Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль адреномедуллина и его рецепторов в функционировании эндотелиальной клетки человека

На правах рукописи

Никитенко Леонид Леонидович

Роль адреномедуллина и его рецепторов в функционировании эндотелиальной клетки человека ( в норме и при некоторых патологиях)

Специальность 14 00 16 - патологическая физиология,

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ИРКУТСК

2007

003159663

Работа выполнена в ГУ "Научный центр медицинской экологии" Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения РАМН, Оксфордском Университете (г Оксфорд, Великобритания) и Лондонском Университете (г Лондон, Великобритания)

Научный консультант Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Колесников Сергей Иванович

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Гутник Игорь Нэрисович

доктор медицинских наук, профессор Семинский Игорь Жанович

доктор биологических наук Попкова София Марковна

Ведущая организация ГОУ ВПО

«Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова»

Защита состоится 26 октября 2007 г в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001 054 01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского Отделения Российской академии медицинских наук» по адресу 664003, г Иркутск, ул Тимирязева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСНЦ СО РАМН по адресу 664003, ул Тимирязева, 16

„ Л1

Автореферат разослан « (Л_»_7_ 2007г

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук Л.Ф. Шолохов

Актуальность проблемы.

В настоящее время исследованию процессов развития и функционирования кровеносной и лимфатической сосудистых систем в норме и при патологии уделяется большое внимание Эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла (ЭКМР) играют ключевую роль в развитии и функции кровеносных и лимфатических сосудов Избыточная пролиферация и трансформация, либо нарушение функции ЭКМР приводит к патологическому ангиогенезу/ лимфангиогенезу или дисфункции сосудистой системы - являющимся показателями злокачественных опухолей и многих других заболеваний [Carmeliet, 2003 и 2005]

Существенный прогресс был достигнут за несколько последних лет в исследовании молекулярных механизмов развития и функционирования сосудистой системы, и в выявлении ключевых ангиогенных и лимфангиогенных факторов, а также в использовании данных знаний для ингибирования ангиогенеза и лимфангиогенеза при опухолевых процессах и неоплазмах/новообразованиях различной этиологии, а также для терапии сердечно-сосудистых заболеваний у экспериментальных животных [Alitalo et al, 2005, Ferrara and Kerbel, 2005]

Одной из современных задач в "транслировании" (применении в практике для терапии человека) данных открытий в области исследования механизмов ангиогенеза и лимфангиогенеза на животных является проверка роли известных и новых факторов в биологии эндотелиальных клеток человека и выявление механизмов, регулирующих экспрессию и функцию их рецепторов, а также определение их потенциальной роли в патогенезе опухолевых и сердечно-сосудистых заболеваний [Nikitenko et al, 2006]

В связи с этим разработка методов получения и культивирования эндотелиальных клеток кровеносного и лимфатического микроциркуляторного русла человека, а также исследование роли новых ангиогенных и лимфангиогенных факторов в биологии данного типа клеток, представляет собой актуальную задачу в области биомедицины

Несмотря на то, что эксперименты, проведенные на животных, указывали на роль нового ангиогенного фактора адреномедуллина (AM) при развитии сосудистой системы в эмбриогенезе и при опухолевых процессах, существовал ощутимый недостаток подобного рода исследований с использованием клеток человека Кроме того, информация о распределении и функционировании эндогенных адреномедуллиновых рецепторов, экспрессированных в клетках и тканях человека, также оставалась неизученной до настоящего времени В связи с этим неизвестными оставались как роль AM и его рецепторов в тканях человека, так и возможности их использования для лечения раковых и других заболеваний [Nikitenko et al, 2006] Данная проблема существует и для других ангиогенных факторов Так, несмотря на несомненную роль одной из ключевых ангиогенных молекул - фактора роста эндотелия (vascular endothelial growth factor, VEGF) в развитии раковых опухолей в экспериментальных исследованиях на животных, применение ингибиторов данного ангиогенного фактора не всегда приводит к положительным результатам [Ferrara and Kerbel, 2005]

Трудности в данной области обусловлены отсутствием системного подхода в анализе экспрессии и функции факторов ангиогенеза и их рецепторов т vitro и in vivo в клетках и тканях человека Под системным подходом подразумевается проведение исследований не только роли данных факторов на эндотелиальные клетки человека, но и исследование транскрипции и трансляции генов, кодирующих данные рецепторы в органах и клетках, изучение механизмов, регулирующих экспрессию рецептора на поверхности клетки, специфичности его взаимодействия с потенциальными лигандами (фармакология рецептора), а также механизмов десенситизации и ресенситизации

Данный подход позволяет рассматривать не только механизм действия определенного ангиогенного фактора на молекулярном и клеточном уровнях, но и потенциал использования данных знаний в теоретической биологии, а также при разработке методов диагностики, интервенции и терапий для прогнозирования эффективности применения ингибиторов и активаторов данных механизмов, выявления типов раковых опухолей (а также индивидуальных пациентов), в которых действие данных препаратов может быть наиболее

результативным, и потенциального использования в клинике для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых, раковых, инфекционных и других заболеваний, связанных с патологическим (лимф)ангиогенезом или дисфункцей сосудистой системы

Исходя из этого, целью данного исследования являлось оценка роли пептида адреномедуллина (АМ) в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека и механизмов, регулирующих экспрессию и функцию его рецепторов в норме и при некоторых патологиях на основе комплексного морфо-функционального и молекулярно-генетического исследования (Рисунок 1)

Механизмы, регулирующие транскрипцию

Механизмы, регулирующие функцию рецептора

-Экспрессия на поверхности клепш - Фармакология рецептора

(специфичность взанмодейсташ с лнпидамн)

-Десенситизация и ресенсптизация

Адреномедуллин а его рецепторы

Трансляционные подход ы

-Изучение экспрессии лиганда и рецептора в клетках и тканях человека

- в норме

- при патологиях

Разработка ингибиторов и методов диагностики заболеваний

Комплексный систематический подход

Рисунок 1 Изучение роли адреномедуллина и его рецепторной системы путем комплексно-систематического подхода

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1 Разработать методы получения и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) из тех тканей человека, в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза,

2 Исследовать роль AM в первичных культурах ЭКМР человека,

3 Исследовать экспрессию адреномедуллинового рецептора - рецептора подобного кальцитониновому рецептору (calcitonin receptor-like receptor, CL, кодируемого CALCRL геном) в клетках и тканях человека,

4 Исследовать механизмы, регулирующие экспрессию CALCRL гена человека в ЭКМР в норме и при патологии путем клонирования и описания промотора, изучения субхромосомной организации данного гена и влияния онкогенных вирусов (на примере вируса саркомы Капоши) на его транскрипцию,

5 Произвести и охарактеризовать антитела против CL рецептора,

6 Исследовать специфичность к различным лигандам, а также механизмы сенситизации и десенситизации, CL рецептора в эндотелии человека,

7 Исследовать роль адреномедуллина и его рецепторов в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологических заболеваний органов репродукции, путем изучения экспрессии пептида и локализации функциональной формы CL рецептора в тканях человека в норме и при патологии (в опухолях почек и яичников и тканях саркомы

Калоши),

8 Исследовать возможность использования разработанных реактивов и методов для диагностики неоплазм, раковых опухолей и других заболеваний,

9 Исследовать возможность модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы

Основные положения выносимые на защиту.

• АМ является новым ангиогенным фактором в тканях человека за счет своей способности активировать пролиферацию и миграцию, а также ингибировать апоптоз эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла

• Экспрессия САЬСЯЬ гена человека зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона При этом ключевым фактором в транскрипции САЬСШЬ гена является его трехмерная субхромосомная структура, в то время как активность промотора играет вторичную роль

• Десенситизация (X рецептора в эндотелиальных клетках человека при избыточной экспрессии лиганда отражается на его функции и может играть роль при развитии сердечнососудистых заболеваний различной этиологии

• Разработанные реактивы и методы могут применяться для диагностики и коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, например патологического ангиогенеза и гиперпроницаемости эндотелия

• Разработана и применена концепция системного анализа механизмов комплексной многоуровнево-селективной регуляции экспрессии и функции адреномедуллиновых рецепторов, а также их роли в полноценном функционировании эндотелиальной клетки в норме и при патологии

Научная новизна работы.

Разработаны и усовершенствованы методы получения и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) человека

Впервые продемонстрирована роль пептида АМ в биологии ЭКМР и ангиогенезе в тканях человека.

Впервые описаны механизмы, регулирующие экспрессию САЮЯЬ гена человека и функцию СЬ рецептора в тканях и эндотелии человека. Впервые продемонстрирована роль СЬ рецептора как рецептора для АМ и пептида относящегося к гену кальцитонина (СОИР) в ЭКМР человека, а также выявлены механизмы его десенситизации

Впервые разработан метод определения трехмерной субхромосомной структуры генов Сконструированы плазмидные векторы, позволяющие эффективно оценивать экспрессию САЬСМ, гена человека, активность его промотора и осуществлять экспрессию СЬ рецептора в клетках млекопитающих Впервые клонированы новые, ранее неохарактеризованные транскрипты САЬСЛЬ гена человека и лентивирусная «библиотека», включающая 27 генов, кодирующих различные вирусные белки вируса саркомы Капоши

Впервые получены уникальные реактивы - поликлональные антитела против человеческого СЬ рецептора и блокирующие моноклональные антитела против гетеродимера СТЖАМР, экспрессированого на поверхности клетки Показана

специфичность данных антител и возможность оценки функционального статуса CL рецептора, а также регуляции его функции в клетках и тканях человека.

Впервые продемонстрирована экспрессия CL рецептора в клетках и тканях человека в норме и при патологиях (на примере опухолевых тканей почек, яичников, лейомиомы и саркомы Капоши)

Разработана и применена концепция системного анализа механизмов комплексной многоуровнево-селективной регуляции экспрессии и функции адреномедуллиновых рецепторов, а также их роли в полноценном функционировании эндотелиальной клетки в норме и при патологии

Практическая значимость исследования.

Разработанные реактивы и методы могут быть использованы для дальнейших исследований биологии эндотелиапьных и стволовых клеток человека, экспрессии и функции CL рецептора в нормальных и опухолевых клетках и тканях человека, а также для диагностики раковых, сердечно-сосудистых и других заболеваний

Полученные плазмидные векторы могут быть использованы в области биотехнологии, а полученные поликлональные антитела против CL рецептора человека - как для научно-исследовательских работ, так и для применения в области диагностики и практической медицины

Разработанные моноклональные антитела против гетеродимеров CL/RAMP могут являться эффективным методом коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, как например патологический ангиогенез и гиперпроницаемость эндотелия

Изученная роль АМ в биологии ЭКМР человека и полученные данные о механизмах, регулирующих экспрессию и функцию адреномедуллиновых рецепторов, представляют собой большой интерес при поиске эффективных методов противоопухолевой терапии и сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ангиогенезом и дисфункцией эндотелия в тканях человека

Полученные результаты расширяют понимание комплексной регуляции адреномедуллиновых рецепторов и позволяют оценить возможность применения ингибиторов/активаторов действия ДМ для трансляционных исследований и терапии заболеваний, связанных с избыточной или недостаточной экспрессией самого пептида, либо его рецепторов, а также проводить предварительные исследования по воздействшо различных веществ на экспрессию, транспорт и функцию CL рецептора в эндотеяиальных клетках, как источнике его локализации m vivo в тканях человека.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости продолжения исследований фармакологии адреномедуллиновых рецепторов как в эндотелиапьных клетках опухолей, так и в самих опухолевых клетках, а также выявления различий рецептора, экспрессированного в нормальном и опухолевом эндотелии

На основе разработанных технологий получения поликлональных и моноклональных антител против CL рецептора человека, определения трехмерной субхромосомной структуры генов и векторных плазмид, содержащих промотор CALCRL гена человека, разработаны методы их использования для диагностики раковых и других заболеваний, а также оформлено и получено два патента на изобретение

Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на конференциях Xth Hamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany, 1999, Xlth International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, York, United Kingdom, 2000, Annual ICRF Colloquium, Warwick, United Kingdom, 2000, Introduction to Molecular and Cellular Research, San-Diego, USA, 2000, 8th IFPA Meeting, Melbourne, Australia, 2002, "Angiogenesis basic mechanisms and therapeutic implications", Ascona, Switzerland, 2002, 5th Imperial College School of Medicine Symposium "Vascular endothelium Role in disease pathogenesis and as a therapeutic target", London, Umted Kingdom, 2002,676th Biochemical Society Meeting, Edinburgh, United Kingdom, 2002, 6th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Москва и Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2003, Special FEBS 2003 Meeting on Signal Transduction, Brussels, Belgium, 2003, The 40th American Association for Cancer Research Annual Meeting, New Orleans, USA, 2003, Jomt International Symposium on CGRP, Amylrn and Calcitonin 4й1 Symposium on Adrenomedullin and Proadrenomedulhn N-20 Peptide, Zurich, Switzerland, 2004, XXXIV Congress of Nordic Federation of Obstetrics of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki, Finland, 2004, XI European Placenta Group Meeting, Glasgow, Umted Kingdom, 2005, Xlth Biennial International Gynecologic cancer Society Meeting, Santa Monica, USA, 2006, The 24th European Conference on Microcirculation From Vascular Biology to Clinical Microcirculation, Amsterdam, Netherlands, 2006, The 9th International Workshop on Kaposi's Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, Cape Cod, USA, 2006, The Physiological Society 2006 Main Meeting, London, United Kingdom, The 21st Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (ISH2006), Fukuoka, Japan, 2006

Публикации: основные материалы работы изложены в одной монографии, руководстве по эмбриологии, двух главах книг, 13 статьях в международных журналах, 21 материалах международных научных конференций, двух оформленных патентах на изобретение

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы (189 источников). Работа иллюстрирована 61 рисунком и 10 таблицами

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Для реализации поставленных задач были использованы следующие методы исследования

• клеточно-биологические (выделение и описание первичных культур эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека, исследование ангиогенной активности пептидов с применением моделей ангиогенеза т vitro),

• гистологические (иммуногистохимия, иммунофлюоресценция, микрочипы тканей, гибридизация in situ, световая, флуоресцентная и конфокальная микроскопия),

• молекулярно-биологические (Northern блоттинг, Western блоттинг, метод полуколичественной и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), ДНК микрочипы, 3'- и 5'-RACE, метод определения субхромосомной структуры генов, клонирование),

• биотехнологические и биохимические (получение, очистка и характеризация поликлональных и моноклональных антител, дегликозилирование, ELISA),

• вирусологические (получение препаратов вируса саркомы Калоши, конструкция и использование лентивирусной «библиотеки», кодирующей индивидуальные гены данного онкогенного вируса)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Задачей первого этапа исследований являлось определение возможной роли AM в ангиогенезе в тканях человека. Для практического выполнения поставленной задачи было необходимо получение зндотелиальных клеток микроциркуля горного русла (ЭКМР) органов и тканей, в которых происходят процессы физиологического или патологического ангиогенеза. Нами были выбраны эндометрий и миометриЙ человека для разработки методов получения ЭКМР и изучения роли адреномедуллина, поскольку физиологический ангиогенез характерен для тканей матки, и предварительные данные экспериментов проведенных в нашей лаборатории указывачи на возможную роль данного пептида в этих тканях [Hague et al., 2000]. Необходимость получения ЭКМР из органов, в которых происходит ангиогенез, для изучения роли новых ангиогенных факторов обусловлено тем, что именно пролиферация и миграция эндотелия микроциркуляторного русла, а не основных сосудов, необходимы для возникновения новых сосудов при ангиогенезе в тканях. Кроме того, эндотелий микроциркуляторного русла разных органов гетерогенен, т.е. может отличаться по своим функциональным свойствам, морфологии и экспрессии рецепторов, а потому и различной способностью отвечать на стимуляцию данными факторами [Auerbach et al, 1985; Gebb and Stevens, 2004; Conway and Carmeliet. 2004].

Разработка методов изолирования, характер» за ни и и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека.

Дзя получения ЭКМР нами были использованы лектин UJex Europeus Agglutinin 1 (UEA1), связанный с магнитными шариками (Рисунок 2). (JEAI селективно распознает эндогелиальные клетки непосредственно в тканях (Рисунок 2), путем связывания с фукозой на

Рисунок 2. Получение и характеристика эндотелиальных клеток микрониркуляториого русл» (ЭКМР) из эндометрия человека.

Эидотелиальные клетки были получены из эндометрнальной ткани матки (А) после гистерэктомии. (А) Радиограмма среза матки (спиральные артерии эндометрия наполнены суспенэией сульфата бария и желатина), Эндогелиальные клетки

микроциркуляторного русла

экспрессируют фукозу, распознаваемую лектином Ulex Europetis Agglutinin ! (UEA-l) выявленого путем (Б) использования метода иммунофлуореспенцни (ФИЩ -зеленый цвет; беше стрелки: DAPI -окраска ядер). Магнитные шарики покрытые лектином UEA-I были использованы для получения чистых культур ЭКМР, формирующих (В) характерный монослой о культуре (магнитные шарики в первом пассаже еще прикреплены к поверхности клеток", красные стрелки) и (Г) капиллярную сеть на матрнксе Матригель.

Иммунофлуоресцентная характеризация ЭКМР матки с использованием антител против специфических маркеров эндотелия (Д) фактора вон Виллебранда (vWF) и (Е) CD31. ЭКМР активно растут в культуре, что продемонстрировано иммуно-флуоресиентной окраской на присутствие (Ж) маркера

лролиферируюших клеток Ki67.

поверхности этих клеток.

