Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Резистентность к терапии урогенитального хламидиоза: механизмы устойчивости к антибактериальным препаратам

На правах рукописи

Николаева Наталья Викторовна

Резистентность к терапии урогенитального хламидиоза: механизмы устойчивости к антибактериальным препаратам

(14.00.11.- кожные и венерические болезни)

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена в отделе инфекций, передаваемых половым путем Государственного учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Михаил Михайлович Васильев

Вадим Маркович Говорун

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук

Доктор биологических наук, профессор

Михаил Александрович Гомберг Сергей Владимирович Сидоренко

Ведущее научное учреждение:

Московский Государственный медико-стоматологический Университет МЗ РФ.

Защита диссертации состоится «9» июня 2004 г. в «_» часов на

заседании Диссертационного совета Д-208.115.01 в Государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Министерства здравоохранения России» по адресу: 107076, Москва, ул. Короленко, д.З, кор. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ЦНИКВИ Минздрава России.

Автореферат разослан «_7_» мая 2004г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д-208.115.01 кандидат медицинских наук

Н.К.Иванова

Общая характеристика работы.

Актуальность темы: C.trachomatis относится к патогенным для человека микроорганизмам, а урогенитальная хламидийная инфекция - к наиболее распространенным инфекциям, передаваемым половым путем [Руководство по лечению 3ППП, 1998, Foxman В et. al 1998]. Ежегодно в мире официально регистрируется около 80 млн. случаев заболеваний, вызванных C.trachomatis [Скрипкин Ю.К.„ Кубанова А.А., Дмитриев ГА, 1996].

Особый интерес для клиницистов представляет лечение хламидийной инфекции, которое, несмотря на постоянно появляющиеся новые рекомендации остается актуальной проблемой. Поскольку хламидии являются бактериями, их лечение проводится антибиотиками. Препаратами выбора для лечения урогенитальной хламидийной инфекции являются тетрациклины, макролиды и некоторые фторхинолоны. Однако до настоящего времени, остается открытым вопрос об истинной способности существующих препаратов и режимов лечения действительно уничтожать хламидии [Глазкова Л.К., Герасимова Н.М., 1996]. В литературе, достаточно давно, стали появляться данные об отсутствии эффекта от адекватной антибактериальной терапии УГХ [Скрипкин Ю.К., Кубанова А.А.,Аковбян В.А 1996, Чеботарев В.В.,1997, Jones R.B., Van der Pol В., Martin D.H. et al., 1990]. Все чаще появляются сообщения об обнаружении штаммов C. trachomatis, устойчивых к антибактериальным препаратам, рекомендуемым для лечения УГХ [Somani J., Bhullar V,B., Workowski K.A. et al 2000].

Возможность формирования устойчивости C.trachomatis к фторхинолонам была показана in vitro [Dessus-Babus S., Beabear СМ., Charton A. et. al, 1998].

Первое достоверное сообщение об обнаружении штаммов C.trachomatis, устойчивых к макролидным антибиотикам, появилось сравнительно недавно [Somani J., Bhullar V.B., Workowski K.A. et al 2000]. Достаточно недавно, российские исследователи, показали в своих работах, что устойчивые к макролидам, клинические изоляты хламидии, имеют мутации в гене 23SpPHK, приводящие к изменению вторичной структуры пептидилтрансферазной петли

РОС. НАЦИОНАЛЬНА« БИБЛИОТЕКА

домена V 23 S субъединицы РНК. Но связи между обнаружением данных мутаций и неудачами лечения установлено не было [Мисюрина О.Ю. 2002г, Шипицина Е.В. 2003г].

Что касается тетрациклинов, то необходимо отметить сообщения об обнаружении штаммов C.trachomatis, устойчивых к доксициклину, а также сообщения о выделении полирезистентных штаммов, устойчивых наряду с другими антибиотиками и к доксициклину [Lefevre J.C., Lepardneur J.P., 1998, Somani J., Bhullar V.B., Workowski K.A et al 2000].

Таким образом, изучение проблем терапии урогенитальной хламидийной инфекции остается актуальной задачей медицинской науки и практики. Применение новых препаратов должно сопровождаться теоретическими и эпидемиологическими исследованиями: определением ингибирующих и бактерицидных концентраций, выявлением частоты встречаемости резистентных клинических изолятов и изучением молекулярных механизмов формирования резистентности клинических изолятов С trachomatis. Цель работы; Изучение причин неудач лечения УГХ на основе сравнительного анализа эффективности терапии урогениального хламидиоза различными антибактериальными препаратами (группы макролидов, тетрациклинов, фторхинолонов), выявление резистентных форм хламидий и исследование молекулярных механизмов устойчивости С trachomatis к антибактериальным препаратам. Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку клинико-микробиологической эффективности наиболее распространенных схем лечения урогенитального хламидиоза нижних отделов мочеполового тракта.

2. Провести сравнительный анализ различных методов диагностики урогенитальной хламидийной инфекции (ПЦР, выделение хламидий на культуре клеток McCoy ).

3. Проанализировать основные причины неудач лечения урогенитального хламидиоза нижних отделов мочеполового тракта и выявить клинические

изоляты C.trachomatis, устойчивые к. фторхинолонам, макролидам и тетрациклинам.

4. В устойчивых к фторхинолонам, клинических изолятах C. trachomatis, исследовать молекулярные изменения в генах гиразы и топоизомеразы IV.

5. В устойчивых к макролидам, клинических изолятах C.trachomatis, исследовать молекулярные изменения в гене 23SpPHK).

Научная новизна: Впервые в России были исследованы причины неуспешного лечения УГХ, а также исследован уровень антибиотикорезистентности клинических изолятов C.trachomatis, выделенных от больных после неуспешного лечения, к основным АБП, используемым в терапии УГХ, с определением МИК и изучением молекулярных механизмов данного явления.

