Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Регуляция тканеспецифичности экспрессии ретровирусов птиц

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 578. 826. 4. 083. 24

ГРИГОРЯН КРИНА АРКАДЬЕВНА

РЕГУЛЯЦИЯ ТКАНЕСПЕЦИЯГШОСТЯ ЭКСПРЕССИИ РЕТРОВИРУСОВ ПТИЦ

(Специальность 14.00.14. - Онкология)

-АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в лаборатория молекулярной генетики (руководитель - доктор биологических наук А.В.Гудков) Онкологического научного центра РАИН (директор - академик РАМН Н. Н. Трапезников).

Научные руководители:

доктор биологических наук доктор биологических наук

А. В. Гудков Б. □. Копнин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор медицинских наук

А. Д. АльтштеВн А. А. Ставровская

Ведущее учреждение:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится

С -иг-С

1992 Г.

на заседании специализированного Ученого совета (К. 001. 17.01} Онкологического научного центра РАИН (118478, Москва, Каширское

шоссе. 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНО РАМН.•

Автореферат разослан

■/С'

-г-

1992 Г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета доктор мед. наук, профессор

В. С. Турусов

!РтгУйЯ-Ловирусы - этиологические агенты многих заболеваний человека я животных. Последствия ретровирусной инфекция для инфицированного организма определяются не только патогенностыо а оикогвнностъю продуктов, кодируемых вирусным геноном, яо я способностью ретровирусов к экспрессии э определённых типах клеток и тканей. Иненно с тканевой специфичностью экспрессии связаны особенности патогенности вирусов рака молочной железы мышей (MMTV) и СПИДА (HIV). Тканевая специфичность кожет быть обусловлена, с одной стороны, неравномерным распространением инфекции (пто свойство детерминируется геном env ретровируса), а с другой - регулироваться на уровне транскрипции вирусных последовательностей сигналами, находящимися в длинных ко;-цевых повторах (LTR) провируса. Известно, также, что способность вируса вызывать различные неоплазии, может определяться природой LTR. Однако исчерпывающих сведений по этому вопросу нет.

Анализ биологической активности вирусов сарконно-лейкоз ного комплекса птиц (ASLV) показал, что экспрессия ASLV в инфицированном организме тканеспецифична и зависит от штамма вируса, которым проводится заражение. Сравнение распределения вирусных ДНК и РНК по органам инфицированного организма (в данной случае куриного эмбриона), говорит о том, что тканевая специфичность экспрессии вирусной РНК. по-видимому, является следствием различной эффективности транскрипции в разных тканях, а не результатом неравномерного распространения инфекции (Зайцевская, 1Э90). Эти наблюдения позволили, используя ту же экспериментальную модель - ретровжрусы группы ASLV, вплотную

подойтя к анализу регуляторных последовательностей ретровирусного генома.

Цели и задачи работы.

Целью исследования^ было выяснение роля регуляторных последовательностей ретровирусного генома в определении тканеспецяфичностя экспрессия онкогенных вирусов

саркомно-лейкозного комплекса птяц я ях патогенностя. В соответствяя с целью работы была поставлены следующие экспериментальные задачк:

1. Клоняровать LTR различных вярусов саркомно-лейкозного комплекса птяц.

2. Сконструировать рекомбянанткые инфекционные провирусы, различающиеся лишь происхождением регуляторных областей их LTR.

3. определить тканевую специфичность транскрипции рекомбинантных провирусов in viro. Здесь кы поставили перед собой задачу разработки нового метода трансфекции инфекционной ДНК in viro.

Научная новизна.

Разработана технология получения рекомбинантных вирусов саркомно-лейкозного комплекса птяц, позволяющая ка основе клонированных LTR ASLV создавать рвкомбхяантные плазмяды, способные инициировать вирусную инфекцию после трансфекцпе in viro. В экспериментах по изучению биологической активности рекомбинантных провирусов, различающихся происхождением своих LTR, выявлено, что различия в структуре U3 области LTR достаточны для изменения характера экспрессии вирусов саркомно-лейкозного комплекса птяц.

Научно-практическая ценность работы.

