Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль аквапоринов в поддержании прозрачности хрусталика (экспериментальное исследование)

На права.),

Ьукопш

¡Г

СУМЕРКИНА Вероника Андреевна

РОЛЬ АКВАПОРИНОВ В ПОДДЕРЖАНИИ ПРОЗРАЧНОСТИ ХРУСТАЛИКА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2010

003493100

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии и Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

ПОПОВ Геннадий Константинович

ГОЛОВНЕВЛ Елена Станиславовна БЫКОВ Евгений Витальевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Омск

Защита состоится «08» апреля 2010 г. в_на заседании диссертационного

совета Д 208.117.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

ТИШЕВСКАЯ Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

Катаракта является одной из ведущих причин слабовидения и слепоты наряду с глаукомой и возрастной макулярной дегенерацией (Р.А. Гундорова и соавт., 2004, 2005, 2006). По данным Всемирной Организации Здравоохранения, на долю катаракты приходится 42 % всей глазной патологии. Согласно статистике, частота возрастной катаракты составляет 33,2 случая на 1 000 населения, причём эта цифра существенно увеличивается с возрастом и достигает в 70 - 79 лет 262,3 на I 000 мужчин и 464,3 на 1 000 женщин. Практически все лица старше 80 лет страдают катарактой (Г.С. Полунин и соавт., 2007).

Основным методом лечения катаракты является хирургическая замена помутневшего хрусталика искусственным (Р.А. Гундорова и соавт., 2005). Однако известно, что через 2-5 лет после оперативного лечения у 25,7 -50,0 % больных наблюдается вторичное снижение остроты зрения вследствие помутнения задней капсулы хрусталика. Это связано с миграцией клеток эпителия с передней капсулы хрусталика на заднюю с их последующей эпитслиально-мезенхимальной трансформацией в фибробласты и миофибробласты, что приводит к образованию на задней капсуле многослойных бляшек (J.M. Wormstone et al., 2001; A. Cerra et al., 2003; K.J. Mansfield et al., 2004). Группу риска по формированию катаракты составляют больные, перенесшие любое хирургическое вмешательство на глазном яблоке (О.И. Кваша, 2007).

В хирургическом лечении катаракты, особенно после внедрения методов факоэмульсификации, достигнуты большие успехи, тем не менее, побочные эффекты и последствия оперативного вмешательства стимулируют исследователей на поиск лекарственных средств для профилактики и, возможно, лечения катаракты (Р.А. Гундорова и соавт., 2005, 2006; О.И. Кваша, 2007). Разработка методов воздействия на прозрачность хрусталика в значительной мере зависит от понимания молекулярных основ катарактогенеза.

В настоящее время достаточно хорошо изучены патогенетические закономерности развития катаракты. Помутнение хрусталика - сложный многофакторный и многостадийный процесс. На прозрачность хрусталика влияют углеводный дисбаланс, неблагоприятные факторы окружающей среды -световая энергия, радиоактивное излучение, электромагнитное поле, механические повреждения. Ключевой этап помутнения хрусталика заключается в агрегации водорастворимых белков кристаллинов, физико-химическое состояние которых определяет прозрачность в большей степени, чем изменения других компонентов. В нормально функционирующем хрусталике кристаллины находятся в виде высококонцентрированного раствора, прозрачного для видимого света. При развитии катаракты под действием неблагоприятных факторов происходит образование крупномолекулярных белковых агрегатов, которые при определённых концентрациях служат причинами помутнения хрусталика.

В последние годы в исследовательских работах, посвященных проблеме помутнения хрусталика, большое внимание стали уделять состоянию его водного гомеостаза. Основными структурами, участвующими в поддержании баланса воды хрусталика, являются белки плазматических мембран -аквапорины (AQP0 волокнистых клеток и AQP1 эпителиальных клеток капсулы) (S.M. Mulders et al, 1995; S. Hamann et al, 1998; K.L. Schey et al. 2000; P. Donaldson et al, 2001; Y. Fujiyoshi et al, 2002; L.E. Ball et al, 2003). Изменение водного гомеостаза непосредственно воздействует на структуру водорастворимых кристаллинов хрусталика, что влияет на состояние его прозрачности. В литературе описаны механизмы гуморальной регуляции активности различных изоформ аквапоринов в почках, головном мозге, лёгких, однако относительно AQP хрусталика эта проблема остаётся нерешённой (D. Marples et al, 1999; Р. Agre, 2004). Кроме того, практически не исследован вопрос об источнике биологически активных веществ, регулирующих функцию аквапоринов хрусталика. Возможно, на эту роль претендует цилиарное тело, поскольку в некоторых работах (J. Escribano et al, 2002; М. Coca-Prados et al, 2007) высказано предположение о том, что оно является мультиэндокринной железой, продуцирующей комплекс биологически активных веществ.

Результаты многочисленных экспериментальных исследований свидетельствуют о существовании потенциальной возможности воздействия па различные звенья формирования помутнения хрусталика, в частности на агрегацию водорастворимых белков цитоплазмы кристаллинов волокнистых клеток (С.Э. Аветисов и соавт., 2008; К.О. Муранов и соавт., 2008, J1.B. Соустов и соавт., 2008).

Известно, что биологические препараты, полученные из интенсивно пролиферирующих тканей, способны поддерживать тканевый и клеточный гомеостаз (В.П. Ямскова и соавт., 2000). К таковым можно отнести развивающиеся органы в различные периоды эмбриогенеза. В Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца доказано, что регуляторный белок, выделенный из хрусталика быка, предотвращает развитие ядерного помутнения хрусталика in vitro (М.С. Краснов и соавт., 2005). Наше внимание обращено на экстракт, полученный из глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона, поскольку именно в этот период развития в тканях присутствует комплекс биологически активных веществ, определяющих высокий пролиферативный потенциал, миграционную способность и дифференцировку клеток.

Анализ этих данных определил цель нашего исследования.

Цель работы

В условиях эксперимента in vitro изучить влияние на прозрачность хрусталика некоторых повреждающих факторов, гуморальных регуляторов активности аквапоринов, а также экстрактов различных тканей.

Задачи исследования

I. Исследовать влияние изменения кальциевого и водного гомеостаза хрусталика на его прозрачность в условиях in vitro;

2. В условиях in vitro оценить прозрачность хрусталика под влиянием гуморальных регуляторов активности аквапоринов;

3. Оценить характер воздействия на прозрачность хрусталика экстракта цилиарного тела;

4. Исследовать влияние экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона па прозрачность хрусталика в условиях in vitro, определить некоторые биохимические и иммунологические свойства экстракта.

Научная новизна

Впервые показано, что нарушение функции аквапоринов в условиях in vitro вызывает изменение прозрачности хрусталика в более ранние сроки, чем дисфункция кальциевых каналов. Установлено положительное влияние гуморальных регуляторов активности аквапоринов (вазопрессин, эстрогены, компоненты рении-ангиотензиновой системы) на прозрачность хрусталика. В условиях эксперимента впервые показано, что экстракт цилиарного тела и экстракт глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона оказывают положительное влияние на прозрачность хрусталика. Впервые исследованы некоторые биохимические и иммунологические свойства экстракта глаза четырнадцатидиевпого куриного эмбриона. В экспериментальных условиях впервые получены косвенные свидетельства существования локальной ренин-ангиотензиновой системы хрусталика.

Теоретическая и практическая значимость работы

В исследовании показан характер влияния различных факторов, в том числе гуморальных регуляторов активности аквапоринов, на прозрачность хрусталика. Доказано положительное влияние на прозрачность хрусталика веществ, обладающих способностью индуцировать шаперонную активность кристаллипов, а также экстракта глаза куриного эмбриона. Полученные результаты могут послужитьть основой для понимания фундаментальных молекулярных механизмов, обеспечивающих сохранение прозрачности хрусталика на протяжении всей жизни, а также лежащих в основе катарактогенеза. Исследование обозначает новые направления поиска препаратов для профилактики и лечения катаракты.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Прозрачность хрусталика в условиях in vitro определяется постоянством кальциевого и водного гомеостаза его клеточных и внеклеточных структур. Одним из ключевых факторов в развитии помутнения хрусталика является нарушение циркуляции жидкости в его компартментах.