Впервые установлено, что двойные мутации (Val60->Ala и Hisl29->GIn), в генах мишеней фторхинолонов, у клинических изолятов. C.trachomatis (серотипа Е), устойчивых к фторхинолонам in vitro, находятся за границами QRDR и могут являться проявлениями полиморфизма гена gyrA, что позволяет предположить наличие у хламидий альтернативных механизмов устойчивости к цанным антибиотикам.

Практическая значимость: На основе полученных данных разработан и внедрен в практику алгоритм обследования и ведения пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией. Основные положения, выносимые на защиту;

1. Проведенный анализ различных методов диагностики позволил обосновать наиболее оптимальные методы обследования пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией при первичном обращении и при контроле излеченности.

2. Выявлены и подтверждены микробиологическими и молекулярно-генетическими методами основные причины неудач лечения при урогенитальной хламидийной инфекции (в частности: переход хламидий в персистирующее состояние, в котором они имеют возможность

приспособиться к действию, различных отрицательных факторов, и наличие антибиотикорезистентности C.trachomatis к основным антибактериальным препаратам рекомендуемым для лечения урогенитальной хламидийной инфекции.

3. Исследование молекулярных изменений 23SpPHK, подтвердило наличие у клинических изолятов C.trachomatis, устойчивых к высоким концентрациям макролидов in vitro, мутаций в гене 23SpPHK, приводящих к изменению вторичной структуры пептидилтрансферазного домена 23SpPHK.

4. Исследование молекулярных изменений в генах гиразы и топоизомеразы IV у клинических изолятов C.trachomatis, выделенных от больных после неуспешного лечения и устойчивых к фторхинолонам in vitro, позволило сделать вывод о наличии у хламидий альтернативных механизмов устойчивости к данным антибиотикам.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения; Основные положения работы нашли применение в практической работе в НКДО ГУ ЦНИКВИ Минздрава РФ, женском венерологическом отделении больницы № 14 имени В.Г. Короленко, в КБ № 6 ФУ "Медбиоэкстрем" МЗ РФ, что позволило повысить эффективность диагностики и этиотропной терапии урогенитального хламидиоза.

Апробация работы; Материалы диссертации доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции "Врач и общество" (Москва, 19 апреля 2002г); на симпозиуме "Генодиагностика в практическом здравоохранении" (Москва, 20 июня 2002 г), на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ (Москва 27 февраля 2003 г.).

Публикации; По теме диссертации опубликовано 9 научных работ. Объем и структура работы; Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, указателя литературы. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 16 рисунками.

Список литературы содержит 80 источников отечественных и 154 источника зарубежных авторов.

Материалы и методы исследования: Клиническое обследование больных проводилось на базе ГУ «ЦНИКВИ МЗ РФ» и КБ №6 ФУ "Медбиоэкстрем" МЗРФ.

Под нашим наблюдением находилось 148 (ПО мужчин и 38 женщин) пациентов в возрасте от 18 до 62 лет (средний возраст 31,3 года). Пациенты были разделены на три группы, для лечения урогенитальной хламидийной инфекции нижних отделов мочеполового тракта, препаратами различных групп, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, не противоречащими утвержденными МЗ РФ схемами лечения урогенитального хламидиоза. I группу составили 52 пациента, получающие терапию препаратом тетрациклинового ряда - доксициклином (вибрамицин), II группу - 49 пациентов, получающих терапию препаратом группы макролидов азитромицином (сумамед), III группу - 47 пациентов, получающих терапию препаратом фторхинолонового ряда- офлоксацин (таривид).

Критериями включения в группы являлись: -отсутствие гонореи, сифилиса, ВИЧ, вирусных гепатитов; -отсутствие антибиотикотерапии за 1 месяц до иследования; -обнаружение C.trachomatis методом посева на культуре клеток McCoy и/или методом ПЦР;

-согласие пациента воздерживаться от незащищенных половых контактов на время лечения и последующего наблюдения;

-отсутствие противопоказаний для лечения антибактериальными препаратами указанных групп.

- При клиническом обследовании оценивали данные анамнеза, субъективные и объективные проявления хламидийной инфекции.

N.gonorrhoeae, T.vaginalis, грибы рода Candida выявляли с помощью микроскопического и культурального методов исследования, идентификацию U.urealyticum и M.hominis осуществляли культуральным методом на среде

"Mycoplasma DUO" ("SanofT-Франция) с количественной оценкой. Лабораторная верификация бактериального вагиноза базировалась на оценке критериев Amsell.

Диагноз урогенитального хламидиоза устанавливался на основании обнаружения C.trachomatis методами ПЦР, и/или методом посева на культуре клеток, кроме того, был использован метод ИФА с определением антител классов JgA, JgG, JgM к C. trachomatis.

Выделение хламидий на культуре клеток McCoy, тестирование чувствительности к антибактериальным препаратам клинических изолятов C.trachomatis, и молекулярно-генетические методы исследования проводились на базе НИИ Физико-химической медицины МЗ РФ, в лаборатории генной инженерии и иммуногенетики.

В качестве контроля был использован генетически охарактеризованный, лабораторный изолят (не имеющий мутаций), чувствительный к тестируемым АБП, принадлежащий к серотипу Е (АТСС VR-885).

Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не наблюдали ни одного включения. За МИК90 принимали наименьшую концентрацию антибиотика, при которой наблюдалось уменьшение количества включений на 90%, по сравнению с контролем. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не наблюдалось ни одного включения.

Сравнением МИК и/или МБК, клинического изолята, с МИК и/или МБК чувствительного контрольного изолята каждый изолят был определен как чувствительный или устойчивый к антибактериальному препарату. Изолят считали устойчивым, если значения МИК и/или МБК превышали определенные для контрольного изолята в 10 и более раз.

Определение нуклеотидной последовательности ампликонов C.trachomatis, проводили с использованием набора для автоматического секвенирования Big Dye TM Terminator V.3.0 Cycle Sequencing ("Applied Biosiste m". США). Для

поиска гомологичных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей в международных базах данных были использованы программы FASTA [Pearson 1988,http://www.ebi.ac.uk/fasta33] и BLAST [Altschul

1990,http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST].