Первоначально ткани эндометрия были собраны в среду МакКоя (.McCoy's 5A medium), содержащую 10% телячьей сыворотки (ТС) и антибиотики, и сохранены на 12-16 часов при 4°С На следующий день ткань была разрезана скальпелем на кусочки размерами 1 мм2, которые впоследствии были инкубированы в течении 2 часов в среде МакКоя, содержащей 2 мг/мл коллагеназы и 10% ТС при постоянном размешивании Данная процедура приводит к распаду тканевых структур и получению клеточной суспензии, которая затем фильтруется через стерильное сито с порами размером 100 мкм для удаления нерастворенных тканей Затем клеточная суспензия центрифугируется и промывается несколько раз средой Этапы получения и харакгеризации ЭКМР человека показаны на Рисунке 2

После этого первоначально клеточная суспензия может быть обогащена на содержание ЭКМР путем центрифугирования полученной клеточной суспензии в "непродолжительном" градиенте "Percoll" При этом клеточная масса ресуспендируется в 20% растворе "Percoll" в физрастворе с содержанием бычьего сывороточного альбумина (БСА) и помещается на поверхность двух слоев раствора "Percoll" - 40%-ного и 60%-ного После этого трехслойный "непродолжительный" градиент (20%-40%-60%) "Percoll" центрифугируется при 670 g в течении 30 минут и обогащенная эндотелиальными клетками популяция формируется между слоями 40%-ного и 60%-ного растворов "Percoll" Клетки собираются с помощью Пастеровской пипетки и ресуспендируются в среде МакКоя, содержащей 10% ТС

Магнитные шарики готовятся предварительно, за день до проведения изолирования эндотелиальных клеток Лекгин Ulex europeus agglutinin был связан ковалентно к тозилактивированными магнитными шариками "Dynabeads" М-450 в соответствии с предварительно опубликованными работами [Jackson et al, 1990] Одинаковые объемы лектина (0 2 мг/мл в боратном буфере, рН 9 6) и шариков (2x107 шариков/мл) были проинкубированы в течение 12-16 часов при 4°С и постоянном перемешивании На следующий день шарики были промыты три раза в физиологическом растворе при помощи магнитного концентратора и ресуспендированы в физиологическом растворе с содержанием БСА до концентрации 2х107 шариков/мл, после чего сохранены при 4°С до использования

Селекция эндотелиальных клеток была проведена при помощи магнитных шариков, покрытых лекгином Ulex europeus agglutinin, путем инкубирования при 4°С в течении 10 минут и постоянном перемешивании Клетки были инкубированы с шариками в пропорции 1 3 в общем объеме 0 5 мл После этого прикрепленные клетки были собраны при помощи концентратора магнитных частиц, с последующим удалением супернатанта, не содержащего магнитных шариков, но содержащего клетки других типов (не-эндотелиальные) Данная процедура проводится три раза, с промежуточной промывкой частиц в среде МакКоя, содержащей 1% ТС в течение 1 минуты

Очищенные популяции ЭКМР эндометрия, полученные из индивидуальных препаратов (количество клеток варьировало от 5000 до 17000), были посажены в чашки Петри (35мм2, при плотности клеток 6000 на ячейку), предварительно покрытые коллагеном IV типа (5;ig/cM2) Культуры клеток были инкубированы при 37°С в инкубаторе во влажной атмосфере с содержанием 5% СОг Среда менялась через каждые 48 часов При достижении конфлюенции клетки были пересажены путем использования раствора, содержащего трипсин и ЭДТА, с последующим разведением в среде в пропорции 1 2

Полученные данным методом клетки первоначально содержат магнитные шарики, прикрепленные к их поверхности (Рисунок 2) Клетки образуют специфические колонии, характерные для данного типа клеток, в течение первых 24 часов Из проведенного количества экспериментов 80% имели своим результатом успешное изолирование эндотелиальных клеток Лишь часть из полученных препаратов (<5%) содержала другие типы клеток, количество которых, тем не менее, не превышало 1-5% ЭКМР эндометрия имели морфологию типичную для клеток данного типа (Рисунок 2) - с большим ядром, заметным контактным ингибированием в точках соприкосновения, а также отсутствием наползания клеток друг на друга при достижении конфлюенции Магнитные шарики оставались прикрепленными к эндотелиальным клеткам после того, как они были посеяны

впервые, и впоследствии было отмечено их спонтанное освобождение при первой пересадке Кроме того, эндотелиальные клетки обладали способностью образовывать "капилляроподобные" структуры при пересадке на матрикс Матригель (Рисунок 2) Предыдущими исследованиями было показано, что только эндотелиальные клетки обладают такой способностью Более подробные детали проведения вышеуказанных экспериментов описаны в наших работах [№Ыепко е1 а1,2000, ЗДкЛепко е1 а1,2006]

Полученные из тканей первичные клетки необходимо было охарактеризовать на наличие специфических маркеров того или иного типа клеток ЭКМР были охарактеризованы с использованием специфических маркеров эндотелия (Рисунок 2, Таблицы 1 и 2) Для проведения анализа специфичности полученной популяции эндотелиальных клеток нами был проведен иммуногистохимический анализ клеток, изолированных из эндометрия, миометрия и децидуапьной ткани Для этого нами был использован спектр моноклональных и поликлональных антител, распознающих антигены, которые экспрессированы специфически на определенных типах клеток (Таблица 1) Иммуногистохимия и иммунофлюоресценция были проведены соответственно методам, описанным в спектре наших работ [крепко а1,2000, ШЫепко е! а1,2001, №кИепко е* а1,2006]

Таблица 1

Моноклоиальные в поликлоиальные антитела, использованные для характерней 1(ни эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла

Антитело/Клон_Антиген ° Литература_Источник

1А4 Гладкомыщечный актин Skalli et at, 1986 Dako

F8/86 Фактор вон Виллебранла Naiemetal, 1982 Dako

JC/70A - CD31 Parums et al, 1990 Dako

LP34 Кератины 5,6 and 18 Molletal, 1982 Dako

MNF116 Керапшы 5,6,8,17,19 Dako

PG-Ml CD68 Fahrn et al, 1993 Dako

V9 Виментин Osbometal, 1984 Dako

MM1 Ki-67 Novocastra

Поликлоиальные Фактор вон Виллебранла Bukhetal, 1986 Dako

Поликиональные VEGFR II (KDR) Barleon et al, 1994 Дар от DrH Weich

" CD31 - cluster designation 31, CD68 - cluster designation 68, VEGFR П - vascular endothelial growth factor receptor II

Маркеры CD31, фактор вон Виллебранда и места связывания лектна Ulex europeus agglutinin присутствовали на эндотелии как в тканях, так и in vitro в течение 4-5 пассажей (Таблица 2) Интенсивная типичная "точечная" окраска на фактор вон Виллебранда была отмечена в цитоплазме эндотелия микроциркуляторного русла эндометрия и децидуапьной ткани в культуре (Рисунок 2) При достижении конфлюенции антиген CD31 присутствует в местах клеточных контактов в данных клетках (Рисунок 2) Кроме того, клетки обладали способностью к эффективной пролиферации, как показано с применением маркера Ki-67 (Рисунок 2)

Нами также были использованы антитела против гладкомышечного актина, кератинов и CD68 (Таблица 1) для определения присутствия мышечных и эпителиальных клеток, а также макрофагов соответственно в культурах эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла Данные эксперименты выявили наличие всего 1-5% неэндотелиальных клеток в менее чем 5 процентах полученных препаратов первичных клеток из исследуемых тканей

Таким образом, оптимизация метода привела к получению чистых (95-100%) первичных культур ЭКМР из тканей человека (децидуа и эндометрий, Рисунок 2)

Применение данного метода с использованием ткани миометрия также привело к успешному получению ЭКМР из данной ткани человека Происхождение ЭКМР

миометрия было охарактеризовано с использованием морфологических, иммуногистохимических и молекулярно-биологических методов

Таблица 2.

Иммунореактивность эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла эндометрия человека на криостатных и парафиновых срезах и в культуре с использованием моноклональных и поликлональных антител (включая результаты по окраске с использованием лекгина 11ЕА-1)

Антиген Криостатные срезы Парафиновые срезы Культура 4-го пассажа

Фактор вон Виллебранда CD31 +++ +++ +++ +++ +++

Виментин ++ ++ ++

Места связывающие НО +++ ++

лекгин UEA1

Ю-67 НО + ИЛИ- -н- или -

VEGFR II (KDR) ++ НО НО

Гладкомышечный -

актин

Кератины ...

5,6,8,17,18,19

CD68

Сокращения указаны в Таблице 1

" Сходная окраска была получена на парафиновых и криостатных срезах

Интенсивность окраски была определена полуколичественным методом +++ - очень интенсивная окраска, ++ - сильная окраска, + - слабая окраска, - - отсутствие окраски, НО - анализ не проведен

Исследование роли адреномедуллина.

Получение чистых культур ЭКМР позволило впервые изучить влияние AM на биологию данного типа клеток человека и проверить гипотезу о роли этого пептида в ангиогенезе в тканях и органах человека. Нами были проведены эксперименты по изучению ролл AM в росте, миграции и регуляции монослоя ЭКМР (Рисунок 3)

Митогенные свойства адреномедуллина.

Митогенный анализ (влияние на пролиферацию) свойств адреномедуллина был проведен с использованием метода инкорпорации радиоактивно меченного тимидина (мегил-3Н) [Nikitenko et al, 2000] Первичные эндотелиальные клетки четвертого пассажа были посажены в 96-луночные тареяки (5000 клеток на лунку) На следующий день среда была заменена на среду с низким содержанием человеческой сыворотки (20%) На третий день клетки были простимулированы факторами роста эндотелия (VEGF), фибробластов (bFGF), эпидермиса (EGF) или адреномедуллином (AM), растворенными в среде, содержащей 10% сыворотки человека, и с добавлением радиоактивно меченного тимидина (1 juCi) После 24-часовой инкубации клетки были трипсинизированы и собраны на фильтры для измерения радиоактивности с помощью сцинтилляционного бета-счетчика

AM индуцировал инкорпорацию тимидина в культурах ЭКМР эндометрия и миометрия (Рисунок 3) человека Интенсивность стимуляции была сравнима с таковой, полученной при использовании известных ангиогенных факторов - VEGF и bFGF, экспрессия которых была ранее выявлена в матке человека [Bicknell and Rees, 1995]

и

а. а

1.1 ■■

lili /VVW

.Ti

Контроль

AM

И,

I* í

в

¡i

"if

i 1

J IM Ш feiisi

x j* ы

✓VVV

Д

f,;

snoi ¿000

1(11« J

□

■■■I

w

• Clone RL-AOW1 ■ Clone RL-AOM2

* Conlrol

St 1С! 8

Врснж после мгыасцик, исдела

Рисунок 3- Роль алреномслуллина в биологии энлотелкальных icier ок мнкро цирку л игорного русла (ЭКМР) человека.

(А) Пролиферация ЭКМР эндометрия в ответ на стимуляцию AM (результаты стимуляции с использованием VEGF приведены для сравнениям Б) Пролиферация ЭКМР миометрня при стимуляции AM. (В) Миграция ЭКМР кожи в аппарате Trartswell в ответ на стимуляцию AM, Данный эффект AM на ЭКМР in vitro сравним с эффектом, наблюдаемым in vrw при использовании (Г) САМ (chicken chorioallantoic membrane assay) (фото адаптировано из Zhao et aL, 1998 для сравнения) н (Д) мышиных ксенографтных моделей (фоте адаптировано из Oehler el aL 2001 для сравнения) (Е) AM защищает монослой ЭКМР от действия активаторов апоптоза (например, низкое содержание сыворотки в среде для культивации). Данный эффект противоположен (Ж) эффекту, наблюдаемому в сосудистой системе мышей при выключенииУудалении гена адреномедуллина (ДТ -дикий тип; НО - нокаут; фото адаптировано из Shindo et aL 2001 для сравнения).

Контроль

Лдреномедуллин стимулирует миграцию эндотелиальных клеток

Для исследования влияния AM на миграцию эндотелиальных клеток нами были использованы аппараты Transwell (Рисунок 3) [Nikitenko et al, 2006] Эндотелиальные клетки были посажены в верхнюю камеру вкладки Transwell Пептиды (адреномедуллин, CGRP или амилин, принадлежащие к одному и тому же семейству пептидов) [Poyner et al, 2002] были добавлены в нижнюю камеру Полная среда для культивирования эндотелиальных клеток (содержащая несколько факторов роста для эндотелиальных клеток) или VEGF были использованы в качестве положительных контролей Среда без факторов роста (0 5% ТС) была использована в качестве отрицательного контроля После 24-часовой инкубации клетки были помечены флуоресцентным красителем (calcem_AM), и количество мигрировавших клеток определено путем измерения флуоресценции клеток с использованием счетчика Е1х 800 с возможностями чтения нижней части вкладыша Данные были проанализированы и статистически обработаны, и фотографии получены с использованием Программ RC4v30 PowerReports и Nicon CoolPix 990 Camera соответственно Только мигрировавшие сквозь поры светонепроницаемой мембраны клетки могут быть детектированы счетчиком

Проведенные эксперименты показали, что AM является фактором миграции эндотелиальных клеток (Рисунок 3) Полученный при использовании данных пептидов миграционный эффект был сравним по интенсивности с таковым, полученным при использовании ангиогенного фактора VEGF Значительный интерес при этом представляет сходство ангиогенных эффектов (пролиферации и миграции), полученных при использовании эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека, и т vivo моделей с использованием тканей цыпленка (Рисунок 3) и ксенотрансплантированных клеточных линий, сверхэкспрессирующих AM, в мышиных моделях (Рисунок 3)

Ингибирование апоптоза адреномедуллином.

Нами были также проведены исследования по выявлению роли AM в ингибировании апоптоза, вызванного пониженной концентрацией сыворотки в культивируемой среде (Рисунок 3) Результаты данных исследований показывают, что AM защищает монослой эндотелиальных клеток человека от разрушений, вызванных пониженной концентрацией сыворотки и гибелью эндотелиальных клеток в данных условиях Значительный интерес при этом представляет сходство морфологии эндотелия человека при ингибировании AM сигналов и эндотелия органов у гомозиготных АМ~' эмбрионов мышей (Рисунок 3) [Shindo et al, 2001]

Таким образом, в результате первого этапа исследований нами были разработаны методы изолирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла эндометрия и миометрия, как органов, в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза. Данные методы получения эндотелия сосудов микроциркуляторного русла человека позволили впервые проверить гипотезу о возможной роли адреномедудлина в данных клетках при процессах ангиогенеза и изучить роль этого пептида в биологии данного типа клеток Результаты проведенных экспериментов продемонстрировали впервые роль адреномедуллина в росте и миграции эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека.

Необходимо отметить, что одновременно исследованиями, проведенными в лабораториях за рубежом, были сделаны открытия о роли AM в эмбриогенезе [Caron and Smithies, 2001, Shindo et al, 2001] и развитии раковых опухолей [Oehler et al, 2001, Oehler et al, 2002], ингибировании апоптоза [Kato et al, 1998, Shichin et al, 1999] и гиперпроницаемости эндотелиальных клеток [Hippenstiel et al, 2001] Обобщение данных исследований и предварительно существовавших знаний о вазоактивных свойствах AM позволило нам сделать заключение о важной роли данного пептида в микроциркуляторном русле [Nikitenko et al, 2002]

В свою очередь данные открытия указывали на необходимость исследования адреномедуллиновых рецепторов в клетках и тканях человека, и в том числе механизмов, регулирующих их экспрессию и функцию

Механизмы, регулирующие экспрессию адреномедуллиновых рецепторов,

[ [еобходимость изучения экспрессии эндогенных ад ре но медулл и нов ых рецепторов обусловлена прежде всего тем, что лиганд может быть секретирован практически любой клеткой. Однако остается неясным, какие клетки являются мишенью для данного пептидного гормона в органах и тканях. Прежде всего, данная информация необходима для разработки методов терапии и регуляции (зктивирования или ингийирования) физиологических и патологических процессов ангиогенеза. Поэтому нами был разработан спектр методов для изучения экспрессии, □ также механизмов, регулирующих транскрипцию гена и функционирование адреномедуллиновых рецепторов в эндотеяиальных клетках.

Исследованиями, проведенными С. Фордом и коллегами [McLatchie et al., 1998] было показано, что G-белок связывающий рецептор Caicitonin receptor-Nke receptor (CRLR, впоследствии переименованный в CL рецептор, колируемый CALCRL геном, в соответствии с номенклатурой Фармакологического С оюза и Геномного Проекта Человека соответственно) путем формирования гетеродимера с одним из трех RAMPs (белков, модифицирующих активность рецепторов) образует рецепторы для нескольких пептидов кал ьц нто н и н о во й группы. Таким образом, CL играет ключевую роль в формировании адреномедуллиновых рецепторов (Рисунок 4). Поэтому наши исследования на следующем этапе были сфокусированы на исследовании механизмов транскрипции CALCRL гена и экспрессии функционального CL рецептора.

CGRP Рецептор Адреномедуллнноные Рецепторы

Рисунок 4. &беио1кв1эиипщ1Й рсигитор СЪ - кдючеш молекула в ал ревомедудл ивовых рейс вторах.

С1 рецептор эксврессвроваи в клетке в виде осио&но-гликоэилкроваввого белка, который локализовав в звдоплазмзтаческом ретикулуме. Велкв модвфвцнрующве активность рецевтора (ЯАМРь) ирвнвмантт участне в термикальвом глвкоэдлированин, травеворте С1_ рецевтора к влазматнческой мембране в определяют февотвв гетсродкилеров. Гетеродвмер Си1*АМР] является рецептором для (ХгкГ К'СКР рецептору, а то время как СЫ1АМР2 и СЬНАМРЗ игтеродимеры во своим фармакологическвм свойствам являются соответствен во АМ, в АМ? рецевторамн.

Исследования экспрессии CALCRL гена in vitro и in vivo.

Первоначально исследованиями, проведенными с использованием тканей человека и применением метода гибридизации in situ нами было показано, что мРНК CALCRL локализована преимущественно в кровеносных сосудах m vivo (Рисунок 5) Данные этих исследований указали на то, что m vivo именно микрососуды являются мишенью для адреномедуллина и CGRP, несмотря на широкий эффект данных гормонов in vitro на многие другие клеточные линии, происходящие из разных органов [Hrnson et al, 2000] Несмотря на данные результаты, исследованию регуляции экспрессии адреномедуллиновых и CGRP рецепторов препятствовало отсутствие знаний прежде всего о регуляции экспрессии CALCRL гена Поэтому первоначальной целью наших исследований являлось клонирование промотора, выявление регуляторных элементов в его структуре и исследование механизмов, регулирующих транскрипцию CALCRL гена в эндотелиальных клетках человека

Транскрипционный анализ CALCRL гена с использованием метода ОТ-ПЦР.

Для транскрипционного анализа (профайлинга) экспрессии человеческого CALCRL гена, нами были использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с предварительным использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР) и РНК, полученных из эндотелиальных и неэндотелиальных клеток, а также из тканей человека Полученные данные показали, что экспрессия CALCRL гена происходит преимущественно в микроциркуляторных эндотелиальных клетках человека, изолированных из легких, эндометрия, миометрия и кожной ткани (Рисунок 5)

Определение транскрипционного начала CALCRL гена с использованием метода RACE.

Для выявления транскрипционного старта и промотора CALCRL гена человека нами был использован метод быстрой амплификации концов комплиментарной ДНК (кДНК) (RACE) RACE является методом, основанным на использовании метода ПЦР, и является эффективным при изолировании полной последовательности кДНК индивидуальных генов Первоначально мы провели дизайн специфического праймера 5 'CCCACAAGC AAGGTGGGAAAGAGTG, соответствующего первому экзону опубликованной последовательности CALCRL гена человека. РНК эндотелиальных клеток была транскрибирована обратной полимеразой с применением олиго-дТ праймера для получения одноцепочечной кДНК Адапторные последовательности были лигированы к обоим концам полученной ДНК для получения двухцепочечной кДНК Лигированная ДНК была использована для проведения ПЦР с использованием ген-специфического и адапторного праймеров

Использование метода 5'-RACE привело к амплификации основного продукта длиной 200 нуклеотидов (Рисунок 6) Данный продукт ПЦР был очищен методом изолирования из геля, просиквенирован, и полученная последовательность сравнена с последовательностью кДНК и геномной последовательностью с целью определения транскрипционного старта CALCRL гена человека. Наши данные привели к выявлению начала транскрипции и позволили определить потенциальный промотор CALCRL гена, и поэтому сделать возможным проведение его клонирования и анализа.

Изначально нами были проведено изучение промотора CALCRL гена, а также гетерогенности его транскриптов и субхромосомной организации в эндотелиальных клетках человека

А Эндотелнальньк' клетки

CALCUL

¿¡-актгш

CALCUL р-актин

- //

S v Î f i ,, Положительный s Ннндотыиа^ьиыс клетки --——„_______—_контроль

<// S///////J

I

! £

в к

>3

» I

M

§ а

S

en

Рисунок 5, Транскрипции САЬСЯЬ гена в клетках н тканях человека.