2. Гуморальными факторами, влияющими на прозрачность хрусталика в условиях in vitro, являются вазопрессин, эстрогены, компоненты ренин-ангиотензиновой системы.

3. Добавление в среду для культивирования хрусталика экстракта цилиарного тела оказывает положительное влияние на прозрачность.

4. Экстракт глаза четырнадцатидневного куримого эмбриона содержит комплекс биологически активных веществ, которые способствуют поддержанию прозрачности хрусталика в условиях in vitro.

5. Ацетилсалициловая кислота оказывает положительное влияние на прозрачность хрусталиков в условиях in vitro.

Апробация работы и публикации

Основные положения работы изложены и представлены на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Саратов, 2006), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященной памяти профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2008), Российском симпозиуме с международным участием, посвященном 70-летию заведующего кафедрой Башкирского государственного медицинского университета Д.А. Еникеева (Уфа, 2009), IV Съезде физиологов Урала с международным участием (Бжатеринбург, 2009).

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 5 из них - в ведущих рецензируемых журналах из перечня, определенного ВАК Минобрнауки РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 12 рисунками. Библиографический список включает 182 источника —40 отечественных и 142 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено иа 836 изолированных хрусталиках взрослых лабораторных беспородных крыс обоего пола. Для получения экстракта глаза было использовано 900 куриных эмбрионов (срок инкубации 14 дней), экстракта цилиарного тела — 20 взрослых лабораторных беспородных кроликов. Эксперименты на животных проводились в соответствии с требованиями Женевской конвенции «International Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990).

Экспериментальное моделирование катаракты in vitro. In vitro хрусталики крыс культивировали в стеклянных герметично закрытых пробирках в 5,0 мл 0,9 % стерильного раствора NaCI, содержащего 80 мг/л гентамицина сульфата, при 37°С. Содержание СаС12 в среде составляло 0,7 мМ, глюкозы — 5 мМ. Вещества, влияние на прозрачность хрусталика которых изучали в исследовании, добавляли в питательную среду в начале культивирования. Степень помутнения хрусталиков оценивали визуально по четырёхбалльной шкале, используя разлинованную подложку. Показателем

изменения водного гомеостаза хрусталиков служило изменение их массы через одни сутки культивирования. Для этого исследуемые хрусталики взвешивали на торсионных весах сразу после извлечения из глаза (Мо. мг) и через одни сутки культивирования (М|, мг). Рассчитывали изменение массы хрусталиков (ДМ = ((М, - М0) / М0) х 100, %).

Получение экстрактов органов и тканей. В экспериментальных условиях получали экстракты гипофиза крысы, цилиарного тела кролика, а также тканей глаза четырнадцатидпевпого куриного эмбриона. Экстракты получали путём гомогенизирования соответствующих органов и тканей с последующим трёхкратным замораживанием и оттаиванием гомогенатов (i. Berczi el al, 2001).

Биохимические .методы. Белок в экстракте глаза куриного эмбриона определяли микрометодом с реактивом Венедикта (Э.М. Коробейникова и соавт., 2000). Белковые фракции в экстрактах определяли методом электрофореза на бумаге по A.IZ. Гуриичу (А.Л. Покровский, 1969). Содержание молекул средней массы определяли по методике, предложенной Габрюляном (Н.И. Габриэлям и соавт., 1984; М.Я. Малахова и соавт., 1987; М.А. Пирадов и соавт., 1990; Е.В. Карякина и соавт., 2004). Активность тканевой желатиназы исследовали с помощью метода прямой зимографии в геле (Е.С. Головнёва, 2003; S. Tyagi et al, 1996).

Иммунологические методы. Хемоаттрактантную активность экстракта глаза куриного эмбриона определяли по методике, предложенной Нелсоном (R.D. Nelson et al, 1975).

Иммуногистохнмические методы. Им му ногистохимическое

исследование хрусталика четырнадцатидневного куриного эмбриона проводили с помощью набора мопоклональных антител к вазоэндотелиалыюму фактору роста VEGF (Upstate. США). Выявление тканевых антигенов проводилось авидин-биотиновым методом, в котором биотипилированные вторичные антитела реагирую! с соответствующими участками пероксидазно-конъюгированного стрептавидина. В качестве хромогенной метки был использован раствор диаминобензидина. Исследование проводилось по стандартной методике, рекомендованной фирмой-производителем набора антител.

Статистические методы. Для статистического анализа полученных данных были использованы программы "Microsoft Excel 2002"1 и "STATISTICA 6,0". Во всех исследуемых выборках гипотеза о нормальности распределения была проверена с помощью критериев согласия yj Пирсона, Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилка, Эппса-Палли. Поскольку распределение величин в рассматриваемых выборках не относится к нормальному, то для определения различия сравниваемых независимых выборок использовали непараметрнческие критерии Крамера-Уэлча, Вилкоксона-Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Сходство или различие связанных выборок определяли с помощью следующих непараметрических критериев: критерия знаков, критерия знаковых рангов Вилкоксона, критерия Крамер-Уэлча, омега-квадрага. Доверительная вероятность Р принималась равной 0,95 (Д. Сепетдиев, 1968; Л.Е. Поляков, 1971; Е.В. Гублер и соавт., 1973, 1978;

А.И. Венчиков и соавт., 1974; А.И. Орлов, 1987, 2003, 2004; Г.Ф. Лакин, 1990; М.Р. Ефимова и соавт., 1999; Ю.П. Лисицын, 2002; О.Ю. Реброва, 2002; Л.Е. Сырцова и соавт., 2004; Б.Ю. Лемешко и соавт., 2005; ГОСТ Р ИСО 5479-2002).

Результаты исследования

Факторы, оказывающие влияние на прозрачность хрусталика в условиях in vitro. В работе изучалось воздействие на прозрачность хрусталика повышенного содержания ионов кальция (15 мМ), блокады кальциевых каналов верапамилом (15 мкМ), а также сочетания высокой концентрации кальция и блокады кальциевых каналов в инкубационной среде. Кроме того, было исследовано влияние на хрусталик блокады аквапоринов эпителия капсулы (AQP1) хлоридом ртути (HgCI2 0,3 мМ).

Результаты работы показали, что различные патологические факторы оказывают неодинаковое влияние на прозрачность хрусталика (табл. I).

Таблица I

Сравнительная оценка сроков помутнения хрусталиков в зависимости от условий культивирования in vitro, Me (25 %; 75 %)

Срок появления помутнения, сутки

Группа 1 степень 2 степень 3 степень

(начальное (промежуточное (полное

помутнение) помутнение) помутнение)

Контроль (фи), раствор) 2 (2; 4) 5 (4; 6) 6 (5; X)

(п = 31)

Избыток ионов Са!+ в среде I (1;2) 3 (2; 3) 4(3; 5)

(СаСЬ 15 мМ) * * *

(п = 3() • • • • •

Блокада кальциевых каналов 2 (2; 2) 4(3; 5) 4(3; 6)

(верапамил 15 мкМ) •• • • *

(п = 31) • •

Избыток ионов Са"+ в среде + i (1; О 2 (2; 2) 3 (2; 4)

блокада кальциевых каналов * * *

(СаСЬ 15 мМ + •

верапамил 15 мкМ)

(п = 31)

Блокада аквапоринов i(i; i) 2(1:2) 2 (2; 2)

№С12 0,3 мМ) * * *

(п = 31)

* - р < 0,01 по сравнению с контролем; • - р < 0,05 по сравнению с HgCh; •• - р < 0,01 по сравнению с HgCl;