Для выравнивания нескольких аминокислотных последовательностей была использована программа CLUSTALW [Jeanmougin

1998,http: //www.ebi.ac.uc.clustalw].

Предсказания положения трансмембранных доменов проводилось с использованием программы ТМАР [Pearson 1997,http://www..ki.se/tmap].

В работе были использованы следующие статистические методы оценки полученных данных: анализ достоверности результатов с помощью критерия Стьюдента, анализ достоверности результатов с помощью критерия х2 • Результаты собственных исследований и их обсуждение: Клиническая характеристика и результаты обследования больных; При анализе комплексного клинико-микробиологического обследования УГХ нижних отделов мочеполового тракта установлен у 148 пациентов - ПО мужчин (74,3%) и 38 женщин (25,7%).

Субъективно-асимтпомное течение урогенитального хламидиоза, констатировано у 83 (56,1%) пациентов: 30 (57,7%) пациентов 1 группы, 25 (51%) пациентов 2 группы и 28 (59,6%) пациентов 3 группы. Выделения из половых путей - 60 (40,5%), дизурия -33 (22,8%),. зуд в области половых органов/или уретре -18 (12,2%), диспареуния 3 (2%), чувство дискомфорта в генитальной области 13 (8,8%).

Объективные клинические признаки воспалительного процесса в нижних отделах мочеполовой системы имели различную, часто сочетанную локализацию (уретра, уретра и/или шейка матки, влагалище, вульва) у 52 (100%) пациентов 1 группы и 48 (97,9%) и 47 (100%) пациентов 2 и 3 групп соответственно.

При анализе результатов микробиологического обследования было установлено, что урогенитальный хламидиоз у мужчин и женщин, нередко

ассоциирован с другими инфекциями, передающимися половым путём (ИППП) - всего 94 (63,5%), моноинфекция встречалась только у 54 (36,4%) пациентов.

Исходя из задач исследования, нами была проведена сравнительная оценка результатов диагностики хламидийной инфекции несколькими методами одновременно у 148 пациентов (ПЦР, культуральная диагностика) до и после лечения, а также анализ выявления титров антихламидийных антител (п= 134). Данные сопоставления результатов ПЦР и культурального методов исследования, представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сопоставление результатов ПЦР п культурального метода диагностики УГХ.

Метод диагностики До лечения 1 После лечения

• (п=148) (п=38)

ПЦР I | 148 (100%) 37 (97,4%) ;

■ Диагностика C.frachomalh на i 1

кулыл ре клеток McCoy 139 (93,9%) 1 38(100%)

Совпадение результатов по 2 116(78,4%) 37 (97,4%)

методам j |

Дороговизна, длительность и трудоемкость микробиологического выделения хламидий в культуре существенно затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике. Вместе с тем, это по нашему мнению это не снижает ценность культурального метода т.к при контроле излеченности метод культуры клеток может дать более полную информацию об эффективности проведенной антибактериальной терапии. Это связано с невозможностью однозначно оценить жизнеспособность микробной клетки на основании выявления фрагмента её генома, с использованием данных молекулярно-биологических методов. Культуральный метод исследования представляется в этом случае более достоверным, т.к. допускает возможность роста в культуре только жизнеспособных бактерий и может дать более полную информацию об этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта. При этом обнаружение мелких форм цитоплазматических включений (МФЦПВ) хламидий при окраске

культурального материала моноклональными антителами к липополисахаридному антигену C.trachomatis, меченными флюоресциином, является микробиологическим признаком персистирующей хламидийной инфекции (Соловьев A.M. 2002г., Гомберг М.А. 2003г).

При анализе данных ИФА установлено, что у большей части пациентов до лечения обнаруживались антитела класса IgM 39 (29,1 %), антитела класса IgG и IgA в 33 (24,6 %) и 2 (1,5 %) случаев соответственно. В 19(14,2 %) случаев обнаруживались антитела классов IgG и IgM, в 14(10,4 %) IgA и IgG и в 18 (13,4 %) антитела всех трех классов.

После лечения у большей части пациентов обнаруживались антитела класса IgG 38 (28,4 %), антитела класса IgM и IgA в 28 (20,9 %) и 2 (1,5 %) случаев соответственно. В 14 (10,4 %) случаев обнаруживались антитела классов IgG и IgM, в 2 (1,5%) IgA и IgG и в 7 (5,2%) антитела всех трех классов.

Для адекватной интерпретации результатов диагностики хламидиоза серологическими методами следует принимать во внимание значение "пограничных титров" - наименьших, возможных разведений, в которых тест-системы определяют антитела против хламидий. Так называемые "диагностические титры" могут подтверждать клинический диагноз, стадию процесса, необходимость назначения антибактериального лечения.

Мы считаем, что ни один метод диагностики не лишен недостатков и не гарантирует 100% выявляемости хламидий. По этой причине при постановке диагноза: урогенитальный хламидиоз необходимо комплексное обследование, включающего два разных метода диагностики. При первичном обращении пациента, наиболее оптимальным комплексом диагностики могут служить ПЦР и ИФА с определением титра антихламидийных антител, для контроля излеченности наиболее информативным является метод выделения хламидий на культуре клеток.

Результаты лечения пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией.

При анализе клинической и микробиологической эффективности установлена заметная положительная динамика во всех трех группах пациентов.

Этиологическое излечение (элиминация инфекционного агента) было диагностировано у ПО (74,3 %) пациентов (37 (71,2 %) пациентов 1 группы, 42 (85,7 %) и 31 (65,9 %) 2 и 3 группы соответственно).. У 38 (25,7 %) пациентов при контрольном обследовании культуральным методом вновь были обнаружены хламидии (15 (28,8 %) пациентов 1 группы, 7 (14,3 %) и 16 (34%) пациентов 2 и 3 группы соответственно) (таб 1).