Разработан новый нетод трансфекции инфекционной ретровирусно* ДНК - трансфекция in viro.

Созданная коллекция клонированных охарактеризованных LTR птичьих ретровирусов может быть использована для приготовления векторов с известной тканевой специфичностью экспрессии.

Выяснение.роли регуляторкых элементов ретровирусного генома о тканевой специфичности экспрессии вирусных генов в инфицированном организме существенно для понимания молекулярных механизмов ретровирусной инфекции и канцерогенеза.

Апробация работы.

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместной Конференции лаборатории цитогенетики, молекулярной генетики, регуляции вирусных я клеточных онкогенов, генетики опухолевых клеток и молекулярной биологии вирусов НИН канцерогенеза ОНЦ РАМН.

объем и структура работа.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и библиографии. Материалы диссертации изложены на 112 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы ■ 20 рисунков. Библиография включает 140 источников отечественной и зарубежной литературы. ^

Обзор литературы.

В обзоре литературы, включающем 5 разделов освещены два основных вопроса: во-первых, анализ структуры, разнообразия и

функциональных доненов регуляторных областей провкрусного генома - LTR ASLV, и, во-вторых, роль LTR и других районов генона ASLV в определении тканевой специфичности экспрессия вирусных генов в онхогенного потенциала ретровкрусов птиц.

Материалы и методы.

Раздел материалы и методы включает описание применённых в работе молекулярно-биологических в генно-инженерных подходов: 1. Метод амплификации специфических последовательностей ДНК -нолимеразная цепная реакция - PCR.

г. Выделение и очистка нуклеиновых кислот, плазхнд.

3. Анализ нуклеиновых кислот:' рестрикционкый гидролиз ДИК, электрофорез ДНК в агарозных и полиакриланидных гелях.

4. Клонирование PCR-продуктов в плазмидных векторах.

5. Секвенирование ДНК по иетоду Сэнгера.

6 Новый метод трансфекции инфекционной ратровирусной ДНК in vivo.

7. Гистоблоттхнг - гибридизация РНК в ДНК на гистологических срезах in situ.

Приводится описание используемого биологического материала (экспериментальных животных, вирусов). Экспериментальной моделью служили куриные эмбрионы породы Бурый Леггорн, селекционированные на отсутствие в их клеточной ДНК лохусов эндогенных провирусов - ev- (Gudkov et al., 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Общая стратегия исследования.

Для выполнения поставленной экспериментальной задачи по созданию методически удобной технологии получения и анализа

рекомбинантных вирусов, ' различающихся своими регуляторныки последовательностями, ны разработали следующую схему исследования (ряс. 1).

Для получения коллекции LTR ASLV иы предполагали использовать метод амплификации специфических последовательностей ДНК поликеразную цепную реакцию - PCR. Для осуществления PCR, покико матрицы для.Тад-поликеркзы, необходимо иметь два пракмера длиной минимум 17-20 н. п. , отжигающихся возле амплифицируемой последовательности. Это взаимодействие должно быть достаточно совершенным, чтобы обеспечить эффективное начало реакции полимеризации. Образующиеся в ходе PCR двухцепочечные копии имеют на концах последовательности прайнеров. Для выбора праймеров был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей LTR, известных к началу работы. Сравнительный анализ 3' нетранслируекой области и U5 LTR различных представителей группы ASLV выявил консервативные районы, которые и. были использованы для синтеза универсальной пары прайнеров. Левый (sense) праймер включал качало первого прямого повтора LTR ASLV, тогда как правый (antisense) праймер -участок последовательности US-области. Этот участок гденткчен для всех ALV (Ju, Cullen, 1985). На концах праймеров были синтезированы сайты для рестрихтазы Cla I - ATCGAT, предназначенные для дальнейшего клонирования PCR-продуктов в векторе RC0S.

Для создания рекомбинантных конструкций инфекционных провирусов, помимо коллекции синтезированных в PCR-реакции LTR, важно было удачно выбрать плазмиду для замены LTR. В нашем распоряжении был вектор RC0S , содержащий полноразмерный геном RSV-SR-B (с делециэй src). в которой LTR SR-RSV заменены на LTR

л.

