CipI5 протеины семейства Вс1-2) в лимфоцитах крови, полученных у здоровых доноров, при действии рекомбинантного фактора некроза опухоли альфа и у пациентов с острым клещевым энцефалитом, характеризующимся измененной продукцией фактора некроза опухоли альфа.

4. Выявить общие закономерности и особенности влияния фактора некроза опухоли альфа на апоптоз лимфоцитов крови в условиях in vitro и при остром клещевом энцефалите.

Научная новизна. Впервые в условиях in vitro установлено, что рекомбинантный TNFa человека дозозависимо влияет на реализацию апоптотической и некротической гибели лимфоцитов крови. Получены новые данные о регулирующей роли транскрипционных факторов NF-kB и Р53, а также о характере изменения баланса белков семейства Вс1-2 при реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток, индуцированного TNFa. Установлено, что при инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита, на фоне повышенного образования TNFa апоптоз лимфоцитов крови реализуется при участии митохондрий, активных форм кислорода и сопряжен с активацией транскрипционных факторов, а также с нарушением соотношения про- и антиапоптотических Bcl-2-белков. Установлено, что дизрегуляция апоптоза лимфоцитов крови как при действии рекомбинантного TNFa in vitro в дозе 0,050 нг/мл, так и при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией данного цитокина, обусловлена запуском однотипных молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе проведенного исследования фактические данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы участия транскрипционных факторов (NF-kB и Р53) и белков семейства- Вс1-2 в TNFa-опосредованной регуляции программированной гибели лимфоцитов в условиях in vitro с применением рекомбинантной формы цитокина. Установлена роль данных участников внутриклеточного сигналинга в дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток при инфекционной патологии, сопровождающейся повышенной продукцией TNFa. Результаты настоящего исследования в дальнейшем могут способствовать раскрытию з механизмов побочных эффектов анти-Т№а-направленной терапии, а также послужить основой для разработки новых технологий коррекции нарушений программы клеточной гибели при заболеваниях, характеризующихся изменением продукции данного цитокина.

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (разделы «Основы цитофизиологии; старение, гибель клетки, взаимодействие клетки с окружающей средой», «Инфекционный процесс: острые инфекции») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный фактор некроза опухоли альфа человека оказывает прямой регулирующий эффект на реализацию апоптоза и некроза лимфоцитов крови.

2. В условиях инфекционного процесса, сопровождающегося повышенной продукцией фактора некроза опухоли альфа (на примере клещевого энцефалита), и при культивировании клеток с рекомбинантным фактором некроза опухоли альфа регуляция апоптоза лимфоцитов крови осуществляется посредством молекулярных механизмов, связанных с активацией митохондриального пути, участием активных форм кислорода и транскрипционных факторов (NF-kB и Р53), а также изменением соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2.

Апробация диссертации. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций» (Кемерово, 2008), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), X Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о-человеке» (Томск, 2009).

Исследования выполнены в рамках проектов РФФИ - «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150офи), «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (09-04-99025-рофи), а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проект «Разработка технологических основ персонализированной терапии и профилактики социально-значимых бактериальных и вирусных заболеваний на основе идентификации молекулярно-генетических механизмов нарушений иммунореактивности системы крови», государственный контракт № 02.512.12.0013 от 01.08.2008 г.), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка г технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (государственный контракт № 02.740.11.0311 от 07.07.2009 г.), поддержаны грантом Совета при Президенте РФ (государственный контракт № 02.120.11.3842-МД от 24.09.2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, и-з --них - 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

ВЫВОДЫ:

1. Влияние TNFa на реализацию гибели лимфоцитов крови носит дозозависимый характер: рекомбинантный TNFa человека в диапазоне концентраций от 0,050 до 0,150 нг/мл вызывает рост числа клеток в состоянии апоптоза, при дозе 0,150 нг/мл — повышение количества лимфоцитов, претерпевающих некроз.

2. TNFa-индуцированный апоптоз в условиях in vitro и апоптоз лимфоцитов крови у пациентов с острым клещевым энцефалитом характеризуется увеличением количества лимфоцитарных клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и повышенным содержанием активных форм кислорода.

3. Апоптоз лимфоцитарных клеток крови, опосредованный рекомбинантным TNFa, в условиях in vitro, а также у больных острым клещевым энцефалитом, связан с активацией транскрипционных факторов NF-kB и Р53.

