Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Роль ароматазы p450 в патогенезе синдрома поликистозных яичников

На правах рукописи

САВИНА Валентина Андреевна

РОЛЬ АРОМАТ АЗЫ Р450 В ПАТОГЕНЕЗЕ СИНДРОМА ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ

14.01.01 - акушерство и гинекология 14.01.02 — эндокринология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

2 0 СЕН 2012

Санкт-Петербург — 2012

005047225

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им.Д.О. Отта» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

медицинский факультет, заведующая кафедрой акушерства, гинекологии и репродуктологии

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский

университет им. И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой эндокринологии им. акад. В.Г.Баранова

Тарасова Марина Анатольевна Потин Владимир Всеволодович

Ниаури Дарико Александровна

Ворохобина Наталья Владимировна

Ведущая организация: ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны РФ. ^^

Защита состоится « ^ А/ОУЯУ^Я 2012 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при ФГБУ «НИИАГ им.Д.О. Отта» СЗО РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИАГ им.Д.О. Отта» СЗО РАМН.

Автореферат разослан «_»

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

2012 г.

Кузьминых Татьяна Ульяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нормогонадотропная недостаточность яичников является одной из частых причин нарушения менструального цикла и бесплодия (RCOG, 2004). Эта форма овариальной недостаточности, характеризующаяся неизмененным базальным уровнем гонадотропинов в крови, может быть обусловлена регуляторными внеовариальными факторами. Проба с эстрадиолом, моделирующая предовуляторный подъем эстрогенов в крови, позволяет выявить нарушение механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом при нормогонадотропной ановуляции, обусловленной сахарным диабетом 1 типа и гипотиреозом (Начинкина Ю.О. 1994; Ткаченко H.H. и соавт., 1997). Однако у большинства больных с нормогонадотропной ановуляцией парентеральное введение эстрогенов вызывает адекватное повышение гонадотропинов в крови (Айламазян Э.К. и соавт., 1994; Потин В.В. и соавт., 1990; Ниаури Д.А., 1995). Это указывает на роль первично-овариальных нарушений в патогенезе данной патологии. Было высказано предположение, что причиной ановуляции у этих больных является недостаточный предовуляторный подъем эстрогенов в крови, обусловленный, например, хроническим воспалительным поражением яичников, аутоиммунным оофоритом, эндометриозом или частичными наследственными ферментативными дефектами, нарушающими синтез эстрогенов в яичниках. С 1991 года в литературе периодически появляются описания случаев снижения ароматазной активности на 81-99,8%, связанных с наличием мутаций в гене ароматазы CYP19 (Shozu М. et al., 1991; Harada N. et al., 1992; Portrat-Doyen S. et al., 1996; Mullís P.E. et al., 1997; Ludwig M. et al., 1998; Deladoey K. et al„ 1999; Scott R.R. et al., 2008). Клиническая картина снижения активности ароматазы у больных женского пола выражается внутриутробной вирилизацией различной степени тяжести с последующим развитием

гипергонадотропного гипогонадизма, поликистозных изменений яичников, ожирения, первичной аменореи, бесплодия. Можно думать, что менее выраженное снижение ароматазной активности проявляется синдромом поликистозных яичников (СПЯ) - заболеванием, входящим в структуру нормогонадотропной недостаточности яичников, встречающимся у 5-10% женщин репродуктивного возраста (Knochenhauer E.S. et al., 1998; Michelmore K.F. et al., 1999). Наиболее характерными признаками СПЯ являются: увеличение яичников с множественными антральными фолликулами, ановуляция, нарушение менструального цикла по типу опсоменореи (до 95%) (Kumarapeli V. et al., 2008), гиперпродукция лютеинизирующего гормона (ЛГ) гипофизом, гиперандрогенемия, гирсутизм (до 70%) (Соболева Е.Л. и соавт., 2007; ESHRE/ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group, 2012), ожирение (38-88%) и нарушение толерантности к глюкозе (Balen А.Н. et al., 1995; Legro R.S. 2008). Еще в прошлом веке появились работы по изучению особенностей стероидогенеза в яичниках при СПЯ (Потин В.В. и соавт., 1990; Short R.V., London D.R. 1961; Erickson G.F. et al., 1979). Увеличение соотношения андрогены/эстрогены в сыворотке крови, в фолликулярной жидкости и в инкубационной среде при культивировании гранулезных клеток яичников больных СПЯ позволило предположить, что дефицит ароматазы является ведущим фактором патогенеза данного заболевания. Ряд медико-генетических исследований (Petry C.J. et al., 2005; Xita N. et al., 2008; Jin J.L. et al., 2009) указывает на наличие ассоциации полиморфизма гена CYP19 с развитием СПЯ. Так, при изучении аллельного варианта (ТТТА)п в 4 интроне гена CYP19 обнаружено (Xita N. et al., 2008) у больных СПЯ более низкое число повторов (ТТТА)п и более высокий уровень тестостерона в крови. В другой работе (Baghaei F. et al., 2003) полиморфизм гена CYP19 del(TTTA)7 ассоциировался с увеличением уровня андрогенов и снижением уровня эстрогенов в крови, и

возможно, снижением ферментативной активности ароматазы. В ходе исследования гена СУР19 в испанской и английской популяции (РеИ-у СЛ. с1 а1., 2005) обнаружена корреляция между БКР50 (гб24 14096) и избытком андрогенов. Китайские ученые (Лп .Г.Ь. е1 а1., 2009) выявили ассоциацию полиморфизма 8ЫР50 (ге2414096) с риском развития СПЯ в своей популяции. Вместе с тем, другие исследователи (игЬапек М. е1 а1., 1999; Sëoderlund Б. е1 а1., 2005) не подтвердили участия каких-либо полиморфных вариантов гена СУР19 в развитии СПЯ у женщин в США и Мексике.