(А) Преимущественная экспрессия САЬСШ мРНК в эндотелнальных клетках, полученных из разных органов человека (НОМУЕС - кожи; ЬМУЕС легких; ЕМУЕС - эндометрия; ММУЕС - миометрия; НЦУЕС -пупочной вены)« была определена путем использования метода ОТ-ПЦР. Экспрессия гена намного ниже в неэндотелиальных клеточных линиях и первичных клеточных культурах [№ккепко е! а1.» 2003) (Б) САЬСЯЬ мРНК локализуется в клетках сосудов микроциркуляторного русла матки как в эндометрнальной, так и миометрнальной тканях (стрелки), но не в эпителиальных железах {короткие стрелки) и строме (звезды) эндометрия (Э), либо гладких мышцах (збех)ы) миометрия (М). Замороженные срезы гибрид тированы с антнее не-зондом, меченным для выявления локализации С4ХСЛ1 мРНК (микроскопия с использованием светлого и темного полей). Сигнал отсутствует при использовании сенс-зонда. СП - светлое поле, 777 - темное поле.

Рисунок 6, Определение EtU41.11 {ранекритшнн CALCRL гена

человека в лнотелн альмы* кктш с испольтовяинем могола .TRACE. Специфичный для первого 'экзона CALCRL гена праЯыер (GSP-1) был использован для проведения RACE реакции амплификации. (А) А ратифицированный продукт

:);t ¡МврОМ 200 нуклеотидных пар для CALCRL гена человека (1) п 2500 нуклеотндных пар ь: ч

транеферри нового рецептора (TFR, 2; контроль?. GSP-1 (3), TFR (4) «ли смесь универсальны* прангиеров (5) прн использовании поодиночке не производят данных продуктов, указывав на их специфичность. А.ч мл и фондированный фрагмент CALCRl. кДНК йыл выделен из геля, очищен и п роен кве пировал для определения З'нетранелированного участи (5'UTR: mitranslated region) CALCRL кДМК. (Б) Проведенное сиквенирование позволило точно определить начало транекршщии CALCRL гена человека.

Клонирование и характеристика промотора CALCRL гена.

Клонирование промотора было проведено с использованием данных 5'RACE эксперимента. Нами был проклонирован фрагмент геномной ДНК, соответствующий 2.3 ко до транскрипционного старта. Конструкты 5'-flanking участка были использованы в экспериментах с модифицированным вектором для подтверждения роли клонированного участка CALCRL гена в транскрипции [Nikitenko et al., 2003]. Полученные данные указывают на то, что клонированный участок геномной ДНК действительно обладает способностью обеспечивать транскрипцию, и поэтому вполне вероятно то, что он является промотором CALCRL гена.

Кроме того, использование программы SIGNAL SCAN позволило определить потенциальные участки связывания известных транскрипционных факторов (ТФ), включая NF-1, Spl и глюкокортикоидпые рецепторы [Nikitenko el al., 2003]. Нами также был проведен дополнительный анализ промотора, который позволил выявить наличие участка ответа на гипоксию (hypoxia-respose element, HRE). Для выявления роли тгого участка в транскрипции CALCRL гена в гипоксических условиях, нами был проведен мутагенез данного фрагмента промотора и соответствующие функционапьные исследования (Рисунок

7).

Результаты данных исследований подтвердили функциональную роль 11RE в экпрессии CALCRL гена.

Гетерогенность CALCRL транскриптов.

Проведенные нами эксперименты с использованием метода Northern blotting и CALCRL зонда выявили наличие нескольких РНК (данные не показаны), но в то же время 5'-RACE эксперимент показал наличие только одного фрагмента (промотора) CALCRL гена (Рисунок 6). Поэтому нами были проведены дальнейшие исследования гетерогенной« транскриптов CALCRL гена.

Нами был использован метод З'-RACE и клонирования ампдифицнрованных фрагментов для выявления гетерогенности CALCRL транскриптов. Анализ полученных клонов указал на наличие альтернативных участков терминации и полиаденилирования CALCRL гена.

А

777?""* "" шШ

C.U.CRL * • — < МО h|.

Г 2 4 5 6 7

Б 11ачало транскрипции

I________________

л<;л,и ллс< TticTt'itKt Ai;t аса<:л<;

pGL3.CAC.CRL 516 mut p CL^CALCRÍ 516

pGUi-CALCRl 516 nuit

рСЯЛ-CALCRL 51«

« u « m m ц (.( ( 1 4

Л PI I II* ,

p

Oniormtji

> промотора

Рисунок 7. Определение активности ЕЖЕ участки промотора СА1.С11[. гена человека.

Посдед&впьяъностъ нормальной н мутированной рСИ-СЛ1СМ, плазм ид. рСЬЗ-CAI.CR.L-S!6 и рСи-СА1С!и.-516тш одинаковы (... ... .,.) за не кл ючен нем замены трех нуклеоткдов в последовательности : I к I ■ (подчеркнуто) мутирован егого вектора.

(Б) Анализ транзитной экспрессии нормального и мутирован-иого векторов. Первичные Х\мр кожи

человека были

транфицпроааны с рЬРйК (для определении равномерной трансфекцин) н САШ1Ь-516 либо рви-СЛ1СЩг516ти). Трансфсциро ванные клетки были проинкубированы при 20% 0з в течение 4 часов, после чего проинкубированы

при 20% 0, либо 0.1% 0г в течении 16 часов. pGL3/phPGTK соотношение было определено дли каждой плазм иды и нормализовано к результатам для pGL3~CALCRL в клетка* при 20% 02. Соотношение pGL3 (относительная активность pGL3) было рассчитано для определения активности участка 11К[ при гипоксии {meaniS.E.M.. one way ANO VA анализ; p'-O.OI)

Субхромосомная организация CALCRL гена.

Проведенные З'-RACE эксперименты и клонирование выявили наличие нескольких мРНК, транскрибированных с CALCRL гена, а также наличие первого нитрона длиной 60kb [Nikitenko et al., 2003]. Поэтому мы предположили, что пермиссивная транскрипция CALCRL гена обеспечивается уникальной структурой гена в эндотелиальных клетках.

Мы провели исследования регуляции промотора CALCRL гена в транекрипционно-пермиссивных (эндотелнальные клетки) и непсрмиссинныч (неэндотелиальные клетки) клетках человека. Для этого нами был использован G-less вектор и ядерные экстракты из клеток человека, и проведен эксперимент по транскрипции in vitro [Ramadass et al., 2007]. Данные этого эксперимента показали что промотор CALCRL гена может быть активен не только в эндотелиальных клетках, но и в неэндотелиальных клетках, поскольку транскрипционные факторы, активирующие экспрессию данного гена, присутствуют в ядерных экстрактах тех и других клеточных линий [Ramadass et al., 2007].

Поскольку специфическая экспрессия CALCRL гена наблюдается в эндотелиальных клетках (Рисунок 5), но промотор может быть активен и в других клетках [Ramadass el al., 2007], это подтверждает ранее вынесенное предположение, что организация (трехмерная структура) данного гена различается в транскрипционнсьпермиссивных (эндотелиальных клетках) н непермессивлыч (неэндотелиальных клетках) человека.

Для проверки данной шнотезы мы использовали метод chromosome conformation capture (ЗС), разработанный в лаборатории А. Акуличева (Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, United Kingdom) для выявления субхромосомной организации CALCRL гена [Akoalitchev et al., 2006; Ramadass et al., 2007]. Данный метод позволил нам проанализировать терхмерную структуру CALCRL гена в транскринционно-пермессивных и непермиссивныч клетках человека. Результаты данного эксперимента (Ramadass et al., 2007], подтверждаю! нашу гипотезу о наличии разных трехмерных структур CALCRL гена в

эндотелиальных и неэндотелиапьных клетках человека. Наличие разнообразия структур в CALCRL гене обеспечивается постоянной активностью РНК полимеразы, и поэтому ее расположением в разных участках данного гена при активной транскрипции в эндотелиальных клетках В то же время в неэндотелиальных клетках структура CALCRL гена указывает на то, что полимераза находится в одном доминирующем положении, которое препятствует активной транскрипции данного гена [Ramadass et al, 2007]

Таким образом, проведенные нами исследования указывают на то, что экспрессия CALCRL гена зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона. При этом ключевым фактором в экспрессии CALCRL гена является его трехмерная субхромосомная структура, которая, скорее всего, обеспечивается эпигенетическими механизмами [Cook et al, 1976] В данных условиях активность промотора играет вторичную роль

Регуляция экспрессии функционального CL рецептора в клетках и тканях.

Для выявления механизмов, регулирующих экспрессию CL рецептора (кодируемого CALCRL геном), необходимо изучение трансляции И экспрессии белка в клетках и тканях Поэтому нами были получены и охарактеризованы специфические антитела против CL рецептора человека

Разработка антител против CL рецептора и их характеристика.

Для выработки антител против CL рецептора человека нами была выбрана стратегия с применением синтезированного пептида из 19 аминокислот, соответствующего карбокси-окончанию белка (HDIENVLLKPENLYN, аминокислотная последовательность 427-461) Специфичность последовательности была проверена с использованием программы CLASTP analysis fhttp //www nebí nlm nih gov! Иммунизация новозеландских кроликов была проведена после связывания пептида с KLH (keyhole limpet haemocyanin) Сыворотка кроликов была забрана один раз до и три раза после иммунизации (с промежутком в один месяц) для выявления титра полученных антител методом ELISA После получения удовлетворительного титра сыворотка иммунизированных животных была забрана и заморожена при -20°С

Анализ антител был проведен с использованием метода иммуноблоттинга кДНК CALCRL и RAMPs генов были клонированы в вектор pcDNA3 1 (вектор для экспрессии в клетках млекопитающих) для сверхэкпрессии функциональных гетеродимеров в клеточной линии НЕК293Т CALCRL кДНК, содержащая полную последовательность, кодирующую CL рецептор, была синтезирована с использованием РНК, полученной из эндотелиальных клеток человека. Белковые экстракты, полученные из клеточных линий сверхэкспрессирующих CL, CL+RAMP1 или CL+RAMP2, были использованы для первичной оценки поликлональных антител, выращенных против CL рецептора человека (Рисунок 8)

Данные проведенных исследований с использованием метода иммуноблоттинга показали, что антитела обладают высокой специфичностью против трех форм CL рецептора -дегликозилированного, основно- и терминально-гликозилированного рецептора (Рисунок 8)

Для подтверждения данных выводов нами были проведены эксперименты с использованием эндогликозидаз F и H, с целью определения какие из детектируемых форм рецептора являются основно- и какие терминально-гликозилированными (данные не показаны, см также Рисунок 11) После подтверждения специфичности полученных антител, они были использованы для проведения иммуногистохимии и иммунофлуоресценции в разных тканях органов человека для определения локализации CL рецептора (Рисунок 9)

Рисунок 8. Временно jkc премированный н

эндогенный CL рецептор.

Кодирующая ДНК CALCRL гена человека была

клонирована в pcDNA3.l -вектор для экспрессии в клетках и назван pcDNA3.l-CALCRL. Для проверки функциональности клонированной кДНК нами была осуществлена коэкспрессия с RAMPs в клетках НЕК293Т и анализ содержания цАМФ при стимуляции соответствующими лигандамн. Дикий тип НЕК.293Т клеток не экспрессирует эндогенных AM и CGRP рецепторов, т.к. концентрация цАМФ в ответ на стимуляцию данными пептидами отсутствует. В то же время в клетках НЕК293Т, которые содержат трансфецнрованные CALCRL и RAMPs человека, рецепторы активны (данные не показаны). Белковые экстракты из клеток были проанализированы методом SDS-PAGE при восстанавливающих условиях, и иммуноблоты обработаны первичными поликлональнымн антителами, выращенными против CL рецептора человека. Антитела специфически распознают CL рецептор человека в НЕК293Т клетках, трансфецнрованных только pcDNA3.l-G4ZC/iZ., или вместе с RAMP/ или RAMP2 (CL+ RAMPI или CL+RAMP2; функциональными AM или CGRP рецепторами соответственно). Нетрансфецированные НЕК293Т клетки (MOCK) или трансфецированные с вектором pcDNA3.1, или RAMPI или RAMP2, не экепрессируют CL рецептор. Разновидности рецептора массой -40-45 кД (белый ромб, основно-гликознлированный рецептор) присутствует в НЕК293Т клетках, трансфецнрованных только с pcDNA3.1-C.4LC/?/.. Рецептор массой -55 кД (черный ромб; терминально гликознлнрованный рецептор) производится клетками только в случае коэкспрессин CL рецептора с RAMPs, Антитела также распознают дегликозилированный рецептор (-37 кД; см. Рисунок 11) и эндогенный CL рецептор человека, экспрессированный в тканях (см. Рисунок 10), Иммуноблоты являются примером двух независимо проведенных экспериментов. Для подтверждения равномерности количества использованных белковых экстрактов нами были использованы антитела против бета-актина 0-Ac tin).

IIFK29JT

cl

В-AC tin

511

37

37

у т

I- 'J

Рисунок 9. Локализация CL рецептора в тканях человека.

Локализация CL рецептара была определена путем проведения иммуногисгохямии на парафиновых срезах с использованием мнкрочнпа тканей и первичных антител против CL человека и вторичных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой, локализация которой была выявлена с применением реактива Vector Red (красный цвет). Клеточные ядра окрашены гематоксилином (голубой цвет). Выявлена преимущественная локализация рецептора в эндотелиальных клетках (стрелки) микроциркуляторного русла (А) эндометрия, (Б) мнометрня, (В) аденокарциномы, (Г) желтого тела, и (Д и Е) шейки матки, а также (Е) в эпителии {короткиеcmpeiKu) шейки матки.

Результаты проведенных иммуногистохимических исследований обобщены в Таблице 3 Полученные данные позволили сделать заключение о том, что в большинстве исследуемых органов и тканей человека рецептор экспрессирован в эндотелиапьных клетках микроциркуляторного русла, а также в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов в некоторых из исследуемых органов Для подтверждения данных выводов нами была проведена двойная иммунофлюоресценция с одновременным использованием двух антител поликлональных - выращенных против СЬ рецептора, и моноклональных - против маркеров индивидуальных типов клеток эндотелиапьных, гладкомышечных клеток, лейкоцитов и макрофагов (данные не показаны) Данные проведенного анализа подтвердили специфическую экспрессию СЬ рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

Таблица 3

Экспрессия СЛ. рецептора в тканях и клетках человека.

Полуколичестаенный анализ экспрессии СЬ рецептора в индивидуальных клеточных типах в тканях человека.

Орган Эндотелий СЬ-ИР Другие типы клеток СЬ-ИР Замелен

лимфатический узел эндотелий ++ ++++ очень сильная экспрессия

матка эндотелий им эпителий гладкомышечные клетки -н-+ сильная экспрессия

миометрия + ++ средняя экспрессия

янчнвкн эндотелий -/+ перициты -/+ + слабая экспрессия

желчный пузырь эндотелий ++++ гладкомышечные клетки эпителий слизистой оболочки -н--/+ отсутствие экспрессии

легкие эндотелий ++++

миндалины эндотелий +++ плоский эпителий ОЯ Окраска ядра

лимфоидные клетки + СЬ-ИР (X - иммунно-

желудок эндотелий /+или+++ шифовые клетки париетальные клетки -н- реактивность

надпочечники эндотелий -н-/+++ эпителий -/+

слюнная железа эндотелий -/+или-н- эпителий протоков серозный эпитлеий +

паращитовндная

железа эндотелий эпителий ++/++++

яички эндотелий +/-Н- сперштогонии клетки Лейдига ++++ Сильная ОЯ

трахея эндотелий ++

почка эндотелии 1111 эпителий +++

пищевод кожа эндотелий эндотелий ++ -/+ гладкомышечные клетки сосудов эпидермис гладкомышечные клетки сосудов +++ ++/+++ ++++

печень эндотелий + гепатоциты n11

поджелудочная

железа эндотелий бета-клетки экзокринные железистые клетки 11 1 1 +/++ ОЯ

плацента эндотелий -

амнион эндотелий -

Исследование локализации и экспрессии функциональной формы СЬ рецептора в тканях и клетках.

Высокая специфичность антител (Рисукнок 8) позволила нам также определить какие формы СЬ рецептора экспрессированы в тканях человека (Рисунок 10) Данные проведенных исследований указывают на то, что в большинстве исследованных тканей человека экспрессирован функциональный рецептор (терминально гликозилированный, ассоциированный с плазматической мембраной клетки) (Рисунок 10), и что соответственно результатам иммуногистохимии (Рисунок 9) этот рецептор находится на поверхности эндотелиальных клеток Дополнительный анализ позволил определить, что в раковых опухолях также экспрессирован функциональный рецептор (Рисунок 10)

Нормальные ткани

Б

Опухолевые ткани

Рисунок 10. Гликозилировайие CL рецептора т vivo

Белковые экстракты были получены из нормальных и раковых тканей человека и проанализированы с применением метода SDS-PAGE при восстанавливающих условиях, с последующей обработкой иммуноблотов с использованием антител LN-1436, выращенных против CL рецептора человека. Стрелка, негликозилированный (~37 кД), белый ромб, основно-гликозилированный (~45 кД), черный ромб, терминально-гликозилированный (~55 кД) разновидности рецептора (А) Нормальные ткани человека (эндометрий, миомегрий и желтое тело) содержат CL рецептор в той или иной форме Экспрессия рецептора отсутствует в плаценте человека на поздних стадиях беременности (Б) В тканях раковых опухолей (почек, яичников, лейомиомы и саркомы Калоши) основная форма CL - терминально гликозилированный рецептор

Таким образом, нами были выращены антитела, позволяющие определять не только наличие, но и функциональную форму (экспрессированную на поверхности клетки) CL рецептора в клетках и тканях человека. Высокая специфичность данных антител позволила нам провести дальнейшие исследования по изучению свойств рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека

Исследование специфичности и динамики десенситизации CL рецептора.

Для выявления свойств рецептора, экспрессированного в ЭКМР человека, как типа клеток, в которых рецептор локализован т vivo, нами была проведена серия экспериментов по изучению

- экспрессии форм рецептора (дегликозилированного, основно- и терминально-

гликозилированного),

- экспрессии RAMPs,

- внутриклеточной локализации рецептора,

- транспорта и интернализации рецептора,

- специфичности рецептора к АМ и CGRP,

- десенситизации рецептора.