У 17 (11,5 %) пациентов (8 пациентов I группы и 9 пациентов II группы) при культуральном исследовании были выявлены мелкие формы

цитоплазматических включений (МФЦПВ) хламидии.

Таблица 1

Результаты контрольного обследования пациентов I, II и III групп

Результат контрольного обследования Количество пациентов (п=148)

I группа (п=52) II группа (п=49) III группа(п=47)

Клиническое излечение 40 (76,9%) 45 (91,8%) 32 (68,1%)

Этиологическое излечение 37 (71,2%) 42 (85,7%) 31 (65,9%)

Клиническое и этиологическое излечение 37 (71,2%) 42 (85,7%) 31 (65,9%)

При оценке эффективности наиболее распространенных схем лечения, наряду с клинико-микробиологическими методами проводили анализ чувствительности клинических изолятов C.trachomatis к антибактериальным препаратам (АБП) различных групп, а также специальные молекулярно-генетические методы исследования с целью изучения основных молекулярных механизмов формирования резистентности C.trachomatis к антибактериальным препаратам.

Результаты тестирования чувствительности к антибактериальным препаратам клинических изолятов C.trachomatis и результаты изучения механизмов защиты хламидий от антибактериальных препаратов:

МИК ОФЛ, ЛФЛ при тестировании in vitro для контрольного изолята составили 0,25 и 2,0 мкг/мл соответственно. По данным литературы МИК ОФЛ и ЛФЛ составляют от 0,5 до 2 мкг/мл [Cross 1999, Samra 2001]. Мы считали, что изолят чувствителен к препарату, если его МИК составляла менее 2 мкг/мл для ОФЛиЛФЛ.

Результаты тестирования чувствительности клинических изолятов C.trachomatis к фторхинолонам представлены в таблице № 2.

Таблица 2

Данные определения чувствительности клинических изолятов C.trachomatis к антибактериальным препаратам группы фторхинолонов

Пациент АБ №изолята ОФЛ' ЛФЛ доке

МИК МБК МИК МБК МИК МБК

Контороль (Е) 0,25 0,5 2,0 2,0 0,008 0,06

1 104(E) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,008 0,015

2 123(G) 0,25 0,25 0,5 0,25 0,1 0,1

3 196(F) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,1 0,1

4 198(F) 0,25 0,25 0,125 0,125 0,1 0,1

5 257 (G) 4 2 0,125 0,125 0,015 0,015

6 280(F) 0,25 0Д5 0,25 0,25 0,1 0,1

7 332(F) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,005 0,005

8 414(E) 0,25 0,25 4 16 0,03 0,015

9 532 (Е) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,03 0,03

10 534(E) 0,25 0,25 0,125 0,125 0,015 0,015

И 553(H) 4 16 32 16 0,25 0,25

12 598 (Е) 1,0 1,0 1,0 1,0 0,008 0,03

13 634 (Е) 0,25 0,25 0,06 0,06 0,008 0,008

14 703 (Е) 1,0 1,0 1,0 1,0 0,25 0,25

Нами было выявлено 2 изолята с промежуточным уровнем устойчивости (МИК антибиотика составляла 4 мкг/мл). Такой уровень устойчивости к ОФЛ продемонстрировали изоляты № 257 (МИК 4 мкг/мл, МБК 2 мкг/мл) и № 553

(МИК 4 мкг/мл, МБК 16 мкг/мл), к ЛФЛ изолят №414 (МИК 4мкг/мл, МБК 16 мкг/мл).

За высокий уровень устойчивости мы принимали МИК препарата более 4 мкг/мл. Такой уровень устойчивости к ЛФЛ продемонстрировал изолят № 553 (МИК 32 мкг/мл, МБК 16 мкг/мл) В отношении ОФЛ таких изолятов выявлено не было.

Во всех клинических изолятах C. trachomatis была исследована структура QRDR gyrA (gyrB) и parC (parE). Исследовав гены-мишеней мы не обнаружили отличий от структуры аналогичных участков в опубликованной последовательности C.trachomatis (AF044267 и AF044268). У части изолятов была найдена двойная мутация, Val60->Ala (GTA->GCA) и Hisl29Gln.

Трехмерное моделирование структуры gyrA из C. trachomatis было выполнено с использованием программы FoldRec-CC [refl] на основе структуры gyrA из E.coli, Protein Data Bank (http://www.rcsb.org) номер 1аЬ4. Результаты представлены на рисунке 2. Видно, что найденные места мутаций Val60->Ala (GTA->GCA) и Hisl29Gln (GAC->GAG) располагаются рядом с QRDR. Однако, известные «горячие точки» (замены, обнаруженные у штаммов резистентных к фторхинолонам) [AAC Oct 1998 р 2474-2481] располагаются с противоположной стороны молекулы. Следовательно, анализ структуры белка не дает достаточных оснований утверждать, что найденные мутации Val60->А1а и Hisl29->Gln являются «горячими точками» в gyrA исследованных изолятов. Все же близкое пространственное расположение мутаций Val60->Ala и Hisl29->GIn к аминокислотной последовательности QRDR может привести к изменению функциональных свойств белка. Следует также заметить, что данные мутации были обнаружены в клинических изолятах, принадлежащих к серототипу Е. В клинических изолятах, серотипов Н и G такие мутации не были обнаружены. Таким образом, идентифицированные мутации Val60->Ala и Hisl29->Gln могут являться проявлениями полиморфизма гена gyrA.

Рнс>нок 2. Район -1, «горячие точки» 5ег83 и А$р87 - 2 и

идентифицированные места м)таций Уа160А1а и Н1$129С1п -3.

Причину низкой эффективности офлоксацина - препарата фторхинолонового ряда при УГХ в нашем исследовании, можно объяснить образованием МФЦПВ в материале от больного, что по данным Гомберга М.А.[28] является микробиологическим признаком персиститующей хламидийной инфекции, а также индукцию этих включений при культивировании клинических изолятов чувствительных к ФХ в среде с антибиотиком (рис.3).