Представляется перспективным изучение особенностей полиморфизма гена ароматазы СУР19 при СПЯ в сравнении с популяционными показателями Северо-Запада Российской Федерации. В современной литературе не представлены результаты исследований экспрессии ароматазы гранулезными клетками яичников больных СПЯ и не разработаны доступные для клинической практики гормональные методы определения ароматазной активности.

Цель исследования отражена в названии и состоит в выяснении роли ароматазы р450 в развитии синдрома поликистозных яичников. Задачи исследования

1. Изучить реакцию половых стероидных гормонов и гонадотропинов на ингибитор ароматазы летрозол у здоровых женщин и разработать тест с летрозолом, позволяющий количественно оценивать ароматазную активность.

2. Определить с помощью теста с летрозолом ароматазную активность при синдроме поликистозных яичников.

3. С помощью иммуногистохимического метода изучить экспрессию овариальной ароматазы при синдроме поликистозных яичников.

4. Определить частоту аллелей и генотипов по гену ароматазы СУР19 ((ТТТА)п полиморфизм, с!е1(ТСТ) полиморфизм и БОТбО (ге2414096)) у больных синдромом поликистозных яичников.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Разработан метод определения ароматазной активности по изменению половых стероидных гормонов и гонадотропинов в ответ на пероральный прием ингибитора ароматазы летрозола (заявка на изобретение № 201206289). Впервые показано, что реакция эстрадиола и гонадотропинов на ингибитор ароматазы летрозол при СПЯ не выходит за пределы ее физиологических колебаний у здоровых женщин. Установлено, что экспрессия овариальной ароматазы при СПЯ соответствует размерам антральных фолликулов. Не выявлено значимых отличий в частоте аллельных вариантов гена ароматазы СУР 19 при СПЯ и у женщин группы сравнения. Теоретическая значимость работы состоит в выяснении роли ароматазы в развитии СПЯ.

Практическая значимость работы. Разработанная проба с летрозолом позволяет оценивать ароматазную активность у больных с различными формами овариальной недостаточности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Однократный прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола приводит через 48 часов к достоверному снижению эстрадиола и адекватному повышению гонадотропинов в крови здоровых женщин.

2. Результаты пробы с ингибитором ароматазы летрозолом, изучение экспрессии овариальной ароматазы иммуногистохимическим методом и генетического исследования аллелей и генотипов гена ароматазы СУР19 не позволяют считать абсолютный дефицит ароматазы причиной развития синдрома поликистозных яичников.

3. Относительный дефицит ароматазы при синдроме поликистозных яичников, проявляющийся снижением коэффициента

эстрадиол/тестостерон, следует связать с гиперпродукцией ЛГ гипофизом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на межлабораторном заседании 7 июня 2012 г. в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, на II ежегодной конференции молодых учёных и специалистов НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН «Репродуктивная медицина: взгляд молодых - 2011», на VI Всероссийской научно-практической конференции: «Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (24-26 ноября 2011, г. Санкт-Петербург) и на VI всероссийском конгрессе «Современные технологии в эндокринологии» (27-31 мая 2012, г. Москва). По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей - в рецензируемых научных журналах.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу отделения гинекологической эндокринологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН, в учебный процесс на кафедре акушерства и гинекологии СПбГМУ имени И.П. Павлова.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики обследованных женщин и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы.

Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста, содержат 21 таблицу и 10 рисунков. Библиография включает 286 источников, в том числе 53 - отечественных и 233 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач в период с 2010 по 2012 гг. в отделении гинекологической эндокринологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О.Отта» СЗО РАМН (заведующая отделением д.м.н. профессор М.А. Тарасова) обследовали 92 женщины с СПЯ и 55 женщин группы сравнения. Группу больных СПЯ составили женщины в возрасте от 19 до 36 лет. Диагноз СПЯ устанавливали на основании характерных клинических проявлений синдрома (ановуляция, нарушение менструального цикла, гирсутизм, ожирение), данных гормонального обследования (повышенный уровень ЛГ, общего и свободного тестостерона в крови, увеличение соотношения ЛГ/ФСГ (фолликулостимулирующий гормон), низкий уровень прогестерона в крови во вторую фазу менструального цикла) и эхографических критериев (увеличение объема яичников более 10 см3, наличие множества мелких антральных фолликулов, расположенных по периферии под утолщенной капсулой, избыточная строма). Группу сравнения составили 55 женщин в возрасте от 22 до 56 лет без СПЯ, что подтверждали анамнестическими, гормональными, ультразвуковыми и лапароскопическими данными. Критериями исключения были: нарушение функции щитовидной железы: гипо- или гипертиреоз, пролактинсекретирующая аденома гипофиза, сахарный диабет 1 типа, надпочечниковая гиперандрогенемия, дефицит массы тела, наличие беременности на момент исследования, применение половых гормонов и их аналогов в течение трех месяцев до обследования.