Экспрессия CL рецептора и RAMPs в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

Экспрессия различных форм CL рецептора была проанализирована с применением методов иммуноблотгинга. Нами были выявлено, что в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека (ЭКМР) присутствуют как основно- так и теминально-гликозилированная формы CL рецептора (Рисунок 11)

Рисунок 11 Экспрессия CL и RAMPs в эндотелиальных клетках человека

(А) Экспрессия CL рецептора была проанализирована путем использования метода иммуноблоттинга Белковые экстракты из эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) кожи человека были проинкубированы с эндогликозидазой F (F, ячейка 2), либо эндогликозидазой Н (Н, ячейка 3) или в их отсутствии (-, ячейка 1), с последующим проведением SDS-PAGE при восстанавливающих условиях и иммуноблоттинга с использованием антител LN-1436, выращенных против CL рецептора человека. Стрелка, негликозилированный (~37 кД), белый ромб, основно-гликозилированный ( 45 кД). черный ромб, терминально-гликозилированный (-55 кД) разновидности рецептора. CL рецептор молекулярной массой ~55 кД восстанавливается до ~37 кД белка после обработки эндогликозидазой F, но устойчив к действию эндогликознцазы Н Впоследствии мембраны были обработаны с использованием антител против бега-актина ф-Actm) для подтверждения использования одинаковых количеств белковых экстрактов (Б) Экспрессия CALCRL и RAMPs мРНК в ЭКМР кожи (ячейка 1), легких (ячейка 2), миометрия (ячейка 3) и эндометрия (ячейка 4) человека были проанализированы с использованием метода ОТ-ПЦР Праймеры для /3-актина (ВА) были использованы в качестве контроля использования одинакового количества РНК для ОТ-ПЦР В качестве контроля была использована РНК, изолированная из ткани почек (ячейка 5) Цифры справа показывают размеры амплифицированных ПЦР-фрагментов

Экспрессия CL рецептора на поверхности эндотелиальных клеток (терминально-гликозилированная форма) коррелирует с экспрессией RAMP2 и RAMP3, но не RAMP1 генов (Рисунок 11)

Полученные данные указывают на то, что вероятнее всего CL рецептор формирует гетеродимер CL/RAMP2 и/или CL/RAMP3 на поверхности ЭКМР человека, и поэтому представляет собой AMi и/или АМг рецептор

Локализация CL рецептора в эндотелиальных клетках.

Данный эндотелиальный рецептор экспрессирован на поверхности клетки и в эндоплазматическом ретикулуме (данные не показаны) in vitro, что подтверждает данные иммуноблоттинга (Рисунок 11), поскольку наличие основно-гликозилированного рецептора обычно ассоциировано с его локализацией в эндоплазматическом ретикулуме, а теминально-гликозилированного - на поверхности клетки, те в плазматической мембране, после дополнительного гликозилирования в результате взаимодействия с RAMP в эндоплазматическом ретикулуме [McLatchie et al, 1998]

Специфичность и интернализация CL рецептора в эндотелиальных клетках.

Для проверки предположения о том, что эндотелиальный CL образует AM рецепторы (либо AMi - CL/RAMP2 и/или АМг - CL/RAMP3), нами были проведены исследования по выявлению фенотипа CL рецепторов, экспрессированных в эндотелиальных клетках человека.

Прежде всего нами было исследовано какие рецепторы - AM или CGRP -экспресированны эндогенно на поверхности ЭКМР человека. Результаты проведенных исследований с использованием методов по определению аккумуляции цАМФ, являющейся

одной из сигнальных молекул в системе адреномедуллиновых рецепторов, и миграции эндотелиальных клеток показали, ЧТО как АМ, так и СОКР. рецепторы жепрессированы в этих клетках (данные не показаны). Эти данные противоречат сделанному предварительно прел положению, что эндотелиальный СЬ образует только АМ ренепгоры.

Поэтому нами были проведены эксперименты по исследованию динамики интернализации эндотелиального СЬ рецептора в ответ на стимуляцию АМ или СОКР. Прежле все™ такое решение было обусловлено тем, что данные работ Кттаздко и коллег [20011 указывали на то, что С1Л1АМР1, СШАМЙ2 и СШАМРЗ гетеродимеры ннтернализуются но разному и ответ на стимуляцию АМ или ССЖР. Например, ССЛАМР! (ССЕ1Р| рецептор) интернализуется преимущественно при взаимодействии с ССЯР. а С1ЖАМР2 (АМ,) и СЬ'ЯАМРЗ (АМ,) рецепторы - ири взаимодействии с АМ

11роведенные нами исследования показывают, что СЬ рецептор в эндотелиальных клетках интернализуется только ири взаимодействии с АМ (Рисунок 12; данные для ССгЯР не показаны). Эти данные соответствуют данным об экспрессии КАМР2 и К.АМРЗ, но не КАМР1, в ЭКМР, предполагающих экспрессию АМ1 и АМ2 рецепторов (Рисунок 11).

Для проверки данных выводов и выяснения, существует ли какое-либо взаимодействие между СОКР и эндотелиальным СЬ рецептором, нами были проведены эксперименты с использованием антагонистов АМ и ССЯР рецепторов (АМ22-М и СОКРзо7 соответвенпо). Данные антагонисты взаимодействуют с рецепторами, но не вызывают каких-либо функциональных изменений [Роупеге! а!., 2001].

Интересным результатом проведенных экспериментов явилось выявление того, что как ЛМ 32.51, пак и СОКРЫЛ способны ингибировать и нтернал изацию эндотелиальн01Т> СЬ рецептора после стимуляции АМ (Рисунок 12). Данные результаты указывают на то, что СОИР также может взаимодействовать с эндотелиальным СЬ рецептором. Если это так, то наблюдаемое ранее влияние не только АМ, но также и СОЯР на миграцию эндотелия, а также аккумуляцию цАМФ в ЭКМР человека (данные не показаны) м01ут быть связаны со взаимодействием данного пеи гида с СЬ рецептором.

~hCL НВЯнВЕ^ w Control MI 1шЬ , Ш V .-T Л 1V я' AM ll-ll " KCL 1 ,> *** V. 1 AM * AM ü.jj

AM - Г CGRP,„ 1 # ф* k Г '* 4L T * » * AM + CGRP

Рисунок 12. Взаимодействие АМ н CGRP с СЬ рецептором, экспрессировааныи в эидогелжалыШ! КЛ1ГГКЙК человека.

Внутриклеточное распределение СЬ рецептора в ЖМР человека до {Контроль) и после стимуляции лигандом (АМ НИ -лМ ь течение И '-". и;.": ) с t- u- ö« до'~..и\лли'ч а^тасоннст™ A.NV; а v. CGRP^yj lU^M;. было определено методом яммунйфлуоресценции. Клетки были зафиксированы сразу после спекуляции. Иммунофлуоресцентная окраска была проведена с использованием антител против СЬ рецептора человека в вторичных анпггел меченных ФИТЦ {зеленый JAI'I использовался для окраски ядер (синий цяет).

Представленные рисунки отображают реэультаты двух экспериментов и демонстрируют экспрессию реЕ^ептора на клеточной поверхности (челеные стрел*ги) и после интервалы за ци и (короткие стрелки; точечная локализация в ранних эндосомах).

Десенсшпизация CL рецептора в эндотелиальных клетках.

Для проверки данных выводов нами были проведены эксперименты по исследованию механизмов десенситизации эндотелиального CL рецептора. Нами было выдвинуто предположение о том, что если CL рецептор взаимодействует как с AM, так и с CGRP, то стимуляция/интернализация рецептора при взаимодействии с одним лигандом должна привести к потере ответа на повторную стимуляцию не только к лиганду, который был использован для первичной стимуляции, но и на стимуляцию другим лигандом Результаты проведенных нами экспериментов приведены на Рисунке 13, и показывают, что при стимуляции AM ответ (фосфорилирование Akt) на стимуляцию с CGRP потерян, и наоборот

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

AM 0 5 10 15 0 5 10 15 15

Прешяжубащш с AM - + + + + + ... -

CGRP 15 " 5 10 15 0 5 10 15 -

Пргавцбаои с CGRP + + + + +

VEGF - - - " - - - - 10 - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1? 14 15 16 17 18

££ ЖШШШШШШШК* fe/l—Ч1Р

Akt -*■ ни» . »im arm • ■' i i "к —.....r, ........mjml jt .щи», , ,

AM VEGF CGRP

рецептор рецептор рецептор

Рисунок 13 Десеиситнзапия эндогенных AM н CGRP рецепторов в эндотелиальных клетках. Динамика десенситизации эндогенных AM и CGRP рецепторов в эндотелиальных клетках микроциркулягорного русла (ЭКМР) человека была изучена путем определения степени фосфорилирования Akt (Akt-P) В контрольной группе клетки были простимулированы 100 nM AM (линии 2-4) либо CGRP (линии 11-13) в течение обозначенного времени В группе предварительной стимуляции (с AM либо CGRP, +/- обозначает было ли проведено предварительное стимулирование), клетки были простимулированы с AM (5-9) либо CGRP (14-18) в течение 15 минут, а затем -проинкубированы в среде без лиганда в течение 30 минут В группе предварительной стимуляции клетки затем были заново простимулированы либо с тем же антагонистом (100 пМ) (5-8 для AM и 14-17 для CGRP соответственно) или другим антагонистом (100 nM) (CGRP для клеток преинкубированных с AM, линия 9, и AM для клеток, престимулированных с CGRP) для изучения десенситизации рецепторов Клетки стимулированные VEGF (10 ng/rol в течение 10 мин, линия 10) служили в качестве контроля

Таким образом, результаты проведенных нами исследований предполагают следующую модель регуляции рецептора, экспрессированного в ЭКМР человека (Рисунок 14) Эндотелиальный CL рецептор может взаимодействовать как с AM, так и с CGRP (Рисунок 14) Данное взаимодействие с любым из лигандов приводит к десенситизации рецептора Однако потеря функции (десенситизация) рецептора только в случае взаимодействия с AM обусловлена интернализацией данного G-белок-связывающего рецептора

Полученные данные открывают интересное направление в изучении биологии AM и CGRP рецепторов в клетках и тканях человека Особенно важным является изучение биологии CL рецептора при патологических условиях, при которых уровень AM или CGRP повышен в тканях и клетках человека, как например сердечно-сосудистые заболевания различной этиологии [Hinson et al, 2000] В данных условиях избыточная экспрессия одного или другого лиганда может привести к полнейшей десенситизации эндотелиального CL рецептора к обоим лигандам Принимая во внимание значительную роль обоих пептидов в

биологии сосудистой системы и эндотелиальных клеток в частности [Hinson et а]., 2000; Nikitenko et al., 2002; Brain and Grant et al., 2004], данные изменения могут кардинально повлиять на состояние органов и тканей при патологии, особенно в том случае, если CL рецептор действительно является посредником всех изученных до данного момента эффектов AM на эндотелиальную клетку [Hinson et al., 2000; Nikitenko et al., 2006|. Результаты проведенных нами исследований указывают на то, что экспрессия и функциональное состояние CL рецептора могут оказывать значительное влияние на функционирование эндотелиалыюй клетки н поэтому играть роль в развитии дисфункции эндотелия при различных патологиях.

Рисунок 14.

Свойства п(ы I e.iniLK.jiui и CL рецегггора и

ассоциированной с ним рецептурной системы .тля ' AM -.CGRP АМвСТЖГ.

Эидотелиальный CL

Ш зкспрессирован на клеточной

поверхности в качестве _{>t—- ~> терминально гликозилиро-

ванного рецептора

лУ ; | НвЯвЕй ^иб (полисахаридные остатки

^MflHH^J связанные с аминотерми-

Ж j? нусом схематически

Ч—----представлены как

* структуры серого цвета) и

11А 118 __ _____ гетеродимера с RAMP, (!)

, ----^if AM и CGRP стимулируют

¿¿^¿Г"" фосфорилирование Akt (Akt-

64 ' интерналнзуется в ранние

ОСОСО^ХХХХООСОЭСХХО Схг ни*» -Щ эндоеомы и направлен на

Д. — (III) деградацию в лизосомы

после стимуляции AM, но

/ ш (IIВ) остается на клеточной

( поверхности после

/ р| взаимодействия с CGRP.

\ I Взаимодействие либо с AM

V / (MIA-III) или CGRP (I-IIB)

^ у приводит к десенентизацин

_ —^ (IV) рецептора к обоим

д пептидам, независимо от

И' ____того какой агонист был

■ ' уу использован для начальной

/ \ стимуляции, а также к

I/г**™ Р цдИ 1 м^ \ потере активности за счет

I f^K 1 ^^^RfljH У J различных механизмов.

Десенскпнацня к AM ■ CGRP

Роль адреномедуллиновых рецепторов в тканях человека в норме и при некоторых патологиях.

Проведенные исследования показали, что ДМ играет важную роль в развитии и функции сосудистой системы животных В то же время, несмотря на полученные нами данные о роли пептида и механизмов, регулирующих его экспрессию и функцию его рецепторов в ЭКМР человека in vitro, вопрос о значении AM и его рецепторов в организме человека в норме и при различных патологиях остается недостаточно изученным Это обусловлено прежде всего отсутствием достаточного количества данных об экспрессии AM и функциональных эндогенных адреномедуллиновых рецепторов в органах и тканях человека

В связи с этим нами был проведен спектр исследований с применением разработанных нами методов для изучения экспрессии CALCRL гена человека и функциональной формы рецептора, а также механизмов, регулирующих его функцию в эндотелиальных клетках человека Наши исследования включали исследование возможности практического применения полученных знаний о функционировании рецепторной системы адреномедуллина в эндотелиальных клетках при патологических заболеваниях сосудистой системы, в том числе

1) Исследование роли AM и его рецепторной системы в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологических заболеваний органов репродукции путем исследования экспрессии его рецепторов

2) Исследование возможности использования разработанных реактивов и методов (антител против человеческого CL рецептора и методов определения субхромосомной организации CALCRL гена) для диагностики неоплазм, раковых опухолей и других заболеваний (в том числе исследование корреляции экспрессии и клинико-патологических показателей)

3) Исследование возможности модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы (разработка ингибиторов и активаторов с использованием современных методов и технологий, включая разработку антител против рецептора, экспрессированного на поверхности клетки)

Практическое применение исследований функционирования рецепторной системы адреномедуллина в эндотелиальных клетках при патологических заболеваниях сосудистой системы.

Роль специфической транскрипции CALCRL гена в эндотелии кровеносных сосудов и лимфатических сосудов человека.

Проведенные нами исследования указывают на специфичность экспрессии CL рецептора в эндотелии сосудов различных тканей и органов человека (Рисунки 5 и 9) Дальнейшее изучение механизмов регуляции экспрессии CALCRL гена в эндотелии человека в нормальных тканях и раковых опухолях позволит разработать методы контроля экспрессии данного гена с целью ингибирования патологического ангиогенеза или регуляции функции кровеносных и лимфатических сосудов

С целью дальнейшего изучения регуляции экспрессии CALCRL гена в эндотелии нами была использована модель саркомы Калоши (КС) как эндотелиальной опухоли [Nikitenko and Boshoíf, 2006] Современными исследованиями было показано, что КС происходит из эндотелиальных клеток, поскольку профиль/спектр экспрессии генов в этой неоплазме очень схож с таковым в лимфатическом эндотелии [Wang et al, 2004]. Этиологически КС связан с инфекцией клеток человеческим герпесвирусом 8 (human herpesvirus 8, HHV8, или Kaposi's sarcoma herpesvirus, KSHV) [Boshoff et al, 1995]

Нашими исследованиями с применением методов ДНК микрочипа, иммуноблотганга и иммуногистохимии было показано, что KSHV регулирует экспрессию CALCRL гена в ЭКМР человека (Рисунок 15)

эк

экюяг

Б

12345* 12345*

Саркома Кожа Капоши

1234512345

МУР

КМ

AKU 'II ММР9

схп ?

Т ЬГ j

CXCL12

ЭК ЭК**"*

& s

I «JB3 CJiUK* OLL4

п

!»!■ Ю f OÎOÎO

В

•^г^йНЯИ

-У.

«à

w A. -li

v ¿шШЁ к

■CSSi^n- < Г?-*>- »'i ■ - . m - , -.

ffToSM дЯТЯ«

Рич\ по к Герпесам рус саркомы .........и (K5HV} регулирует "»ьгспрессию CALCRL (CL) tt

»ндателнальньп к.Ч'i k.i\ мнкроцнркуля-ториогй русла '(f.iипекп.

"Эндогелиальные клетки ммкроциркуляторноэ с русла человека {ЭК) были и"фенирезаны вирусом саркомы Капоши (ЭК™1) (1-6 - шесть разных культур клеток) (А) Экспрессия генов была выявлена методом ДНК м и крон и па. Относительная экспрессия отражена с использованием аналитической шкалы (синий цвет -пониженная экспрессия; красный цвет - повышенная экспрессия). Результаты анализа также отображены в виде графика, демонстрирующего повышенную экспрессию CALCRL в нкфецировзнньгх клетках (Vart et а),, 2007). (Б) Экспрессия CALCRL также повышена в тканях саркомы Капоши (КС) по сравнению с нормальной кожей (1-5 - представлены результаты, полученные при анализе тканей от пяти пациентов). (В) Экспрессия CL рецептора в тканях КС была изучена с использованием метода иммуногистохимии и поликлопальных антител против рецептора. Вторичные антитела, меченные перокендазой хрена, и днаминобензидиновая реакция были использованы для выявления локализации рецептора в опухолевых веретенообразных клетках саркомы Капоши (левый и центральный снимки). Этиологически данные клетки связаны с инфецированнем эндотелнальных клеток микроцнркуляторного русла человека и их последующей трансформацией в опухолевые клетки. Срезы ткани, обработанные преиммунной сывороткой, были использованы в качестве контроля (правый снимок). Участок среза, использованный на центральном н правом снимках, обозначен на левом снимке.

Мы произвели клонирование 27 генов, кодируемых вирусом [Vart et al., 2007], и провели транскрипционный анализ с целью выявления влияния данных генов на экспрессию CALCRL гена человека (Рисунок 16). Нами было выявлено, что К2 ген (кодирующий вирусный интерлейкин 6) может являться таким кандидатом (Рисунок 16). Таким обратом, онкогенные вирусы способны регулировать экспрессию CALCRL гена человека. Поэтому нами была выдвинута гипотеза о том, что A M и CALCRL играют роль в патологическом ангиогенезе и лимфангиогенезе, являющимися одними из симптомов КС. Дальнейшие исследования направлены на изучение механизмов регуляции данного G-белок связывающего рецептора с целью использования данных для разработки методов диагностики и, возможно, терапии данной неоплазмы.

i -"H Я 1 Т I re-SyffOTVlwTwPW! [ LTR И" | CMVLgag |Pol_|Jat iRa^PoiyA I CMV VSV-QlPolyÀ |

pSIN pCMV-8.9i pMD.G

Нектор KOAiip}K>naiií ¡1нм1ВНАуа.и,ный Упаковочный лектор Вектор кодирующий вирусный ген оболочку

Лен Til виру спая «библиотека»

К>Н\ (епг I' »Ol ...,!"< 1

к; ■лгш-]

kt. vmb4

orf"ï.

k.ï к-ьду

ks virf..

я N. 1 m.-..:

ki: л

vll_-(

obf": v.r VCli"

orf" lan.a-l

orf-j \r;nc-R

lam?

ks 1

orfw Rla

k1 ч1к..

orf 1 '.Mj.'. L

ortss

Kil

Kl 1

ORT:-6 vpk

i v.VIH.J!

ORF-/ ' v.JK".^

orí--j viUl1

ORF" ? l;:Lo, .

РНК скрннинг

Ощосттельнын уровень ' Ai CRI мРИК

Рисунок I 6 Анализ ре| % .OJIIH H жепреесин CALCRL теня в ж, юге. шальных клетках мвкрощврцгл игорного русла человека индивидуальными геначи герпесвнруся саркомы Капоши (KSHV).