9ац fût tvw П>Т

г

л,

рик рта-

Н 1*1

ввРЛТИЛЭ "TTAHCtCTWUJld

«i* 4

■m

РИК

I ТТЛИС*ТИ1\Ц\Л*

Рис. I. Общая стратегия исследования. А - провирус ASLV; ... - консервативные зоны - источник последовательностей дл . праАмеров. dr - прямой повтор 1; РРТ - полипуриновый тракт; Б - коллекция MR ASLV; В - рекомбинант; Г - новый провирус;

Д - РНК рекомбинантного провируса - транскрипция определяется "новым" LTR.

Л

эндогенного вируса RAV-0 (Hughes et al., 1987; Greenhouse et al., 1988). Известно, что LTR RAV-0 обеспечивает крайне низкий уровень экспрессии вирусных генов, по сравнению с LTR RSV. Поэтому мы предполагали, вместо замещения правого ITR, просто "отодвинуть" его, подставив клонированный фрагнент LTR по сайту Cía I (рис. 1В), в расчёте на то, что первое поколение новых провирусов будет нести новый, более сильный экзогенный LTR, который и обеспечит преимущественное размножение вируса, даже если будет фоновая экспрессия LTR RAV-0. Подобные рассуждения основаны на знании молекулярного механизма процесса репликации ретровирусного генома. Как известно, синтез РНК ретровирусов инициируется в R-области левого LTR, а терминируется в правом LTR, перекрывая тем самым все гены (Varrnus, Swanstrora, 1982). Поэтому, при конструировании ре.чомбинанта таким образом, что экзогенный LTR вносится перед правым LTR RAV-0, после первичной транскрипции, которая определяется ещё LTR RAV-0, на концах собственно вирусных генов возникает структура, характерная для

РНК вириона - Rrav~°u5--—---------U3*R* (рис. 1В). В процессе

обратной транскрипции, осуществляемом ревертазой (образовавшейся на этапе первичной транскрипции), образуется полноценный, способный к интеграции, новый провирус, из о ласть которого по происхождению принадлежит клонированному фрагменту LTR экзогенного вируса (рис.1Г).

Для решения вопроса о роли последовательностей LTR в определении тканевой специфичности транскрипции вирусных генов и сравнения картин экспрессии различных рекомбинантов было необходимо получение инфекционных рекомбинантных ретровирусов трансфекцией in vivo. Здесь был использован "фенонен инфекционности" ДНК для куриного эмбриона и разработанный ранее

в лаборатория нолокулярной генетики метод гистоблоттинга, применимый для быстрого тестхрованяя распределения РНК по органам я тканям на гистологкческих срезах (Gudkov et al., -1989).

2. Получение коллекции LTR вирусов группы ASLV.

2.1. Синтез фрагментов LTR с пряиекеняем полинеразкай цепной

реакции - PCR.

В результате реакция PCR (в качестве матриц были взяты образцы ДНК, выделенной нз клеток куряных энбриональных фябробластов (CEF), инфицированных различными ASLV: RAV-50, RAV-l, MAV-1, MAV-2(NEF), RSV-SR-A, RSV-B77) нами были получены фрагменты ДНК разных молекулярных весов (рис.2), однако в случае позитивного контроля размер соответствовал ожидаемому для фрагмента LTR (собственно LTR плюс прямой повтор) эндогенного вируса - приблизительно 400 н.п.(Tsichlis et al., 1982). Эти данные дали основание полагать, что сянтезярованные продукты действительно являются фрагментами LTR. Однако, мы поникали, что полным доказательством правильности наших предположений может быть только определение полной нуклеотядной последователькостх полученных в ходе реакции PCR фрагментов ДИК.

Неожиданным оказалось наличие продукта длиной S7C н. п. в пробе, где в качестве матрицы была взята ДНК из клеток нехнфицярованных ev- куриных эмбрионов. Этот продукт присутствовал в большем яля меньшей количества и в других пробах. В дальнейшей отдельный анализ этого фрагмента (LTR X) привёл к характеристике нового, ранее неизвестного класса

I

• > <

s

570 400

>

и

0

ш

1

> 5

1) СИ

О Ь

Г» Ы

х г

06 и

I >

и «

г» г»

а >

и к

■ '' «Ьч»'

-г

О'-' ,,

* \~ryt- 1

I

Рис. 2. Продукты реакции PCR. Матрицы - ДНК из клеток CEF, инфицированных вирусами группы ASLV.

