Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка технологии мягких агаровых капсул с масляными экстрактами

На правах рукописи

Демченко Дмитрий Валентинович

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МЯГКИХ АГАРОВЫХ КАПСУЛ С МАСЛЯНЫМИ ЭКСТРАКТАМИ

14.04.01- Технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 ь Ved 2015

Санкт-Петербург 2015

005559355

Работа выполнена в ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации» Научный руководитель:

Шиков Александр Николаевич доктор фармацевтических наук Официальные оппоненты:

Лиходед Виталий Алексеевич доктор фармацевтических наук, профессор,

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, профессор кафедры фармацевтической технологии с курсом биотехнологии Абрамович Римма Александровна доктор фармацевтических наук, доцент,

ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России, заведующая кафедрой технологии получения лекарств и организации фармацевтического дела факультета повышения квалификации медицинских работников Ведущая организация: Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «31» марта 2015 года в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14) и на сайте организации, (https://sites.google.eom/a/pharminnotech.com/dissovet).

Автореферат разослан «07 » 2015 г.

Ученый секретарь

/С? У?

диссертационного совета Д 208.088.01, /Т^г!^'

кандидат фармацевтических наук, доцент ^// /Г Орлов А.С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Теория и практика производства лекарств уделяют значительное внимание разработке оптимальных лекарственных форм для новых и уже существующих и применяемых в медицине лекарственных веществ.

Среди лекарственных форм капсулы являются одними из наиболее интенсивно развивающихся направлений фармации. На сегодня препараты в форме желатиновых капсул занимают до 20% номенклатуры в странах с развитой фармацевтической промышленностью [Lewcock, 2007].

Основными факторами, ограничивающим применение желатиновых капсул, являются: подверженность желатина микробной контаминации, капсулы могут разрушаться или изменять свою форму под действием прямых солнечных лучей, при температуре более 40 °С или при влажности более 75%, а также ограничения по применению желатина в связи заболеваемостью губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота и ограничениями по применению вегетарианцами, и людьми употребляющими халяльную и кошерную пищу [Irwandi et al., 2009; Johnson et al., 2011].

Кроме того, капсулы на основе желатина без дополнительной обработки не пригодны для субстанций, разрушающихся в желудке под действием кислоты [Walsh, 2003; Mahato, 2012].

Мягкие капсулы остаются одной из немногих лекарственных форм, способных сохранять и доставлять маслорастворимые лекарства в легкодоступной для организма форме - растворе [Liu, 2008].

Для включения в лекарственную форму «мягкие капсулы» перспективными являются: масляные экстракты, рыбий жир и другие липофильные субстанции.

Современные технологии не позволяют получать качественное липофильное извлечение из рыб (рыбий жир) в нативном состоянии, без применения высокотемпературного нагревания. Кроме того, отсутствие требований по определению в рыбьем жире витаминов Е и Дз делает необходимым разработку современных методов стандартизации рыбьего жира.

В связи с этим актуальна разработка состава и технологии мягких агаровых капсул, позволяющих включать масляные экстракты (МЭ) животного и растительного

происхождения, и разработка технологии МЭ печени рыб семейства тресковых Gadidae и его стандартизация.

Степень разработанности темы исследования

Изучению структурно-механических и реологических свойств гелей и пленок на основе полимеров полисахаридной и белковой природы, а также оценке стабильности пленок, посвящены работы отечественных и зарубежных ученых Е.Д. Щукина, М.С. Gomez-Guille'n, R.J. Avena-Bustillos, S. Mali и др.

Отечественное оборудование и технология производства мягких желатиновых капсул были предложена В.Г. Макаровым с сотрудниками. За рубежом созданы капсулы с применением пуллулана, крахмала, целлюлозы и других полимеров (Vegicaps, Vcaps, Plantcaps). Однако эти капсулы являются желудочнорастворимыми.

Вопросами повышения эффективности экстракции липофильных веществ путем применения двухфазной системы экстрагентов, интенсификации с использованием пульсационных технологий уделяется большое внимание в исследованиях М.А. Балабудкина, В.А. Вайнштейна, И.Е. Кауховой, А.Н. Шикова.

Хроматографическому разделению и анализу липофильных витаминов посвящены работы А.З. Абышева, И.Г. Зенкевича, Р.И. Яхимовича, C.J.B. Blake и др.

Однако технология получения кишечнорастворимых мягких капсул на основе агар-агара, пригодных для капсулирования масляных экстрактов, а также щадящая технология экстракции печени рыб предлагаются впервые.

Все выше сказанное предопределило актуальность темы исследования, формулировку цели и последовательность решения задач.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы явилась разработка новой технологии мягких агаровых капсул, предназначенных для капсулирования масляных экстрактов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Изучить структурно-механические и реологические свойства гидрогелей и пленок на основе агар-агара, используемых для оболочки капсул;

2. Разработать состав оболочки капсул на основе полимера агар-агара и изучить его стабильность;

3. Разработать технологию, методы анализа и изучить безопасность МЭ печени рыб семейства тресковых;

4. Разработать технологию, методы стандартизации и изучить некоторые биофармацевтические свойства (in vitro) препаратов в форме мягких агаровых капсул;

5. Составить проекты нормативной документации на «Масляный экстракт печени рыб семейства тресковых (Gadidae)», биологически активную добавку к пище (БАД) «Масляный экстракт печени рыб семейства тресковых, капсулы агаровые 0,3 г» и лекарственный препарат «Масляный экстракт травы пустырника, капсулы агаровые 0,3 г» в форме мягких агаровых капсул.

Научная новизна

Впервые изучены структурно-механические и реологические свойства гидрогелей и пленок на основе агар-агара для капсулирования.