Лснтивируснал библиотека (27 индивидуальных KSHV генов) была создана с использованием плазм нды pSIN и двух других 11 лiiчм;i необходимых для производства лентизирусиых частиц. Список клонированных генов и их производные. Энлотелнальные клетки были ннфецировапы с использованием лентивирусной библиотеки и экспрессия соответствующих вирусных генов была проверена с не пользован нем метода ОТ-ГН^Р (данные не показаны). "Эффективность инфекции была проверена с использованием лент и вирусных частиц произведенных с использованием pSIN плазм ид tj, экс пресс нру юте Л Gf-'P (green fluorescent protein; данные не показанbi)r Проведенный количественный ОТ-ПЦР анализ с исподьзованнем метода TaqMan выявил регуляцию CALCRL гена вирусным геном К2. кодирующим цигокин- вирусный ннтерлейкин-б (vIL-6).

Современными исследованиями с испол ьэовацием мышиных моделей по изучению роли генов в эмбриогенезе была показана роль CALCRL в развитии сосудистой системы [Dakor el al., 2006] и развитии эдемы при его отсутствии, а также СХОДСТВО фенотипа данных животных с таковым у мышей, у которых был выключен ген лиганда - адреномедуллина. [Carón et al., 2000; Shindo et al., 2001: Shimosawa el al„ 2002]. Данные этих исследований также подтверждают предположения о роли CALCRL/CL в развитии и функционировании сосудистой системы и при патологическом л и м фа н ги о генезе и ангиогекезе, как например при развитии КС.

Потенциальная роль механизмов сенситизации и десенситизации адреномедуллиновых рецепторов в эндотелиальных клетках человека в дисфункции эндотелия и при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Транскрипция CALCRL гена (Рисунки 5 и 6) и экспрессия данного G-белок связывающего рецептора на поверхности клетки (Рисунок 8) являются одними из первоначальных ступеней в регуляции экспрессии данного рецептора в эндотелии Циркуляция данного рецептора и механизмы его сенситизации и десенситизации к стимуляции лигандами также играют значительную роль в дальнейшей регуляции функции CL рецептора (Рисунки 12,13 и 14) [Nikitenko et al, 2006, Pararaeswaran and Speilman, 2007]

Нами была использована модель диабетической беременности для изучения механизмов десенситизации и сенситизации AM рецепторов в сосудистой системе человека. Нами было показано, что сосуды плаценты при диабетической беременности теряют чувствительность (десенситизируются) к стимуляции адреномедуллином (данные не показаны) Таким образом, повышенное давление у женщин при патологической беременности (диабете в данных Исследованиях) может являться результатом недостаточного контроля расширения сосудов адреномедуллином При этом регуляция AM рецепторов в сосудистой системе может привести к уменьшению кровеносного давления у пациентов и, таким образом, облегчить течение беременности при диабете

Аналогичный феномен наблюдался при повышении концентрации AM в культуре эндотелиальных клеток [Nikitenko et al, 2006] Кроме того, изменения в работе адреномедуллиновых рецепторов наблюдается в тех in vivo условиях, при которых концентрация AM повышена Так например, при хронической сердечной недостаточности - сердечно-сосудистом заболевании, при котором концентрация AM в крови значительно повышена, обычный длительный эффект пептида на артерии скелетных мышц значительно ослаблен, что происходит частично из-за недостаточной продукции оксида азота в сосудах предплечья [Kato el al, 1996, Nakamuia et al, 1997] Механизмы подобных эффектов до настоящего времени оставались неизученными Данные проведенных нами исследований указывают на то, что эти эффекты могут быть результатом повышенной концентрации AM, ведущей к интернализации CL рецептора в эндотелиальных клетках, поскольку т vivo в тканях человека рецептор преимущественно экспрессирован именно в этих клетках (см Рисунки 5 и 9), а также потому, что AM стимулирует продукцию оксида азота этими клетками [Zhang and Hintze, 2001]

Таким образом, несмотря на повышенный уровень AM при патологиях, чувствительность адреномедуллиновых рецепторов может быть понижена при определенных патологиях и поэтому существует необходимость коррекции их функции (или ресенситизации) с целью обеспечения нормальной работы сосудистой системы

Роль адреномедуллина и его рецепторной системы в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток.

Современными исследованиями была продемонстрирована роль AM в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток человека [Iwase et al, 2005, Yurugi-Kobayashi et al, 2006, Murakami et al, 2006] Авторы предположили, что AM влияет на стволовые клетки через гетеродимер CL/RAMP2, но какие-либо данные в поддержку данной гипотезы приведены не были Разработанные нами антитела против CL рецептора человека могут помочь в дальнейшем решить по крайней мере вопрос об экспрессии функциональной формы данного рецептора в стволовых клетках человека, а также выявить, действительно ли AM (или CGRP) взаимодействует с этим G-белок связывающим рецептором в данных клетках

Нашими исследованиями была показана экспрессия компонентов рецепторной системы AM {CALCRLICL и RAMPs), по крайней мере на транскрипционном уровне, в предшественниках эндотелиальных клеток человека (данные не показаны) и в бластоцисте на ранних стадиях эмбрионального развития человека (Рисунок 17) Данные результаты указывают на возможную роль CL рецептора в дифференцировке стволовых клеток эмбриона и костного мозга. Таким образом, использование разработанных нами реактивов поможет ускоренному изучению роли AM в эмбриогенезе и дифференцировке стволовых клеток человека

!. .1 . Ti L.M. -1

а» * tint

--- 8--- -

Рисунок 17. Экспрессии CA LCR L н RAMPs в стволовых клетках человека.

Окспрессня CALCRL и RAMPs в бластоинсте человека была исследована методом ОТ-ПЦР, CALCRL RAMPI и RAMP2. но не RAMPS ч.:>Н.Ч экслресснруются в бластошкгте человека на шестом дне развития. мРНК миометрия служила положительным контролем, поскольку все компоненты рецСЕНОрной системы зкспрессированы в данной ткани. вклгочая RAMPS, ^-аюин (БА) служил контролем.

Роль адрсномедуллича и его рецепторной системы в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и при патологических заболеваниях органов репродукции.

Несмотря на изначальные неудачи и негативный результаты клинических испытаний, значительный прогресс сделан в течение нескольких последних лет а использовании ингибиторов ангиогенеза в опухолях и неоплазмах/новообразованиях [Ferrara and Kerbel, 2005]. Несколько клинических исследований с использованием ингибиторов ключевого ангиогенного фактора - VEGF (фактор роста эндотелия) - А. не только подтвердили представление о том, что ангиогенез - важная мишень для лечения опухолевых процессов, но также выявили феномен противодействия некоторых видов опухолей антиангиогенной терапии [Hurwitz et al., 2004; Kerbel et al., 2002J. В настоящее время существуют свидетельства того, что ключевые ангиогенные факторы могут быть замещены другими факторами (в том числе и AM) [Nikitenko et al-, 2006] в процессе развитая и дальнейшего npoipecca болезни, или что другие известные или новые ангиогенные молекулы могут быть ответстбенны за компенсирующий («прорывной») ангиогенез в гипоксическом микроокружении раковых опухолей во время анти-ангиогенных стратегий [Ferrara and Kerbel, 2005]. Кроме того, эффективные тканеспецифическис ангиогенные факторы могут быть ответственны за такое противодействие анти-аш иогенной терапии [LeCouter et al., 2002].

Поэтому определенной трудностью в транслировании результатов и открытий в исследованиях механизмов ангиогенеза является определение различий в молекулярных механизмах ангиогенеза между индивидуальными видами опухолей/стадиями путем определения роли известных и новых факторов, включая ключевые и тканеспецифичные ангиогенные факторы. Данный подход позволит осуществлять выбор селективной анти-аштюгенной терапии из спектра тех, что уже используются в клинических исследованиях или в процессе разработки, а также определять вероятность эффективности для индивидуальных пациентов [Ferrara and Kerbel, 2005] при лечении того или иного типа опухоли,

В течение нескольких последних лет проявляется повышенный интерес к изучению алреномедуллина, который обусловлен в значительной мере ролью, которую данный пептид играет в ангиогенезе (Рисунок 18) [Nikitenko et al., 2006].

ос-—

лтт »слит Ц1Т »!< I»

в ......

Рост ■грлцма

Созрсыан* «кулоа ^

Реет сосудов

Фориироияиг шилиро! Ляпюпнп

По»1Ш11к)( вроАафгрйци ■ устоичнить К авовтозу

Развитие опухоли

Рисунок 18. Роль «дреном еду ллнна в прогрессии опухолей.

Предыдущими исследованиями была предложена роль гипоксии и цнтокинов & регуляции экспрессии и секреции адреномедуллинэ (АМ), который способствует развитию ксенографгов раковых клеток путем стимуляции автокрииного роста и повышенной выживаемости опухолевых клеток, а также путем паракринного механизма за счет воздействия на окружающие сосуды. Возможные внутриклеточные эффекты действия АМ на клетки микроокружения опухоли (гладкомышечные клетки стенки сосудов, эидогелиальные клетки и опухолевые клетки) предполагают роль данного пептида в начальном развитии опухоли, устойчивости к химиотерапии и прогрессии. АС - аденилатииклаза, ОС - гуанилатциклаза, РКА -протеинкиназа А+ РКв - протеинкиназа в, РЬС - фосфолнпаза С, МЕК - протеннкиназа активированная м итоге ном, ЕН.К - экстрацеллюляриая кнназа, регулирующаяся сигналом (также называемая МАРК -протеи н-киназа. активированная митогеном).

В случае АМ, как нового ангиогенного фактора (Рисунок 18), существует несколько насущных вопросов, приведенных ниже (Жкцепко е1 аЬ, 2006];

1). В каких раковых опухолях наблюдается повышенная экспрессия АМ?

2). Какие клетки экспрессируют адреномедуллиновые рецепторы в раковых тканях человека?

3). Существует ли корреляция экспрессии (X рецептора с клинико-патологическими показаниями в определенных раковых опухолях?

Исследование экспрессии адреномедуллина в раковых тканях человека.

На начальном этапе мы исследовали в каких раковых опухолях наблюдается повышенная экспрессия адреномедуллина путем использования ДНК чипов и клонированных нами плазмидных векторов для получения АМ зондов Из 13 изученных опухолей нами была выявлена повышенная экспрессия ЛА/мРНК в раковых тканях почек (Рисунок 19)

Northern б&от НО

кДНК скрининг

3

s

0

Я 4)

1

Ч l.CUb

Н О

Статистика

0087

Н»рнинше Оцпвш

в К я

1 г 3456739

- 10

#f» •« 3 5kb . * : ,

13

t • Ii - 12

Рисунок 19 Экспрессия адреномедуллина в нормальных и опухолевых тканях

Cancer Profiling Array (кДНК чип/блог) состоит из нормализованных парных кДНК образцов, полученных из общей РНК из 13 органов Каждая пара состоит из опухолевого (О) образца и нормальной (Н) ткани, полученных от одного и того же пациента. Парная кДНК представляет собой общее количество мРНК экспрессированной в данной ткани Блот был использован для получения данных о корреляции экспрессии гена адреномедуллина (АМ) с развитием опухоли кДНК AM и убиквитина были клонированы в вектор для получения зондов Зонды были помечены 32Р-дЦГФ Cancer Profiling Array и РНК Northern блот были последовательно прогибридизированы с каждым из зондов в соответствии с разработанными нами методами (Nikitenko et al, 2001) После гибридизации, промывки и экспозиции блотов, радиоактивный сигнал был зарегистрирован с использованием X-Ray пленки и измерен с помощью PhosphoScreen и ImageQuant Software После этого зонд был удален и проведена гибридизация с последующим зондом Соотношение АМ/Убиквитин было рассчитано для определения относительного уровня экспрессии мРНК Специфичность зондов была проверена с помощью Northern блоттинга Экспрессия АМ была повышена только в трех видах опухолей, при этом самая большая разница была обнаружена с опухолях почек (выделено штриховой линией) Статистический анализ был проведен с использованием теста Вилкоксона (Р=0 0067)

Поэтому наши дальнейшие исследования по изучению экспрессии CL рецептора были направлены на данный вид опухоли, а также на изучение лейомиомы, рака яичников и КС (см Рисунок 15), где предварительные результаты указывали на возможную роль АМ и его рецепторов в развитии данных неоплазм [Hague et al, 2000, Giacolone et al, 2003, Vart et al, 2007]

Нами была выдвинута гипотеза о том, что экспрессия АМ и CL рецептора могут являться факторами прогноза развития раковых опухолей [Nikitenko et al, 2006] Проведенные в течение последних двух лег исследования в нашей и других лабораториях показали, что существует корреляция между экспрессией лиганда, либо его рецептора, и развитием, либо прогрессированием, опухолевых образований в определенных органах человека [Ucar et al, 2006, Pavel et al, 2006, Michelsen et al, 2006]

Исследование экспрессии функционального CL рецептора и его локализации в раковых тканях человека.

Поскольку исследования, проведенные в нашей лаборатории, указывали на то, что экспрессия AM повышена в опухолевых тканях почек, яичников, лейомиомы и саркомы Калоши, мы изучили экспрессию адреномедуллиновых рецепторов в этих тканях Экспрессия AM регулируется воспалительными цитокинами и гипоксией Гипоксия является обычным показателем микроокружения опухолей и одной из основных причин роста и прогрессии раковых опухолей [Hams, 2002], и поэтому роль AM как промотора данных процессов путем индуцирования ангиогенеза была предложена для многих опухолевых заболеваний, включая лейомиому [Nikitenko et al, 2006] В то же время экспрессия адреномедуллиновых рецепторов в опухолевых тканях до настоящего времени оставалась неизученной [Nikitenko et al, 2006] Поэтому мы провели исследования по выявлению того, какие клетки экспрессируют адреномедуллиновые рецепторы в опухолевых тканях на примере почек, яичников, лейомиомы и КС

Экспрессия CL рецептора в раковых опухолях почек.

Рак почек (РП) составляет 2% раковых заболеваний [http //www cancerresearchuk oral Пятилетняя статистика выживаемости - 40 5% [Campaign, 2001], прежде всего из-за метастазов, которые происходят у 75% процентов пациентов [Dawson and Whitfield, 1996] Конвенционная химиотерапия либо иммунотерапия у данных пациентов приводит к ответу всего лишь у 10% данных пациентов [Cancer Principles and Practice of Oncology, 2001, Godley and Stinchcombe, 1999] Основной проблемой при РП является диагностика и предсказание течения заболевания Наиболее эффективным показателем является стадия развития Другие показатели, как например гистология и степень, являются менее значительными при определении и предсказании исхода

Экспрессия AM мРНК была предварительно изучена при РП, но данные являлись очень немногочисленными [Fujita et al, 2002, Takahashi et al, 2002] Исследования, проведенные Fujita и коллегами (2002), указывали на корреляцию экспрессии AM и васкуляризацией опухолевых тканей, однако незначительное количество тканей было использовано для проведения достаточной статистической обработки полученных данных В то же время данные о адреномедуллиновых рецепторах и корреляции их экспрессии с прогрессом развития опухолей оставался неизученным Прежде всего это было обусловлено отсутствием антител против адреномедуллинового рецептора (CL)

Разработанные нами специфические поликлональные антитела против CL рецептора человека (Рисунок 8) позволили провести подобного рода исследования Прежде всего нами было показано, что экспрессированный в опухолевых тканях рецептор терминально гликозилирован (Рисунок 10), и поэтому представляет собой функциональную форму рецептора (экспрессированного на поверхности клетки) Кроме того, нами были использован микрочип, содержащий значительное количество (180 пар) опухолевых и нормальных тканей почек (ТМА, tissue пмсгоаггау) для изучения экспрессии и локализации CL рецептора методом иммуногисгохимии (Рисунок 20) В опухолевых тканях рецептор экспрессирован как эндотелиальными, так и опухолевыми клетками (Рисунок 20) Экспрессия CL рецептора в опухолевых клетках значительно повышена по сравнению с нормальными эпителиальными клетками (Рисунке 20), и коррелирует с показателями выживания пациентов (Nikitenko et al, 2007, неопубликованные данные)

ТМА

* / * ' * ' - - ' «V. к ЩШ

Нормальная ткань Опухолевая ткань

Рисунок 20- Экспрессия CL рецептора в нормальных и опухолсвьи тканях пачек.

Подобно Cancer Profiling Array (см. Рисунок 19), Multiple tissue array (МТА) состоит из гистологических образцов парных опухолевой н нормальной тканей, «слученных от одного н того же пациента. Образцы (кол-во 180 пар; источник - архивы The Department of Cellular Pathology, John RadclifTc Hospital, Oxford, UK) били зафиксированы а формалине н гистология подтверждена патогистоло! ами, МТА было составлено с использованием цилиндрических образцов диаметром Полученные таким образом образны были

смонтированы на блоки, с которых были произведены гистолог ические срезы, содержащие одновременно от 60 до 100 образцов тканей. Срезы были использованы лля иммуио01стохимии е применением выращенных нами антител против CL рецептора. МТА был использован для получения даинмх о локализации рецептора в нормальных и опухолевых тканях и исследования уровня его экспрейти и. Рецептор локализован преимущественно в эндотелии клубочков в нормальной ткани (строчка), н его экспрессия повышена в опухолевых клетках. Иммуиореактивность CL рецептора была измерена полуколичестаенкым методом в опухолевых клетках (О), и проведено сравнение с нормальными 111 | зпителиальмымн клегкамн почек.

Экспрессия CL рецептора в тканях лейомиом.

ЛеЙомиомы (фиброиды) матки — опухолевые образования в миометрии. Данные неоплазмы встречаются у трети женщин и являются Значительной причиной возникновения кровотечений, болей, бесплодия и спонтанных абортов |TJake et al,, 2002], В настоящее время наиболее распространенным метолом лечения фиброидов является хирургическое вмешательство и данные Опухоли являются обычным показателем для гистерэктомии. Существует мнение о том, что патологический ангиогенез чвляется значительным фактором н процессе развития и прогрессивного роста лей ом и ом. Экспрессия известных ангиогенкых факторон, как например VEGF и bFGF, была зарегистрирована в лейомиомах и предложена их роль в ангиогенных процессах. Тем не менее, было показано, что среди всех изученных ангиогенных факторов, экспрессия только AM, но не других факторов, коррелирует с количеством сосудов микро циркулярного русла миомегрия и индексом пролиферации эндотелия при развитии лейомиом [Hague et al., 2002). Тем не менее, анализ экспрессии AM и его рецепторов в тканях лейомиом и миометрия матки одного и того же пациента не был проведен, 1(еобходимость данного рода исследований обусловлена потенциальной возможностью воздействия на сосудистую систему лейомиом без побочных эффектов на окружающий миомегриЙ. В связи с этим нами были проведены исследования экспрессии AM, CALCRL и RAMPs мРНК, а также локализации С1, рецептора в парных тканях дейомиомы и миометрия, полученных от одного и того же пациента (Рисунок 2!}.

Миометрий

Лейомиома

« Рисунок 21 Экспрессия CL рецептора в тканях нормального миометрия и лейомиомы.