В контрольной группе при отсутствии воздействия патологических агентов начальное помутнение наблюдалось на 2 сутки, полное помутнение на 6 сутки. Избыток ионов кальция в культуральной среде вызывал достаточно быстрое, по сравнению с контролем, помутнение хрусталика (добавление в среду 15 мМ СаС12инициировало помутнение на 1 сутки, полное помутнение-

на 4 сутки). В работах других авторов доказано, что повышение уровня внутриклеточного кальция приводит к ряду метаболических и регуляторных нарушений в клетке: активации протеаз (калпаин 1 и 2, калпастатин), ингибированию Ыа,К-АТФазы, синтезу патологических белков, нарушению вторичной и третичной структуры нормальных белков, апоптозу, нарушению мембранной проницаемости. Высокая концентрация ионов кальция нарушает работу натриевых насосов, оказывая прямое цитотоксическое действие на эту структуру (N.A. Delainere et al, 1993). Все вышеперечисленные факторы приводят к нарушению молекулярной структуры белков хрусталика и, следовательно, к его помутнению (R.J.W. Truscott et al, 1990; J. Sanderson et al, 2000; L.-F. Wang et al, 2001; M.R. Williams et al, 2001; D. Tang et al. 2003; P.D. Cîupta et al, 2004).

Клокада кальциевых каналов верапамилом при физиологической концентрации ионов кальция в среде (0,7 мМ) также вызывала помутнение хрусталика в более короткие, по сравнению с контролем, сроки (начальное помутнение — 2 сутки, полное помутнение па 4 сутки). Это можно объяснять создаваемым дефицитом ионов кальция в клетках хрусталика, что сказывается на интенсивности обменных процессов, поскольку кальций является активатором различных ферментных систем и выступает в роли внеклеточного мессенджера. Некоторые исследователи описывают формирование так называемой гипокальциемической катаракты при снижении концентрации кальция (P.D. Gupta et al, 2004).

В норме концентрация ионов кальция в поверхностных слоях хрусталика ниже, чем в ядре. К. Németh-Cahalan и соавт. (2000, 2004) полагают, что недостаток кальция в волокнистых клетках ядра повышает проницаемость водных каналов AQP0, вызывая помутнение хрусталика. Этот эффект опосредуется капьмодулином, поскольку С-концевой конец аквапоринаО имеет специфический участок для его связывания (К. Varadaraj et al, 2005; K.M.I,. Rose et al, 2008).

При одновременном добавлении в инкубационную среду высокой концентрации СаСЬ и всрапамила развивалось быстрое помутнение хрусталика (начальное помутнение - 1 сутки, полное помутнение - 3 сутки). Нарушение прозрачности в данном случае может быть обусловлено низкой концентрацией ионов кальция, высокой активностью аквапорина 0 (в ответ на недостаток кальция в волокнистых клеток) и дефицитом воды в хрусталике. По-видимому, таког о рода изменения оказывают более выраженное негативное воздействие на прозрачность, чем изолированный избыток или недостаток кальция в хрусталике.

Однако, как показали результаты проведенных экспериментов, большее значение в развитии помутнения хрусталика играет дисфункция водных каналов. Применение блокатора акваноринов HgCI2 в концентрации 0,3 мМ резко сокращает сроки формирования помутнения хрусталика. Начальное помутнение фиксируется уже в 1 сутки культивирования, а полное - на 2 сутки. Описанное действие 0,3 мМ сулемы оценивается нами как эффект функционального блокирования акваноринов, а не токсического влияния на

клетки, которое реализуется при концентрации 0,7 мМ (И.О. Folkesson et al, 1994). Блокада аквапоринов AQP1 вызывает нарушение циркуляции жидкости между эпителием капсулы и волокнистыми клетками ядра хрусталика, что приводит к повреждению структуры водорастворимых белков крисгаллинов, которые определяют прозрачность хрусталика и обладают активностью белков теплового шока и шаперонов. В результате развивается помутнение хрусталика. Полученные нами экспериментальные данные согласуются с клиническими исследованиями других авторов. Доказано нарушение функции AQP0, снижение количества AQP1 и возрастание содержания воды в ядре хрусталика больных сенильной катарактой (L.J. Takemoto et al, 1991).

Влияние биологически активных веществ на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика в условиях in vitro. В литературе имеются сообщения о том, что на прозрачность хрусталика оказывают влияние биологически активные вещества, присутствующие во внутриглазной жидкости. Это обстоятельство послужило теоретической предпосылкой для проведения следующей серии экспериментов - изучить влияние гуморальных факторов на водный гомеостаз и прозрачность хрусталика (L.S. King et al, 1996; С. Moon et al, 1997; R.V. Patil et al, 1997; T. Ma et al. 1998).

Вазопрессин, Вопрос гуморальной регуляции функции аквапоринов хрусталика (AQP0 и AQP1) освещен недостаточно широко. Однако доказано, что активность аквапорина 2 и аквапорина 4 (AQP2 и AQP4) собирательных трубочек почек находится под регуляторным влиянием вазопрессина. Различные изоформы водных каналов имеют гомологичную биохимическую структуру (S. Nielsen et al, 1993; A. Frigeri et al, 1995; D. Marples et al, 1999; 'Г. Brawn et al, 2000; S. Hohmann et al, 2000; P. Agre, 2004). В этой связи представляется актуальным исследовать эффект вазопрессина на функционирование аквапоринов хрусталика в условиях in vitro. В первой серии экспериментов изучали влияние экстракта гипофиза крысы на состояние водного гомеостаза и прозрачность хрусталика. Экстракт был использован в качестве источника вазопрессина, поскольку из всего комплекса биологически активных веществ, синтезирующихся в гипофизе, этот пептид является единственным эффектором, оказывающим непосредственное влияние на водный гомеостаз клетки (табл. 2). Во второй серии хрусталики культивировали в среде, содержащей различные концентрации синтетического аналога вазопрессина (десмопрессина ацетат) (табл. 3).

Добавление в культуральную среду как синтетического аналога вазопрессина, так и экстракта гипофиза позволяет существенно продлить срок сохранения прозрачности хрусталиков. Вероятно, вазопрессин активирует функцию аквапоринов эпителия капсулы, обеспечивая поступление в хрусталик необходимого для поддержания метаболизма количества воды. Этому сопутствует достоверно большее увеличение массы, чем в контроле. В результате хрусталики сохраняют прозрачность до 8 - 9 суток (контроль - 6 сутки).

Таблица 2

Сравнительная оценка сроков помутнения и изменения массы хрусталиков в опытных (культивирование в среде с различным содержанием экстракта гипофиза) и контрольной (культивирование в физиологическом растворе) группах, Ме (25 %; 75 %)

"^\Группа Контроль (п = 31) Концентрация экстракта гипофиза

0,02 % 0,03 % 0,04 % 0,05 %

Параметр 0 = 31) (п = 31) (и = 31) (п = 31)

Изменение массы 8,9 10,7 5,0 6,2 8,2

через одни сутки (5,5; 11,0) (5,8; 13,5) (1,0; 8,5) (3,8; 12,2) (5,4; 9,5)

культивирования ДМ. % * ** **

Начальное 2 (2; 4) 2(2; 3) 2(1;3) 2(1:2) 1(1; 2)

помутнение (1 степень), сутки * * **

Промежуточное 5 (4; 6) 5(4;7) 6(5; 7) 4(3; 4) 4 (4; 5)

помутнение (2 степень), сутки * * *

Полное помутнение 6 (5; 8) 8(7; И) 10(8; 12) 8(6; 10) 8 (5; 10)

(3 степень), сутки * ** » *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - р < 0,01 по сравнению с контролем.