"Н 0й - контроль чистоты реакции ( отсутствие контанинапии); "ev*n - ДНК из клеток эмбрионов, несущих ev-З локус -

позитивный контроль; nev"n - днк из неинфицироваиных ev" куриных эмбриональных клеток - негативный контроль;

эндогенных провирусов птиц (подробно в данной работе не обсуждался).

2. 2. Клонирование и секвенхрование PCR-продуктов.

Синтезированные в PCR-реакции фрагменты LTR RAV-1, RAV-50, RSV-B77, HAV-2(NEF) препаративно выделяли из агарозного геля и после рестрикцнонного гидролиза Clal клонировали в плазниду pBlUESCRIPT. Помимо визуального скрининга рекомбинантных плазмид ( белые колонии трансформантов), нами был применена методика скрининга колоний с помощью PCR с прежней, универсальной, парой праймеров. Приготовление препарата ДНК из отдельного клона проводилось суспендированием колонии в пробирке для PCR.

Секвенирование LTR ASLV велось с использованием стандартной пары праймеров ("Universal", "Reverse") по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977). Для каждого из PCR-продуктов было секвенировано по крайней нере два независимых клона. Каждая вставка секве ировалась в обоих направлениях.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей LTR, клонированных в данной работе (LTR NEF (MAV-2), LTR RSV-B77, LTR RAV-1 и LTR RAV-50), показал почти ÎOOX гомологию с известными ранее из литературных источников. Во всех секвенированных LTR отмечены полипуриновые тракты, - A'GGGAGGGGGAAA, после которых с пары нуклеотидов TG начинаются все LTR hSLV ( Temin, 1982) ; сигнал полиаденилирования - ААТААА и следующая за нии R-область - GC........ и также последовательность ТАТТТАА (и ТАТА-Ьох").

В результате множественного выравнивания нуклеотндных последовательностей всех клонированных фрагментов LTR ASLV (рис.3) были подтверждены данные других авторов о том, что наиболее консервативными районами LTR ASLV являются R и U5. в то время как наиболее вариабельна из область, которая и определяет

ЯЕР. . . ЛТССАТСССААТССССТТСТААССССССААСССТТСАСССАССССАСТАТААСАТСТАТА КАУ50.*****************************т*****А**ТА**********Сб*****Т** £АУ1..*********************** *****д*****с***С* *****А**А********* 377. . , ***********************с**************С**С*****Т***А*****А**

б I

ПЕГ. . .ССССААААСТСССССТСТСССГТСТААСССССТТАССААСТССССТССАССТАТСССАСА !1АУ50. ********* **«**СТ******** *****С***** *********АС*А***А*Т**Т ЦАУ1..************************************************************ В77.,.******о*******Т********************************СА*С***в*С**А

ил

НЕЕ. . .ТАТССТТТТССАТАСССАСССССАААТСТАСТСТТААТСАТАСОТТААСАТСТАТАТТАС 1?АУ50. *ТС*********************************ТС** * *АСТ*'{,****СТС*ТС [{XVI. . ********************************************»Т***1,*1.**С*****

В77...*т*********************************************** * **С*****

РРТ

181

(1ЕК. . .САААТААСССААТССССГСАТАССАССАААТААССТАТТАТАТСАТССАТТССТАСССАС Е1АУ50. * **С*Т* *ТТА** **А*САТС*С*Т* *С*АС**СССТ*А** А**АСА*А*А