(А) Экспрессия CL рецептора была исследована методом двойной иммунофлуоресценции с использованием поликлональных антител против рецептора и моноклональных антител против специфических маркеров разных типов клеток CD31 (эндотелиальные клетки), CD45 (лейкоциты) и SMA (гладкомышечные клетки) Вторичные антитела были мечены ФИТЦ либо ТК (техасским красным) соответственно Клетки, экспрессирующие одновременно рецептор и один из маркеров, были определены по наличию желтой окраски после наложения двух фотографий (Б) Экспрессия CALCRL и RAMPs мРНК в тканях лейомиомы (JI) и окружающих тканях миометрия (М) была определена с использованием метода Northern blotting. Убиквитиновый зонд был использован в качестве контроля Соотношение экспрессии CALCRL и RAMPs к экспрессии убиквитина отражает относительное содержание мРНК в соответствующих тканях (В) Срезы тканей содержащих как опухоль (лейомиома, Л) так и окружающую ткань миометрия (М) были окрашены иммунгистохимически с использованием антител притив CD34 - маркера эндотелиальных клеток и, соответственно, сосудов Подсчет количества сосудов был произведен с использованием метода «горячих точек» Chalkley counting [Fox and Hams, 2004, Hague et al, 2001, Nikitenko et al, 2006] Результаты анализа показывают корреляцию CL и RAMP2 мРНК и количества микроциркуляторных сосудов в тканях лейомиомы и окружающего миометрия (*рО 05, **р<0 01)

Нами была выявлена специфическая экспрессия CL рецептора в эндотелиальных тканях как лейомиомы, так и окружающего миометрия (Рисунок 21) Следует заметить, что данные результаты отличаются от распределения рецептора в опухолевых тканях почек (Рисунок 20) Экспрессированный в эндотелиальных клетках тканей лейомиомы CL рецептор (Рисунок 21) является терминально гликозилированным. (Рисунок 10), а поэтому - функционально активным (ассоциированным с экспрессией на поверхности клетки) Кроме того, экспрессия CL рецептора понижена в тканях лейомиомы, что связано прежде всего с уменьшением количества сосудов микроциркуляторного русла в данной опухоли (Рисунок 21) Принимая во внимание то, что AM играет роль в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла миометрия [Nilatenko et al, 2006], нами было выдвинуто предположение о том, что для эффективной терапии с применением ингибиторов AM и его рецепторов для лечения лейомиом необходимо дальнейшее изучение различий адреномедуллиновых рецепторов, экспрессированных в эндотелии нормального миометрия и тканей лейомиом для выявления потенциальных различий и эффективной терапии, избегающей побочных эффектов [Nikitenko et al, 2006]

Экспрессия CL рецептора в клетках саркомы Капоши.

В связи с тем, что нами была обнаружена повышенная экспрессия CALCRL в КС -опухоли, связанной с трансформацией эндотелиальных клеток при инфекции онкогенным вирусом KSHV (Рисунки 15 и 16) нами также была изучена локализация CL рецептора в тканях КС с использованием метода иммуногистохимии Результаты проведенных исследований показали, что веретенообразные клетки опухоли экспрессируют CL рецептор (Рисунок 15) Дополнительно проведенные нами исследования т vitro с использованием ЭКМР человека указывают на то, что вирус увеличивает экспрессию рецептора в инфецированном эндотелии [Fhss et al, 2006] Учитывая то, что AM является ангиогенным фактором, нами была выдвинута гипотеза о возможной роли AM в аберрантном ангиогенезе при развитии КС [Fliss et al, 2006]

Таким образом, в результате проведенных нами исследований, была впервые продемонстрирована экспрессия функциональной формы CL рецептора в опухолевых тканях почек, лейомиомы и КС, а также локализация данного G-белок связывающего рецептора. Нами впервые показано, что в зависимости от вида опухоли, рецептор экспрессирован либо только эндотелиальными клетками (лейомиома, саркома Капоши), либо еще и в опухолевых клетках (опухоли почек и яичников) Вполне возможно, что уровень экспрессии рецептора опухолевыми клетками отражает стадию прогресса опухоли, либо обеспечивает защиту клетки от воздействия радио-и химиотерапии

Результаты проведенных нами исследований указывают на то, что дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение потенциальных различий в свойствах данного рецептора в нормальных и раковых тканях с целью разработки методов специфичной регуляции (ингибирования или стимуляции) их функции, в зависимости от роли, которую они играют в той или иной опухолевой или нормальной ткани, а также для предотвращения побочных эффектов [Nikitenko et al, 2006] Данного рода исследования должны включать изучение фармакологии и фенотипа рецепторов, которые CL образует в клетках, в которых он экспрессирован т vivo в норме и при патологии (например, раковых опухолях) Более подробно данные идеи описаны в нашем недавнем обзоре [Nikitenko et al, 2006]

Использование разработанных реактивов и методов в диагностике неоплазм и раковых опухолей.

Для обеспечения лечения раковых опухолей необходимы современные диагностические методы К сожалению, в настоящее время методы диагностики, например, рака почек отсутствуют Полученные в наших исследованиях данные о возможной роли АМ в биологии рака почек (Рисунок 20), а также разработанные методы исследования экспрессии CL рецептора, позволяют диагностировать данный вид рака и прогнозировать исход данного заболевания у индивидуальных пациентов, поскольку нами было обнаружена корреляция экспрессии CL рецептора и прогнозом развития болезни у пациентов с раком почек [Nikitenko et al, 2007, неопубликованные данные] Кроме того, на основе метода ЗС разработаны методы диагностики раковых и других заболеваний [Akoulitchev et al, 2006, Ramadass et al, 2007]

Перспективы модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы (разработка ингибиторов и активаторов с использованием современных методов и технологий).

Результаты наших исследований механизмов, регулирующих экспрессию и функцию G-белок связывающего рецептора CL в клетках и тканях человека указывают на наличие и роль многоступенчатого регуляционного процесса Таким образом, регуляция функции CL рецептора может быть осуществлена на нескольких уровнях (Рисунок 22), и поэтому использование нескольких современных технологий может быть применено с данной целью (Таблица 4)

АМ CGRP

у"

Специфичность распознавания лигандами

Активность промотера CALCRL гена

t

CALCRL гена

(определяющим фактор экспресин)

• RAMPs

I

гетеродимер

Стабильность РНК

t

Субхромосомная

\

Терминальное

Трансляция

\

Основное

л

Длительность действия и концентрация лиганда

(факторы, определяющие функциональность рецептора)

RAMPs

RAMPs

(факторы, опрелс хяюищс экспрессию на повер\ности к.\етки и специфичность)

Рисунок 22. Многоступенчатая регуляция специфической экспрессии и функциональных свойств СЬ рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека

Нами был разработан особенный реактив для специфического ингибнрования ДМ рецептора. Мы использовали метод генетической инженерии для получения моноклональных антител, распознающих С1ЖАМР гетеродимер, экс пресен ро ванный на поверхности клетки (Рисунок 23). Характеристика антител указывает на то, что они распознают СЬЯАМР2 гетеродимер (АМ] рецептор) (данные не показаны).

Использование данных антител в функциональных исследованиях показало, что они обладают способностью ингибировать действие АМ и, соответственно, оказывать влияние на физиологию эндотелиальныч клеток человека (Рисунок 23), Проведение дальнейших исследований укажет на возможность использования данных и других антител (Таблица 4) для ингибирования ангиогенеза в раковых опухолях и регуляции АМ сигналов при патологиях, связанных с повышенной активностью данного пептида или его рецепторов.

А р

\ \ \ -

и >Ы1.ци« %

- • контрой, л^-.; V |ЕМя

Рисунок 23. Разработка моиок,юна.1ьны1 антител против гетеродимера СЬ/ЯАМР человека.

Моноклональные антитела против гетеродимера СЬНАМР были вырашены против нативного эпитопа с использованием метода генетической иммунизации. Позитивный моноклон 1ХМЬ-С1опе6 был использован для: (А) сравнительного анализа с использованием поликлопальных антител LN-I436 выращенных нами против внутриклеточного карбокси-окончания рецептора (см.Рис, 8), а также (Б) для блокирования действия лигандов, (А) Моноклопальные антитела распознают только рецептор, экспрессированный на поверхности клетки {зеленые стрелки), в то время как полнкл□ нап ьныс антитела распознают как рецептор на плазматической мембране (белые стрелки), так и внутриклеточно вокруг ядра (а именно в зндоплазматическом ретикулуме, Мкиепко е! а1., 2007, неогтуб ли кованные данные) (короткие белые стрелки). (Б) Применение моноклональных антител против гетеродимера СЬКАМР т \irro приводят к разрушению монослоя эн дот ел и ал ь н ых клеток (ЭК), Монослой зндотелиальных клеток в культуре окрашен с использованием флуоресцентного красителя са1се1П-АМ. Стрелки указывают на отсутствие клеток^ и их количество отображает интенсивность разрушения эндотелиального монослоя при низком содержании сыворотки в среде (Контроль) и при добавлении антител против нативного СШ1АМР комплекса.

Таблица 4

Специфические и неспецифические модуляторы эффектов индуцированных адреномедуллином

Мишень

Реактив /вещество

Механизм действия Биологическая активность

Побочные эффекты или недостатки

Анти-ангиогенный потенциал

Аиганд (адреномедуллин)

Рецептор

Рибозим против AM мРНК

АМВР-1 (связывающий белок)

Блокирующие антитела против АМ

Позитивные непептидные регуляторы Негативные непептидные регуляторы

Фрагменты пептидоа

АМ22-52 (антагонист рецептора) ССИРв-З? (антагонист рецептора)

Блокирующие антитела против СЬ Блокирующие антитела против ЯАМРз

Антитела против нативного рецептора (гетеродимера СЬ/ЯАЪЛР)

Деградация AM мРНК

Аффиность к рецептору не изменена Защита пептида от деградации протеазами

Ингибирование активности AM

сАМ Связывание с AM

Конкуренция с лигандом за связывание с рецептором

Предполагаемое прямое взаимодествие с рецептором

Прямое взаимодесгвие с рецептором экспрессированным на поверхности клетки

Отсутствие направленной доставки

Тест не проведен

Тест не проведен

Вазоконстрикция

Короткая half-life Короткая half-life

Тест не проведен Тест не проведен

Тест не проведен

Тест не проведен

Тест не проведен

Уменьшенное количество сосудов в ксенографтных опухолях Тест не проведен Тест не проведен

Предотвращает неоваскуляриэадию Тест не проведен

Ингибирует миграцию и формирование капиллярной сети НЦУЕС

Ингибирует фующию эндотелиальных клеток Разрушает монослой эндотелия

Сигнальные каскады (вторичные мессенджеры)

wortmannin (ингибитор PI3K) PD98059 (ингибитор МАРК)

Ингибирование фосфорилирования вызванного лигандом

Неспецифическое Неспецифическое

Предотвращает ангиогенез т vitro 11 т vw

Неизвестные

Бинбластин

Неизвестно

Не специфическое

Предотвращает индуцированное AM формирование капилляров

выводы

1 Путем использования лекгина Ulex Europeus Agglutinin 1 (UEA1), связанного с магнитными шариками, разработаны методы выделения чистых популяций эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла эндометрия и миометрия матки человека, как органов, в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза, а также методы культивирования первичных культур данных клеток, позволяющие изучать роль ангиогенных и других факторов в их биологии

2 Доказана роль нового ангиогенного фактора адреномедуллина в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека путем демонстрации его влияния на пролиферацию и миграцию этих клеток, а также ингибирование апоптоза и регуляцию проницаемости эндотелиального монослоя

3 Клонированы и охарактеризованы промотор и новые гетерогенные транскрипты CALCUL гена человека, а также разработан метод определения трехмерной субхромосомной структуры генов Показано, что экспрессия CALCUL гена зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона При этом ключевым фактором экспрессии CALCRL гена является его трехмерная структура, а активность промотора играет вторичную роль Продемонстрированы влияние гипоксии на активность промотора CALCRL гена человека и роль онкогенного вируса саркомы Калоши на экспрессию CL рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека

4 В экспериментах с использованием первичных клеточных культур и тканей человека и разработанных плазмидных векторов, позволяющих производить зонды для гибридизации in situ и Northern блоттинга, показана специфическая экспрессия CALCRL гена человека, а также CL рецептора, в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла m vitro и in vivo

5 Впервые определены функциональные свойства G-белок связывающего рецептора CL экспрессированного в тканях и эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека Продемонстрировано, что именно CL рецептор непосредственно взаимодействует с адреномедуллином и осуществляет роль рецептора для данного пептида в эндотелии человека, обеспечивая работу известных до настоящего момента сигнальных каскадов, ассоциированных со стимуляцией эндотелия адреномедуллином В экспериментах по изучению интернализации рецептора с использованием антагонистов AM и CGRP рецепторов показано, что CL рецептор также играет роль CGRP рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека

6 Продемонстрировано, что избыточная экспрессия одного или другого лиганда (AM либо CGRP) приводит к потере функции (десенситизации) эндотелиального CL рецептора к обоим лигандам, и поэтому может играть роль при развитии сердечно-сосудистых заболеваний различной этиологии При этом десенситизация рецептора обусловлена его интернализацией только в случае взаимодействия с AM

7 Разработаны поликлональные антитела против человеческого CL рецептора и продемонстрирована их способность распознавать дегликозилированный, основно-гликозилированный и терминально-гликозилированные формы рецептора, а также возможность их использования для определения локализации рецептора в клетках человека m vitro и m vivo

8 Впервые продемонстрирована экспрессия CL рецептора в тканях человека в норме и при патологии (на примере опухолевых тканей почек, яичников, лейомиомы и саркомы Калоши) Показано, что в раковых опухолях рецептор может быть эКспрессирован либо только в эндотелиальных клетках (лейомиома и саркома Калоши), либо в эндотелиальных клетках и в раковых клетках (опухолевые заболевания почек и яичников) Впервые выявлена необходимость исследования фармакологии адреномедуллиновых рецепторов как в эндотелиальных клетках опухолей, так и в самих опухолевых клетках, а также необходимость выявления различий свойств рецептора, экспрессированного в нормальном и опухолевом эндотелии

9 Показано, что существует корреляция между экспрессией лиганда, либо его рецептора, и развитием/прогрессированием опухолевых заболеваний человека. Выявлено, что в

опухолевых тканях экспрессия рецептора в раковых клетках может быть ассоциирована с появлением раковых клеток в сосудах микроциркуляторного русла.

10 Продемонстрировано, что онкогенные вирусы (например, вирус саркомы Капоши) обладают способностью регулировать экспрессию (X рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека Сконструированная лентивирусная «библиотека» позволила выявить роль индивидуального вирусного гена К2 (кодирующего у1Ь6) в регуляции экспрессии СЬ рецептора. Полученные данные впервые указывают на необходимость дальнейшего изучения роли адреномедуллиновых рецепторов в трансформированном вирусом эндотелии, а также выявления различий свойств СЬ рецептора, экспрессированного в нормальном и трансформированном эндотелии человека

11 Получены моноклональные антитела против гетеродимера СЬЛЙАМР, экспрессированного на поверхности клетки, и показана возможность их использования для регуляции свойств эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека, что указывает на возможность их применения в качестве эффективного метода коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, как например патологический ангиогенез и гиперпроницаемость эндотелия

12 Экспрессия адреномедуллиновых рецепторов на ранних стадиях эмбриогенеза и дифференцировки стволовых клеток во взрослом организме указывает на их возможную роль в процессе дифференцировки клеток человека

13 Впервые выявлены и обобщены роль многоступенчатой регуляции специфической экспрессии и функциональных свойств СЬ рецептора в биологии эндотелиальных клеток в норме и при патологии

Список научных работ опубликованных по теме диссертации

1. Oehler МК, Nikitenko LL, Hague S, Bicknell R, Rees MCP Expression of the angiogenic growth factor adrenomedullm m endometrial carcinoma cell lines and endometrial adenocarcionoma Xth Hamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany -1999 - P 112

2. Oehler MK, Nikitenko LL, Hague S, Bicknell R, Rees MCP Prognostic relevance of serum vascular endothelial growth factor m ovarian cancer // Xth Hamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany -1999 -P 128

3. Nikitenko LL, MacKenzie IZ, Rees MCP, Bicknell R Adrenomedullm is an autocrine regulator of endothelial growth m human endometrium // Molecular Human Reproduction - 2000 - Vol 6 (9) -P 811-819

4. Nikitenko LL, Lloyd BH, Rudland PhS, and Barraclough R. Localisation by m situ hybndisation of S100A4 (p9Ka) mRNA m primary human breast tumour specimens // International Journal of Cancer -2000 - Vol 86 -P 219-228

5. Nikitenko LL, MacKenzie IZ, Bicknell R, Rees MCP Adrenomedullin/CGRP receptors m the human uterus // Xlth International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, York, Umted Kingdom -2000 -P 234

6. Nikitenko LL, MacKenzie IZ, Rees MCP, Bicknell R. Isolation, culture and growth factor responsiveness of human endometrial endothelium // Annual ICRF Colloquium, Warwick, United Kingdom- 2000 -P 54

7. Nikitenko LL, MacKenzie I, Rees MCP, Bicknell R. Adrenomedullm is an autocrine regulator of endothelial growth m human endometrium // Introduction to Molecular and Cellular Research, San-Diego, USA -2000 -P 97

8. Nikitenko LL, Brown NS, Smith DM, MacKenzie I, Bicknell R, Rees MCP Differential and cell-specific expression of calcitomn-receptor-like receptor and receptor activity modifying proteins m the human uterus //Molecular Human Reproduction -2001 - Vol 7(7) -P 655-664

9. Nikitenko LL, Smith DM, Hague S, Wilson CR, Bicknell R, Rees MCP Adrenomedullm and the Microvasculature //Trends in Pharmacological Sciences - Vol 23(3) -P 101-103

10. Rees MCP, Nikitenko LL, Hague S, Bicknell R. Endometrial angiogenesis In Maruo T, Barlow

D, Mardon H, Kennedy S (eds) Cell and Molecular Biology of Endometrium in Health and Disease Soeshi Publishing -2002 -P 145-155

11. Wilson CR, Nikitenko LL, Smith DM, Sargent EL, Rees MCP Expression of adrenomedullin and its receptors in placenta and decidua // 8th IFPA Meeting, Melbourne, Australia - 2002 - P -121

12. Nikitenko LL, Patel S, Chssold P, Rees MCP, Bicknell R Molecular characterization of the adaptive response of endothelial cells to hypoxia // Angiogenesis basic mechanisms and therapeutic implications, Ascona, Switzerland - 2002 - P - 27

13. Nikitenko LL, Rees MCP, Bicknell R Adrenomedullin signalling system and microvascular endothelial cell response to hypoxia. 5th Imperial College School of Medicine Symposium "Vascular endothelium Role in disease pathogenesis and as a therapeutic target" // London, United Kingdom -2002 -P 18

14. Nikitenko LL, Smith DM, Bicknell R, Rees MCP Transcriptional regulation of human CRLR m microvascular endothelial cells // 676th Biochemical Society Meeting, Henot-Watt University, Edinburgh, United Kingdom -2002 -P 81

15. Nikitenko LL, Smith DM, Bicknell R, Rees MCP Transcriptional regulation of the CRLR gene in human microvascular endothelial cells by hypoxia // The FASEB Journal - Vol 17(11) - P 1499-501 Full-length article is available at http //www fasebi org/cgi/repnnt/02-0993fievl pdf