Гормональные исследования проводили в гормональной лаборатории отдела эндокринологии репродукции ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН (руководитель лаборатории к.б.н. Н.Н. Ткаченко). Гормональное обследование включало определение иммуноферментным методом в

сыворотке крови уровня ФСГ, ЛГ, общего тестостерона («Алкор Био», Россия), а также свободного тестостерона и эстрадиола на 2-5 день менструального цикла («DRG diagnostics», Германия). При выполнении лапароскопической операции содержание гормонов в крови оценивали повторно на 10-12 день менструального цикла (в день операционного вмешательства). Определение содержания в сыворотке крови пролактина и прогестерона («Алкор Био», Россия) выполняли на 20-21 день менструального цикла. При проведении пробы с летрозолом в сыворотке крови определяли содержание ФСГ, ЛГ, общего тестостерона, свободного тестостерона и эстрадиола до и через 24, 48 и 72 часа после перорального приема 10 мг летрозола на 2-й день менструального цикла.

Ультразвуковое сканирование матки и яичников проводили на аппарате «Sonoace Х4» (Корея) с использованием трансвагинального датчика с частотой 4-9 МГц. При ультразвуковом исследовании определяли размеры матки, толщину и структуру эндометрия, размеры яичников, состояние фолликулярного аппарата, наличие доминантного фолликула и жёлтого тела, их размеры; наличие других полостных образований.

Лапароскопию проводили на 10-12 день менструального цикла по общепринятой методике с помощью лапароскопа фирмы «Karl Storz» (Германия). При лапароскопии выполняли биопсию яичников. Диагноз СПЯ подтверждали при наличии увеличенных в размерах яичников, имеющих гладкую, блестящую белочную оболочку с выраженным сосудистым рисунком и отсутствием старых желтых тел. Стадии наружного генитапьного эндометриоза (НГЭ) оценивали согласно классификации Американского общества фертильности.

Гистологическое и иммупогистохимическое исследование биоптатов яичников выполняли в отделе патоморфологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Огга» СЗО РАМН (руководитель отдела з.д.н. Р.Ф. д.м.н. профессор И.М.

Кветной). Для гистологического исследования образцы ткани яичников в виде полос размерами 0,5 х 1,0 см фиксировали в 10% нейтральном формалине (pH 7,2), обезвоживали в автоматической установке «Leica TP 1020», заливали в парафин, готовили срезы толщиной 5мкм. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием первичных кроличьих поликлональных антител к ароматазе р450 (Clone ab 18995; 1:100, «Abcam», США). Визуализацию реакции проводили, применяя набор EnVision/HRP («Dako», Дания). Негативный контроль выполняли с применением блокирующей сыворотки (DAKO LSAB 2 kit). Позитивный контроль проводили на ткани плаценты. Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01М цитратном буфере (pH 7,6). Количественную оценку результатов иммуногистохимических реакций выполняли с помощью программы «Видеотест-Морфология 5.0». Фотосъемку проводили при увеличении 400х (окуляр 10х, объектив 40х). В группе сравнения ароматазную активность определяли в гранулезных клетках доминантных фолликулов и фолликулах 5-6 мм в диаметре, в группе больных СПЯ - в максимальном фолликуле. Ароматазную активность измеряли по методике, предложенной Suzuki Т. et al., 1994, используя показатель интегральной оптической плотности и количество клеток гранулезы в объекте по формуле: интегральная оптическая плотность/количество клеток гранулезы. Значения оценивали по 5 полям зрения, высчитывали среднее значение.

Генетическое обследование проводили совместно с лабораторией пренатальной диагностики наследственных заболеваний человека ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН (под непосредственным руководством в.н.с. профессора Т.Э. Иващенко, руководитель лаборатории член-кор.

РАМН з.д.н. РФ проф. B.C. Баранов). Генетическое исследование включало анализ аллельных вариантов гена CYP19 ((ТТТА)п полиморфизм), (del(TCT)) и SNP50 (rs2414096) методом полимеразной цепной реакции.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 7.0, Microsoft Excel и др.) с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Результаты исследования

Клиническая характеристика больных СПЯ Группу больных СПЯ составили 92 женщины в возрасте от 19 до 36 лет (средний возраст 27,1±0,4 года). Индекс массы тела колебался от 18,2 кг/м2 до 39,3 кг/м2 и в среднем составил 25,3±0,7 кг/м2. Симптомы андрогензависимой дермопатии проявлялись в виде вульгарных угрей у 31 (33,7%) женщины и в виде гирсутизма - у 43 (46,7%) женщин. Возраст менархе колебался от 11 до 17 лет и в среднем составил 13,4±0,1 года, что достоверно (р=0,03) превышало показатель группы сравнения (12,5±0,3 года). У всех больных СПЯ были выявлены нарушения менструального цикла по типу олигоопсоменореи (п=62) или вторичной аменореи (п=30). У 31 (33,7%) женщины с СПЯ имелось первичное бесплодие продолжительностью от одного года до 12 лет, средняя продолжительность - 3,6±0,5 года. У двух (2,2%) больных СПЯ имелось вторичное бесплодие.