4. При культивировании лимфоцитов крови с рекомбинантным TNFa в апоптогенной концентрации (0,050 нг/мл) и в условиях повышенной продукции TNFa при остром клещевом энцефалите имеет место дисбаланс белков семейства Bcl-2, обусловленный снижением содержания антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL.

5. При патологии, характеризующейся повышенной продукцией TNFa (острый клещевой энцефалит), и при действии на лимфоцитарные клетки рекомбинантной формы цитокина в конечной концентрации 0,050 нг/мл in vitro имеют место общие закономерности TNFa-опосредованного нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов крови.

105

Заключение

TNFa представляет собой уникальный медиатор иммунной системы, обеспечивающий как специфические, так и неспецифический защитные реакции организма. Существующие на сегодняшний день знания предполагают, что большинство биологических эффектов цитокинов достигаются с помощью позитивной или негативной регуляции танатогенной программы различных типов клеток. Известно, что реализация клеточной гибели (как путем апоптоза, так и некроза) зависит от типа клеток, фазы их жизненного цикла и внутриклеточного метаболизма.

В последние десятилетия многочисленные исследования были направлены на выявление молекулярных механизмов запускаемого TNFa апоптоза в аспекте верификации действия цитокиновых молекул.

Установлено, что индукция летальной программы под действием TNFa обусловлена сборкой специфического адаптерного комплекса и каспазными реакциями. Кроме того, была обнаружена способность инициаторного звена каспазного каскада - каспазы-8 - привлекать альтернативные пути, связанные с образованием пор в митохондриальной мембране и выходом апоптогенных факторов в цитоплазму, а также с повышенной генерацией вторичных мессенджеров АФК.

Предполагается, что избыточное количество АФК через ряд редокс-чувствительных посредников, в частности МАР-киназ, опосредую-т активацию транскрипционных факторов. По мнению исследователей, наибольшее значение в модуляции проапоптотического эффекта TNFa имеют факторы транскрипции NF-кВ и Р53. Однако, несмотря на пристальное изучение этого процесса на современном этапе, не существует - единой концепции поведения NF-kB и Р53 при TNFa-индуцированном апоптозе клеток.

Указанные транскрипционные факторы регулируют экспрессию белков семейства Вс1-2, баланс между про- и антиапоптотическими членами которого во многом предопределяет дальнейшую судьбу клетки. Вопрос вовлечения Bcl-2-протеинов, принадлежащих к разным структурно-функциональным группам, в реализацию инициированной TNFa программы апоптотической гибели является малоизученным и носит отчасти гипотетичный характер.

Патогенез подавляющего количества заболеваний (аутоиммунная патология, инфекционные болезни, злокачественные новообразования) сопряжен с нарушением апоптоза, индуцированного цитокиновыми молекулами, в том числе и TNFa. Среди причин дизрегуляции данного процесса особо стоит выделить изменение внутриклеточного сигналинга TNFa как наиболее тонкого инструмента «настраивания» клеточных функций.

Учитывая вышесказанное, представляется целесообразным проведение исследования, направленного на изучение дозозависимых эффектов цитокина на реализацию апоптоза и некроза, а также выявление дополнительных участников TNFa-опосредованного апоптоза и идентификацию их роли в качестве регуляторных молекул при заболеваниях, сопровождающихся усилением продукции цитокина.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материал исследования

Для достижения поставленной цели в диссертационной работе были выделены два блока исследования: экспериментальный и клинический, включавшие в себя изучение летальных эффектов TNFa при воздействии in vitro его рекомбинантной формой на лимфоциты, полученные у здоровых доноров, и регистрацию особенностей реализации программированной гибели лимфоцитов, полученных у пациентов с вирусной инфекцией (острым клещевым энцефалитом и хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита), то есть в условиях различной продукции эндогенного TNFa.

В основу работы положены результаты комплексного обследования 65-ти человек (30 мужчин и 35 женщин, средний возраст 31±3 года). Из . них 20 здоровых доноров и 45 пациентов с клещевым энцефалитом. Критериями исключения из исследования явились: возраст менее 18 или более 50 лет, наличие в анамнезе фактов злоупотребления алкоголем, наркотической зависимости, психических расстройств; обострение хронических соматических заболеваний, наличие инфекционных болезней другой этиологии, период проведения противовирусной, иммуномодулирующей, а также иной фармакотерапии.