т*

"ТК *" J■

л

-УЗ

" < *

Рост хтамилии на (.реле с антибиотиком (40\ ЧА 1 4)

' ^ < » ^ -' „• »'*>- -

г ~ » ,,, , г

-Г; Х-'^С^ 1 « с

Образование МФЦПВ в к\ 1ьт\ре к 1Сгок на срете с антибиотиком (40\Ч\ 1 4)

Рис. 3 Пмм)иоц11то\11\шчсское окрашивание моиок-лональнымн антителами к ЛПС хламидий (Конфокальный микроскоп №соп О-ЕсЬрье-

С 1

К настоящему времени в литературе описаны данные, подтверждающие возможность формирования абберангных включений хламидий под влиянием

ципрофлоксацина и офлоксацина [Dresses-Werringloer U., Padubrin I., Zeidler H. et. al 2000].

Минимальные ингибирующие концентрации доксициклина в отношении хламидий варьируют в достаточно широких пределах: от 0,015 до 1,0 мкг/мл [Сидоренко С.В.,2001]. Значение МИК всех исследованных нами клинических изолятов C.trachomatis укладывалось в рамки от 0,005 до 0,25 мкг/мл, т. е. в своем исследовании мы не обнаружили устойчивых к доксициклину изолятов (таб. 2). Случаи неэффективности проводимой антибактериальной терапии можно объяснить обнаружением феномена гетеротипической резистентности, когда при действии высоких концентраций антибиотика выживает менее 1% бактерий, и устойчивость к антибиотику не закреплена генетически: в следующих поколениях число устойчивых организмов остаётся прежним [Jones R.B., Van der Pol В., Martin D.H. et al., 1990]. Считается, что в жизненном цикле выживших бактерий преобладают стадии, в которых они наименее чувствительны к действию антибиотиков. Необходимо отметить, что у 4 пациентов (у которых при контроле излеченности были обнаружены хламидий), сохранялись клинические проявления заболевания, что указывает на необходимость дальнейшего изучения феномена гетеротипической резистентности с клинической точки зрения, поскольку в доступной литературе мы не обнаружили данных об изучении корреляции данного феномена, с клинической эффективностью препарата.

МИК A3 и ЭР для C.trachomatis составляют 0,06 мкг/мл [Сидоренко СВ., 2001].

По результатам тестирования чувствительности клинических изолятов к макролидам в нашем исследовании, также было выявлено 2 клинических изолята C.trachomatis, устойчивых к ним (NN 21,227) для которых МИК и/или МБК составляли не менее 0,8 мкг/мл. Изолят №208, устойчивый к ЭР (МИК >12,8 мкг/мл, МБК >12,8 мкг/мл) показал низкий уровень устойчивости к A3 (МИК 0,05 мкг/мл, МБК >3,2 мкг/мл) (таб. 3).

Таблица 3

Чувствительность к азитромицину и эритромицину клинических изолятов СЛтасИотай$

№ изолята Антибиотик

Эритромицин Азитромицин

МПКм МИК МБК МПК90 МИК МБК

Контроль Е 0,015 0,03 0,25 0,004. 0,008 0,008

1 21(С) за 6,4 6,4 1,6 за за

2 104(Е) 0,06 0,125 0,125 0,06 0,125 0,5

3 123(С) 0,01 0,025 0,025 0,025 0,05 0,05

4 155(Е) 0,05 0,1 0,1 0,05 0,1 0,1

5 196(10 0,01 0,025 0,025 0,025 0,05 0,05

6 198(Р) 0,01 0,025 0,025 0,025 0,05 0,05

7 208(в) 6,4 >12,8 >12,8 0,025 0,05 >3,2

8 227(0) 0,4 0,8 0,8 3,2 >6,4 >6,4

9 244 (Е) 0,015 0,03 0,25 0,004 0,008 0,008

10 253 (в) 0,05 0,1 0,1 0,05 0,1 0,1

11 257 (в) 0,1 0,25 0,25 0,1 0,25 0,25

12 280(1) 0,01- 0,025 0,025 0,025 0,05 0,05

13 332(1?) 0,01. 0,025 0,025 0,025 0,05 0,05

14 414(Е) 0,1 0,25 0,25 0,1 0,25 0,25

15 532(Е) 0,06 0,125 0,25 0,1. 0,25 0,25

16 534 (Е) 0,06 0,125 0,25 0,1 0,25 0,25

17 553 (Н) 0,1 0,25 0,25 0,1 0,25 0,25

18 598 (Е) 0,007 0,015 0,25 од 0,25 0,25

19 634 (Е) 0,06 0,125 0,125 0,004 0,008 0,008

20 695 (Е) 0,05 0,1. 0,1 0,05 0,1 0,1

21 703 (Е) 0,007 0,015 0,25 0,1 0,25 0,25

Во всех изолятах, устойчивых к макролидам, была проведена

амплификация геномной ДНК с парами праймеров 2381 и 2382, 2383 и 2384. Затем была определена нуклеотидная последовательность ампликонов. Последовательность первого участка, ограниченного праймерами 2381 и 2382, не отличалась от аналогичных участков в опубликованной последовательности. При определении нуклеотидной последовательности второго участка, ограниченного праймерами 2382 и 2384, были обнаружены участки, в которых в одном положении находилось два различных основания.

Данные результаты воспроизводились при определении нуклеотидной

последовательности' по прямой и обратной цепи для двух независимо

полученных ампликонов. После проведения амплификации и определения

нуклеотидной последовательности первого гена 23SpPHK, расположенного

ближе к сайту начала репликации, были обнаружены несколько нуклеотидных

замен: Т2606 ->G, Т2611 ->С, С2617 ->Т, Т2618 -»G, T2619 -»А. При анализе

нуклеотидной последовательности второго гена 23SpPHK, не было обнаружено

никаких отличий от нуклеотидной последовательности аналогичного участка в

опубликованной последовательности C. trachomatis. После моделирования

вторичной структуры пептидилтрансферазной области 23SpPHK C.trachomatis

(с помощью программы DNAsys 3.0 for Windows) было обнаружено, что

данные мутации приводят к разрушению ряда двойных связей, формирующих

пептидилтрансферазную петлю домена V 23SpPHK (рис.3).