Результаты гормонального обследования Всем больным СПЯ (п=92) выполнили гормональное обследование, включавшее оценку содержания в крови гонадотропинов, андрогенов и

эстрадиола на 2-5 день менструального цикла, уровень пролактина и прогестерона на 20-21 день менструального цикла. В группе сравнения гормональное обследование и ультразвуковое исследование органов малого таза провели 32 соматически здоровым женщинам с овуляторным циклом. Возраст женщин колебался от 22 до 37 лет и в среднем составил 29,4±0,8 года. Результаты гормонального обследования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Уровень гонадотропинов и половых стероидных гормонов (М±ш) в крови обследованных женщин на 2-5 день менструального цикла и уровень пролактина и прогестерона на 20-21 день менструального цикла и граница доверительного интервала при р=0,05

Гормоны Больные СПЯ (п=92) Группа сравнения (п=32) р

ФСГ, МЕ/л 5,5±0,2 5,1-5,9 6,2±0,3 5,6-6,7 р=0,02

ЛГ, МЕ/л 8,6±0,5 7,5-9,5 4,0±0,3 3,4-4,6 р<0,001

Эстрадиол, пмоль/л 191,6±12,4 165,7-215,5 204,2±13,3 160,9-199,1 р=0,8

Тестостерон, нмоль/л 2,2±0,2 1,7-2,4 1,6±0,1 1,4-1,9 р=0,2

Свободный тестостерон, пмоль/л 10,3±0,9 8,7-12,4 4,3±0,5 3,2-5,4 р<0,001

Андростендион, нмоль/л 9,1 ±0,7 10,5-2,7 5,7±0,6 4,5-6,8 р<0,001

Отношение эстрадиола (пмоль/л) к общему тестостерону (нмоль/л) 86,8±6,1 64,3-89,3 117,8±8,7 100,1-135,7 р<0,001

Отношение эстрадиола (пмоль/л) к свободному тестостерону (пмоль/л) 23,9±2,5 18,8-29,3 60,3±6,2 47,3-79,3 р<0,001

Пролактин, мМЕ/л 345,6±18,6 310,8-380,9 372,1±20,9 329,6-415,1 р=0,1

Прогестерон, нмоль/л 7,1±0,9 5,3-8,8 54,8±1,8 51,4-58,48 р<0,001

В крови больных СПЯ наблюдалось достоверное (р<0,05) повышение уровня ЛГ, свободного тестостерона и андростендиона и снижение уровня ФСГ на 2-5 день менструального цикла по сравнению с аналогичными показателями у женщин с овуляторным менструальным циклом. Соотношение ЛГ/ФСГ у больных СПЯ (1,6±0,1) было достоверно (р<0,001) выше, чем в группе сравнения (0,7±0,1). Достоверное (р<0,001) снижение коэффициентов эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон при СПЯ по сравнению с аналогичными коэффициентами у женщин с овуляторным циклом свидетельствует об относительном дефиците овариальной ароматазы, вероятно, обусловленным гиперпродукцией ЛГ гипофизом. На 20-21 день менструального цикла в крови больных СПЯ уровень прогестерона был значительно (р<0,001) ниже аналогичного показателя у женщин группы сравнения и свидетельствовал об ановуляции. На 10-12 день менструального цикла (в день проведения лапароскопии) гормональное исследование повторили 19 больным СПЯ и 16 женщинам репродуктивного возраста с сохраненным овуляторным циклом из группы сравнения (табл. 2).

К 10-12 дню менструального цикла содержание свободного тестостерона и андростендиона в крови больных СПЯ достоверно (р<0,05) повысилось, повышение уровня общего тестостерона наблюдалось, но не было достоверным (р=0,4). На 2-5 день менструального цикла у больных СПЯ содержание эстрадиола в крови было достоверно (р<0,02) ниже, чем в группе сравнения. К 10-12 дню содержание эстрадиола (195,2±15,4 пмоль/л) в крови больных СПЯ, практически, не изменилось. Можно думать, что из-за нарушения ароматизации андрогенов в эстрогены предовуляторного подъема уровня эстрадиола в крови не происходило, и периовуляторный пик гонадотропинов отсутствовал. У женщин с овуляторным циклом к 10-12 дню менструального цикла прослеживался достоверный (р<0,001)

предовуляторный подъем уровня эстрадиола в крови с 21б,8±17,6 пмоль/л до 694,8±37,6 пмоль/л и периовуляторный подъем ЛГ - с 4,2±0,3 МЕ/л до 20,0±1,7 МЕ/л.

Таблица 2

Уровень гонадотропинов и половых стероидных гормонов (М±т) в крови обследованных женщин на 2-5 и 10-12 день менструального цикла

Гормоны Больные СПЯ (п=19) Группа сравнения (п=16)

2-5 10-12 2-5 10-12

ФСГ, МЕ/л 6,0±0,7 5,9±0,4 6,3±0,5 7,4± 1,6

ЛГ, МЕ/л 8,9±1,0* 9,6±0,7* 4,2±0,3 20,0±1,7Л

Эстрадиол, пмоль/л 184±17,8** 195,2±15,4* 216,8±17,6 694,8±37,6Л

Тестостерон, нмоль/л 1,9±0,3 2,3±0,3 1,7±0,2 1,7±0,1

Свободный тестостерон, пмоль/л 6,5±1,4* 10,8±1,7*лл 3,9±0,6 3,8± 0,4

Андростендион, нмоль/л 7,1±0,9** 8,2±0,3*лл 5,1 ±0,1 5,9± 0,1

Примечание:

* - р<0,001 по сравнению с аналогичным показателем в группе сравнения ** - р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в группе сравнения л - р<0,001 по сравнению с исходным показателем на 2-5 день цикла ЛЛ - р<0,05 по сравнению с исходным показателем на 2-5 день цикла