Обследованные пациенты находились либо на диспансерном учете, либо на стационарном лечении в неврологическом отделении МЛПУ МСЧ «Строитель» (главный врач - Н.Н. Бартфельд), а также в инфекционном отделении МЛПУ «Городская больница №3» г. Томска (главный врач -М.А. Лукашов). Клинические группы были сформированы при непосредственном участии профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук Н.Г. Жуковой.

Группу здоровых доноров составили 20 практически здоровых добровольцев (5 мужчин и 15 женщин, средний возраст - 28±2 года), не страдавших инфекционными заболеваниями и не предъявлявших на момент обследования жалоб соматического профиля.

У всех обследованных лиц было получено добровольное информированное согласие на проведение необходимых для исследования г манипуляций.

Материалом исследования являлась кровь, взятая утром натощак путем пунктирования локтевой вены и стабилизированная гепарином (25 ЕД/мл).

Исследование выполнено на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководитель -канд. мед. наук О.Е. Чечина).

2.1.1. Характеристика экспериментального блока исследования

В настоящем исследовании была проведена оценка молекулярных механизмов TNFa-опосредованной дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток, основанная на применении рекомбинантного TNFa (rTNFa). При культивировании клеток в среде, содержащей rTNFa, происходит взаимодействие последнего с рецепторами эндогенного TNFa TNF-RI и TNF-RII, расположенными на клеточной мембране, что запускает цепь биохимических реакций, существенно отражающихся на состоянии клеток [MacEwan D. J., 2002].

Поскольку TNFa является сильным стимулятором программированной гибели лимфоцитов крови [S. Gupta et al., 2005], в настоящем исследовании для индукции апоптоза были использованы минимальные количества rTNFa («Biosource», США), значения конечных концентраций которых составили 0,015, 0,025, 0,050, 0,100 и 0,150 нг/мл.

Для этого клетки, полученные у здоровых доноров, инкубировали в двух параллельных пробах: интактной и с добавлением rTNFa в соответствующей дозе. Культивированные таким образом лимфоциты далее были исследованы на предмет реализации программированной t * гибели в аннексиновом тесте, оценки численности клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий; также в лимфоцитах было определено содержание АФК, уровень транскрипционных факторов NF- ' kB, Р53, ингибитора циклинзависимых киназ p2lWAF1/ClP1 и белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 (Вах, Bad, Bcl-2, Bcl-xL).

2.1.2. Характеристика клинического материала

Необходимым условием для изучения молекулярных механизмов дизрегуляции TNFa-опосредованного апоптоза лимфоцитов является выбор нозологической единицы, сопровождающейся повышенной продукцией клетками TNFa. В качестве такой клинической модели нами был выбран инфекционный процесс, вызванный лимфотропным вирусом семейства Flaviviridae — вирусом клещевого энцефалита [Zhu N. et al., 2001; Gritsun T.S. et al., 2003]. В связи с этим для решения сформулированных в диссертационной работе задач нами было проведено обследование 45-ти пациентов (25 мужчин и 20 женщин, средний возраег -35±3 года) с клещевым энцефалитом, включая 25 лиц с острым клещевым-энцефалитом и 20 человек с антигенемией вируса клещевого энцефалита (КЭ) (более 6 мес после острого периода КЭ).

Диагноз острого 'клещевого энцефалита (ОКЭ) (шифр МКБ-10-А84.0) (25 пациентов) устанавливали на основании присасывания либо факта наличия ползающих клещей, а также клинической картины заболевания (острое начало, инфекционный синдром, неврологический статус). Верификацию диагноза осуществляли по результатам исследования клещей на присутствие антигена вируса клещевого энцефалита, определения в сыворотке крови у пациентов его антигена и титра специфических антител классов М и G к указанному возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА), а также по данным выявления РНК вируса клещевого энцефалита с использованием полимеразно-цепной реакции.