Таблица 3

Сравнительная оценка сроков помутнения и изменения массы хрусталиков опытных (культивирование в среде с различным содержанием десмопрессипа ацетата) и контрольной (культивирование в физиологическом растворе) группах, Ме (25 %; 75 %)

Группа Контроль (п = 31) Концентрация десмопрессипа ацетата

10 пг/мл 25 пг/мл 50 пг/мл

Параметр (и =31) (ч=31) (п= 31)

Изменение массы 8,9 12,6 12,0 11,2

через одни сутки (5,5; 11,0) (10.9; 14,7) (10,1; 14,0) (8,0; 13.1)

культивирования ДМ. % * * *

Начальное 2 (2; 4) 2 (2; 2) 2(1; 3) 2(1:2)

помутнение (1 степень), сутки * * *

Промежуточное 5 (4; 6) 5 (4; 6) 5 (4; 7) 5 (4; 6)

помутнение (2 степень), сутки

Полное помутнение (3 степень), сутки 6(5; 8) 8(6; 10) ** 9(7; 10) ** 9(7; II) **

* - р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - р < 0,01 по сравнению с контролем.

Компоненты ренин-ангиотензиновой системы

(ангиотензинпревращающий фермент (ЛПФ) и ангиотензин II). В литературе, посвященной функционированию ренин-ангиотензиновой системы, упоминается возможность влияния её продуктов на обмен жидкости в различных структурах глаза. В частности, считается, что РАС регулирует секрецию внутриглазной жидкости. В структурах глаза экспрессируется большинство компонентов ренин-ангиотензиновой системы (А.В. СиШпапе е( а1, 2002; C.J. \1oravski е( а1, 2003). Однако до сих пор нет данных о влиянии РАС на жизнедеятельность хрусталика. В то же время в исследованиях на других органах, например на почках, доказано регулирующее влияние ангиотензина II на активность аквапоринов 1 (Я. Вои!еу е( а1, 2009; Г-Н. Клуоп е1 а1, 2005). В работе изучали влияние присутствия в среде 23 нМ каптоприла и 10 мкМ валсартана на прозрачность и водный гомеостаз хрусталиков.

Ингибитор АПФ каптоприл позволил сохранить прозрачность хрусталиков до 9 суток, что достоверно больше, чем в контрольной группе (табл. 4). В опытной группе наблюдалось увеличение массы хрусталиков на 8,4 % от первоначальной величины, однако этот показатель не различался с контрольной группой (8,9 %). Блокада рецепторов к ангиотензину 11 эпителиальных клеток капсулы хрусталика продлевала прозрачность хрусталика до 8 суток. Масса хрусталиков через одни сутки культивирования увеличивалась на 12,8 %. Оба показателя достоверно отличаются от контрольной группы.

Таблица 4

Сроки формирования различных степеней помутнения и изменение массы хрусталиков в опытных (блокада ангиотспзинпревращающего фермента, блокада рецепторов к ангиотензину II) и контрольной (культивирование в физиологическом растворе) группах, Ме (25 %; 75 %)

Параметр Контроль (п = 31) Блокада АПФ (каптоприл) (п = 33) Блокада рецепторов к ангиотензину 11 (валсартан) (л = 22)

Изменение массы через одни сутки культивирования ДМ, % 8.9 (5,5; 11,0) 8,4 (5,0; 14,1) 12.8 (11,8; 15,1) **, ••

Начальное помугнение (I степень), сутки 2 (2; 4) 2 (2; 2) * 1 (1;2) ** •

Промежуточное помутнение (2 степень), сугки 5 (4; 6) 5 (4; 6) 4(3; 4) * •

Полное помутнение (3 степень), сутки 6 (5; 8) 9(7; II) ** 8 (7; 9) *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - р < 0,01 по сравнению с контролем; •- р < 0,05 по сравнению с каптоприлом; •• - р < 0,01 по сравнению с каптоприлом.

На этом основании можно сделать вывод, что ренин-ангиотензиновая система оказывает влияние на регуляцию жизнедеятельности хрусталика. Вероятно, в эпителиальных клетках капсулы хрусталика существует собственная система синтеза компонентов репин-ангиотензиновой системы. Маши данные косвенно свидетельствуют о синтезе ангиотензина 11 эпителиальными клетками капсулы хрусталика (блокада АПФ эпителия капсулы хрусталика каптоприлом), а также о наличии рецепторного аппарата к этому пептиду. Поэтому можно предположить наличие аутокринной и паракринной регуляции активности акваноринов хрусталика посредством ангиотензина II. В хрусталике синтез AT1I может происходить как в эпителии передней капсулы, обладающем высокой метаболической активностью, так и в волокнистых клетках, содержащих криеталлины, проявляющие шаперонные свойства.

Таким образом, подобно другим органам (сердце, почки, надпочечники, яичники, тимус) (W.D. Strain et al, 2002) хрусталик, возможно, имеет собственную локальную ренип-ангиотензиновую систему. Однако для доказательства этой гипотезы требуются дополнительные развёрнутые исследования относительно экспрессии компонентов РАС в хрусталике!

Эстрогены. Хрусталики культивировали в среде, содержащей 100 нМ синэстрола (синтетический эстрогенный препарат не стероидного строения). В опытной группе наблюдалось значительно большее увеличение массы хрусталиков (13,7 %), чем в контрольной (8,9 %) (табл. 5).

Таблица 5

Сроки формирования различных степеней помутнения и изменение массы

хрусталиков в опытной (культивирование в среде, содержащей 100 нМ синэстрола) и контрольной (культивирование в физиологическом растворе) группах, Me (25 %; 75 %)

" _Группа Контроль Синэстрол 100 нМ

(п = 31) (п = 32)

Параметр ———

Изменение массы через одни сутки 8,9 13,7

культивирования ДМ, % (5,5; 11,0) (11,6; 17,2) *

Начальное помутнение 2 (2; 4) 2(2;3)

(1 степень), сутки

Промежуточное помутнение 5 (4; 6) 6 (4; 7)

(2 степень), сутки

Полное помутнение 6 (5; 8) 8(7; И)

(3 степень), сутки *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем.

Изменение массы хрусталиков можно связать с активацией аквапорипов, что приводит к избыточному скоплению воды под капсулой хрусталика. Однако, несмотря на это обстоятельство, полное помутнение наступает на 8

сутки, что достоверно дольше, чем в контрольной группе (6 сутки). Наблюдаемое нами влияние эстрогенов на прозрачность хрусталика можно объяснить блокированием процессов перекисного окисления липидов, но для понимания механизмов регуляции водного гомеостаза хрусталика эстрогенами требуются дополнительные исследования.

Источник биологически активных веществ, регулирующих водный гомеостаза хрусталика в структуре глаза. В качестве источника регуляторов водного гомеостаза хрусталика можно предположить цилиарное тело, которое участвует в секреции внутриглазной жидкости. В этой связи в следующей серии экспериментов хрусталики были культивированы в среде, содержащей различные концентрации экстракта цилиарного тела (табл. 6).

Таблица 6

Сравнительная оценка сроков помутнения и изменения массы хрусталиков при культивировании в среде, содержащей экстракт цилиарного тела в различной концентрации, Ме (25 %; 75 %)

Группа Параметра. Контроль 01 = 31) Концентрация экстракта цилиарного тела, %

0,02 % (п = 31) 0,03 % (п = 31) 0,04 % (" = 31) 0,05 % (п = 31)

Изменение массы через одни сутки культивирования ДМ, % 8,9 (5,5; 11,0) 13,8 (10,8; 17,9) ** 12,0 (9,6; 15,8) * 12,5 (10,4; 18,1) ** 15,3 (12,9; 17,8) **

Начальное помутнение (1 степень), сутки 2 (2; 4) 2(1; 2) * 2(2; 3) 2(!;3) * 2 (2; 2) *

Промежуточное помушеиие (2 степень), сугхи 5 (4; 6) 5 (4; 7) 7 (5; 9) ** 5 (4; 6) 5 (3; 6)

Полное помутнение (3 степень), сутки 6 (5; 8) 8 (6; 9) * 9(8; 14) ** 8(6; 10) 8(6; 10) **

* - р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - р < 0,01 по сравнению с контролем.