Результаты ультразвукового обследования

Ультразвуковое исследование органов малого таза выполнили всем женщинам с СПЯ (п=92). Продольный, сагиттальный и поперечный размеры матки больных СПЯ были достоверно (р<0,001 и р<0,05) меньше, чем в группе сравнения. Пролиферация эндометрия у больных СПЯ была замедлена, и величина М-эхо (3,2±0,1 мм) в начале цикла была достоверно (р<0,001) ниже, чем у женщин с овуляторным циклом (4,2±0,1 мм). Объем яичников больных СПЯ был достоверно Ср<0,001) больше, чем у женщин

группы сравнения и превышал 10 см3. Яичники больных СПЯ значимо (р<0,001) отличались наличием множества мелких антральных фолликулов. На 10-12 день менструального цикла (в день проведения лапароскопии) ультразвуковое исследование повторили 19 больным СПЯ и 16 женщинам репродуктивного возраста с овуляторным циклом из группы сравнения. Оценивали средний диаметр максимального фолликула и толщину эндометрия (табл. 3).

Таблица 3

Диаметр лидирующего фолликула и толщина эндометрия (М±т) обследованных женщин на 2-5 и 10-12 день менструального цикла

Эхографические показатели Больные СПЯ (п=19) Группа сравнения (п=16)

2-5 10-12 2-5 10-12

Толщина эндометрия, мм 3,2±0,1 * 6,6±0,6*л 4,2±0,1 10,1±0,4Л

Лидирующий фолликул, мм 5,4±0,7* 6,6±0,4* 7,2±0,2 18,5±0,7Л

Примечание:

* - р<0,001 по сравнению с аналогичным показателем группы сравнения л - р<0,001 по сравнению с исходным показателем на 2-5 день цикла

К 10-12 дню менструального цикла средний диаметр максимального фолликула в группе больных СПЯ увеличивался незначительно. У женщин с овуляторным циклом с увеличением диаметра лидирующего фолликула возрастали уровень эстрадиола в крови и толщина эндометрия, о чем свидетельствует положительная корреляция между данными показателями (г=0,49; р=0,05 и г=0,6; р=0,01 соответственно). У больных СПЯ к концу фолликулярной фазы менструального цикла наблюдался рост эндометрия, но его толщина была достоверно (р<0,001) меньше соответствующего показателя у женщин группы сравнения.

Результаты лапароскопии, гистологического и

иммупогистохимического исследования биоптатов яичников

Лапароскопию выполнили 19 больным СПЯ. Возраст больных СПЯ варьировал от 19 до 33 лет и в среднем составил 26,5±0,8 года. Во всех случаях диагноз СПЯ при лапароскопии был подтвержден, проведена диатермокаутеризация яичников и биопсия яичников. В группе сравнения лапароскопию произвели 16 женщинам с сохраненным овуляторным циклом. Возраст женщин колебался от 22 до 37 лет и в среднем составил 30,6±1,3 года. У всех женщин был регулярный менструальный цикл. Показаниями к оперативному вмешательству послужили: длительное бесплодие неясной этиологии и подозрение на НГЭ. Одна больная была прооперирована по поводу хронических тазовых болей, и одной женщине была проведена лапароскопия по поводу параовариальной кисты. При лапароскопии у 10 больных был выявлен НГЭ I степени, у троих - НГЭ II степени. При диагностировании НГЭ проводили электрокоагуляция эндометриодных гетеротопий. У всех женщин выполняли биопсию яичников.

Гистологическим и иммуногистохимическим методом исследовали 19 биоптатов яичников больных СПЯ и 16 биоптатов яичников женщин группы сравнения. При гистологическом исследовании биоптатов яичников у всех больных СПЯ определялся выраженный склероз белочной оболочки яичников и гиперплазия стромы. Содержание атрезирующихся фолликулов было достоверно (р<0,05) выше в биоптатах яичников больных СПЯ (у 89,5% больных), чем в группе сравнения (у 56,3% женщин). При этом атрезия фолликулов у больных СПЯ имела тенденцию к кистозной трансформации. В корковом слое яичников больных СПЯ количество примордиальных фолликулов было ниже, чем в группе сравнения, но отличие не было статистически достоверным (р=1,0).

При иммуногистохимическом исследовании биоптатов яичников больных СПЯ имелся дефицит экспрессии ароматазы клетками гранулезы максимальных фолликулов. Экспрессия ароматазы, приходящаяся .на одну клетку гранулезы максимального фолликула яичников больных СПЯ (45,4±1,4), была достоверно (р<0,001) ниже, чем у женщин с сохраненным овуляторным циклом (556,7±11,4). При оценке продукции ароматазы клетками гранулезы антральных фолликулов (5-6 мм) яичников женщин группы сравнения определено, что на данной стадии развития ароматазная активность была низкой. Экспрессия ароматазы, приходящаяся на одну клетку гранулезы антрального фолликула яичников женщин с сохраненным овуляторным циклом (41,7±1,8), была сопоставима (р=0,1) с продукцией ароматазы клетками гранулезы максимальных фолликулов яичников больных СПЯ (45,4±1,4). Таким образом, экспрессия овариалыюй ароматазы при СПЯ соответствует размерам антральных фолликулов.