У обследованных больных ОКЭ протекал в стертой и лихорадочной форме легкой и умеренной степени тяжести. Ведущим симптомом у лиц с лихорадочной формой ОКЭ была лихорадка с повышением температуры тела до 38-40°С. Острый период заболевания характеризовался выраженными признаками интоксикации, большинство пациентов предъявляли жалобы на головные и мышечные боли. Объективно были установлены вегетативные нарушения разной степени: гиперемия лица и верхней части туловища (64,5%), инъекция сосудов склер и конъюктивтг1 (56,4%), усиление местного красного дермографизма (50,2%). Особенностью неврологических проявлений лихорадочной формы КЭ являлись изменения со стороны центральной нервной системы в виде легкого центрального пареза мимических мышц, неравномерности кожных и глубоких рефлексов, нарушения конвергенции и болезненности точек выхода ветвей тройничного нерва. При стертой форме ОКЭ температура тела не превышала 37,5°С, ведущим синдромом был астено-вегетативньт. Пациенты предъявляли жалобы на общее недомогание, отсутствие аппетита, мышечные боли в спине. При объективном обследовании были установлены вегетативные нарушения в виде стойкого красного дермографизма и потливости. Проведенные лабораторные исследования, включавшие биохимический анализ крови (АЛТ, ACT, креатинин, общий белок, глюкоза, мочевина, билирубин, С-реактивный белок, серомукоиды), оценку гемостаза, общий анализ мочи и крови, свидетельствовали о наличии воспаления как у пациентов с лихорадочной, так и у больных со стертой формой ОКЭ.

Во вторую группу были включены 20 пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита (более 6 мес), согласно клинической классификации, предложенной Н.Г. Жуковой и соавт. [2002]. У всех лиц данной группы через 6-24 мес после перенесенного -з лихорадочной форме острого клещевого энцефалита в крови обнаруживался антиген возбудителя, а также высокий титр специфических к нему Ig G. Ведущим у данной категории лиц был психовегетативный синдром различной степени выраженности. На момент обследования пациенты предъявляли жалобы на повышенную утомляемость, слабость, раздражительность, эпизоды головной боли и миалгию в конечностях, несвязанную с физической нагрузкой. Нарушения со стороны вегетативной нервной системы проявлялись в виде бледности кожных покровов (91,4%), гипергидроза дистальных отделов конечностей (80,5%), быстрой истощаемости брюшных рефлексов (46,4%) и лабильности сердечнососудистой системы с наклонностью к гипотонии (31,5%). Всем пациентам при обследовании проводились биохимический анализ крови (AJIT, ACT, .креатинин, общий белок, мочевина, билирубин), оценка гемостаза, общий , анализ мочи и крови, которые не выявили наличие острой воспалительной реакции. с*

2.2. Методы исследования

В соответствии с поставленными задачами исследование проходило в два последовательных этапа.

На первом этапе в условиях культивирования лимфоцитов in vitro с рекомбинантным TNFa была идентифицирована заинтересованность в реализации TNFa-опосредованной апоптотической гибели активных форм кислорода, транскрипционных факторов, белков семейства Вс1-2.

На втором этапе была проведена оценка молекулярных механизмов дизрегуляции апоптоза на модели клещевого энцефалита, i сопровождавшегося изменением продукции цитокина.

Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом в соответствии с использованными методами исследования представлены в таблице 1.

2.2.1. Выделение лимфоцитов крови

Лимфоциты выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. и соавт, 1980].

Венозную гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) выдерживали при 37°С в течение 40-60 мин для отделения плазмы и эритроцитов.

Полученную плазму наслаивали на градиент плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см) в соотношении 2:1 и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Образовавшееся на границе раздела фаз кольцо из смеси мононуклеарных клеток собирали в стерильную центрифужную пробирку, дважды отмывали средой RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), последовательно ресуспендируя и центрифугируя каждый раз по 10 мин при 1500 об/мин. Для удаления моноцитов суспензию клеток помещали в пластиковый планшет.

Жизнеспособность лимфоцитов определяли в счётной камере Горяева. Для этого 0,1 мл клеточной взвеси смешивали с равным объемом 0,5% раствора трипанового синего («Serva», США). Концентрацию клеток рассчитывали по формуле:

Х = А-КТ04 (клеток/мл), где А - количество клеток в 20-ти больших квадратах камеры; К -коэффициент разведения.

Результаты оценивали по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет, количество которых не превышало 5-7 % [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].

2.2.2. Культивирование лимфоцитов крови

Выделенные лимфоциты крови культивировали в 96-луночных планшетах в объеме 200 мкл и во флаконах. Суспензию клеток (2-105 на лунку либо 1-106 на флакон) инкубировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma», США), 0,3 мг/мл L-глутамина и 2мМ/мл HEPES («Flow», GB), в течение 18 ч при температуре 37°С и 5% С02 [Хаитов P.M. и соавт., 1995]. При проведении экспериментального блока в инкубационную среду добавляли соответствующее количество rTNFa в конечной концентрации 0,015, 0,025, 0,050, 0,100 и 0,150 нг/мл («Biosource», США).