Добавление в культу рал ьную среду экстракта цилиарного тела позволяет продлить срок сохранения прозрачности хрусталиков. Так, в контрольной группе полное помутнение наступает на 6 сутки, в то время как в опытных группах - от 8 до 9 суток. Изменение массы хрусталиков в опытных группах достоверно больше, чем в контрольной. Таким образом, можно полагать, что экстракт цилиарного тела, оказывает влияние на водный гомеостаз хрусталика.

Очевидно, в условиях in vivo цилиарное тело синтезирует во внутриглазную жидкость комплекс биологически активных веществ, участвующих в регуляции активности аквапорииоа различных структур глаза, омываемых жидкостью передней камеры, в том числе и хрусталика.

Полученные нами экспериментальные данные согласуются с точкой зрения других авторов. М. Coca-Prados и J. Escribano (2007) рассматривают цилиарное тело в качестве мультифункциональной нейроэндокринной железы. Доказано, что цилиарное тело обладает способностью продуцировать комплекс протеаз, иейропептидов, гормонов (натрий-уретический пептид), факторов роста. Установлено, что в клетках цилиарного тела присутствуют стероиды, ангиогензин. Все вышеперечисленные биологически активные вещества участвуют в поддержании водного гомеостаза различных структур глаза, в том числе и хрусталика (М. Coca-Prados et al, 2007).

Большой интерес вызывает гипотеза о синтезе клетками цилиарного тела компонентов ренин-ангиотензиновой системы. Описанные нами выше результаты работы свидетельствуют о влиянии компонентов ренин-ангиотензиновой системы на прозрачность хрусталика. Па наш взгляд, можно предположить, что продуцентом компонентов РАС в структуре глаза является цилиарное тело. Поэтому были проведены эксперименты по культивированию хрусталиков в среде, содержащей 0,03 % экстракт цилиарного тела, которое предварительно с целью блокады ангиогензинпревращающего фермента было помещено в 23 нМ раствор каптоприла(табл. 7).

Таблица 7

Сравнительная оценка сроков помутнения и изменения массы хрусталиков при культивировании в среде, содержащей 0,03 % экстракт нативного цилиарного тела и экстракт цилиарного тела, предварительно обработанного каптоприлом,

Ме (25 %; 75 %)

Группа Контроль Ш = 31) Экстракт цилиарного тела 0,03 % Экстракт цилиарного тела, обработанного

Параметр (п = 31) каптоприлом (п=!2)

Изменение массы 8,9 12,0 12,8

через одни сугки (5,5; 11,0) (9,6; 15,8) (12,1; 14,1)

культивирования ДМ, % * *

Начальное 2 (2; 4) 2 (2; 3) 2 (2; 3)

помушение ( 1 с'гсмспь), сутки

Промежуточное 5 (4; 6) 7 (5; 9) 6 (5; 7)

момутпепие (2 степень), сутки ** ♦

Полное помутнение (3 степень), сутки 6 (5; 8) 9(8; 14) ** 9(8; 15) **

* - р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - р < 0,01 по сравнению с контролем.

Полученные результаты оказались неожиданными - не было обнаружено достоверных различий массы и сроков формирования помутнения в сравниваемых группах. Наши эксперименты косвенно опровергли вероятность продукции ангиотензина цилиарным эпителием. В то же время другие авторы описывают обнаружение ангиотензина в цилиарном теле (М. Coca-Prados et a!, 2007). Учитывая это обстоятельство, остаётся лишь высказать предположение, что цилиарпое тело само по себе не секретирует ангиотензин, а накапливает его и другие компоненты РАС, поступающие из кровотока. По мере необходимости происходит высвобождение биологически активных веществ из цилиарного тела во внутриглазную жидкость, и именно таким путём осуществляется гуморальная регуляция жизнедеятельности структур глаза, омываемых жидкостью передней камеры, в том числе и хрусталика. По, безусловно, для более уверенного суждения об этом явлении необходимо провести отдельное биохимическое и гистохимическое исследование цилиарного тела, что не является целью данной работы.

Таким образом, основными регуляторами функциональной активности аквапоринов I эпителия капсулы хрусталика являются вазопрессин, компоненты ренин-ангиотензиновой системы, эстрогены. В качестве их источника во внутриглазной жидкости, омывающей хрусталик, выступает цилиарпое тело. И, наконец, можно полагать, что в эпителии хрусталика имеется собственная система синтеза компонентов РАС. Адекватная регуляция водного гомеостаза хрусталика позволяет сохранять биохимическую структуру кристаллинов, что препятствует помутнению хрусталика.

Влияние ацетилсапицилоаой кислоты на прозрачность хрусталика. В последние годы с целыо предотвращения помутнения хрусталика предпринимаются попытки воздействовать иа такой процесс, как агрегация водорастворимых белков цитоплазмы волокнистых клеток кристаллинов (С.Э. Аветисов и соавт., 2008; К.О. Муранов и соавт., 2008). Из белков хрусталика агрегации наиболее подвержены у- и p-кристаллипы. а-кристаллин обладает шаперонной активностью и способен замедлять агрегацию этих протеинов. В этой связи представляет интерес исследование влияния веществ, обладающих способностью индуцировать активность шаперонов, на прозрачность хрусталика (Л.В. Соусгов и соавт., 2008). Многие авторы подчёркивают, что подобными свойствами обладает ацетилсалициловая кислота, поэтому открывается возможность изучить её антикагаракталыюе действие (D.A. Jurivich et al, 1992; С. Amici et al, 1995; T.W. Fawcett et al, 1997; D.F. Smith etal, 1998).

Культивирование хрусталиков в присутствии различных концентраций ацетилсалициловой кислоты позволяет существенно продлить срок сохранения прозрачности (полное помутнение - 10 сутки (10 пМ); 8 сутки (50 пМ); контроль - 6 сутки) (табл. 8). Можно полагать, что одним из возможных механизмов сохранения прозрачности хрусталиков в данных группах является способность ацетилсалициловой кислоты препятствовать агрегации кристаллинов и способствовать увеличению в клетках количества белка

теплового шока ШР70. Этот эффект более выражен при низкой концентрации препарата в среде (10 пМ), чем при высокой (50 пМ).

Таблица 8

Сравнительная оценка сроков помутнения хрусталиков опытных (культивирование в среде с различным содержанием ацетилсалициловой кислоты) и контрольной (культивирование в физиологическом растворе) группах, Ме (25 %: 75 %)

Контроль (п = 31) Концентрация ацетилсалициловой кислоты

Параметр 10 пМ (п = 31) 50 пМ (п = 31)

Начальное 2 (2; 4) 2(1:3) 2(1;3)

помутнение * *

(1 степень), сугки

Промежуточное 5(4:6) 5 (4; 7) 5 (4; 6)

помутнение (2 степень), сутки

Полное помутнение 6 (5; 8) 10(8; 12) 8(6; 10)

(3 степень), сутки ** • *

р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - р < 0,01 по сравнению с

контролем; • - р < 0,05 но сравнению с 50 пМ ацетилсалициловой кислоты.

Влияние экстракта глсма четырнаОцатидневмого куриного эмбриона на прозрачность хрусталика в условиях in vitro. Перспективным направлением современной медицины является возможность коррекции различных нарушений при использовании биологически активных веществ, выделенных из органов и тканей. Известно, что на пролиферативный потенциал клеток, их миграционную способность и специфическую дифференцировку оказывают влияние факторы роста и другие биологически активные вещества. Кроме того, прозрачность хрусталика определяется функциональной активностью водорастворимых белков — кристаллинов. Очевидно, эти субстанции содержатся в экстракте эмбрионального глаза, придавая ему характерные биологические свойства. В этой связи нам представляется актуальным изучить влияние экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона на состояние циркуляции жидкости в хрусталике в условиях in укго(табл. 9),

При культивировании в среде, содержащей 0,02 % - 0,05 % экстракта эмбрионального глаза, хрусталики сохраняли прозрачность и форму. При сравнении выборок статистически значимых различий в сроках формирования полного помутнения и в степени изменения массы хрусталиков между наблюдаемыми группами (0,02 - 0,05 %) обнаружено не было.