16. Nikitenko LL Molecular mechanisms of the adaptive response of endothelial cells to hypoxia // 6th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Москва и Санкт Петербург, Российская Федерация - 2003 - Р 17

17. Nikitenko LL, Smith DM, Bicknell R, Rees MCP Mechanisms of transcriptional regulation of GPCR CRLR in the microvasculature // Special FEBS 2003 Meeting on Signal Transduction, Brussels, Belgium EJB The FEBS Journal 2003 - Vol 270(1) -P 49

18. Patel S, Nikitenko LL, Terret J, Bicknell R Identification of hypoxia inducible messengers expressed in human dermal microvascular endothelial cells // The 40th American Association for Cancer Research Annual Meeting, New Orleans, USA - 2003 - P 270

19. Wilson CR, Nikitenko LL, Sargent IL, Rees MCP Adrenomedullin multiple functions in human pregnancy //Angiogenesis -2004 - Vol 7(3) -P 203-12

20. Nikitenko LL Heterogeneity of novel CRLR transcripts m human microvascular endothelial cells Jomt International Symposium on CGRP, Amylin and Calcitonin 4th Symposium on Adrenomedulhn and ProadrenomedulhnN-20 Peptide, Zurich, Switzerland -2004 -P 21

21. Pathak H, Staff AC, Harsem NK, Braekke K, Sargent I, Rees MCP, and Nikitenko LL Adrenomedullin expression m the decidua in normal and pre-eclamptic pregnancy XXXIV Congress of Nordic Federation of Obstetrics of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki, Finland -2004 - P 58

22. Carroll VA, Nikitenko LL, Bicknell R, Hams AL Antiangiogemc activity of a domain deletion mutant of tissue plasminogen activator containing kringle 2 // Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology -2004 - Vol 25(4) -P 736-41

23. Nikitenko LL Embiyomc development Tutorials for biomedical students // Collection MCQ Keble College, Oxford, United Kingdom -2005 - 24P

24. Wilson J, Pathak H, Staff AC, Harsem NK, Braekke K, Rees MCP, Sargent IL, Nikitenko LL Expression of adrenomedulhn and its receptor m third trimester placental bed decidua from normal and pre-eclamptic pregnancies // XI European Placenta Group Meeting, Glasgow, United Kingdom -2005 -P -72

25. Nikitenko LL, Blücher N, Fox S, Smith DM, Bicknell R, Rees MCP Adrenomedullin and CGRP interact with endogenous calcionin-receptor-hke receptor m endothelial cells and mduce its desensitisation via different mechanisms //Journal of Cell Science -2006 -Vol 119(5) -P 910922

26. Nikitenko LL, Cross T, Campo L, Leek R, Helen T, Manek S, Bicknell R, Rees MCP Expression of terminally glycosylated calcitonin receptor-like receptor m uterine leiomyoma endothelial phenotype and association with microvascular density // Clinical Cancer Research/ -2006 - Vol 12(19) -P 5648-58

27. Nikitenko LL, Fox S, Kehoe S, Rees MCP, Bicknell R Adrenomedullin and tumour

angiogenesis I I British Journal of Cancer -2006 - Vol 94 -P 1-7

28. Nikitenko LL, Boshoff С Endothelial Cells and Cancer // In Moncada S, Higgs A (eds) Handbook of Experimental Pharmacology, The Vascular Endothelium Springer-Verlag, Berlin Heidelberg -2006 - Vol 176 -P 637-664

29. Nikitenko LL, Morrison J, Roseman F, Rees MCP, Kehoe S Expression of adrenomedulhn and terminally glycosylated calcitonin receptor-like receptor in ovarian cancer // 11th Biennial International Gynecologic Cancer Society Meetmg, Santa Monica, CA, USA - Int J Gynecol Cancer-2006 Vol 16(Suppl3) -P 690

30. Nikitenko LL, Blücher N, Fox SB, Bicknell R, Smith DM, Rees M Adrenomedulhn and CGRP interact with endogenous calcitonin receptor-like receptor in microvascular endothelial cells and mduce its desensitization via two different mechanisms// The 24th European Conference on Microcirculation From Vascular Biology to Clinical Microcirculation, Amsterdam, Netherlands -2006 - P43

31. Nikitenko LL, Blücher N, Fox SB, Bicknell R, Smith DM, Rees M Desensitisation of endogenous calcitonin receptor-like receptor m human microvascular endothelial cells The 21st Scientific Meetmg of the International Society of Hypertension (ISH2006), Fukuoka, Japan - 2006 -P 153

32. Fliss P, Vart R, Trotter M, Boshoff C, Nikitenko LL Calcitonin receptor-like receptor is upregulated m Kaposi's sarcoma The 9th International Workshop on Kaposi's Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, Hyannis, USA - 2006 - P 64

33. Nikitenko LL, Blücher N, Fox SB, Bicknell R, Smith DM, Rees M Adrenomedulhn and CGRP mteract with endogenous calcitonin receptor-like receptor m microvascular endothelial cells and induce its desensitization via two different mechanisms // Abstracts of The Physiological Society

2006 Main Meetmg, University College London, London, Umted Kingdom - 2006 - P 80

34. Vart R, Nikitenko LL, Lagos D, Trotter M, Boshoff С Viral CPCR and FLIP upregulate angiopoietin-2 expression m lymphatic endothelium via МАРК pathway The 9th International Workshop on Kaposi's Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, Cape Cod, USA -2006 -P 53

35. Vart R, Nikitenko LL, Lagos D, Trotter M, Gratnx F, Bourboulia D, Takeuchi Y, Boshoff С Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus encoded vIL6 and vGPCR regulate angiopoietin-2 expression in lymphatic endothelial cells Cancer Research -2007 - Vol 67(9) -P 4042-51

36. Nikitenko IX, Shimosawa T, Vart R, Henderson S, Gratnx F, Rees MCP, Fujita T, and Boshoff С Adrenomedulhn deficiency causes impaired lymphatic regeneration and hyperpermeability -

2007 - В печати

37. Ramadass AS, Nikitenko LL, Martianov I, Chow N, Rees MCP, Akouhtchev A Regulatory switch between distinct chromosomal conformations of active transcriptional units - 2007 - В печати

Монография

Никитенко JIJI, Колесников С И Роль адреномедуллина в биологии эндотелиальной клетки человека //-М - ОАО «Издательство Геотар-Медиа» - 2007 -147 С

Патенты оформленные по материалам диссертации

Nikitenko LL, Smith DM, Bicknell R, Rees MCP Transcriptional Regulation of Therapeutically Useful Gene // International Patent GOIN 33/50 - 2003

Akouhtchev A, Ramadass A, Nikitenko LL Chromosomal conformation footprints in diagnostics of aberrant gene expression // UK Patent No 0603251 0 - 2006

Подписано в печать 20 07 2007 Тираж 100 экз Заказ 999

Издательство "Laboratory Press" Wolfson Institute for Biomedical Research The Cruciform Building, Gower Street London, WC1E 6BT United Kingdom

В настоящее время большое внимание уделяется исследованию процессов развития и функционирования кровеносной и лимфатической сосудистых систем в норме и при патологии. Эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла (ЭКМР) играют ключевую роль в развитии и функционировании кровеносных и лимфатических сосудов. Избыточная пролиферация и трансформация, либо нарушение функции ЭКМР приводит к патологическому ангиогенезу/ лимфангиогенезу или дисфункции сосудистой системы - являющимся показателями злокачественных опухолей и многих других заболеваний [Адамян, 1998; Давыдов, 2002; Carmeliet, 2003 и 2005].

Существенный прогресс был достигнут за несколько последних лет в исследовании молекулярных механизмов развития и функционирования сосудистой системы, и в выявлении ключевых ангиогенных и лимфангиогенных факторов, а также в использовании данных знаний для ингибирования ангиогенеза и лимфангиогенеза при опухолевых процессах и неоплазмах/новообразованиях различной этиологии, а также для терапии сердечно-сосудистых заболеваний у экспериментальных животных [Alitalo et al., 2005; Ferrara and Kerbel, 2005].

Одной из современных задач в "транслировании" (применении в практике для терапии человека) данных открытий в области исследования механизмов ангиогенеза и лимфангиогенеза на животных является проверка роли известных и новых факторов в биологии эндотелиальных клеток человека и выявление механизмов, регулирующих экспрессию и функцию их рецепторов, а также определение их потенциальной роли в патогенезе опухолевых и сердечно-сосудистых заболеваний.

В связи с этим разработка методов получения и культивирования эндотелиальных клеток кровеносного и лимфатического микроциркуляторного русла человека, а также исследование роли новых ангиогенных и лимфангиогенных факторов в биологии данного типа клеток, представляет собой актуальную задачу в области биомедицины.

Несмотря на то, что проведенные на животных эксперименты указывали на роль нового ангиогенного фактора адреномедуллина (AM) при развитии сосудистой системы в эмбриогенезе и при опухолевых процессах, существовал ощутимый недостаток подобного рода исследований с использованием клеток человека. Кроме того, информация о распределении и функционировании эндогенных адреномедуллиновых рецепторов, экспрессированных в клетках и тканях человека, также оставалась неизученной до настоящего времени. В связи с этим неизвестными оставались как роль AM и его рецепторов в тканях человека, так и возможности их использования для лечения раковых и других заболеваний. Данная проблема существует и для других ангиогенных факторов. Так, несмотря на несомненную роль одной из ключевых ангиогенных молекул - фактора роста эндотелия (vascular endothelial growth factor, VEGF) в развитии раковых опухолей в экспериментальных исследованиях на животных, применение ингибиторов данного ангиогенного фактора не всегда приводит к положительным результатам [Ferrara and Kerbel, 2005].

Трудности в данной области обусловлены отсутствием системного подхода в анализе экспрессии и функции факторов ангиогенеза и их рецепторов in vitro и in vivo в клетках и тканях человека. Под системным подходом подразумевается проведение исследований не только роли данных факторов на эндотелиальные клетки человека, но и исследование транскрипции и трансляции генов, кодирующих данные рецепторы в органах и клетках; изучение механизмов, регулирующих экспрессию рецептора на поверхности клетки; специфичности его взаимодействия с потенциальными лигандами (фармакология рецептора), а также механизмов десенситизации и ресенситизации.

Данный подход позволяет рассматривать не только механизм действия определенного ангиогенного фактора на молекулярном и клеточном уровнях, но и потенциал использования данных знаний в теоретической биологии, а также при разработке методов диагностики, интервенции и терапий для прогнозирования эффективности применения ингибиторов и активаторов данных механизмов, выявления типов раковых опухолей (а также индивидуальных пациентов), в которых действие данных реактивов может быть наиболее результативным, и потенциального использования в клинике для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых, раковых, инфекционных и других заболеваний, связанных с патологическим (лимф)ангиогенезом или дисфункцей сосудистой системы.

Исходя из этого, целью данного исследования являлось оценка роли пептида адреномедуллина (AM) в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека и механизмов, регулирующих экспрессию и функцию его рецепторов в норме и при некоторых патологиях на основе комплексного морфо-функционального и молекулярно-генетического исследования (Рисунок 1).

Механизмы, регулирующие функцию рецептора

Механизмы, регулирующие транскрипцию

-Экспрессия на поверхности клетки - Фармакология рецептора специфичность вааимодеиспня с двпндип) -Десенситизация и ресенситизация

Трансляционные подходы

-Изучение экспрессии лиганда и рецептора в клетках и тканях человека

- в норме

- при патологиях

Разработка ингибиторов и методов диагностики заболеваний

Комплексный систематический подход

Рисунок 1. Изучение роли адреномедуллина и его рецепторной системы с помощью комплексно-систематического подхода.

Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Разработать методы получения и культивирования эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла (ЭКМР) из тех тканей человека, в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза, а именно эндометрия и миометрия;

2. Исследовать роль AM в первичных культурах ЭКМР человека;

3. Исследовать экспрессию адреномедуллинового рецептора - рецептора, подобного кальцитониновому рецептору (calcitonin receptor-like receptor, CL, кодируемого CALCRL геном) в клетках и тканях человека;

4. Исследовать механизмы, регулирующие экспрессию CALCRL гена человека в ЭКМР в норме и при патологии, путем клонирования и описания промотора, определения субхромосомной организации данного гена и влияния онкогенных вирусов (на примере вируса саркомы Капоши) на его транскрипцию;

5. Произвести и охарактеризовать антитела против CL рецептора;

6. Исследовать специфичность к различным лигандам, а также механизмы сенситизации и десенситизации, CL рецептора в эндотелии человека;

7. Исследовать роль адреномедуллина и его рецепторов в ангиогенезе при развитии раковых опухолей и патологических заболеваний органов репродукции, путем изучения экспрессии пептида и локализации функциональной формы CL рецептора в тканях человека в норме и при патологии (в опухолях почек и яичников и тканях саркомы Капоши);

8. Исследовать возможность использования разработанных реактивов и методов для диагностики неоплазм, раковых опухолей и других заболеваний;

9. Исследовать возможность модулирования функционирования адреномедуллиновых рецепторов с целью коррекции их функции при патологиях развития и функции сосудистой системы.

Научная новизна работы

Впервые на основе модифицированных методов получены эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла (ЭКМР) человека из тех тканей, в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза, а именно эндометрия и миометрия.

Впервые продемонстрирована роль пептида AM в биологии ЭКМР и ангиогенезе в тканях человека.

Впервые описаны механизмы, регулирующие экспрессию CALCRL гена человека и функцию CL рецептора в ЭКМР человека. Впервые продемонстрирована роль CL как рецептора для AM и CGRP (пептида, относящегося к гену кальцитонина) в ЭКМР человека, а также выявлены механизмы его десенситизации.

Впервые разработан метод определения трехмерной субхромосомной структуры генов. Сконструированы плазмидные векторы, позволяющие эффективно оценивать экспрессию CALCRL гена человека, активность его промотора и осуществлять экспрессию CL рецептора в клетках млекопитающих. Клонированы новые, ранее неохарактеризованные транскрипты CALCRL гена человека и создана лентивирусная «библиотека», включающая 27 генов, кодирующих различные вирусные белки вируса саркомы Капоши.

Впервые получены уникальные реактивы - поликлональные антитела против человеческого CL рецептора и блокирующие моноклональные антитела против гетеродимера CL/RAMP, экспрессированого на поверхности клетки. Показана специфичность данных антител и возможность их применения для оценки функционального статуса CL рецептора либо регуляции его функции в клетках человека.

Впервые продемонстрирована экспрессия CL рецептора в клетках и тканях человека в норме и при патологиях (на примере опухолевых тканей почек, яичников, лейомиомы и саркомы Капоши).

Разработан и применен комплексный систематический подход к изучению ангиогенного фактора адреномедуллина и его рецепторной системы.

Впервые выявлены и обобщены роль многоступенчатой регуляции специфической экспрессии и свойств CL рецептора в полноценном функционировании эндотелиальной клетки человека в норме и при патологии.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанные реактивы и методы могут быть использованы для дальнейших исследований биологии эндотелиальных и стволовых клеток человека, экспрессии и функции CL рецептора в нормальных и опухолевых клетках и тканях человека, а также для диагностики раковых, сердечнососудистых и других заболеваний.

Полученные плазмидные векторы могут быть использованы в области биотехнологии, а полученные поликлональные антитела против CL рецептора человека - как для научно-исследовательских работ, так и для применения в области диагностики и практической медицины.

Разработанные моноклональные антитела против гетеродимеров CL/RAMP могут являться эффективным методом коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, как например патологический ангиогенез и гиперпроницаемость эндотелия.

Изученная роль AM в биологии ЭКМР человека и полученные данные о механизмах, регулирующих экспрессию и функцию адреномедуллиновых рецепторов, представляют собой значительный интерес при поиске эффективных методов противоопухолевой терапии и сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ангиогенезом и дисфункцией эндотелия в тканях человека.

Результаты проведенных исследований расширяют понимание комплексной регуляции адреномедуллиновых рецепторов и позволяют оценить возможность применения ингибиторов/активаторов действия AM для трансляционных исследований и терапии заболеваний, связанных с избыточной или недостаточной экспрессией самого пептида, либо его рецепторов, а также проводить предварительные исследования по воздействию различных веществ на экспрессию, транспорт и функцию CL рецептора в эндотелиальных клетках, как источнике его локализации in vivo в тканях человека.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости продолжения исследования фармакологии адреномедуллиновых рецепторов как в эндотелиальных клетках опухолей, так и в самих опухолевых клетках, а также выявления различий рецептора, экспрессированного в нормальном и опухолевом эндотелии.

На основе применения полученных поликлональных антител против CL рецептора человека и использования векторных плазмид, содержащих промотор CALCRL гена человека, а также разработанной технологии определения трехмерной субхромосомной структуры генов, предложены методы использования данных реактивов для диагностики раковых и других заболеваний, а также оформлено и получено два патента на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Адреномедуллин является ангиогенным фактором в тканях человека за счет своей способности активировать пролиферацию и миграцию, а также ингибировать апоптоз эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла.

2. G-белок связанный рецептор CL непосредственно взаимодействует с адреномедуллином и осуществляет роль рецептора для данного пептида в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

3. Разработан и применен комплексный систематический подход к изучению ангиогенного фактора адреномедуллина и его рецепторной системы, в результате чего впервые выявлены и обобщены роль многоступенчатой регуляции специфической экспрессии и свойств CL рецептора в полноценном функционировании эндотелиальной клетки человека в норме и при патологии.

4. Разработанные реактивы и методы могут применяться для диагностики и коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, например патологического ангиогенеза и гиперпроницаемости эндотелия.

Апробация работы

Результаты исследований по теме диссертации доложены на конференциях: Xth Hamburg Symposium on Tumor Markers, Hamburg, Germany, 1999; Xlth International Congress of Histochemistry and Cytochemistry, York, United Kingdom, 2000; Annual ICRF Colloquium, Warwick, United Kingdom, 2000; Introduction to Molecular and Cellular Research, San-Diego, USA, 2000; 8th IFPA Meeting, Melbourne, Australia, 2002; "Angiogenesis: basic mechanisms and therapeutic implications", Ascona, Switzerland, 2002; 5th Imperial College School of Medicine Symposium "Vascular endothelium: Role in disease pathogenesis and as a therapeutic target", London, United Kingdom, 2002; 676th Biochemical Society Meeting, Edinburgh, United Kingdom, 2002; 6th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Москва и Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2003; Special FEBS 2003 Meeting on Signal Transduction, Brussels, Belgium, 2003; The 40th American Association for Cancer Research Annual Meeting, New Orleans, USA, 2003; Joint International Symposium on CGRP, Amylin and Calcitonin 4th Symposium on Adrenomedullin and Proadrenomedullin N-20 Peptide, Zurich, Switzerland, 2004; XXXIV Congress of Nordic Federation of Obstetrics of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki, Finland, 2004; XI European Placenta Group Meeting, Glasgow, United Kingdom, 2005; Xlth Biennial International Gynecologic cancer Society Meeting, Santa Monica, USA, 2006; The 24th European Conference on Microcirculation. From Vascular Biology to

Clinical Microcirculation, Amsterdam, Netherlands, 2006; The 9th International Workshop on Kaposi's Sarcoma Associated Herpesvirus (KSHV) and Related Agents, Cape Cod, USA, 2006; The Physiological Society 2006 Main Meeting, London, United Kingdom; The 21st Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (ISH2006), Fukuoka, Japan, 2006.