.. ******** ****** ***^*****ь*** **********^**т* **********

В77. ..********" ****** ************* ****т********С* ******* *

ПЕГ. . . АСССАССТСАССССАТАТСССССТТААСАСААСТСТСТСТТССТТСССТСАТТССТТССТ

Е?АУ50. ***АС*9**САТ**СС**Т**Т* . ИАУ1. .1.1.«"Т*1,***С*А*********АС^* В77...****Т** ***********Т*й*С

*** **АА*С*СС*АССА**С*С'к** * ***БТС***Т***************** *

*********А********С******** *

301

ЯЕК. . . САТСССАТСАТСТАССССССАСАСТАТСАТТССАТААСАССАТСССАССАТТСАТССТСа 1гАУ50.АТ*А*** КАУ1..******* В77,..*******

*С*ССАА*А*АС*С**С*** С**

*** ******** *****д* **с *** «**(;**** ******* **ф

****Т*С**С*АС** ***************

*******С******Т

361

ТАТА-Ьох

НЕГ.. .СССАТССТСАТТССТССАСТААССАСТТАТСТААСССАССААТСТАТТТААССТТСТАСТ

11АУ50. ****д*ТСС***Т*ССА***А***

КАУ1,, ************************

В77... *****С********Т********А

**********ТССС***С ******************

421 -+11 -» Ц5

ИЕГ. . .ТССТААСААТАААСС САТТСТАССТСТСАССАСАТТССТСТССАССТСССТТСАТСССС 11АУ50.*ССАТ**********С****ТС***АТ********************************* НА VI.,*************** ***** ****** ******************************* В77.*************** ** *********с*******************************

РА

«во

МЕР. . .ССАСССТССАТТСССТСАССАСТАССААСАССТСААТСААСТАСАТСЗАТгзо 11АУ50. *******Т*********************************с*********71 КАУ1..**************************************************,м В77...********** *** *д*** ***т**** *********************** *485

Рис.3. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ьтй абьу. ^ - места дополнительных хнсерций.

структурное разнообразие я отличия в уровне экспрессии ретровирусного генона. Как видно из рис. 3 основные различия заключаются в коротких, в зависимости от типа 1/ГЛ, инсерциях или делецхях длиной до 15 н.п. Практически полная гомология наблюдается, кроме 115 > Б, - в 3' нетранслируеной области генома АБЬV, а также в участках полипуринового тракта, сигнала полиаденилпрования я "ТАТА-Ьох".

3. Получение рехохбинананых провирусов.

Хорошо представляя структуру клонированных фрагментов ЬТЯ, кы выбрали пару ЬТЛ, для конструирования рекокбинанткых провирусов, различающихся происхождениен->своих ЬТИ. При этом кы руководствовались тем, что, как известно, район, отвечающий за разнообразие и в то же время специфику и уровень экспрессии ретровирусного генома - это из-область ЬТК в выбранной для создания рекомбинантных конструкций паре ЬТИ 1Ш7-1 - ЬТЛ ИАУ-50 именно из обх. .сть представляла собой район наиболее существенных различий. В ток случае, если эта пара ига обладает различной биологической активностью, она могла бы служить отличной модельной системой для дальнейшего анализа.

Для получения рекомбинантных плазикд фрагменты 1/пг ИАУ-1 и ЬТИ ЯАУ-50 из вектора рВБ были переклонированы в предварительно обработанный щелочной фосфатазой вектор ИСОБ. При анализе трансформантов необходимо было учитывать то обстоятельство, что формирование нового провируса, из область которого по происхождению принадлежит клонированному фрагменту ЬТЯ КАУ-1 или ЬТЯ ЛАу-50, возможно лишь при встраивании вставки (ЬТИ КАУ-1 ЬТК ИЛУ-бО) в "правильной" ориентации:

из-И-и5—дад-ро1-епу—с1г-иЗ-К-иЕ*—из-Н-и5, тогда как при клонировании равновероятна я "неправильная" ориен-

тацхя:

из -И—и5—дад-ро1—еплл—и5-К-из-<1г-из-Н-и5.

Для проверки ориентации Ш* 1*АУ-1 к 1,Тй ПАУ-50 был проведён рестрикционный гидролиз рекомбянантнных плазкид. Сайты для рестриктазы ЕсоИ1 во фрагментах ЬТЯ РАУ-1 п Ьта ЯАУ-50 расположены ассимкетрично , что давало возможность предполагать различную длину фрагментов в двух возможных случаях ориентации.

В результате проведенных исследований по отбору рекомбинантных плазнид с правильной ориентацией фрагментов ЬТН ИАУ-1 и ЬТИ ЯАУ-50, нами были получены три рекомбинантные конструкции ИСОБ/ЬТК ЯАУ-БО с правильной ориентацией вставки -ЬТЯ ИАУ-50 и две рекомбинантные конструкции КСОЗ/ЬТЛ КЛУ-1, одна из которых содержала вставку - мл НАУ-1 в обратной ориентация [ЯСОВ/ига 1?АУ-1(клон 33)]. Получение ИСОЗ/ЬТК КАУ-1(33) обеспечивало отрицательный контроль в дальнейшей работе по анализу биологической активности рекомбинантных провнрусов.

4. Анализ биологической активности реконбинантных провирусов.

4. 1. Получение инфекционных реконбинантных ретровирусов: трансфекция лп гХуо.

Проверка биологической активности реконбинантных плазмид, несуших ретровирусные последовательности, требовала проведения траасфекцяи плазмидной ДНК в куриные клетки и освобождения инфекционного вируса. "Классическая" схона эксперимента включала бы трансфекцию культуры куриных фибробластов плазмидной ДИК кальций-фосфатным или иным нетодом и использование культуральной среды, содержащей вирус, для заражения куриных энбрионов. Ны стремились избежать не всегда воспроизводимых и трудоёмких

этапов работы, связанных с трансфекцией. Для этой цели был применён новый вариант трансфекции инфекционной ретровирусной ДНК - траисфекция in viro,

Кы основывались на наблюдениях, сделанных в лаборатории Б. С. Народицкого (ИПИЕ ВЛСХНИЛ). Введение водного раствора очищенной ДНК аденовируса CELO в аллантонсную полость куриных эмбрионов приводило к появлению инфекционного вируса (GrabXo et al., 1987). Эти результаты показали принципиальную возможность успешной трансфекции in vivo. Однако, оставалось неясным, применим ли зтот подход для изучения тканеспецифичности экспрессии рекомбинантных ретровирусов, кодируемых плазмидной ДНК. а также сохраняется ли характер распространения инфекции в случае трансфекции in vivo.

Чтобы ответить на эти вопросы, мы исследовали распределение вирусной РНК по органам эмбрионов, инъецированных раствором плазмидной ДНК pATRC. pATRC несёт полный геном RSV, штамм Прага, подгруппа С. Эмбрионы, инъецированные pATRC, сравнивали с эмбрионами, инфицированными вирусом RSV-PR-C (Эайцевская, 1990). Для выявления вирусспецифической РНК брались эмбрионы 18-20 дня инкубации, заражённые pATRC на 10 день эмбрионального развития. Оказалось, что инфекция RSV распространяется и, более того, характер распределения вирусной РНК по организму эмбрионов, инфицированных pATRC, сходен с таковым в случае простой вирусной инфекции RSV-PR-C: .в обоих случаях транскрипция происходит преимущественно в печени я желудке эмбрионов.

Таким образом, проведённые эксперименты по введение плазмидной ДНК в аллантоксную полость куриного эмбриона, позволили сделать вывод о ток, что трансфекцию in vivo можно использовать для инфицирования рекомбинантныни ретровирусамя,

кодируемыми плазмидной ДНК, вместо обычно* трансфекцин хп г Иго с последующим заражением.

4. 2. Анализ тканевой специфичности экспрессии рекомбинантных вирусов.

Срезы 18-19-дневных эмбрионов, инфицированные йа 7 день инкубационного развития рекомбинантныни конструкциями КСОБ/ЬТН ИАУ-50 и ЯСОв/Ьта ЯАУ-1, были исследованы при поноиа гистоблотгибридизации с [^РЗ-рАТУЭ меченым зондон на присутствие в тканях зараженных эмбрионов вирусспецифяческой РНК. Оказалось, что транскрипция вирусных генов носит выраженный органо- и тканеспецифический характер, индивидуальный для каждого из рекомбинантов. Так, наиболее высокий уровень экспрессии в случае ИСОБ/ЬТН 11АУ-1 наблюдается в печен и селезенке, тогда как транскрипция ЕСОЗ/ЬТИ ИАУ-бО происходит преимущественно в 'желудке и слизистой оболочке различных отделов желудочно-кишечного тракта.

Кроме того, нами было проведено заражение плазмидой ИСОЭ, чтобы убедиться в Тон. что в случае выпадения экзогенного 1/ГК при интеграции рекомбинантного провируса, наблюдаемая картина экспрессии не определяется 1/ГВ ЛАУ-О. Отсутствие на гистоблоттах детектируемого сигнала подтвердило предполагаемый предельно низкий уровень транскрипционной активности ЬТН ИАУ-О (по-видимому, из-за отсутствия энхансерной области а из 1/ГР. ЯАУ-О).

Таким образом, мы показали, что созданные нами конструкции инфекционны для организма куриного эмбриона. Сравнение двух рекомбинантов, отличающихся лишь происхождением своих ЬТИ, выявило принципиальные различия в тканеспецифическом характере экспрессии вирусных генов в зависимости от происхождения их ЬТИ

Это позволяло сделать вывод о том, что различия в нуклеотидных последовательностях LTR, а точнее U3 области LTR ASLV, достаточны для модификации уровня и специфичности экспрессии ретровирусного генома. Установив этот факт, можно планировать дальнейшие эксперименты по выявлению конкретных последовательностей в LTR ретровирусов, отвечающих за проявление онкогенного потенциала а тканевую специфику транскрипции вирусных генов.

Обсуждение.

6 главе "Обсуждение" полученные экспериментальные данные рассматриваются в контексте информации, накопленной о LTR ASLV, в связи с их ролью в определении специфики экспрессии ретровжрусных генов. Обсуждается вклад различных генетических факторов в создание специфической картины транскрипции сконструированных реконбинантных провирусов. Кроне того, проводится критический анализ разработанной технологии получения рекокбинантных ASLV а метода трансфекции провирусной ДНК ASLV in rlro.

вывода

1. Методом PCR с применением пары универсальных прайкеров, соответствующих консервативный областям провирусного генома, выделены фрагменты LTR следующих вирусов саркомно-лейкозкого

комплекса птиц: RAV-1, RAV-ijO, В77, MAV-2 (NEF) • Полученные LTR

Л

ASLV клонированы, определена их нуклеотидная последовательность.

2. Разработан метод трансфекцив провирусной ДНК ASLV in vivo: прямое введение раствора плазкпдной ДИК, содержащей клонированный провирус, в аллантонсную полость куриного эмбриона ведёт к эффективному распространения ретровирусной инфекции.

3. Разработана технология получения реконбинанткых ASLV, позволяющая на основа клонированных LTR ASLV и плазмиды RCOS создавать рекомбинантные плазмиды, несущие провярусы, различающиеся 3' LTR, и способные инициировать вирусную инфекцию после трансфекции in vivo.

4. Сравнение распределения вирусных мРНК, проведённое для сконструированных рекомбинантных провирусов с LTR RAV-1 а RAV-50, показывает. что экспрессия вирусных генов носят тканеспецифичесний характер и индивидуальна для казхдогс из рекомбинантов. По-видимому, различия в структуре U3 области LTR ASLV достаточны для изменения характера экспрессии вирусов саркомно-лейкозного комплекса птиц.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертация

1. Зайцевская Т.Е., Чернов И. В. , Григорян И. А., Комарова Е. А. , Денисова Р. А., Хейнар И., Негиба И., Свобода Я., Гудков А. В. Тканевая специфичность экспрессии вирусов саркомно-лейкозного комплекса птиц. - Доклады АН СССР, 1990, т. 313, с. 983-986.

2. Zaitsevskaya Т.У., Chernov M.V., Grigorian I.A., Komarova Е.А. Heinar J., Nehyba J., Svoboda J., Gudkov A.V. Tissue-specific expression of avian sarcoma-leukosis viruses in chicken embryos. - Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1991, v.88 - in press.

3. Grigorian I.A., Naroditsky B.S., Gudkov A.V. Transfection tae infectious retrovirus DNA in viro. - Virology, 1992, submitted.

ч

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ВОНЦ АМН СССР ПОДП. К ПЕЧАТИ 2, 02 $2}-' ЗАКАЗ ТИРАЖ ¿'¿и*3-