Культивирование хрусталиков крыс в среде с экстрактом в высокой концентрации (2 %) вызывало выраженное изменение формы хрусталиков на шаровидную. При этом начальное помутнение отмечалось на 1 сутки культивирования. Одновременно мы констатировали изменение массы

хрусталиков на 21,6 %, что достоверно выше, чем в контрольной группе (8,9%), На основании полученных данных можно сделать вывод, что высокие концентрации экстракта эмбрионального глаза способны резко стимулировать активность А(}Р1, что вызывает приток воды через эпителий капсулы в пограничную с волокнистыми структурами зону. В результате увеличивается масса хрусталика, изменяется его форма, однако полное помутнение наступает в более поздний период, чем в контрольной группе.

Таблица 9

Сравнительная оценка сроков помутнения и изменения массы хрусталиков опытных (культивирование в среде с различным содержанием экстракта эмбрионального глаза) и контрольной групп, Ме (25 %; 75 %)

Группа Изменение Срок появления помугнения, сугки

массы, %

1 степень 2 степень 3 степень

(начальное (промежу- (полное

помутнение) точное помутнелне)

помутнение)

Контроль 8,9 2 (2; 4) 5 (4; 6) 6 (5; 8)

(физ. раствор) (5,5; 11,0)

(п = Э1)

Экстракт глаза 0,02 % 12,2 2(1; 2) 4(3; 5) б (4; 8)

(п = 31) (8,2; 15,3) * •• * •• + ••

Экстракт глаза 0,03 % 9,4 1 (1; 1) 4 (3; 7) 7 (5; 8)

(п = 32) (6,6; 13,0) • • * ♦ • •

Экстракт глаза 0,04 % 9,4 2(!;2) 4 (3; 4) 6(5; 7)

(п = 31) (7,0; 14,7) *# **

•• • • • •

Экстракт глаза 0,05 % 9,1 1 (1:2) 4 (3; 5) 6 (4; 9)

(п = 31) (5,8; 11,9) «» ** • * 9

Экстракт глаза 2 % 21,6 Ц|;|) 2 (2; 2) 8 (6; 9)

(п = 31) (13,9; 29,7) ** ** **

**

* - р < 0,05 по сравнению с контролем; ** - р < 0,01 но сравнению с контролем; • - р < 0,05 по сравнению с экстрактом глаза 2 %; •• - р < 0,01 по сравнению с экстрактом глаза 2 %.

Биохимические и иммунологические свойства экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона. 14 день развития эмбриона курицы характеризуется тем, что в этот период в тканях присутствует комплекс биологически активных веществ, которые определяют высокий пролиферативный потенциал, миграционную способность и специфическую дифференцировку клеток. Вероятно, эти субстанции содержатся в экстракте эмбрионального глаза, придавая ему характерные биологические свойства.

Содержание белка. В экстракте эмбрионального глаза содержание белка составляет 2,84 ± 0,031 (М ± ш) г/л. Белки в экстракте представлены коллагеном, актином, вимептином, тубулином, гликопротеидами, линонротеидами, фосфопротеидами, хромопротеидами (А.Ш. Бышевский и соавт., 1994), а также кристаллинами - водорастворимыми белками хрусталика.

Фракционный состав белка. В экстракте определяются альбумины (14,413 ± 2,8854, %), «-глобулины (24,872 ± 3,3032, %), [З-глобулины (20,646 ± 1,7281, %) и у-глобулины (37,724 ± 4,7639, %). В двух пробах были обнаружены следы белков, относящихся к преальбуминам. Можно предположить, ■ что в состав этой фракции входят крисгаллины хрусталика, молекулярная масса которых составляет около 21 кДа.

Содержание молекул средней массы. Анализ полученных экспериментальных данных показал, что на 14 день развития в глазу куриного эмбриона присутствуют субстанции, относящиеся к молекулам средней массы (МСМ). Уровень молекул средней массы в экстракте эмбрионального глаза составляет 4,7 ± 0,11 (М ± т).

Молекулы средней массы представляют собой гетерогенную группу веществ разнообразной структуры с молекулярной массой от 300 до 5 000 Б. (С настоящему времени установлено, что в состав этой группы веществ входят простые и сложные пептиды, гликопептиды, нуклеопептиды, гуморальные регуляторы (инсулин, глюкагон, различные факторы роста, «тропины» и их комплексы), некоторые витамины, олигосахариды, производные глкжуроповых кислот, спиртов. По современным представлениям, МСМ являются показателем, не только отражающим уровень патологического белкового метаболизма, но и характеризующим присутствие биорегуляторов. Доказаны антиоксидантные, иммуностимулирующие и стресспротективные свойства МСМ (Н.И. Габриэлян и соавт,, 1984; М.Я., Малахова и соавт., 1987; М.А. Пирадов и соавт., 1990). Вероятно, определённые в ходе нашей работы молекулы средней массы в эмбриональном экстракте являются представителями субстанций, являющихся регуляторами морфогенеза.

Значение рН. рН является одной из основных характеристик гуморальной среды организма. Постоянство рН обеспечивает оптимальную работу ферментных систем. Концентрация ионов водорода влияет на проницаемость клеточных мембран. Полученный нами экстракт куриного эмбрионального глаза имеет значение рН (М ± гп) 7,42 ± 0,015.

Желатиназная активность, В работе была определена желатиназная активность глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона. В качестве контроля использовали ткань печени взрослой здоровой крысы. В наших исследованиях активность желатиназной активности печени взрослой крысы составляет 15,5. Глаз четырнадцатидневного куриного эмбриона желатиназной активностью не обладает. Желатиназа является ферментом, относящимся к группе матриксных металлопротеиназ. Матриксные металлопротеиназы представляют собой цинксодержащие протеазы, способные к специфическому гидролизу всех основных белков экстрацеллюлярного матрикса. Они участвуют в процессе роста, развития и ремоделирования тканей, Согласно нашим

исследованиям, желатиназа в структурах глаза куриного эмбриона не определяется, что. вероятно, связано с тем, что в данный период развития (14 день) процессы тканевой перестройки выражены незначительно.

Хемоаттрактантная активность. В исследовании мы сравнивали индексы хемотаксиса экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона с контрольными группами (С5а компонент комплемента, Staphylococcus aureus штамм 209). Анализ полученных в результате исследования данных показал, что эмбриональный экстракт обладает такой же способностью активировать хемотаксис, что и классические хемоаттрактангы -С5а компонент комплемента (М ± m составляет 1,776 ± 0,2002) и Staphylococcus aureus штамм 209 (1,721 ± 0,1758). Индекс хемотаксиса экстракта эмбрионального глаза составляет 2,186 ± 0,2131. Статистически значимых различий между индексами хемотаксиса нейтрофилов к экстракту эмбрионального глаза и к контрольным хемоаттрактантам не обнаружено (доверительная вероятность 0,95). Можно полагать, что экстракт обладает способностью индуцировать процессы клеточной миграции.

Экспрессия VEGF в структурах глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона. Интересно, что в нашем исследовании VEGF обнаружен в волокнистых клетках эмбрионального хрусталика. Классическим является представление, что фактор роста эндотелия определяется только на сосудистых структурах. Как известно, хрусталик не кровоснабжается, однако волокнистые клетки экспрессируют VEGF. Функция VEGF в хрусталике точно не установлена, но известно, что в эмбриональном периоде развития вокруг хрусталика имеется капиллярная сеть. Вероятно, VEGF, синтезируемый клетками хрусталика, участвует в регуляции развития капилляров. К моменту рождения сосудистая сеть хрусталика редуцируется, а экспрессия VEGF в хрусталике сохраняется, возможно, в ответ на возникшую тканевую гипоксию (Y.-B. Sbui et al, 2003).