Внедрение результатов исследований

Полученные данные используются в учебном процессе в Кибл Колледже (Keble College) (Оксфорд,. Великобритания) и в учебном пособии «Embryonic development: Tutorials for biomedical students. Collection MCQ». Материалы диссертации вошли в монографию «Роль адреномедуллина в биологии эндотелиальной клетки человека», издательство «Гэотар-Медиа» (Москва, 2007), и книг для биологов и медиков «Cell and Molecular Biology of Endometrium in Health and Disease», издательство «Soeshi Publishing» (Soeshi, 2002) и «Handbook of Experimental Pharmacology, The Vascular Endothelium», издательство «Springer-Verlag» (Berlin-Heidelberg, 2006).

Разработаны способы определения субхромосомной организации генов и механизмов, регулирующих экспрессию CALCRL гена человека (международные патенты «Chromosomal conformation footprints in diagnostics of aberrant gene expression» No.0603251.0 / A. Akoulitchev, A. Ramadass, L.L. Nikitenko (United Kingdom) Submitted 17.02.2005; Published 17.02.2006 и «Transcriptional Regulation of Therapeutically Useful Gene: (GOIN 33/50) L.L. Nikitenko, D.M. Smith, R. Bicknell, M.C.P. Rees (United Kingdom) Submitted 17.11.2002; Published 17.11.2003), позволяющие оценивать транскрипционную активность генов для диагностики раковых и других заболеваний.

По результатам выполненных по теме диссертации исследований опубликованы в открытой печати 38 научных работ, в том числе в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ, - 11, одна монография издательства «Гэотар-Медиа» (г. Москва), в материалах международных научных конференций - 21, руководство по эмбриологии и две главы книг международных издательств, и два оформленных патента на изобретение.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 194 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения и выводов, и указателя цитируемой литературы (45 отечественных и 189 иностранных источников). Работа иллюстрирована 10 таблицами и 62 рисунками в виде графиков, схем и фотографий.

Работа выполнена на базе лабораторий патофизиологии репродукции (зав. отд. д.м.н. Колесникова Л.И.) Института педиатрии и репродукции человека ГУ "Научный центр медицинской экологии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук» (и.о. директора д.м.н., профессор Долгих В.В.) (Иркутск, Российская Федерация), молекулярных механизмов ангиогенеза (зав. отд. д.м.н. Риис М.К.П.) кафедры акушерства и гинекологии Оксфордского Университета (Оксфорд, Великобритания), биохимии ядерной динамики (зав. отд. к.б.н. Акуличев А.) школы патологии сэра В. Данна Оксфордского Университета (Оксфорд, Великобритания), молекулярных механизмов ангиогенеза (зав. отд. к.б.н. Бикнелл Р.) Института молекулярной медицины (Оксфорд, Великобритания), вирусной онкологии (зав. отд. д.м.н., профессор Бошофф К.) Института биомедицинских исследований Вулфсона Лондонского Университета (Лондон, Великобритания), кафедры эндокринологии (зав. отд. д.м.н., профессор Фуджита Т.) медицинской школы Токийского Университета (Токио, Япония) и кафедры биохимии (зав. отд. д.б.н., профессор Робберехт П.) Брюссельского Университета (Брюссель, Бельгия).

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эндотелиальная клетка играет ключевую роль в развитии и функции кровеносных и лимфатических сосудов. Избыточная пролиферация и трансформация эндотелиальных клеток ведет к патологическому ангиогенезу/лимфангиогенезу или дисфункции сосудистой системы — являющимся показателями злокачественных опухолей и других заболеваний (Таблица 1) [Folkman et al., 2000; Carmeliet et al., 2000; Alitalo et al., 2005].

В данной работе представлены результаты нашего исследования роли пептида адреномедуллина [Kitamura et al., 1993], охарактеризованного в 1998 году как потенциальный новый ангиогенный фактор [Zhao et al., 1998], а также его рецепторов в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

Несмотря на то, что эксперименты, проведенные с использованием хориоаллантоисной мембраны цыпленка [Zhao et al., 1998], а также впоследствии на мышах с использованием in vivo моделей [Oehler et al., 2002], указывали на возможную роль петида адреномедуллина в процессе развития сосудистой системы животных, существовал ощутимый недостаток подобного рода исследований с использованием клеток и тканей человека. Кроме того, информация о распределении и функционировании эндогенных адреномедуллиновых рецепторов, экспрессированных в клетках человека, до настоящего времени также остается недостаточно изученной, на что было впервые указано в нашем литобзоре [Nikitenko et al., 2006а].

В связи с этим неизвестными оставались как роль AM и его рецепторов в тканях человека, так и возможности их использования для лечения раковых заболеваний. Данная проблема существует и для других ангиогенных факторов. Например, несмотря на несомненную роль ключевого ангиогенного фактора VEGF в развитии раковых опухолей при проведении экспериментальных исследований на животных, применение ингибиторов данного ангногенного фактора не всегда приводит к положительным результатам [Ferrara and Kerbel, 2005]. С нашей точки зрения, трудности в данной области обусловлены отсутствием системного подхода в анализе экпрессии и функции факторов ангиогенеза in vitro и in vivo в клетках и тканях человека.

Поэтому целью наших исследований являлся комплексный систематический подход к изучению роли ангиогенного фактора AM и его рецепторной системы в клетках и тканях человека (Рисунок 1). Под системным подходом мы подразумеваем исследования по изучению не только роли адреномедуллина в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека, но также транскрипции и трансляции генов, кодирующих компоненты его рецепторной системы (CL, RAMP и др.), механизмов, регулирующих экспрессию функционально активных рецепторов, их локализации в тканях человека, специфичности взаимодействия с потенциальными лигандами (фармакология рецептора), а также механизмов десенситизации и ресенситизации. Для достижения данной цели нами был использован спектр современных молекулярно-биологических, цитологических, гистологических и функциональных методов и моделей.

В настоящем исследовании прежде всего исследовалась роль AM в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла (Глава 3) и характеризовался спектр и механизмы экпрессии AM и его рецептора (Главы 4 и 5) в организме человека. Были выявлены следующие характеристики системы: неспецифифическая экспрессия лиганда различными клетками организма (особенно при стимуляции цитокинами и при гипоксии) и специфическая экспрессия рецептора эндотелием, обуславливающие спектр паракринных, автокринных и эндокринных механизмов действия лиганда на сосудистую систему. Также в работе обоснована возможная роль адреномедуллиновых рецепторов в росте и функционировании кровеносной и лимфатической систем человека в физиологически нормальных и раковых процессах.

Кроме того, системный подход включал исследование трансляционных подходов (Глава 6), а именно возможности применения полученных знаний о AM и его рецепторной системе для разработки методов диагностики и лечения спектра заболеваний, связанных с дисфункцией сосудистой системы и развитием раковых заболеваний. Данный подход позволил рассмотреть не только механизм работы определенной биологической системы на молекулярном уровне (в данном случае адреномедуллиновых рецепторов в эндотелиальной клетке), но и потенциал использования данных знаний в теоретической биологии, а также при разработке терапий для использования в клинике при лечении широкого спектра заболеваний (от раковых опухолей до сердечно-сосудистых заболеваний и направленной дифференцировки стволовых клеток в эндотелиальные клеточные линии).

В диссертации использованы результаты собственных исследований, проведенных автором с применением модифицированных методов получения первичных культур эндотелиальных клеток человека, изолированных из микроциркуляторного русла кожной и маточных тканей, по изучению экспрессии AM и его рецепторов в различных нормальных тканях и раковых опухолях. Использовано несколько оригинальных и современных методик, позволяющих изучить и определить роль адреномедуллиновых рецепторов в физиологии человека на клеточном и тканевом уровнях. В экспериментах с использованием первичных клеточных линий и тканей человека выявлена специфичность экспрессии адреномедуллинового рецептора (G-белок-связанного рецептора (GPCR) CL, кодированного CALCRL геном) в эндотелиальных клетках in vitro и in vivo.

В диссертации приводится экспериментальное обоснование причин такой специфической экспрессии гена (субхромосомной организации) адреномедуллинового рецептора в эндотелии (Глава 4), а также его регуляции различными факторами, включая онкогенный вирус саркомы Капоши (Глава 6). Дается понятие о дальнейшей «специализации» рецептора при узнавании лигандов, а также механизмов регулирующих его «сенситизацию» и «десенситизацию» (Главы 5 и 6).

Проведенное исследование имеет теоретическое и практическое значение. Полученные данные раскрывают молекулярную основу «специфической экспрессии рецепторов, связанных с G-белком (GPCRs)» на примере селективной транскрипции CALCRL гена, играющего важную роль в биологии эндотелиальной клетки. В настоящих исследованиях использованы методология клонирования и сравнительного функционального анализа промотора в комбинации с изучением субхромосомной структуры индивидуального гена в транскрипционно — позитивных (пермессивных) и -негативных (непермессивных) клеточных линиях, а также в нормальных тканях и раковых опухолях человека.

Знание основных принципов и механизмов экпрессии и функции ткане-или клеточно-специфических GPCR рецепторов, включая CL, может позволить в будущем разрабатывать более специфические методы ингибирования либо активирования данных рецепторов, способствующих полноценному функционированию их лигандов, и играющих роль в биологии кровеносной и лимфатической систем человека (Глава 6).

Кроме того, созданный комплексный методический подход и разработанные методы позволят более полно характеризовать роль других новых ангиогенных факторов (на примере AM в данной работе) в физиологии человека, что, несомненно, имеет значение для эффективного применения соответствующих методов терапии с применением знаний о механизмах эспрессии и функционирования данных факторов и их рецепторов в клетках и тканях человека (Глава 6).

Некоторые из разработанных нами методов и реактивов могут быть использованы в диагностике различных заболеваний, включая спектр сердечно-сосудистых, раковых, и, возможно, инфекционных болезней и диабета (Глава 6).

Принцип сравнительного исследования эспрессии лиганда и рецептора в тканях человека позволяет прогнозировать эффективность применения ингибиторов и активаторов ангиогенеза и дисфункции эндотелия, а также выявлять типы раковых опухолей (а также индивидуальных пациентов), в (у) которых действие данных препаратов может быть наиболее результативным.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований была впервые изучена роль адреномедуллина в биологии эндотелиальных клеток человека (результаты обобщены на Рисунке 20) и изучены механизмы экспрессии и функции G-белок связанного рецептора CL (результаты обобщены на Рисунках 31,45 и 59).

Применение комплексно-систематического подхода по изучению роли AM и его рецептора CL в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека привело к получению данных, позволяющих оценить возможность применения ингибиторов/активаторов действия адреномедуллина (Таблица 11) для трансляционных исследований и терапии заболеваний, связанных с избыточной или недостаточной экспрессией самого пептида либо его рецепторов, а также проводить предварительные исследования по воздействию различных веществ на экспрессию, транспорт и функцию CL рецептора в эндотелиальных клетках, как источнике его локализации in vivo в тканях человека (Рисунок 34; Таблица 9).

Для ясности необходимо, очевидно, свести ряд важнейших выводов в единую схему, которая была бы универсальной и объясняющей механизмы экспрессии и функции адреномедуллиновых рецепторов в эндотелиальной клетке, а также их роль в норме и при патологии (Рисунок 62).

Регуляция транскрипции CAI\CRhгена

М\ киши ifi/.i.

Эксирееепя на 1|(>1н'рхм(К"111 R \ \h

Активностьрсц

J (сдостаточная iipo y\ iviliui океп va a;toi.i 1 ннсрирошщасмос п>

- 1It дос la iDMMi.iii к \ii naio\ni iiMCCKiiii

1111 IIOI CllC.t

13a !o\n \aiамии -(AiiM(|»)aiii iioi c'lic.i I'lin nfjiipoiiaiiiic ROS, iinomota и iнперпронимаемоеiн Aii(|)(|>cpciiiinpoitK.i

-C I 1!ОЛОШ.1\ KU'IOK

Дисфункция г)НА<)1елиал1>1Н)п к u- i км ционирокание )(})срснциацим шальной клетки

Опухолевые ткани Ишемия Репродукция

Рисунок 62. Роль CL рецептора в биологии эндотелиальной клетки человека в норме и при патологии.

Экспрессия рецептора на поверхности эндотелиальной клетки обеспечивает взаимодействие с лигандами и нормальную функцию эндотелиальных клеток в норме и при патологии (например, при ангиогенезе и лимфангиогенезе в раковых опухолях). Нарушение функции рецептора в результате недостаточной экспрессии рецептора либо его десенситизации могут приводить к дисфункции эндотелиальной клетки при патологиях различной этиологии.

Резюмируя изложенные в данной диссертации результаты проведенных экспериментальных исследований, нами сделаны следующие выводы:

1. С помощью использования лектина Ulex Europeus Agglutinin 1 (UEA1), связанного с магнитными шариками, впервые получены чистые популяции эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека из тех тканей, в которых происходят процессы физиологического ангиогенеза, а именно эндометрия и миометрия, позволяющие изучать роль ангиогенных и других факторов в их биологии.

2. Обоснована роль ангиогенного фактора адреномедуллина в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека, в том числе его влияние на пролиферацию и миграцию этих клеток, а также ингибирование апоптоза и регуляцию проницаемости эндотелиального монослоя.

3. Клонированы и охарактеризованы промотор и новые гетерогенные транскрипты CALCRL гена человека, а также разработан метод определения трехмерной субхромосомной структуры генов. Показано, что экспрессия CALCRL гена зависит прежде всего от клеточно- и ткане-специфического фона. При этом ключевым фактором экспрессии CALCRL гена является его трехмерная структура, а активность промотора играет вторичную роль. Продемонстрированы влияние гипоксии на активность промотора CALCRL гена человека и роль онкогенного вируса саркомы Капоши на экспрессию CL рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

4. В экспериментах с использованием первичных клеточных культур и тканей человека, а также разработанных плазмидных векторов, позволяющих производить зонды для гибридизации in situ и Northern блоттинга, показана специфическая экспрессия CALCRL гена человека, а также CL рецептора, в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла in vitro и in vivo.

5. Впервые определены функциональные свойства G-белок связанного рецептора CL, экспрессированного в тканях и эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека. Продемонстрировано, что именно GPCR CL непосредственно взаимодействует с адреномедуллином и осуществляет роль рецептора для данного пептида в эндотелии человека, обеспечивая работу нисходящих сигнальных каскадов, ассоциированных со стимуляцией эндотелия адреномедуллином. В экспериментах по изучению интернализации рецептора с использованием антагонистов AM и CGRP рецепторов показано, что CL рецептор также играет роль CGRP рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека.

6. Продемонстрировано, что избыточная экспрессия одного или другого лиганда (AM или CGRP) приводит к потере функции (десенситизации) эндотелиального CL рецептора к обоим лигандам, и поэтому может играть роль при развитии сердечно-сосудистых заболеваний различной этиологии. При этом десенситизация рецептора обусловлена его интернализацией только в случае взаимодействия с AM.

7. Разработаны поликлональные антитела против человеческого CL рецептора и продемонстрирована их способность распознавать дегликозилированный, основно-гликозилированный и терминально-гликозилированные формы рецептора, а также возможность их использования для определения локализации рецептора в клетках человека in vitro и in vivo.

8. Впервые продемонстрирована экспрессия CL рецептора в тканях человека в норме и при патологии (на примере опухолевых тканей почек, яичников, лейомиомы и саркомы Капоши). Показано, что в раковых опухолях рецептор может быть экспрессирован либо только в эндотелиальных клетках (лейомиома и саркома Капоши), либо в эндотелиальных клетках и в раковых клетках (опухолевые заболевания почек и яичников). Впервые выявлена необходимость исследования фармакологии адреномедуллиновых рецепторов как в эндотелиальных клетках опухолей, так и в самих опухолевых клетках; а также необходимость выявления различий свойств рецептора, экспрессированного в нормальном и опухолевом эндотелии.

9. Показано, что существует корреляция между экспрессией лиганда, либо его рецептора, и развитием/прогрессированием опухолевых заболеваний человека. Выявлено, что в опухолевых тканях экспрессия рецептора в раковых клетках может быть ассоциирована с появлением раковых клеток в сосудах микроциркуляторного русла.

10. Продемонстрировано, что онкогенные вирусы (например, вирус саркомы Капоши) обладают способностью регулировать экспрессию CL рецептора в эндотелиальных клетках микроциркуляторного русла человека. Сконструированная лентивирусная «библиотека» позволила выявить роль индивидуального вирусного гена К2 (кодирующего vIL6) в регуляции экспрессии CL рецептора. Полученные данные впервые указывают на необходимость дальнейшего изучения роли адреномедуллиновых рецепторов в трансформированном вирусом эндотелии, а также выявления различий свойств CL рецептора, экспрессированного в нормальном и трансформированном эндотелии человека.

11. Получены моноклональные антитела против гетеродимера CL/RAMP, экспрессированного на поверхности клетки, и показана возможность их использования для регуляции свойств эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека, что указывает на возможность их применения в качестве эффективного реактива для коррекции патологий, связанных с функцией адреномедуллиновых рецепторов, как например патологический ангиогенез и гиперпроницаемость эндотелия.

12. Экспрессия адреномедуллиновых рецепторов на ранних стадиях эмбриогенеза и дифференцировки стволовых клеток во взрослом организме указывает на их возможную роль в процессе дифференцировки клеток человека.

13. Разработан и применен комплексный систематический подход к изучению ангиогенного фактора адреномедуллина и его рецепторной системы, в результате чего впервые выявлены и обобщены роль многоступенчатой регуляции специфической экспрессии и свойств CL рецептора в полноценном функционировании эндотелиальной клетки человека в норме и при патологии (Рисунки 59 и 62).

Адреномедуллиновые рецепторы и будущее

В заключение представляется необходимым отметить, что в данной диссертации впервые обобщены результаты исследований молекулярных механизмов, регулирующих экспрессию и функцию адреномедуллиновых рецепторов в клетках человека. Данная работа является основой для дальнейшего изучения роли адреномедуллина и его рецепторов в биологии эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла человека.

Результаты наших исследований указывают на необходимость более детального изучения AM, CALCRL и RAMP генов ( в том числе возможных мутаций и полиморфизма нуклеотидов) [Ishimitsu et al., 2001; Nakazawa et al., 2001] и эпигенетических механизмов, регулирующих их экспрессию; механизмов десенситизации и ресенситизации CL рецептора; роли адреномедуллина и CGRP в (лимф)ангиогенезе в процессе эмбриогенеза и развития, либо прогрессирования (метастазирования), раковых опухолей; фенотипических различий CL рецептора, экспрессированного в нормальном и раковом эндотелии (в том числе в трансформированных онкогенным вирусом клетках саркомы Капоши); и разработки специфических ингибиторов и активаторов адреномедуллиновых рецепторов (Таблица 11) [см. также Doods et al., 2000; Zhang et al., 2000 для высокоспецифичных антагонистов CGRP рецепторов].

Несомненно то, что результаты подобного рода исследований позволят расширить наши знания о роли адреномедуллина и его рецепторов в микроциркуляторном эндотелии, а также соответствующих молекулярных механизмах, и будут являться дальнейшей основой для разработки трансляционных подходов для диагностики, либо терапии, сердечнососудистых и опухолевых заболеваний человека.