У женщин с овуляторным циклом ароматазная активность в клетках гранулезы доминантного фолликула была достоверно (р<0,001) выше, чем в клетках гранулезы антральных фолликулов. При этом с увеличением диаметра доминантного фолликула с 15 мм до 22 мм ароматазная активность достоверно (г=0,09; р=0,73) не увеличивалась, тогда как уровень эстрадиола в крови с увеличением диаметра фолликула достоверно (1=0,49; р=0,05) возрастал. Таким образом, в течение нормального менструального цикла в конце фолликулярной фазы содержание эстрогенов в крови зависит от количества клеток гранулезы доминантного фолликула.

Результаты пробы с летрозолом

В группе сравнения пробу с ингибитором ароматазы р450 летрозолом выполнили 16 соматически здоровым женщинам с овуляторным циклом. Возраст женщин колебался от 24 лет до 31 года и в среднем составил

27,9±0,6 года. Возраст наступления менархе варьировал от 12 до 14 лет и в среднем составил 12,8±0,2 года, продолжительность менструального цикла в среднем составила 28,1±0,5 дня. В анамнезе у 4 женщин имелись беременности, закончившиеся физиологическими родами.

У здоровых женщин наиболее выраженные изменения (снижение уровня эстрадиола, повышение уровня андрогенов и гонадотропинов в крови) приходились на 3-й день пробы (через 48 часов) после приема летрозола. Под влиянием летрозола уровень эстрадиола в крови достоверно (р=0,003) снижался на 38,3±8,6 пмоль/л (24,0±4,8%). Согласно механизму отрицательной обратной связи на третий день пробы происходило значимое (р<0,001) увеличение содержания в крови ФСГ на 4,1±0,5 МЕ/л (70,1±10,3%) и ЛГ на 3,6±0,5 МЕ/л (138,3±24,0%). Однако увеличение уровня общего тестостерона и свободного тестостерона в крови под влиянием летрозола не было статистически значимым (р=0,2 и р=0,3 соответственно). Учитывая разнонаправленность изменений андрогенов и эстрогенов под влиянием летрозола, для оценки реакции на препарат использовали отношение эстрадиол/общий тестостерон и отношение эстрадиол/свободный тестостерон. В группе здоровых женщин на третий день пробы граница доверительного интервала (при р=0,05) коэффициента эстрадиол/общий тестостерон колебалась от 47,6 до 97,5, а коэффициента эстрадиол/свободный тестостерон от 15,2 до 36,1.

Проба с ингибитором ароматазы летрозолом была проведена 15 больным СПЯ, возраст которых варьировал от 23 до 29 лет и в среднем составил 26,2±0,6 года. Индекс массы тела варьировал от 19,1 кг/м2 до 34,2 кг/м2 и в среднем составил 26,2±1,6 кг/м2. Возраст менархе колебался от 11 до 15 лет и в среднем составил 12,6±0,3 года. У всех больных СПЯ были выявлены нарушения менструального цикла по типу олигоопсоменореи (п=6) или вторичной аменореи (п=9). У 5 женщин с СПЯ имелось первичное бесплодие продолжительностью от 1,5 до 3 лет, средняя продолжительность - 2,5±0,3 года.

Таблица 4

Изменения уровня гонадотропинов в крови обследованных женщин в ответ на прием летрозола

Показатели Уровень гормонов в крови (М±ш) Р

СПЯ (п=15) Группа сравнения (п= 16) '

ФСГ(МЕ/л) - 1 й день пробы 5,3±0,4 (4,4-6,2)* 6,0±0,3 (5,4-6,6) 0,2

ФСГ(МЕ/л) - Зй день пробы 8,6±0,3 (7,9-9,3) 10,1 ±0,6 (8,9-11,3) 0,1

Абсолютная разница ФСГ(МЕ/л) 3,3±0,6 (2,1-4,5) 4,1 ±0,5 (2,9-5,2) 0,4

Относительная разница ФСГ от исходного(%) 81,7±23,4 (30,8-132,7) 70,1±10,3 (50,6-92,2) 0,7

ЛГ(МЕ/л) - 1й день пробы 7,7±1,0 (5,5-9,8) 3,5±0,5 (2,5-4,5) 0,004

ЛГ(МЕ/л) - Зй день пробы 10,2±1,4 (7,2-13,2) 7,1 ±0,6 (5,9-8,3) 0,06

Абсолютная разница ЛГ(МЕ/л) 2,6±0,9 (0,6-4,5) 3,6±0,5 (2,6-4,7) 0,3

Примечание:

* - в скобках приведены границы доверительного интервала (при р=0,05)

Реакция больных СПЯ на летрозол была схожей с реакцией здоровых женщин (табл. 4-5). Не наблюдалось значимых различий в исследуемых группах в абсолютном и относительном увеличении к третьему дню пробы уровня ФСГ и андрогенов в крови (р>0,05), в уменьшении содержания эстрадиола в крови (р>0,05). Относительный прирост содержания ЛГ в крови больных СПЯ, на третий день пробы был достоверно (р=0,01) ниже, чем в группе сравнения, однако при сравнении абсолютных показателей динамики ЛГ разница в исследуемых группах не была статистически значима (р=0,3). Снижение коэффициентов эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон при СПЯ на третий день пробы было более выраженным, чем у здоровых женщин.