Анализ биохимических и иммунологических свойств экстракта показывает, что в его состав входит комплекс биологически активных веществ, способных регулировать процессы клеточной пролиферации и дифференцировки. Так, среди белков экстракта, вероятно, присутствуют кристаллины, которые выполняют не только структурную функцию, но и обладают шаперонной активностью. В экстракте глаза куриного эмбриона обнаружены молекулы средней массы, представленные разнообразными биорегуляторами. Достаточно сильная хемоаттрактантная активность экстракта свидетельствует о его способности индуцировать процессы клеточной миграции. В тканях, из которых получен экстракт, присутствует VEGF, что является свидетельством высокой активности процессов пролиферации, миграции и дифференцировки клеток на 14 день развития куриного эмбриона.

Перечисленные характеристики экстракта эмбрионального глаза являются вполне востребованными для коррекции помутнения хрусталика. Дальнейшее исследование свойств и особенностей биологического действия экстракта представляется перспективным в поиске новых методов профилактики катаракты.

ВЫВОДЫ

1. Негативное влияние на прозрачность хрусталика оказывают нарушение гомеостаза ионов кальция и дисфункция водных каналов эпителия капсулы. Блокада аквапоринов 1 хлоридом ртути индуцирует формирование помутнения в более ранние сроки, чем дисбаланс Са2+в клетках хрусталика.

2. Биологически активные вещества (вазопрессин, эстрогены, компоненты репин-ангиотензиповой системы) положительно воздействуют на прозрачность хрусталика в условиях in vitro, что может быть связано с их влиянием на водный гомеостаз.

3. Ингибирование синтеза ангиотензина М и блокада его рецепторов продлевает период сохранения прозрачности хрусталика в условиях in vitro, что позволяет сделать заключение о наличии в структурных компонентах хрусталика (эпителий капсулы, волокнистые клетки ядра) локальной ренин-ангиоте! шшо во й с истем ы.

4. В экспериментальных условиях добавление в культурапьную среду экстракта цилиарного тела позволяет продлить срок сохранения прозрачности хрусталиков, что может быть связано с наличием в его составе биологически активных веществ, регулирующих активность аквапоринов хрусталика.

5. В условиях in vitro ацетилсалициловая кислота оказывает положительное влияние на прозрачность хрусталика.

6. Экстракт глаза куриного эмбриона, содержащий комплекс биологически активных веществ, обладает способностью продлевать период сохранения прозрачности хрусталика глаза в условиях in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сумеркина, В.А. Роль кальциевых и водных каналов хрусталика в катарактогенезе. Коррекция помутнения хрусталика экстрактами эмбриональных тканей / В.А. Сумеркина // Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием. —Саратов, 2006. - С. 150-15).

2. Сумеркина, В.А. Влияние регуляторов гистогенеза зрительного анализатора на прозрачность хрусталика in vitro / В.А. Сумеркина, Г.К. Попов, Э.Н. Коробейникова // Морфология. -2008. - Т. 134. - № 5. - С. 96.

3. Сумеркина, В.А. Роль кальциевых каналов и аквапоринов эпителия хрусталика в развитии катаракты in vitro / В.А. Сумеркина, Г.К. Попов, Л.В. Воронова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145. -№2,- С. 144-148.

4. Сумеркина, В.А. Факторы поддержания прозрачности хрусталика в условиях in vitro / В.А. Сумеркина П Медицинский вестник Башкортостана. -2009.-№2.-С. 164-167.

5. Сумеркина, В.А. Индукция стрессорного ответа кристаллинов при блокаде аквапоринов эпителия капсулы хрусталика / В.А. Сумеркина // Вестник Уральской медицинской академической науки. —2009. -№ 2. - С. 116-117.

6. Сумеркина, В.А. К вопросу о влиянии экстракта эмбрионального глаза на состояние водной циркуляции в хрусталике / В.А. Сумеркина // Вестник Уральской медицинской академической науки. —2009. -№ 2. - С. 118-119.

7. Сумеркина, В.А. Система гуморальной регуляции водного гомеостаза хрусталика / В.А. Сумеркина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия «Образование. Здравоохранение. Физическая культура». -2009. - № 39 (172). - С. 83-86.

СУМЕРКИНА Вероника Андреевна

РОЛЬ АКВАПОРИНОВ В ПОДДЕРЖАНИИ ПРОЗРАЧНОСТИ ХРУСТАЛИКА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Формат 60x84 У,,,. Бумага ВХИ 80 тр. Объем 1,4 усл. п. л. Тираж (00 жз. Заказ №271

И31 отоплено в полном соответствии с качеством предоставленных оригиналов заказчиком в ООО «РЕКПОЛ», 454048, г. Челябинск, пр. Ленина, 77, тел (351) 265-41 -09. 265-49-84

Актуальность

Катаракта является одним из самых распространённых заболеваний органа зрения и одной из ведущих причин слабовидения и слепоты наряду с глаукомой и возрастной макулярной дегенерацией [9, 10, 11]. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, на долю катаракты приходится 42 % всей глазной патологии. Согласно данным статистики, частота возрастной катаракты составляет 33,2 случая на 1 ООО населения, причём эта цифра существенно увеличивается с возрастом и достигает в 70 - 79 лет 262,3 на 1 ООО мужчин и 464,3 на 1 ООО женщин. Практически все лица старше 80 лет страдают катарактой [34].

Основным методом лечения катаракты является хирургическая замена помутневшего хрусталика искусственным [10]. Однако известно, что через 2 — 5 лет после оперативного лечения у 25,7 - 50,0 % больных наблюдается вторичное снижение остроты зрения вследствие помутнения задней капсулы хрусталика. Это связано с миграцией клеток эпителия с передней капсулы хрусталика на заднюю с их последующей эпителиально-мезенхимальной трансформацией в фибробласты и миофибробласты, что приводит к образованию на задней капсуле многослойных бляшек [54, 111, 175]. Группу риска по формированию катаракты составляют больные, перенесшие любое хирургическое вмешательство на глазном яблоке [14].

В хирургическом лечении катаракты, особенно после внедрения методов факоэмульсификации, достигнуты огромные успехи, тем не менее побочные эффекты и последствия оперативного вмешательства стимулируют исследователей на поиск лекарственных средств для профилактики и, возможно, лечения катаракты [10, 11, 14]. Консервативное лечение катаракты имеет существенные преимущества перед хирургическим. Однако, несмотря на длительную историю терапии помутнения хрусталика, достаточно эффективных схем консервативного лечения заболевания не предложено. Разработка методов воздействия на прозрачность хрусталика в значительной мере зависит от понимания молекулярных основ катарактогенеза.

В настоящее время достаточно хорошо изучены патогенетические закономерности развития катаракты. Помутнение хрусталика — сложный многофакторный и многостадийный процесс. На прозрачность хрусталика влияют углеводный, электролитный дисбаланс, неблагоприятные факторы окружающей среды - световая энергия, радиоактивное излучение, электромагнитное поле, токсические химические агенты, механические повреждения. Ключевой этап помутнения хрусталика заключается в агрегации водорастворимых белков кристаллинов, физико-химическое состояние которых определяет прозрачность в большей степени, чем изменения других компонентов. В нормально функционирующем хрусталике кристаллины находятся в виде высококонцентрированного раствора, прозрачного для видимого света. При развитии катаракты под действием неблагоприятных факторов происходит формирование крупномолекулярных белковых агрегатов, которые при определённых концентрациях служат причинами помутнения хрусталика.

В последние годы особой популярностью пользуется свободнорадикальная теория катарактогенеза А. 8рес1;ог, согласно которой основной причиной формирования катаракты является процесс перекисного окисления липидов хрусталика. Поэтому в офтальмологической практике в основном используют препараты с антиоксидантным действием («Сэнкаталин» (пиреноксин), «Квинакс» (азапентацен полисульфонат натрия), «Офтан Катахром», «Тауфон», «Вита Йодурол») [33].