Теоретически и экспериментально обоснован состав, и технология новой лекарственной формы — мягких агаровых капсул с масляными экстрактами биологически активных веществ (БАВ) животного и растительного происхождения. Изучена стабильность агаровых пленок и прочность оболочек мягких агаровых капсул.

Впервые разработан и изучен МЭ печени рыб семейства тресковых (Gadidae■).

Впервые разработаны методы анализа витамина Е с применением флуориметрии и витамина Дз с применением тонкослойной хроматографии (ТСХ) в МЭ печени рыб семейства тресковых.

Впервые показано, что мягкие агаровые капсулы являются кишечнорастворимыми.

Теоретическая и практическая значимость

Впервые разработан состав оболочки мягких капсул на основе агар-агара, с толщиной оболочки в 4 раза тоньше и 2,5 раза стабильнее мягких желатиновых капсул.

Разработан состав мягких агаровых капсул, содержащих масляные экстракты БАВ, позволяющий высвобождать действующее вещество в кишечнике, наиболее приемлемом отделе для всасывания липофильных субстанций.

Впервые разработана технология переработки печени рыб семейства тресковых, позволяющая получать МЭ без термообработки, содержащий действующие вещества в нативном состоянии.

Проведена наработка мягких агаровых капсул, содержащих МЭ печени рыб семейства тресковых, и МЭ травы пустырника с использованием капсуляторной установки Тип МПГ-80 (Акты о наработке от 12 ноября 2012 г.).

Установлена безопасность применения МЭ печени рыб семейства тресковых.

Разработан проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на лекарственное средство в форме мягких агаровых капсул, заполненных МЭ травы пустырника. Разработана нормативная документация (НД) на производство МЭ печени рыб семейства тресковых (ТУ 9369-005-46245913-2012; ТИ 005^6245913-2012) и БАД в форме мягких агаровых капсул с МЭ печени рыб семейства тресковых (ТУ 9369-00646245913-2012; ТИ 006-46245913-2012).

Материалы по разработке технологии мягких агаровых капсул с масляными экстрактами используются в учебном процессе ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России в лекционном курсе для слушателей центра повышения квалификации специалистов, практических работников фармацевтической промышленности цикла «Основы производства твердых лекарственных форм с учетом вМР» (акт внедрения от 25.12.2014). Материалы по разработке технологии масляного экстракта печени рыб семейства тресковых используются в учебном процессе ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России в лекционном курсе и практических занятиях дисциплины «Технология лекарственных средств и биологически активных добавок природного происхождения» факультета промышленной технологии лекарств (акт внедрения от 25.12.2014).

Методология и методы исследования

Методология исследования включала оценку различных составов гелей и пленок на основе гелеобразователей растительного и животного происхождения. Для оценки качества гелей и пленок использовали тесты, характеризующие структурно-механические и реологические свойства: тест на вязкость, прочность (разрыв), текучесть (пластичность) и микроскопический анализ. Стабильность пленок и прочность капсул на основе агарового полимера оценивали в тесте по влиянию на них влажности.

Основные показатели качества печени рыб определяли по методикам ГОСТ 763685. Состав жирных кислот определяли методом ГХ-МС, содержание витамина А определяли по методу ГФ X, стр. 487; содержание витамина Е определяли флуориметрическим методом; содержание витамина Д3 определяли методом ВЭТСХ с предварительной колоночной хроматографией.

МЭ травы пустырника получали по разработанной ранее технологии с использованием лабораторной роторно-пульсационной установки. Содержание суммы иридоидов определяли спектрофотометрическим методом.

Качество мягких агаровых капсул оценивали по показателям: внешний вид, средняя масса содержимого, распадаемость. Установление сроков годности препаратов проводили при хранении в естественных условиях. Препараты в мягких агаровых капсулах получали в промышленных условиях на базе ЗАО «Фармаген».

Изучение безопасности МЭ печени рыб семейства тресковых проводили на цыплятах.

Положения, выносимые на защиту

1. Составы гидрогелей и пленок на основе агар-агара.

2. Результаты сравнительного исследования влияния природы гелеобразователей и других вспомогательных веществ на структурно-механические и реологические свойства агаровых гидрогелей и пленок.

3. Результаты изучения стабильности агаровых пленок и прочности оболочек мягких агаровых капсул.

4. Технология и методы анализы МЭ печени рыб семейства тресковых.

5. Технология мягких агаровых капсул, содержащих масляные экстракты.

6. Результаты по изучению биофармацевтических свойств мягких агаровых капсул с масляными экстрактами.

7. Методы стандартизации мягких агаровых капсул, содержащих масляные экстракты.

8. Результаты изучения безопасности МЭ печени рыб семейства тресковых.

9. Проект ФСП на лекарственное средство в форме мягких агаровых капсул, заполненное МЭ травы пустырника. НД на МЭ печени рыб семейства тресковых и НД на БАД в форме мягких агаровых капсул с МЭ печени рыб семейства тресковых.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов определяется воспроизводимостью данных, использованием современных физико-химических и математических методов исследования, большим объемом используемой информации.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 статьи в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК», 2 патента РФ и 1 заявка на патент РФ.

Материалы диссертации прошли апробацию на XIV Международном съезде "ФИТОФАРМ-2010", Санкт-Петербург, 2010 г.; Международной научно-методической

конференции, «Сандеровские чтения», Санкт-Петербург, 2012 г.; XVI Международном съезде "ФИТОФАРМ-2012", Санкт-Петербург, 2012; I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации», Санкт-Петербург, 2013; XVIII Международном съезде "ФИТОФАРМ-2014", Санкт-Петербург, 2014 г.

Результаты проведенного исследования получили следующее внедрение:

- Материалы по разработке мягких агаровых капсул используются в учебном процессе ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России в лекционном курсе для слушателей центра повышения квалификации специалистов, практических работников фармацевтической промышленности цикла «Основы производства твердых лекарственных форм с учетом GMP» СПХФА (акт внедрения от 25.12.2014).

- Материалы по разработке процесса экстрагирования печени рыб семейства тресковых используются в учебном процессе ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России в лекционном курсе и практических занятиях дисциплины «Технология лекарственных средств и биологически активных добавок природного происхождения» факультета промышленной технологии лекарств (акт внедрения от 25.12.2014).

- Наработка в производственных условиях ЗАО «Фармаген» мягких агаровых капсул, содержащих МЭ печени рыб семейства тресковых (Gadidae), и МЭ травы пустырника, сем. яснотковых (Lamiaceae) с использованием капсуляторной установки Тип Mill -80 (Акты о наработке от 12 ноября 2012 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации».

Личный вклад автора в проведенное исследование и получение научных результатов

Автор диссертационной работы самостоятельно определил план исследования, сформулировал цель и задачи, проанализировал литературу, провел лабораторные исследования и статистическую обработку полученных данных. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах исследований автора. Доля участия автора в накоплении информации более 90%, в обобщении и анализе материала — 100%.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 14.04.01 -

Технология получения лекарств, а именно пункту 1 - исследования теоретических основ фармацевтической технологии, валидации, управление рисками, перенос технологий с этапа фармацевтической разработки в серийное производство, пункту 3 - разработка технологий получения субстанции и готовых лекарственных форм, пункту 4 — исследования по изучению особенностей технологии получения готовых лекарственных форм из различных видов субстанций, сырья и вспомогательных веществ, пункту 6 -исследование биофармацевтических аспектов в технологии получения лекарственных средств их дизайн и изучение факторов, влияющих на биодоступность, пункту 7 — совершенствование системы организации производства, изготовления и контроля качества лекарственных средств.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 235 работы, в том числе 123 на иностранных языках. Работа изложена на 164 страницах, содержит 41 таблицу, 36 рисунков.

Приложение включает НД на МЭ печени рыб семейства тресковых, данные по изучению стабильности МЭ, акт о наработке МЭ печени рыб семейства тресковых, ФСП (проект) на лекарственное средство в форме мягких агаровых капсул, заполненных МЭ травы пустырника, данные по изучению стабильности лекарственного средства, НД на мягкие агаровые капсулы, содержащие МЭ печени рыб семейства тресковых, акты о наработке агаровых капсул, акты внедрения в учебный процесс.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении изложены актуальность, цель и задачи исследования, показано научная и практическая значимость работы.

Глава 1. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен рассмотрению рынка препаратов в форме капсул. Обсуждены современные технологические и биофармацевтические аспекты создания препаратов в форме капсул. Представлены преимущества капсулирования лекарственных субстанций. Проанализированы различные гелеобразователи,

позволяющие создавать гидроколлоидные структуры. Представлен обзор по вспомогательным веществам, используемым в технологии лекарственных препаратах в форме капсул. Показана перспективность разработки лекарственной формы - мягких агаровых капсул для капсулирования липофильных субстанций. Описан химический состав и фармакологические свойства некоторых видов лекарственного сырья, применяемых в составе препаратов в форме мягких капсул.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали полисахарид агар-агар, желатин пищевой марки К-13.

Сырье и вспомогательные вещества по показателям качества соответствовали требованиям ГФ XII, ФС или соответствующей НД.

Целевыми биологически активными наполнителями мягких капсул на основе агар-агара служили масляные экстракты из сырья животного и растительного происхождения. МЭ травы пустырника получали по разработанной ранее технологии с использованием роторно-пульсационной установки.

Изучение структурно-механических и реологических свойств гелей проводили с использованием ротационного вискозиметра Rheotest 2 (VEB MLW Prufgerate-Werk Medingen, Германия). Микроскопический анализ оболочек капсул проводили с помощью микроскопа Axio Scope AI, Carl Zeiss (Германия). Стабильность оценивали по влиянию влажности на прочность пленок и капсул.

Для идентификации, разделения и количественного определения основных БАВ использовали: спектрофотомерию, флуориметрию, хромато-масс-спектрометрию, колоночную хроматографию и тонкослойную хроматографию. Распадаемость капсул определяли в соответствии с требованиями ГФ XI и Eur.Ph. 7.0. Испытания на микробиологическую чистоту проводили в соответствии с ГФ XII.

Статистическую обработку результатов осуществляли согласно требованиям ГФ

XI.

Глава 3. Разработка и изучение полимерных пленок для создания мягких агаровых капсул

Анализ литературы и предварительные эксперименты показали, что альтернативным желатину и наиболее подходящим загустителем и гелеобразователем для получения мягких капсул является полисахарид - агар-агар, а вспомогательными

веществами: глицерин, сорбит, цитрат натрия, хлорид натрия и лимонная кислота. В результате предварительных экспериментов установили оптимальную концентрацию агар-агара в растворе для получения оболочки — 5 масс. %.

Для создания оптимального состава оболочки мягких капсул, изучали влияние пластификаторов (глицерина, сорбита) и модифицирующих добавок (цитрата натрия, хлорида натрия и лимонной кислоты) на динамическую вязкость агарового геля, прочность агаровых пленок и текучесть агарового геля [ОетсИепко е1 а1., 2012; Демченко и др., 2013; ОетсЬепко е1 а1., 2014].

Планирование эксперимента осуществляли методом греко-латинского квадрата.

Содержание вспомогательных веществ (в масс. %) варьировали на 4 уровнях: глицерин (X,), сорбит (Х2) - 0, 2,5, 5 и 7,5; цитрат натрия (Х3) - 0, 1, 2,5 и 5; хлорид натрия (Х4)- 0, 0,5, 1 и 2; лимонная кислота (Х5) - 0, 1, 2 и 3%.

Гели готовили при температуре растворения агар-агара 95 °С.

В результате обработки экспериментальных данных получено уравнение регрессии в натуральных единицах, описывающее зависимость вязкости геля от изученных факторов:

У= 512,4+30,6Х +27,9Х -49,ЗХ -192,ЗХ +7,IX X -22,0Х,Х +79,7Х X (Я2=0,89)

' ' 2 3 5 13 15 35

Дисперсионный анализ показал, что значимое влияние на вязкость геля оказывали содержания цитрата натрия (42,4%), лимонной кислоты (18,2%) и соотношение цитрата натрия и лимонной кислоты (28,2 %).

Полученные агаровые гели отличаются по вязкости. Чтобы сравнить и

охарактеризовать реологические свойства исследуемых составов гелей, строили кривые

текучести. Наиболее репрезентативные реограммы представлены на рис. 1.

Рисунок 1 - Реограммы тиксотропных систем

Состав 1: 2,5% глицерина, 2,5% сорбита, 2,5% цитрата натрия, 2% хлорида натрия; Состав 2: 5% глицерина, 2,5% сорбита, 5% цитрата натрия, 1 % лимонной кислоты; Состав 3: 2,5% сорбита, 1% цитрата натрия, 1% хлорида натрия, 3% лимонной кислоты;

Состав 4: 7,5% глицерина, 2,5% сорбита, 0,5% хлорида натрия, 2% лимонной кислоты.

Касательно? нлрк.ение Па-1

Гели с большим содержанием лимонной кислоты (2-3%) и небольшим количеством других вспомогательных веществ после разрушения не восстанавливались (составы: 3, 4). Составы 1,2 с содержанием цитрата натрия в пределах 2,5-5%, характеризовались низкой степенью тиксотропности и быстро восстанавливались после механического воздействия.

Увеличение содержания лимонной кислоты больше 1% существенно снижало динамическую вязкость гелей, что связано с разрушением структуры агаровых гелей в кислой среде. Внесение в состав геля цитрата натрия более 2% стабилизировало структуру геля, что связано с созданием буферной системы.

Учитывая специфику оборудования - капсуляторной установки, раствор для формирования оболочки должен обладать текучестью. Текучесть растворов различного состава оценивали после выливания гелей на стеклянную пластинку до момента потери текучести, вследствие сшивки растущих полимерных цепей, и образования студня.

На основании обработки экспериментальных данных получено следующее уравнение регрессии для текучести гелей:

У=89,6+5,4Х1-3,8Хз-0,7Х1Х2-1,8Х,Х4-0,7Х2Хз+3,51Х2Х4+1,6Х2Х5 (Я2=0,94)

Дисперсионный анализ показал, что значимое влияние на текучесть геля оказывают содержания цитрата натрия (40,6%), соотношения сорбита и хлорида натрия (23,2%), сорбита и лимонной кислоты (24,5%).

Добавление в состав гелей сорбита или хлорида натрия снижало текучесть гелей. Однако добавление в состав гелей, с содержанием сорбита 2,5-7,5%, хлорида натрия вело к повышению текучести гелей. В присутствии лимонной кислоты текучесть гелей увеличивалась. Причем в присутствии лимонной кислоты существенное увеличение текучести начиналось при увеличении концентрации сорбита более 2,5%.

Для получения стабильной лекарственной формы важна прочность оболочки капсулы. Для этого изучали предел прочности агаровых пленок (механическое напряжение, выше которого происходит разрушение материала).

В результате обработки экспериментальных данных получено следующее уравнение регрессии, описывающее зависимость прочности агаровых пленок от изученных факторов:

У=0,075Х1-0,037Х3-0,370X4-0,087Х5-0,017Х,Х3-0,047X1X4+0,084X3X5-0,116X4X5 (Я2=0,94)

Анализ уравнения показал, что значимое влияние на прочность пленок оказывали содержания глицерина (34,8%), цитрата натрия (14,7%) и соотношения глицерина и цитрата натрия (21,5%), лимонной кислоты и цитрата натрия (15,8%).

Установлено, что увеличение содержания глицерина и снижение содержания цитрата натрия увеличивает прочность пленок. Одновременное увеличение содержания цитрата натрия и глицерина снижало прочность пленок. Прочность пленок с цитратом натрия снижается при добавлении в состав лимонной кислоты.

Далее исследовали влияние пластификаторов и модифицирующих добавок на стабильность агаровых пленок при хранении. Агаровые пленки высушивали до постоянной массы 50 мг/см2. Стабильность пленок изучали при комнатной температуре и относительной влажности воздуха (RH) 33, 53 и 75%. Результаты адсорбции влаги в образцах рассчитывали с помощью математической модели, предложенной Peleg [Mali et al., 2005; Gowena et al., 2007].

Кинетика адсорбции влаги агаровыми пленками различного состава при относительной влажности воздуха (RH) 75% представлена на рис. 2.

RH 75%

Рисунок 2 - Кинетики адсорбции влаги агаровыми пленками различного состава при относительной влажности воздуха (ЯН=75%)

Составы:

1- без добавок; 2 - 5% глицерина; 3 - 4% глицерина, 1% сорбита; 4 - 2% сорбита; 5 - 2% цитрата натрия; б - 1% лимонной кислоты; 7-1% цитрата натрия, 0,5% лимонной кислоты

Время, час

Согласно данным (рис. 2) стабильность пленок увеличивалась при увеличении содержания лимонной кислоты, цитрата натрия и сорбита (составы 4, 5, 6, 7). Увеличение содержания глицерина снижало стабильность пленок (составы 2, 3).

Для оценки данных изотерм сорбции агаровых пленок различного состава использовали Guggenheim-Anderson-de Boer (GAB) модель [Mali et al., 2005]. Изотермы сорбции агаровых пленок различного состава при RH 33, 53 и 75% представлены на рис. 3.

c.s

0 t^F-j-1-,-,-,-,-r-

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Составы:

1 - без добавок;

2 - 5% глицерина;

3 - 4% глицерина, 1% сорбита;

4 - 2% сорбита;

Рисунок 3 - Изотермы сорбции агаровых пленок с пластификаторами

0.8

Относительная влажность воздуха, aw

Гигроскопичность пленок росла с увеличением концентрации глицерина (рис. 3, составы 2, 3).

По результатам изучения структурно-механических и реологических свойств агаровых гелей и пленок проводили оптимизацию состава агаровой массы для получения капсул с помощью программы Excel 5.0. (Функция «Поиск решений»).

Параметры оптимизации выбраны исходя из технологических характеристик капсулятора: динамическая вязкость 500-600 мПа*с, прочность агаровых пленок 0,1-0,2 кг/мм2, текучесть агаровых гелей 85-95 мм, адсорбция влаги менее 0,4 г/г. При обработке экспериментальных данных установили оптимальный состав: агар-агар (5,0%), глицерин (3,6%), сорбит (0,6%), цитрат натрия (1,1%), лимонная кислота (0,5%), нипагин (0,05%), вода (до 100,0%). Хлорид натрия не включили в оптимальный состав, так как его добавление не оказало значительного влияния на вязкость и прочность агаровых гелей.

Мягкие капсулы на основе желатина и агар-агара нарабатывали в промышленных условиях ЗАО «Фармаген». Сравнительный микроскопический анализ показал, что толщина оболочки мягких желатиновых капсул составила 200±21 мкм, мягких агаровых капсул - 50±4 мкм [Демченко и др., 2012]. Очевидным преимуществом агаровой оболочки является ее меньшая толщина и меньшая пористость, что позволяет прогнозировать большую стабильность агаровых капсул при хранении.

Дополнительно оценивали влияние влажности на прочность мягких капсул на основе агар-агара и желатина в течение 30 суток (720 часов), при комнатной температуре и относительной влажности воздуха (RH) 100%. Результаты адсорбции

влаги в образцах мягких желатиновых и агаровых капсул рассчитывали с помощью математической модели, предложенной Peleg [Mali et al., 2005; Gowena et al., 2007].

Скорость адсорбции влаги в образце мягких желатиновых капсул превышала скорость адсорбции влаги мягких агаровых капсул в 1,5 раза (0,0014 (г/г)/час по сравнению с 0,0009(г/г)/час). Все образцы изменили внешний вид на 4 сутки эксперимента. На 12 сутки эксперимента образцы мягких желатиновых капсул разрушились и зафиксирован рост микрофлоры. Образцы мягких агаровых капсул разрушились на 30 сутки.

Таким образом, капсулы на основе агар-агара в 2,5 раза стабильнее желатиновых капсул.

Глава 4. Разработка технологии биологически активного наполнителя для мягких агаровых капсул

В качестве субстанции животного происхождения выбрали МЭ печени рыб семейства тресковых. Технология МЭ печени рыб семейства тресковых была разработана нами впервые [Пат. 2420213, 2009].

Для извлечения липидной фракции из печени рыб семейства тресковых подбирали экстрагент, позволяющий получать МЭ без нагревания с сохранением ценных биологически активных веществ в нативном состоянии. Еще одним лимитирующим фактором для выбора экстрагента был подбор его минимального количества, достаточного для выделения липидной фракции печени трески. Тем самым сохраняются функциональные свойства конечного продукта - МЭ печени рыб семейства тресковых.

Объектами наших исследований являлись - печень трески, печень путассу, печень минтая. Масляный экстракт получали мацерацией с интенсификацией процесса с помощью перемешивания смеси сырья и экстрагента.

В результате ряда проведенных экспериментов установлено, что оптимальный экстрагент, позволяющий получить качественный продукт - смесь масло / вода в соотношении 1:1. Он позволяет выделять из ткани печени тресковых рыб водную и липидную фракции одновременно. Подбор соотношения сырье: экстрагент производили по оценке времени расслоения фракций после экстрагирования. Выбор соотношения на примере печени трески представлен на рис. 4.

Рисунок 4 - Зависимость времени расслоения фракций от соотношения сырье (печень трески): экстрагент (кукурузное масло/вода 1:1)

Примечание:

*- образование нетекучей массы; ** - образование стойкой эмульсии.

образование нетекучей массы;

1:0,1 1:0,2 1:0,3 1:0,4 1:0,5 1:0,7 1:1,0 1:2,0 Соотношение сырье: экстрагент

Оптимальное соотношение сырье: экстрагент для извлечения липидной фракции из

печени различных представителей семейства тресковых составляет 1:0,4-1:1. Для

обеспечения стабильности МЭ в качестве антиоксиданта выбрали — бутилгидрокситолуол. Данные стабильности показали, что включение в состав МЭ бутилгидрокситолуола в количестве 0,04% обеспечивает стабильность продукта в течение 1,5 лет.

На основании серии экспериментов в производственных условиях разработаны : технологические режимы и апробирована в условиях предприятия ЗАО «Фармаген» | технологическая схема производства МЭ печени рыб семейства тресковых (рис. 5).

Препараты рыбьего жира содержат витамины групп А, Е, Д и полиненасыщенные ( жирные кислоты, которые вносят существенный вклад в биологическое действие препарата.

Для стандартизации МЭ печени рыб семейства тресковых разработали и

Согласно методике витамина Е определяли методом флуориметрии при длине волны возбуждения 292 нм; длине волны испускания 305-395 нм [Демченко и др., 2010]. Валидационные параметры методики определения витамина Е представлены в таблице 1.

валидировали методики количественного определения витамина Е и Дз.

ВР.1.1. Приготовление тезинфицируюших средств

BP. 1.2. Подготовка помещений

ВР.1.3. Подготовка оборудования

ВР.1.4. Подготовка персонала

ВР.1.5. Подготовка воды

ВР.2.1. Измельчение печени рыб

ТП.2.2. Экстракция

ТП.2.3. Сепарирование

ТП.2.4. Очистка

УМО. 3.1. Фасовка липидного комплекса

УМО. 3.2. Упаковка готовой продукции

ВР.1. Вспомогательные работы

Кмкб, Кх

ТП.2. Приготовление МЭ

Кмкб.Кх Кт

УМО.З Фасовка, упаковка

Кмкб. Кх,

Кт

Готовая продукция

Рисунок 5 - Технологическая схема производства МЭ печени рыб семейства тресковых

Показатель Значение

Линейность (Linearity) и аналитическая область (Range), мкг/мл 10,00-120,00

Уравнение регрессии* У=0,0725 + 0,0040-Х

Коэффициент корреляции, г 0,99

Относительное стандартное отклонение, RSD, % 3,55

Стандартное отклонение для b (Sb) 0,0001

Стандартное отклонение для a (Sa) 0,0054

Точность (Accuracy), % 97,00- 103,00

Предел обнаружения LOD, мкг/мл 0,0210

Предел количественного определения LOQ, мкг/мл 0,0640

* X - концентрация раствора а-токоферола ацетат, мкг/мл; Y - флуоресценция.

Содержание витамина Е в пересчете на а-токоферола ацетат в МЭ печени трески составило 0,51±0,02%, в МЭ печени путассу - 0,52±0,01%.

Для определения витамина Дз МЭ предварительно очищали на колонке с окисью алюминия, затем анализировали методом ВЭТСХ. В работе использовали пластины Kieselgel 60 F 254 (Merck, Германия). Для разделения выбрали подвижную фазу хлороформ/диэтиловый эфир (9:1 по объему). Детектирование хроматограмм осуществляли в ультрафиолетовом свете при 280 нм. Обработку результатов осуществляли с использованием программы WinCats ст. 1.3.4. (Camag, Швейцария) [Demchenko et al., 2011].

Разработанную методику определения витамина Дз надлежащим образом валидировали (таб. 2).

Таблица 2 - Валндацнонные параметры методики определения витамина Д3

Показатель Величина

Линейность (Linearity) и аналитическая область (Range), нг 200,00- 1000,00

Уравнение регрессии (Y= а + Ь Х)* Y= 502,46 +8,68-Х

Коэффициент корреляции г 0,99

Относительное стандартное отклонение, RSD, % 4,57

Значение свободного члена в уравнении регрессии (а), % 502,46

Точность (Accuracy), % 85,00- 115,00

Предел обнаружения LOD, нг 30,00

Предел количественного определения LOQ, нг 200,00

* Y - площадь пика при длине волны детектирования 280 нм; X - количество витамина Дз, нг

Содержание витамина Дз в МЭ печени трески составило 35,30±1,12 МЕ/г, в МЭ печени путассу - 50,85±2,47 МЕ/г.

Другими параметрами стандартизации МЭ печени рыб семейства тресковых выбраны органолептические свойства, плотность, перекисное и кислотное числа, число омыления, массовая доля неомыляемых веществ, массовая доля влаги и примесей нежирового характера, количественное содержание полиненасыщенных жирных кислот, содержание витамина А.

Безопасность МЭ печени рыб семейства тресковых оценивали на цыплятах в возрасте 8 недель. Способ введения внутрижелудочно. Существенных изменений по данным физиологических, биохимических, патоморфологических и гистологических исследований не наблюдали в дозе до 5,5 г/кг.

В качестве модельной субстанции растительного происхождения выбрали МЭ травы пустырника. МЭ травы пустырника разработан ранее по оригинальной технологии с использованием роторно-пульсационного аппарата. Препарат «Иридол» на

основе МЭ травы пустырника в клинических испытаниях проявил себя как эффективный и безопасный препарат при лечении артериальной гипертензии [Шиков и др., 2004; БЫкоу е1 а1„ 2011].

Глава 5. Разработка технологии агаровых капсул с масляными экстрактами Подобраны технологические параметры капсулирования и разработана технологическая схема производства мягких агаровых капсул. Установили, что для получения капсул необходимо поддерживать температуру нагрева агаровой массы 80-90 °С. Температура циркулирующего масла составляет от 5 до 11 °С.

Проведенные исследования стабильности капсул на основе агар-агара показали, что оптимальная масса оболочки капсулы составляет не менее 6-7% от массы содержимого капсулы. Меньшая масса оболочки не обеспечивала стабильности капсул, приводя к их разрушению и увеличению количества брака. Установили, что для получения мягких капсул на основе агар-агара не требуется стадия выстойки в холодильном шкафу. С целью увеличения прочности оболочки капсул применяли метод дегидратации в спирте этиловом 95% в течение 3 мин. На основании серии экспериментов разработана и апробирована технологическая схема производства мягких агаровых капсул в производственных условиях ЗАО «Фармаген» (рис. 6).

Для оценки биофармацевтических свойств мягких агаровых капсул проводили тест распадаемости. Распадаемость определяли на лабораторном идентификаторе распадаемости в соответствии с требованиями ГФ XI и Еиг.РЬ. 7.0. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты теста распадаемость для мягких желатиновых и агаровых капсул_

Объекты исследования Время распадаемости, мин

Желудочно- растворимые капсулы (вода, 37 °С, не более 20 мин) Кишечнорастворимые капсулы

0,1 моль/л кислота хлористоводородная, 37 °С, не должны распадаться в течение 1 часа Фосфатный буфер, рН 6,8, 37 "С, не более 1 часа

Мягкие желатиновые капсулы 7,0±0,4

Мягкие агаровые капсулы не распадаются не распадаются 3,2±0,2

ВР.1.1. Приготовление лезинсЬиииоуюших средств

ВР.1.2. Подготовка помещений

ВР.1.3. Подготовка оборудования

ВР.1.4. Подготовка персонала

ВР.1.5. Подготовка воды

Вспомогательные работы

ТП.2.

Кмкб Кх

Приготовление массы для капсулноования

* Потери

ТП.3.1. Приготовление агаровой массы

ТП.4.1. Капсулирование

ТП.4.2. Отделение масла от капсул

ТП.4.3. Сушка капсул

ТП.4.4. Промывка капсул

ТП.4.5. Обработка агаровых капсул

ТП.4.6. Калибровка и просмотр капсул

УМО. 5.1. Фасовка капсул

УМО. 5.2. Упаковка готовой ПРОДУКЦИИ

тп.з.

Кт Кх

ТП.4.

Кмкб,Кх,Кт

Приготовление массы для оболочки

Потери

Получение капсул

Потери

•Огх(

I 5 я £

УМО.5 Фасовка, упаковка

Кмкб.Кх.Кт

Потери

I Отходы

Готовая продукция

ПО.6. Регенерация органического

растворителя

Потери

Рисунок 6 - Технологическая схема производства мягких агаровых капсул Установлено, что капсулы на основе агар-агара в отличие от мягких желатиновых капсул были устойчивы в воде и растворе хлористоводородной кислоты, и распадались в растворе фосфатного буфера через 3,2±0,2 мин.

Полученные результаты позволяют рекомендовать мягкие агаровые капсулы для капсулировання липофильных субстанций, защиты субстанций от кислой среды желудка и обеспечения высвобождения действующих веществ в наиболее предпочтительной для липофильных веществ среде - кишечнике.

По результатам проведенных исследований разработан проект ФСП на лекарственное средство МЭ травы пустырника в агаровых капсулах и проект ТУ на биологически активную добавку к пище МЭ печени рыб семейства тресковых в мягких агаровых капсулах.

В качестве параметров подлинности лекарственного средства МЭ травы пустырника выбраны: наличие в УФ-спектре пиков с шах 410±2нм и 669±2нм; наличие на ТСХ пластине не менее трех пятен иридоидов с Rf 0,2-0,8. По показателю «количественное определение» для лекарственного средства МЭ травы пустырника предложено нормирование по содержанию суммы иридоидов в пересчете на гарпагида ацетат спектрофотометрическим методом.

При изучении стабильности лекарственного препарата в условиях естественного хранения показана его стабильность в течение не менее 2,5 лет.

В качестве параметров стандартизации, разработанной БАД с МЭ печени рыб семейства тресковых, предложено использовать: органолептические показатели (внешний вид, запах, вкус), средняя масса содержимого одной капсулы, распадаемость капсул, плотность, кислотное число, перекисное число, число омыления, массовая доля неомыляемых веществ, массовая доля влаги и примесей нежирового характера, содержание полиненасыщенных жирных кислот, содержание витамина А, Е и Дз.

Количественную оценку разработанной БАД МЭ печени рыб семейства тресковых в агаровых капсулах предложено проводить по следующим показателям: содержанию полиненасыщенных жирных кислот с применением газохроматографического метода с использованием ионизационно-пламенного детектора и капиллярной колонки; содержанию витамина А спектрофотометрическим методом; содержанию витамина Е флуориметрическим методом; содержанию витамина Дз методом ТСХ.

Для стандартизации БАД по санитарно-химическим, радиологическим и микробиологическим показателям руководствовались требованиями СанПиН 2.3.2.107801 (разд. 1.10.2, 1.7.8, 1.10.5.1).

Органолептические, физико-химические, санитарно-химические, радиологические и микробиологические показатели БАД должны соответствовать требованиям ТУ 9369006-46245913-2012.

На основании результатов исследования стабильности установили, что при хранении в течение 1,5 лет (в естественных условиях) агаровые капсулы с МЭ печени рыб семейства тресковых не изменяли своих свойств и по всем показателям удовлетворяли требованиям НД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги диссертационной работы сводятся к следующим основным положениям:

1. Исследованы структурно-механические и реологические свойства гидрогелей и пленок различного состава на основе агар-агара. Установлено, что основное влияние на динамическую вязкость геля оказывает лимонная кислота и цитрат натрия, при этом внесение больше 1% лимонной кислоты существенно снижает динамическую вязкость. Одновременное внесение в состав геля сорбита и лимонной кислоты увеличивало текучесть геля. Доказана необходимость включения в состав геля 2% глицерина в качестве пластификатора, обеспечивающего достаточную прочность пленок.

2. С применением математико-статистического планирования эксперимента определены оптимальные состав и технология мягких агаровых капсул для капсулирования масляных экстрактов. Разработка состава мягких капсул на основе агар-агара позволила создать оболочку с толщиной в 4 раза тоньше и в 2,5 раза прочнее в условиях повышенной влажности (1Ш около 100%) по сравнению с оболочкой мягких желатиновых капсул.

3. Впервые разработана технология переработки печени рыб семейства тресковых, позволяющая получать МЭ без нагревания с сохранением ценных биологически активных веществ в нативном состоянии. Оптимальным экстрагентом для получения МЭ печени рыб семейства тресковых является смесь масло / вода (1:1). Оптимальным соотношением сырье: экстрагент для экстракции БАВ печени рыб семейства тресковых является 1:0,4-1:1. Установлено, что МЭ печени рыб семейства тресковых безопасен в дозе до 5,5 г/кг.

4. Разработаны и валндированы методики флуориметрического количественного анализа витамина Е и хроматографического количественного анализа витамина Д3 в МЭ печени рыб семейства тресковых.

5. Впервые разработана технология мягких агаровых капсул. В производственных условиях подобраны технологические параметры капсулирования: температура нагрева агаровой массы (80-90) °С, для увеличения прочности оболочки капсул необходима дегидратация спиртом этиловым 95% в течение 3 мин. Показано, что капсулы на основе агар-агара пригодны для капсулирования МЭ растительного и животного происхождения. Агаровые капсулы стабильны в среде искусственного желудочного сока и распадаются в растворе фосфатного буфера через 3 мин, что позволяет отнести их к кишечнорастворимым.

6. Разработаны методы стандартизации препаратов в форме мягких агаровых капсул. Разработаны проекты нормативной документации: ФСП на лекарственное средство «Масляный экстракт травы пустырника, капсулы 0,3 г», НД на масляный экстракт печени рыб семейства тресковых (СасИс1ае) и НД на БАД к пище «Масляный экстракт печени рыб семейства тресковых, капсулы 0,3 г». В условиях ЗАО «Фармаген» проведена апробация технологии мягких агаровых капсул.

7. Установлено, что МЭ травы пустырника в агаровых капсулах стабилен в течение 2,5 лет, а МЭ печени рыб семейства тресковых в агаровых капсулах - в течение 1,5 лет при хранении в естественных условиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК:

1. Демченко, Д.В. Определение витамина Е методом флуориметрии / Д.В. Демченко, О.Н. Пожарицкая, А.Н. Шиков, В.Г. Макаров // Пищевая промышленность. — 2010. — № 4. - С. 38-40.

2. Demchenko, D.V. Validated HPTLC Method for quantification of vitamin D3 in fish oil / D.V. Demchenko, O.N. Pozharitskaya, A.N. Shikov, V.G. Makarov // J. Planar Chromatogr. -2011. - V. 24, № 6. - P. 487-490.

3. Демченко, Д.В. Реологические исследования агаровых гидрогелей для создания оболочки мягких капсул / Д.В. Демченко, О.Н. Пожарицкая, А.Н. Шиков, Е.В. Флисюк, A.B. Русак, В.Г. Макаров // Хим.-Фармац. Журн. - 2013. - Т.47, №10. - С. 45-47.

4. Demchenko, D.V. Rheological study of agar hydrogels for soft capsule shells / D.V. Demchenko, O.N. Pozharitskaya, A.N. Shikov, E.V. Flisyuk, A.V. Rusak, V.G. Makarov // Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2014. - V.47, №10. - P. 556-558.

Патенты:

5. Пат. 2405542 C2 Российская Федерация МПК А61К 9/48; А61К 36/484; А61К 36/41; А61К 33/30; А61К 33/00; А61К 31/592; А61К 31/355; А61К 31/202; А61К 31/201; А61К 31/122; А61К 31/07; А61Р 43/00. Мягкая экструзионная капсула, способ приготовления раствора для её наполнения, способ получения капсул и способ увеличения плотности агаровой оболочки / О.Н. Пожарицкая, Д.В. Демченко, А.Н. Шиков, В.Г. Макаров; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество "Санкт-Петербургский институт фармации" (RU). -№ 2008145811 /15; заявл. 19.11.2008; опубл. 10.12.2010,- 13 с.

6. Пат. 2420213 Cl Российская Федерация МПК A23L 1/327; С11В 3/16; С11В 1/10. Комплексная переработка печени рыб семейства тресковых / О.Н. Пожарицкая, Д.В. Демченко, А.Н. Шиков, В.Г. Макаров; заявитель Закрытое акционерное общество "Санкт-Петербургский институт фармации" (RU), патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «Научно-Производственная Компания «ФАРМАСОФТ» (RU).-№2009142115/13; заявл. 16.11.2009; опубл. 10.06.2011,- 11 с.

7. Заявка 2014142863 Российская Федерация МПК А61К9/48; А61К47/36; A61J3/07. Мягкая капсула с кишечнорастворимой оболочкой и способ её получения / О.Н. Пожарицкая, Д.В. Демченко, А.Н. Шиков, В.Г. Макаров; заявитель Закрытое

акционерное общество «Санкт-Петербургский институт фармации» (RU). -№ 2014142863/20; заявл. 23.10.2014. - 22 с. Материалы научно-практических конференций:

8. Demchenko, D.V. Isolation and HPTLC identification of vitamin D3 from lipid complex "Adaptol" / Demchenko D.V., Pozharitskaya O.N., Shikov A.N. // 14th International Congress Phytopharm 2010. - Saint-Petersburg, 2010. - P. 27.

9. Демченко, Д.В. Мягкая нежелатиновая капсула как перспективная форма для капсулирования лекарственных субстанций / Д.В. Демченко, А.Н. Шиков, В.Г. Макаров // Сборник научных трудов международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения». - Санкт-Петербург, 2012. - С. 83-85

10. Demchenko, D.V. Agar films: effect of additives on mechanical properties / D.V. Demchenko, O.N. Pozharitskaya, A.N. Shikov // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. Материалы XVI международного конгресса Фитофарм. - 2012. - Т.10, Вып.2 - С. 46.

11. Демченко, Д.В. Биофармацевтическая оценка показателей мягких капсул на основе полимера агар-агара / Д.В. Демченко, О.Н. Пожарицкая, А.Н. Шиков, В.Г. Макаров // Сборник материалов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации». — СПб: Изд-во СПХФА, 2013.-С. 118-119.

12. Demchenko, D.V. Influence of polymer type on water sorption and on mechanical properties of soft capsules / D.V. Demchenko, O.N. Pozharitskaya, A.N. Shikov // Обзоры no клинической фармакологии и лекарственной терапии. Материалы XVIII международного конгресса Фитофарм. - 2014. - Т.12 - С. 13.

Подписано в печать 28.01.2015 Формат 60x84'Л6 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ №29/01 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)