Таблица 5

Изменения уровня эетрадиола, общего и свободного тестостерона в крови обследованных женщин в ответ на прием летрозола

Показатели Уровень гормонов в крови (М±т) Р

СПЯ (п=15) Группа сравнения (п=16)

Общий тестостерон (нмоль/л) - 1й день пробы 2,0±0,2 (1,6-2,4)* 1,4±0,2 (1,1-1,8) 0,08

Общий тестостерон (нмоль/л) - Зй день пробы 2,4±0,2 (1,9-2,9) 1,7±0,2 (1,3-2,1) 0,2

Абсолютная разница общего тестостерона (нмоль/л) 0,5±0,1 (0,2-0,8) 0,2±0,2 (-0,1-0,6) 0,9

Относительная разница общего тестостерона (%) 29,1±7,8 (12,1-46,2) 22,1±16,4 (-13,0-57,3) 0,6

Свободный тестостерон (пмоль/л) - 1й день пробы 9,6±2,5 (4,2-15,0) 5,6±1,0 (3,5-7,7) 0,3

Свободный тестостерон (пмоль/л) - Зй день пробы 9,9±1,8 (6,0-13,9) 5,9±1,1 (3,6-8,2) 0,1

Абсолютная разница свободного тестостерона (пмоль/л) 0,3±1,1 (-2,0-2,7) 0,3 ±0,4 (-0,6-1,2) 0,3

Относительная разница свободного тестостерона (%) 15,4±8,1 (-2,3-33,17) 18,7±16,0 (15,9-53,3) 0,3

Эстрадиол (пмоль/л) - 1 й день пробы 146,7±7,8 (129,8-163,6) 144,2±7,9 (127,3-161,0) 1,00

Эстрадиол (пмоль/л) - Зй день пробы 98,5±3,1 (91,8-105,2) 105,9±4,5 (96,3-115,4) 0,2

Абсолютная разница эетрадиола (пмоль/л) -48,2±6,8 (-63,0-(-33,4)) -38,3±8,6 (-19,8-(-56,8)) 0,4

Относительная разница эетрадиола (%) -31,5±2,7 (-37,4-(-25,6)) -24,0±4,8 (-13,7-(-34,2)) 0,3

Отношение эетрадиола (пмоль/л) к общему тестостерону (нмоль/л) — 1й день пробы 79,9±8,0 (62,5-97,4) 114,6±15,8 (80,4-148,8) 0,1

Отношение эетрадиола (пмоль/л) к общему тестостерону (нмоль/л) — Зй день пробы 44,6±4,0 (35,9-53,3) 72,5±11,5 (47,6-97,5) 0,05

Отношение эетрадиола (пмоль/л) к свободному тестостерону (пмоль/л) - 1 й день пробы 23,2±5,1 (12,0-34,4) 39,0±8,0 (21,8-56,3) 0,3

Отношение эетрадиола (пмоль/л) к свободному тестостерону (пмоль/л) - Зй день пробы 14,5±2,7 (8,7-20,3) 25,7±4,8 (15,2-36,1) 0,06

Примечание:

* - в скобках приведены границы доверительного интервала (при р=0,05)

Результаты генетического исследования

Всем больным СПЯ (п=92) было проведено генетическое исследование, включающее в себя анализ аллелей и генотипов по гену CYP19 ((ТТТА)п полиморфизм, del(TCT) полиморфизм и SNP50 (rs2414096)).

Аналогичное генетическое исследование проведено всем (п=55) женщинам группы сравнения. Возраст женщин колебался от 22 до 56 лет и в среднем составил 30,7±1,3 года. Средний возраст менархе в группе сравнения равнялся 12,5±0,3 года. На момент исследования 49 женщин группы сравнения имели регулярный менструальный цикл, у 6 женщин наступила своевременная менопауза. В группе сравнения беременности в анамнезе отмечены у 38 женщин, у 28 женщин было двое физиологических родов, у двоих — одни роды, 8 женщин имели в прошлом невынашивание беременности. У всех женщин репродуктивного возраста группы сравнения зарегистрирована овуляция с полноценной лютеиновой фазой.

Частыми генотипами по гену CYP19 ((ТТТА)п полиморфизм) как у больных СПЯ, так и у женщин группы сравнения были: (ТТТА)7(ТТТА)7 (25% и 30,9% соответственно), (ТТТА)7(ТТТА)8 (15,2% и 18,2% соответственно) и (ТТТА)7(ТТТА)11 (28,3% и 16,4% соответственно). Остальные генотипы гена CYP19 ((ТТТА)п полиморфизм) встречались реже в обеих группах. При анализе частот генотипов по гену CYP19 ((ТТТА)п полиморфизм) не выявлено статистически значимых различий между сравниваемыми группами (р>0,05). Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей одного из двух полиморфных вариантов гена CYP19 (del(TCT)) между выборками больных с СПЯ и группы сравнения также не выявил достоверных различий (р>0,05). Согласно полученным данным, генотипы SNP50 (rs2414096) AJA и G/G по гену CYP19 встречались реже в группе больных СПЯ, чем в группе сравнения, но эта разница не была достоверной (р>0,05). Частота A/G генотипа по гену CYP19 SNP50 (rs2414096) в группе с

СПЯ превышала таковую в группе сравнения (46,7% и 40% соответственно), однако, данные различия также не были статистически достоверны (р>0,05). При анализе ассоциации анамнестических данных, результатов гормонального исследования больных СПЯ с полиморфизмом гена ароматазы р450 СУР 19 ((ТТТА)п полиморфизм, <1е1(ТСТ) полиморфизм и БЫР50 (гб24 14096)) достоверных различий обнаружено не было (р>0,05). Анализ аллелей и генотипов по гену ароматазы СУР19 ((ТТТА)п полиморфизм, с1е1(ТСТ) полиморфизм и БЫР50 (гэ2414096)) не выявил ассоциации с клиническими и гормональными особенностями СПЯ.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с полноценным овуляторным менструальным циклом экспрессия овариальной ароматазы положительно коррелирует с размером доминантного фолликула и уровнем эстрадиола в крови.