В то же время результаты многочисленных экспериментальных исследований свидетельствуют о существовании потенциальной возможности воздействия на другие звенья формирования помутнения хрусталика, в частности на агрегацию водорастворимых белков цитоплазмы кристаллинов волокнистых клеток [1, 24].

Из белков хрусталика агрегации наиболее подвержены у- и p-кристаллины. а-кристаллин обладает шаперонной активностью и способен замедлять агрегацию этих белков. Считается, что с возрастом такая активность а-кристаллина ослабевает и это является одной из причин развития возрастной катаракты. В связи с этим возможны два пути поиска антикатарактальных препаратов, обладающих «шапероноподобным» действием. Первый — это поиск веществ, замедляющих агрегацию непосредственно у- и |3-кристаллинов, второй - поиск веществ, поддерживающих защитную активность а-кристаллина [38]. Многие исследователи подчёркивают, что ацетилсалициловая кислота обладает способностью индуцировать активность шаперонов, поэтому открывается возможность исследовать её антикатарактальное действие [44, 69, 98, 155].

В последние годы в исследовательских работах, посвящённых проблеме помутнения хрусталика, большое внимание стали уделять состоянию его водного гомеостаза. Основными структурами, участвующими в поддержании баланса воды хрусталика являются белки плазматических мембран -аквапорины (AQP0 волокнистых клеток и AQP1 эпителиальных клеток капсулы) [48, 63, 74, 85, 119, 148]. Очевидно, изменение водного гомеостаза непосредственно воздействует на структуру водорастворимых кристаллинов хрусталика, что влияет на состояние его прозрачности. В литературе описаны механизмы гуморальной регуляции активности различных изоформ аквапоринов в почках, головном мозге, лёгких, однако относительно AQP хрусталика этот вопрос остаётся открытым [43, 112]. Кроме того, практически не исследован вопрос об источнике биологически активных веществ-регуляторов функции аквапоринов хрусталика. Возможно, на эту роль претендует цилиарное тело, поскольку в некоторых работах [56, 65] высказано предположение о том, что оно является мультиэндокринной железой, продуцирующей комплекс биологически активных факторов.

Известно, что биологические препараты, полученные из интенсивно пролиферирующих тканей, способны поддерживать тканевый и клеточный гомеостаз на нормальном уровне [40]. К таковым можно отнести развивающиеся органы в различные периоды эмбриогенеза, а также ткани взрослого организма. В Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца доказано, что регуляторный белок, выделенный из хрусталика быка, предотвращает развитие ядерного помутнения хрусталика in vitro [16].

Наше внимание обращено на экстракт, полученный из глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона, поскольку именно в этот период развития в тканях присутствует комплекс биологически активных веществ, определяющих высокий пролиферативный потенциал, миграционную способность и дифференцировку клеток.

Анализ этих данных определил цель нашего исследования.

Цель работы

В условиях эксперимента in vitro изучить влияние на прозрачность хрусталика некоторых повреждающих факторов, гуморальных регуляторов активности аквапоринов, а также экстрактов различных тканей.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние изменения кальциевого и водного гомеостаза хрусталика на его прозрачность в условиях in vitro;

2. В условиях in vitro оценить прозрачность хрусталика под влиянием гуморальных регуляторов активности аквапоринов;

3. Оценить характер воздействия на прозрачность хрусталика экстракта цилиарного тела;

4. Исследовать влияние экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона на прозрачность хрусталика в условиях in vitro, определить некоторые биохимические и иммунологические свойства экстракта.

Научная новизна

- Впервые показано, что нарушение функции аквапоринов в условиях in vitro вызывает изменение прозрачности хрусталика в более ранние сроки, чем дисфункция кальциевых каналов.

- Впервые установлено положительное влияние гуморальных регуляторов активности аквапоринов (вазопрессин, эстрогены, компоненты ренин-ангиотензиновой системы) на прозрачность хрусталика.

- В условиях эксперимента впервые показано, что экстракт цилиарного тела и экстракт глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона оказывают положительное влияние на прозрачность хрусталика.

- В экспериментальных условиях впервые получены косвенные свидетельства существования локальной ренин-ангиотензиновой системы хрусталика.

- Впервые исследованы некоторые биохимические и иммунологические свойства экстракта глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона.

Теоретическая и практическая значимость

В исследовании показан характер влияния различных факторов, в том числе гуморальных регуляторов активности аквапоринов, на прозрачность хрусталика. Доказано положительное влияние на прозрачность хрусталика веществ, обладающих способностью индуцировать шаперонную активность кристаллинов, а также экстракта глаза куриного эмбриона. Полученные результаты могут стать основой для понимания фундаментальных молекулярных механизмов, обеспечивающих сохранение прозрачности хрусталика на протяжении всей жизни, лежащих в основе катарактогенеза, а также укажут новые направления поиска антикатарактальных препаратов.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Прозрачность хрусталика в условиях in vitro определяется постоянством кальциевого и водного гомеостаза его клеточных и внеклеточных структур. Одним из ключевых факторов в развитии помутнения хрусталика является нарушение циркуляции жидкости в его компартментах.

2. Гуморальными факторами, влияющими на прозрачность хрусталика в условиях in vitro, являются вазопрессин, эстрогены, компоненты ренин-ангиотензиновой системы.

3. Добавление в среду для культивирования хрусталика экстракта цилиарного тела оказывает положительное влияние на прозрачность.

4. Экстракт глаза четырнадцатидневного куриного эмбриона содержит комплекс биологически активных веществ, которые способствуют поддержанию прозрачности хрусталика в условиях in vitro.

5. Ацетилсалициловая кислота оказывает положительное влияние на прозрачность хрусталиков в условиях in vitro.

Апробация работы

Основные положения работы изложены и представлены на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Саратов, 2006), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященной памяти профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2008), Российском симпозиуме с международным участием, посвященном 70-летию заведующего кафедрой Башкирского государственного медицинского университета Д.А. Еникеева (Уфа, 2009), IV Съезде физиологов Урала с международным участием (Екатеринбург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 5 из них - в рецензируемых журналах из перечня, определенного ВАК Минобрнауки РФ (Бюллетень экспериментальной биологии и медицины №2, 2008; Вестник Уральской медицинской академической науки № 2, 2009; Морфология № 5, 2008; Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия «Образование. Здравоохранение. Физическая культура» № 39, 2009).

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 12 рисунками. Библиографический список включает 182 источника - 40 отечественных и 142 иностранных.

110 выводы

1. Негативное влияние на прозрачность хрусталика оказывают нарушение гомеостаза ионов кальция и дисфункция водных каналов эпителия капсулы. Блокада аквапоринов 1 хлоридом ртути индуцирует формирование

24* помутнения в более ранние сроки, чем дисбаланс Са в клетках хрусталика.

2. Биологически активные вещества (вазопрессин, эстрогены) положительно воздействуют на прозрачность хрусталика в условиях in vitro, что может быть связано с их влиянием на водный гомеостаз.

3. Ингибирование синтеза ангиотензина II и блокада его рецепторов продлевает период сохранения прозрачности хрусталика в условиях in vitro, что позволяет сделать заключение о наличии в структурных компонентах хрусталика (эпителий капсулы, волокнистые клетки ядра) локальной ренин-ангиотензиновой системы.

4. В экспериментальных условиях добавление в культуральную среду экстракта цилиарного тела позволяет продлить срок сохранения прозрачности хрусталиков, что может быть связано с наличием в его составе биологически активных веществ, регулирующих активность аквапоринов хрусталика.

5. В условиях in vitro ацетилсалициловая кислота оказывает положительное влияние на прозрачность хрусталика.

6. Экстракт глаза куриного эмбриона, содержащий комплекс биологически активных веществ, обладает способностью продлевать период сохранения прозрачности хрусталика глаза в условиях in vitro.