с • с С - в

й в ж С - G * >

*CtCOlB * >*е с * с D А 0А

_o«*C6Cuu ccü,„ciHC 2611 ь

сс i % 5 Аи С в С ü GC

2б19261826" J

„u-*a2606 с

ö < \ Л * Ii

ал с в

и * в

Ьвв.иви «•с U • в С • G

о о

Рис.3 Структура пептидилтрансферазной петли 23S рРНК С. trachomatis. Стрелками отмечены мутации, обнаруженные в устойчивых к макролидам, клинических изолятах.

Таким образом, проведенные исследования с использованием клинико-микробиологических и молекулярно-генетических методов позволили обосновать причины неуспешного лечения урогенитального хламидиоза, а

также причины возникновения антибиотикорезистентности C.trachomatis как одного из факторов данного явления. Мы считаем, что полученные данные необходимо учитывать при проведении традиционной антибактериальной терапии УГХ, особенно в случаях рецидивирующих заболеваний, а также при разработке новых антихламидийных препаратов

ВЫВОДЫ

1. При сравнении эффективности различных схем лечения урогенитального хламидиоза нижних отделов мочеполового тракта установлено, что клиническая и микробиологическая эффективность азитромицина составляет 91,8% и 85,7%, доксициклина 76,9 % и 71,2 % , офлоксацина 68,1 % и 65,9 % соответственно.

2. При первичном обращении пациента наиболее оптимальным комплексом диагностики может служить ПЦР и ИФА с определением титра антихламидийных антител (IgA, IgM и IgG), для контроля излеченности наиболее информативным методом является выделение хламидий на культуре клеток

3. Основными причинами неудач лечения при урогенитальной хламидийной инфекции являются: переход хламидий в персистирующее состояние, в котором они имеют возможность приспособиться к действию различных, отрицательных факторов (86,8 %) и наличие антибиотикорезистентности C.trachomatis к рекомендуемым антибактериальным препаратам (13,2 %).

4 Клинические изоляты C.trachomatis, выделенные от больных после неуспешного лечения и устойчивые к высоким концентрациям макролидов in vitro, имеют мутации в гене 23SpPHK, приводящие к изменению вторичной структуры пептидилтрапсферазного домена 23SpPHK. 5. Двойные мутации Val60->Ala и Hisl29->Gln, в генах мишеней фторхинолонов у клинических изолятов C. trachomatis, серотипа Е, выделенных от больных после неуспешного лечения и устойчивых к фторхинолонам in vitro, находятся за границами QRDR и могут являться

проявлениями полиморфизма гена ругЛ, что позволяет сделать вывод о наличии у хламидий альтернативных механизмов устойчивости к данным антибиотикам.

Практические рекомендации: Полученные результаты проведенного нами

исследования позволили нам разработать алгоритм ведения пациентов с

урогенитальной хламидийной инфекцией.

Алгоритм ведения пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией

— Анализ объективных и субъективных проявлений заболевания, данных полового, урологического, акушерско-гинекологического анамнеза с акцентом на перенесенные или сопутствующие заболевания урогенитальной системы и данные сексологического анамнеза;

— комплексное обследование пациента на наличие возбудителей ИППП;

— при наличии сопутствующих заболеваний урогенитальной системы привлечение смежных специалистов (урологов, гинекологов); —проведение комплекса диагностических методов, используемых для диагностики хламидийной инфекции (при первичном обращении пациента наиболее оптимальным комплексом диагностики может служить ПЦР и ИФА с определением титра антихламидийных антител (IgA, ^М и ^в), для контроля излеченности наиболее информативным методом является выделение хламидий на культуре клеток).

— проведение контроля излеченности в сроки не ранее 28 дней от момента приема последней дозы антибактериального препарата;

— клинико-микробиологическое обследование и лечение половых партнеров (с обязательной рекомендацией пациенту пользоваться барьерными методами контрацепции при половых контактах до их излечения и излечения половых партнеров);

—наиболее оптимальным препаратом (наиболее высокая клиническая эффективность, минимальное количество побочных эффектов и осложнений, а также наиболее короткие сроки лечения) для лечения неосложненной

урогенитальной хламидийной инфекции, нижних отделов мочеполового тракта является азитромицин в дозе 1,0 однократно, за 1 час до еды; — дополнительный контроль, за излечением хламидийной инфекции в сроки от 3 до 6 месяцев от момента окончания антибактериального лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. М. М. Васильев, Н. В. Николаева Хламидийная, инфекция. Проблема антибиотикорезистентности. // Вестник дерматологии и венерологии 2003. -№3.-С. 18-22.

2. Н. В. Николаева. Эффективность препаратов из группы макролидов и тетрациклинов при лечении урогенитальной хламидийной инфекции // Вестник дерматологии и венерологии 2003 - №4 -С.40-42.

3. М. М. Васильев, Н. В. Николаева, В. М. Говорун, Т. М. Парфёнова. Устойчивость C.trachomatis как один из факторов неэффективности проведённой терапии при урогенитальной хламидийной инфекции. // Инфекции, передаваемые половым путём 2003. - №1. - С.24-27.

4. М. М. Васильев, Н. В, Николаева. Значимость ПЦР-диагностики и культурального метода исследования в качестве контроля излеченности при урогенитальной хламидийной инфекции // Материалы научно-практической конференции " Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путём и хронических дерматозов", Екатеринбург 2002г, с. 42.

5. М. М, Васильев, Н. В. Николаева, В. М. Говорун и др. Случай выделения изолята С. trachomatis от больного после лечения, не связанный с устойчивостью к антибактериальным препаратам (эритромицину, доксициклину, ципробаю). // Материалы Межрегиональной научно-практической конференции "Врач и общество". Архив межрегиональной коллегии врачей. Рецензируемый научно-практический альманах. Том 1, 2002, с.80.

6. Н. В. Николаева. Значение метода выделения хламидий в культуре клеток McCoy в качестве контроля излеченности у больных с урогенитальной

хламидийной инфекцией. // Материалы научно-практической конференции, посвященная памяти профессора А. Л. Машкилейсона 1 ноября 2002 г., с 113.

7. Н. В. Николаева, М. М. Васильев, В: М. Говорун. К вопросу о резистентности C.trachomatis. II Материалы X Росийского национального конгресса "Человек и лекарство". 7-11 апреля 2003 г. с. 48.

8. Н. В. Николаева Значимость культурального метода исследования и ПЦР-диагностики при различном клиническом течении урогенитального хламидиоза. // Материалы X Российского национального конгресса "Человек илекарство'.2003г. с. 739.

9. М.М. Васильев, Н.В. Николаева Гетеротипическая резистентность как один из факторов неуспешного лечения урогенитального хламидиоза.// Материалы I Всероссийского съезда дерматовенерологов. Санкт-Петербург, II том, 2003г., с.98.

Список сокращений

A3 - азитромицин

АБП - антибактериальный препарат ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота: ДОКС - доксициклин

ИППП - инфекции, передающиеся половым путем ИФА - иммуноферментный анализ ЛФЛ - ломефлоксацин МЛ - макролиды

МФЦПВ- мелкие формы цитоплазматических включений

ОФЛ - офлоксацин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

УГХ - урогенитальный хламидиоз

ФХ - фторхинолоны

ЦФЛ -ципрофлоксацин

Эр - эритромицин

QRDR - Quinolon Reistance- Determining Region

Типография ООО «Телер» 127299 Москва ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 06.052004 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Бумага «Снегурочка» 0.5 псчл. Заказ № 315

1-8 6 70

C.trachomatis относится к патогенным для человека микроорганизмам, а уро-генитальная хламидийная инфекция - к наиболее распространенным инфекциям, передаваемым половым путем [57, 127]. На его долю приходиться примерно 50-70% всей патологии урогенитального тракта. [75, 79, 210]. Ежегодно в мире официально регистрируется около 80 млн. случаев заболеваний, вызванных C.trachomatis [64]. В США заболевания, вызванные C.trachomatis, признаны самыми распространёнными заболеваниями, передаваемыми половым путём [229]. Отмечено, что хламидии обнаруживаются у 5% здоровых людей и более чем у 20% пациентов кожно-венерологических клиник [211]. Вследствие своего широкого распространения и существенного влияния на здоровье населения урогенитальная хламидийная инфекция представляет одну из самых серьезных проблем здравоохранения [1,3,17,15,45,64,65,68,70]. Широкому распространению урогенитального хламидиоза, как отмечают многие авторы, способствуют прежде всего два фактора. Одним из них является высокая заражаемость при половых контактах, другим — бессимптомное течение инфекции [63,65]. Клинический спектр заболеваний вызываемых C.trachomatis достаточно разнообразен. У женщин это чаще всего уретрит, эндоцервицит, а также воспалительные заболевания органов малого таза, перитонит, перигепатит [43,209]. У мужчин это уретрит и сопутствующие ему осложнения (эпидидимит, орхоэпидидимит, везикулит, простатит и др.). Одним из самых грозных осложнений длительно не диагностируемой и неле-ченной урогенитальной хламидийной инфекции являются нарушения репродуктивной функции [54, 72, 107].

Особый интерес для клиницистов представляет лечение хламидийной инфекции, которое несмотря на постоянно появляющиеся новые рекомендации остается актуальной проблемой. Поскольку хламидии являются бактериями, их лечение проводится антибиотиками. Препаратами выбора для лечения урогенитально хламидийной инфекции являются тетрациклины, макролиды и некоторые фторхинолоны. Однако до настоящего времени нет единого подхода к терапии урогенитального хламидиоза, остается неоднозначной оценка клинической эффективности "новых" антибактериальных препаратов. Остается открытым вопрос об истинной способности существующих препаратов и режимов лечения действительно уничтожать хламидии [20]. Широкое использование антибиотиков приводит к появлению резистентных к ним штаммов микроорганизмов, что в свою очередь ограничивает эффективность антимикробной терапии. В литературе достаточно давно стали появляться данные об отсутствии эффекта от адекватной антибактериальной терапии [62, 74,150], все чаще появляются сообщения об обнаружении штаммов С. trachomatis устойчивых к антибактериальным препаратам рекомендуемым для лечения УХИ [206]. Возможность формирования устойчивости С.trachomatis к фторхинолонам была показана in vitro [115]. Данные, полученные при изучении механизмов устойчивости, свидетельствуют о том, что первичной мишенью действия фторхинолонов у С.trachomatis является ДНК-гираза. Селекция мутаций происходит в локусе типичном для грамот-рицательных бактерий. Первое достоверное сообщение об обнаружении штаммов С.trachomatis устойчивых к макролидным антибиотикам появилось сравнительно недавно [206]. Достаточно недавно, появились первые работы об обнаружении мутаций в гене 23SpPHK у устойчивых к макролидам клинических изолятов С. trachomatis, однако связи между антибиотикорези-стентностью и неудачами лечения установлено не было [49,80].

Что касается тетрациклинов, то необходимо отметить сообщения об обнаружении штаммов С.trachomatis устойчивых к доксициклину, а также сообщения о выделении полирезистентных штаммов, устойчивых наряду с другими антибиотиками и к доксициклину [162,206].

Возможно, что случаи устойчивости C.trachomatis к антибактериальным препаратам встречаются чаще, чем принято считать, однако не всегда проводится контроль излеченности, и поэтому такие случаи просто не регистрируются.

Таким образом, изучение проблем терапии урогенитальной хламидийной инфекции остается актуальной задачей медицинской науки и практики. Применение новых препаратов должно сопровождаться теоретическими и эпидемиологическими исследованиями: определением ингибирующих и бактерицидных концентраций, выявлением частоты встречаемости резистентных клинических изолятов и изучением молекулярных механизмов формирования резистентности клинических изолятов С. trachomatis.

Целью данной работы являлось: Изучение причин неудач лечения УГХ на основе сравнительного анализа эффективности терапии урогениального хламидиоза различными атибактериальными препаратами (группы макролидов, тетерациклинов, фторхинолонов), выявление резистентных форм хламидий и исследование молекулярных механизмов устойчивости C.trachomatis к антибактериальным препаратам.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1.Провести сравнительную оценку клинико-микробиологической эффективности наиболее распространенных схем лечения урогенитального хламидиоза.

2. Провести сравнительный анализ различных методов диагностики урогенитальной хламидийной инфекции (идентификация C.trachomatis методом ПЦР и методом выделения на культуре клеток McCoy).

3. Изучить основные причины неудач лечения урогенитального хламидиоза нижних отделов мочеполового тракта и выявить клинические изоляты C.trachomatis, устойчивые к фторхинолонам, макролидам и тетрациклинам.

4. В устойчивых к фторхинолонам клинических изолятах C.trachomatis исследовать молекулярные изменения в генах гиразы и топоизомеразы IV.

5. В устойчивых к макролидам клинических изолятах C.trachomatis исследовать молекулярные изменения в гене 23SpPHK).

Научная новизна: Впервые в клинической практике был исследованы причины неуспешного лечения УГХ, а также исследован уровень антибиотико-резистентности клинических изолятов C.trachomatis, выделенных от больных после неуспешного лечения к основным АБП, используемым в терапии УГХ, с определением МИК и изучением молекулярных механизмов данного явления.

Впервые установлено, что двойные мутации Val60->Ala и Hisl29->Gln, в генах мишеней фторхинолонов у клинических изолятов C.trachomatis генотипа Е, выделенных от больных после неуспешного лечения и устойчивых к высоким концентрациям фторхинолонов in vitro нахоящиеся за границами QRDR могут являться проявлениями полиморфизма гена gyrA, что позволяет сделать вывод о наличии у хламидий альтернативных механизмов устойчивости к данным антибиотикам.

Практическая значимость: На основе полученных данных разработан и внедрен в практику алгоритм обследования и ведения пациентов с урогени-тальной хламидийной инфекцией.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения: Основные положения работы нашли применение в практической работе в НКДО ГУ ЦНИКВИ Минздрава РФ, женском венерологическом отделении больницы № 14 имени В.Г. Короленко, в КБ № 6 ФУ "Медбиоэкстрем" МЗ РФ, что позволило повысить эффективность диагностики и этиотропной терапии урогенитального хламидиоза.

выводы

1. При сравнении эффективности различных схем лечения урогенитального хламидиоза нижних отделов мочеполового тракта установлено, что клиническая и микробиологическая эффективность азитромицина составляет 91,8% и 85,7%, доксициклина 76,9% и71,2% , офлоксацина 68,1% и 65,9% соответственно.

2. При первичном обращении пациента наиболее оптимальным комплексом диагностики может служить ПЦР и ИФА с определением титра антихламидийных антител (IgA, IgM и IgG), для контроля излеченности наиболее информативным методом является выделение хламидий на культуре клеток

3. Основными причинами неудач лечения при урогенитальной хламидийной инфекции являются: переход хламидий в персистирующее состояние, в котором они имеют возможность приспособиться к действию различных отрицательных факторов (86,8%) и наличие антибиотикорезистентности C.trachomatis к рекомендуемым антибактериальным препаратам (13,2%).

4. Клинические изоляты C.trachomatis, выделенные от больных после неуспешного лечения, устойчивые к высоким концентрациям макролидов in vitro, имеют мутации в гене 23SpPHK, приводящие к изменению вторичной структуры пептидилтрансферазного домена 23SpPHK. 5. Двойные мутации Val60->Ala и Hisl29->Gln, в генах мишеней фторхинолонов, у клинических изолятов C.trachomatis генотипа Е, выделенных от больных после неуспешного лечения и устойчивых к фторхинолонам in vitro, находяться за границами QRDR и могут являться проявлениями полиморфизма гена gyrA, что позволяет сделать вывод о наличии у хламидий альтернативных механизмов устойчивости к данным антибиотикам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты проведенного нами исследования позволили нам разработать алгоритм ведения пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией.

Алгоритм ведения пациентов с урогенитальной хламидийной инфекцией

Анализ объективных и субъективных проявлений заболевания, данных полового, урологического, акушерско-гинекологического анамнеза с акцентом на перенесенные или сопутствующие заболевания урогенитальной системы и данные сексологического анамнеза; комплексное обследование пациента на наличие возбудителей И111111; при наличии сопутствующих заболеваний урогенитальной системы привлечение смежных специалистов (урологов, гинекологов); проведение комплекса диагностических методов, используемых для диагностики хламидийной инфекции (при первичном обращении пациента наиболее оптимальным комплексом диагностики может служить ПЦР и ИФА с определением титра антихламидийных антител (IgA, IgM и IgG), для контроля излеченности наиболее информативным методом является выделение хламидий на культуре клеток). проведение контроля излеченности в сроки не ранее 28 дней от момента приема последней дозы антибактериального препарата; клинико-микробиологическое обследование и лечение половых партнеров (с обязательной рекомендацией пациенту пользоваться барьерными методами контрацепции при половых контактах до их излечения и излечения половых партнеров); наиболее оптимальным препаратом (наиболее высокая клиническая эффективность, минимальное количество побочных эффектов и осложнений, а также наиболее короткие сроки лечения) для лечения неосложненной урогенитальной хламидийной инфекции нижних отделов мочеполового тракта, является азитромицин в дозе 1,0 однократно, за 1 час до еды; дополнительный контроль за излечением хламидийной инфекции в сроки от 3 до 6 месяцев от момента окончания антибактериального лечения.