2. Однократный пероральный прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола вызывает через 48 часов достоверное снижение уровня эстрадиола (-24,0±4,8%) и адекватное повышение ФСГ (70,1±10,3%) и ЛГ (138,3±24,0%) в крови здоровых женщин.

3. Экспрессия овариальной ароматазы при синдроме поликистозных яичников соответствует размерам антральных фолликулов.

4. Реакция половых стероидных гормонов и гонадотропинов на ингибитор ароматазы летрозол при синдроме поликистозных яичников не выходит за пределы ее физиологических колебаний у здоровых женщин.

5. Снижение коэффициентов эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон у больных синдромом поликистозных яичников по сравнению с аналогичными коэффициентами у женщин с сохраненным овуляторным циклом свидетельствует об относительном

дефиците овариальной ароматазы, вероятно, обусловленным гиперпродукцией ЛГ гипофизом.

6. Частоты аллелей и генотипов по гену ароматазы СУР19 ((ТТТА)п полиморфизм, ёе!(ТСТ) полиморфизм и БОТ50 (ге2414096)) не отличаются у больных СПЯ и у женщин группы сравнения (р>0,05).

7. Результаты пробы с ингибитором ароматазы летрозолом и генетического исследования гена ароматазы СУР19 не позволяют считать дефицит овариальной ароматазы причиной развития синдрома поликистозных яичников.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Проба с летрозолом (заявка на изобретение № 201206289) для определения ароматазной активности может использоваться в научно-исследовательской и клинической практике. Однократный пероральный прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола на 2-й день менструального цикла вызывает достоверное снижение уровня эстрадиола и адекватное повышение гонадотропинов в крови здоровых женщин.

2. Оценка пробы с летрозолом:

A. Снижение уровня эстрадиола в крови через 48 часов более чем на 56,8 пмоль/л или более чем на 34,2% указывает на повышенную ароматазную активность. Снижение уровня эстрадиола в крови через 48 часов менее чем на 19,8 пмоль/л или менее чем на 13,7% указывает на пониженную ароматазную активность.

B. У здоровых женщин снижение уровня эстрадиола сопровождается подъемом уровня гонадотропинов в крови: ФСГ с 6,0±0,3 МЕ/л до 10,1±0,6 МЕ/л (70,1±10,3%), ЛГ с 3,5±0,5 МЕ/л до 7,1±0,6 МЕ/л (138,3±24,0%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аллельные варианты гена CYP19 (ароматазы р450) и активность ароматазы р450 у больных синдромом поликнстозных яичников / В.А. Савина, Н.Ю. Швед, В.В. Потин [и др.] // Медицинская генетика. — 2012. — № 4. — С. 36 - 41.

2. Ароматазная активность при синдроме поликистозных яичников / В.А. Савина, В.В. Потин, М.А. Тарасова, Н.Н. Ткаченко // Материалы VI Всероссийского конгресса эндокринологов. — М., 2012. — С. 502. — электрон, опт. диск (CD-ROM).

3. Овариальная ароматаза р450 при синдроме поликистозных яичников / В.А. Савина, И.М. Кветной, М.А. Клещев [и др.] // Медицинский академический журнал. — 2012. — Т. 11, вып. 1. — С. 47- 53.

4. Применение ингибитора ароматазы летрозола для индукции овуляции у женщин с синдромом поликистозных яичников / А.З. Морчиладзе, В.А. Савина, Н.Н. Ткаченко, М.И. Ярмолинская // Журнал акушерства и женских болезней. — 2011. — Т. LX, вып. 2. — С. 52- 58.

5. Роль овариальной ароматазы р450 в патогенезе нормогонадотропной ановуляции / В.А.Савина, В.В. Потин, В.В. Рулев [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. — 2011. — Том LX, спецвып. — С. 81.

6. Савина, В.А. Определение экспрессии ароматазы в яичниках иммуногистохимическим методом / В.А. Савина, Г.Х. Толибова // Журнал акушерства и женских болезней — 2011 г. — Т. 60. — № 4. — С. 144.

7. Савина, В.А. Овариальная ароматаза р450 при нормогонадотропной недостаточности яичников / В.А. Савина // Журнал акушерства и женских болезней. — 2012. — Т. LXI, вып. 1. — С. 84- 89.

8. Савина, В.А. Роль ароматазы в патогенезе первично-овариальной недостаточности / В.А. Савина, В.В. Потин, М.А. Тарасова // Журнал акушерства и женских болезней. — 2010. — Т. 59, вып. 6. — С. 85- 93.

9. Савина, В.А. Экспрессия ароматазы в яичниках в норме и при нормогонадотропной ановуляции / В.А. Савина, Г.Х. Толибова // Труды шестой Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье -основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения». - СПб., 2011, — С. 211-212.

Подписано в печать 29.08.2012г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 2796.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru