Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка способов анализа бутоконазола нитрата в лекарственном препарате и биологических жидкостях

На гм>авах рукописи

ЛАРСКЛЯ КСЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ АНАЛИЗА БУТОКОНАЗОЛА НИТРАТА В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

ПЯТИГОРСК 20)2

005014192

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения и социального развития

Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,профессор Гаврилин Михаил Витальевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Лазарян Джон Седракович, ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой токсикологической химии

кандидат фармацевтических наук, профессор

Олешко Григорий Иванович, ГБОУ ВПО Пермская ГФА Минздравсоцразвития России, профессор кафедры фармакогнозии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

^ учреждение высшего профессионального

образования «Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита состоится //» МШ? 20/^ года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208Ж01. при ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан » 20/4гг-Ученый секретарь диссертационного совета

Компанцева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Грибковые поражения слизистой оболочки влагалища являются достаточно распространенным гинекологическим заболеванием. Несмотря на имеющийся арсенал противогрибковых препаратов число больных с этой патологиеи имеет тенденцию к росту. Поэтому поиск новых, более эффективных противогрибковых лекарственных средств ведется во многих странах.Одним из них является бутоконазола нитрат. Сведения, опубликованные в научной литературе, показывают, что бутоконазола нитрат превосходит по противогрибковой активности в отношении грибов рода Candida другие лекарственные средства. Однако в Российской Федерации препараты бутоконазола нитрата не производятся. На фармацевтическом рынке имеются два препарата зарубежного производства: Гинофорт и Гиназол (совместное производство США и Венгрии), один из которых (Гинофорт)

зарегистрирован в России.

Для производства препарата на основе бутоконазола нитрата для

„логической практики в нашей стране необходимо решение не только технологических вопросов, но и разработки надежных методов оценки качества. Полный набор критериев качества препарата помимо содержания основного вещества должен включать также оценку содержания вспомогательных веществ (консервантов), посторонних примесей, определение биодоступности, оценку специфической активности, а также сроков хранения (годности) препарата.

Известно что использование сепарационных методов анализа (хроматографические, элеюрофорешческие методы) позволяет эффективно решать вопросы стандартизации лекарственных препаратов сложной, состава. Однако возможность их применения для анализа лекарственных форм бутоконазола нитрата в России не исследована. Изучение возможности применения химических и физико-химических методов анализа позволит разработать методики контроля качества нового лекарственного препарата, содержащего бутоконазола нитрат. Это в значительной степени будет способствовать его скорейшему внедрению в медицинскую практику.

Поэтому разработка методик анализа и оптимизация уже имеющихся, а также стандартизация нового лекарственного препарата бутоконазола нитрата, крема вагинального 20 мг/г, является актуальной задачей для фармации.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является разработка аналитических методик для оценки качества лекарственного препарата на основе бутоконазола нитрата, его стандартизации, установления сроков годности, изучения фармакокинетических

параметров.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучил, возможность использования хроматографических методов для качественного и количественного анализа бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола, входящих в состав изучаемого лекарственного препарата, а также оценки степени его

чистоты.

2. Обосновать параметры пригодности системы для хроматотрафического разделения бутоконазола, нипагина и нипазола в лекарственном препарате «Бутоконазол, крем вагинальный, 20 мг/г»

3. Провести валидационную оценку предлагаемых методик контроля качества препарата по основным критериям: специфичность, линейность, прецизионность, точность, правильность, диапазон применения, робастность.

4. Определить робастность методики количественного определения бутоконазола нитрата и консервантов по изменениям показателей прецизионности и правильности в процессе руганного анализа с использованием контрольных карт Шухарта. Установить контрольные границы среднего значения открываемое™ и размахов для данной методики.

5. Изучить возможность использования капиллярного электрофореза для качественного и количественного определения бутоконазола нитрата в биологических жидкостях. Провести сравнительную оценку фармакокинетических параметров, противогрибковой активности и мукоадгезивных свойств бутоконазола нитрата, крема вагинального, 20 мг/г и препарата-прототипа «Гинофорт».

Научная новизна.

Разработана методика качественного и количественного определен] бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола в креме при совместном присутствии. Показана зависимость коэффициентов разделения пиков бутоконазола и консервантов а также коэффициентов их асимметрии от состава подвижной фазы. Разработан методика определения посторонних примесей в препарате методом ВЭЖХ Проведеннная валидационная оценка методик показала приемлемость их применен

для анализа готового продукта и его стандартизации.

Впервые для определения робастности предложенной методики анализа использованы контрольные карты Шухарта. Так же с их помощью выбран допустимый диапазон изменений состава элюента, внутри которого величины основных валидационных характеристик статистически не меняются.

Выбраны условия элеирофоретического определения бутоконазола нитрата в биологаческих жидкостях с учетом его физико-химических свойств (низкая растворимость в водной среде как основания, так и его соли). С помощью метода капиллярного электрофореза (КЭФ) проведено сравнительное исследование фармакокинетических характеристик бутоконазола нитрата, при различных путях введения. Изучены мукоадгезивные свойства предлагаемого крема в сравнении с

прототипом - Гинофортом.

Практическая зримость резуг-ктятов исследования. Доказана возможность

использования метода ВЭЖХ для параллельного количественного определения

бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола при совместном присутствии и из одной

навески, а также определения посторонних примесей в препарате.

Предложена методика анализа с использованием КЭФ бутоконазола нитрата,

которая может считаться альтернативной широко распространенному методу ВЭЖХ.

С помощью КЭФ исследована динамика накопления бутоконазола в плазме

крови крыс при шправаганальном введении исследуемого крема на его основе в

сравнении с Гинофортом, а также внутрибрюшинным введением раствора субстанции.

Проведено сравнение мукоадгезивных свойств кремов бутоконазола и

Гинофорта. Установлено, что по всем изученным параметрам предлагаемый препарат

сопоставим с Гинофортом.

Показана возможность использования контрольных карт Шухарта для оценки робастносги методик анализа как во время их разработки, так и в процессе рутинного

анализа.

Проведено изучение стабильности препарата бутоконазола. Установлено, что препарат сохраняет свою стабильность в течение трех лег при соблюдении условий

хранения.

Внедрение результатов исследования в практику. Совместно с ЗАО «Валента Фармацевтика» разработан проект ФСП на Бутоконазол, крем вагинальный, 20 мг/г, передан на регистрацию в Министерство здравоохранения и социального развития РФ.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 2008 и 2009 гг.), а также на 65-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, 2007 г.). По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в т.ч. 2 - в журналах, рекомендуемых ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 158 странице печатного текста, содержит 43 таблицы и 42 рисунка, состоит из «Введения», «Обзора литературы» и 4-х глав собственных исследований, общих выводов, а также списка литературы, включающего 142 источника, в том числе 106 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Нижеприведенные исследования проводились с использованием образцов крема, предоставленных ЗАО «Валента Фармацевтика» следующего состава (таблица 1): Таблица 1 - Состав Бутоконазола, крема вагинального, 20 мг/г

Компонент

Бутоконазола нитрат

Масло вазелиновое

Твин 80

Моноглицериды дистиллированные

ПЭ0400

ПЭО 1500

Сорбит

Мочевина

Пропиленгликоль

Нипагин

Нипазол

Вода очищенная

Масса, г

2,0

17,0

5,0

1,0

9,0

6,0

1,50

3,0

20,0

0,08

0,02

до 100,0

Выбор условий количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола при совместном присутствии

Проведенный литературный поиск показал, что значительное количество работ

как отечественных, так и зарубежных ученых посвящено исследованию фармакологической активности препарата бутоконазола, тогда как информации об

использовании аналитических методик невелико. Согласно фармакопее США (USP) количественное определение бутоконазола нитрата и консервантов (нипашна и нипазола) проводят с использованием метода ВЭЖХ в различных условиях. В обоих случаях применяется изократический режим хроматографирования и предусмотрено

использование внутреннего стандарта (таблица 2).

Таблица 2 - Условия количественного анализа бутоконазола нитрата и парабенов . ________т теп iinCil\

я препарате Гинофорт в соответствии у ^ Методика 1 Методика 2

Бутоконазола нитрат Пара 5ены

Состав ПФ: Состав ПФ:

Метанол Ацетатный буфер 0,054М, рН 4,3 65% 35% Ацетонитрил Вода 35-40% 65-60%

Детектирование УФ, 225 нм Детектирование УФ, 254 нм

Внутренний стандарт Бензимидазол Внутренний стандарт Этилпарабен пжности использова

11суаык1 лш^ы -------

метода ВЭЖХ для качественного и количественного анализа бутоконазола, нипагина и нипазола при совместном присутствии. Объектами исследования являлись растворы модельной смеси, содержащие бутоконазола нитрат, нипашн и нипазол, а также

растворы СО этих веществ.

Использование метода пробного градиента позволило провести оптимизацию

условий хроматографирования модельной смеси. Оптимальным оказался градиентный

режим элюирования анализируемого раствора: от 20 до 40% ацетонитрила за 5 минут,

затем до 70% за 10 минут. Предложенная система позволила достоверно отделить друг

от друга все пики анализируемых компонентов (рис. 1).

Рисунок 1 - Хроматограмма раствора модельной смеси нипагина, бутоконазола и нипазола

Однако, несмотря на удовлетворительные параметры разрешения хроматографической системы, неприемлемыми остались значения асимметрии пиков бутоконазола и нипагина (2,94 и 0,54, соответственно).Поэтому следующим шагом эксперимента стало улучшения показателей хроматографической системы с использованием динамических модификаторов. Нормативные документы на субстанцию бутоконазола и Гинофорт в качестве модификаторов предписывают использовать уксусную кислоту и кислоту ортофосфорную. Экспериментально установлено, что при использовании последней пик бутоконазола имеет более правильную форму, чем при применении ацетатного буферного раствора. Поэтому в качестве водного компонента подвижной фазы было решено использовать раствор

кислоты ортофосфорной.

Следующим этапом работы стало определение оптимального диапазона концентрации водной фазы элюента. Для этого хроматографировали раствор модельной смеси в режиме градиентного элюирования (от 20 до 40% ацетонитрила за 5 минут, затем до 70% за 10 минут) с использованием в подвижной фазе растворов кислоты ортофосфорной различной концентрации.

0,05 0,1 0,15

Концентрация кислоты ортофосфорной, М

■ Бутоконазол - -Нипагин

----Нипазол______

0,2

Рисунок 2 - Графики зависимости значений ЯБр пиков бутоконазола, нипапша и нипазола от концентрации кислоты ортофосфорной

0 0,05 0,1 0,15 _

Концентрация раствора кислоты ортофосфорной, М

-Бутоконазола нитрат

— -Нипагин --- - Нипазол

» Рекомендуемый диапазон значений коэффициента асимметрии

Рисунок 3 - Графики зависимости значений коэффициентов асимметрии пиков бутоконазола, нипапша и нипазола от концентрации кислоты ортофосфорной

На хроматограммах фиксировали площади пиков компонентов и коэффициенты

их асимметрии. Для площадей пиков вычисляли относительное стандартное

отклонение. На основании полученных данных строили графики зависимости

изучаемых критериев от состава ПФ (рис. 2-3). Результаты позволяют сделать вывод,

что коэффициенты асимметрии пиков для всех компонентов имеют

удовлетворительные значения при использовании кислоты ортофосфорной с

концентрацией от 0 до 0,08 М.

Относительное стандартное отклонение площадей пиков исследуемых веществ соответствует рекомендуемым требованиям при использовании кислоты с концентрацией 0,03 - 0,06 М.

В этой связи, оптимальным составом водной фазы элюента следует считать

раствор кислоты ортофосфорной с концентрацией 0,03-0,06 М.

Таким образом, при использовании градиентного режима элюирования раствора модельной смеси бутоконазола, нипагана и нипазола: от 20 до 40% ацетонитрила за 5 минут, затем до 70% за 10 минут и использовании раствора кислоты ортофосфорной с концентрацией от 0,03-0,06 М в качестве водной фазы элюента, все пики определяемых веществ на хроматограмме достоверно отделены друг от друга. Параметры пригодности хроматографической системы соответствуют рекомендуемым требованиям. Хроматограмма, полученная в описанных условиях, представлена на рис. 4.

V« и т

... ..... .... .... ....

.... ... ..... — ... .... .... ... ...

.......

- ... .... ...

.... Г ... .... ; ... .... .... ----

"ч г ~ к г «а. О 1 X ж 2 1 3 1 4 15 X б X Г I 8 X -> 2 О 2 I 3 П «...

Рисунок 4 - Хроматограмма раствора модельной смеси нипагина (1), бутоконазола (2) и нипазола (3)

Однако, несмотря на полученные результаты, затруднено достоверное количественное определение нипазола в креме. Это связано с его низким содержанием в препарате по сравнению с бутоконазолом, что приводит к значительному увеличению величины относительного стандартного отклонения площадей пиков. Вместе с тем, при повышении концентрации нипазола в растворе растет и содержание бутоконазола, что отрицательно влияет на форму его пика: коэффициент асимметрии выходит за установленные рамки 0,75-2,5. Поэтому целесообразно было провести сравнительную оценку показателей пригодности хроматографической системы для

каждого компонента на различных уровнях концентраций. Приготовленные растворы хроматографировали, определяли коэффициенты разрешения, коэффициенты асимметрии, относительные стандартные отклонения площадей пиков.

1*

*г ■

» \ —- -—- " —

«г « ...............\............................ —

-V ™ —- - —

-- - . • ^ ---ГГГп'Йш'п........ — —

с • У а.алх.

б)

Рисунок 5 - Графики зависимости параметров пригодности хроматографической ™ь, (1-асимметрия пика, 2-РазРешение, 3-К8В площадей пиков) от концентрации раствора бугоконазола (а), нипагина (б) и нипазола (в)

На основании полученных данных строили графики зависимости параметров пригодности хроматогрфической системы для каждого компонента от его

концентрации в растворе (рис. 5).

Как показано на представленных рисунках, область оптимальных аналитических

концентраций для всех компонентов при совместном присутствии, составляет интервал 1,25-2,0 мг/мл для бугоконазола, 0,05-0,08 мг/мл для нипагина и 0,01250,02 мг/мл для нипазола. Это объясняется тем ,что в этом интервале концентрации

11

параметры пригодности хроматографической системы удовлетворяют рекомендуемым

требованиям для всех компонентов.

Валидационная оценка методики количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола

Следующим этапом работы стала валидационная оценка предлагаемой методики

по основным показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность, точность (таблица 3).

Таблица 3 - Валидационные характеристики ВЭЖХ методики количественного определения компонентов крема______

Показатель Бутоконазола нитрат Нипагин Нипазол

Линейность у=7472,Зх+14,5 г=0,9999 у=28694х+57,2 1=0,9992 у=29087х+5,2 г=0,9986

Прецизионность Х=20,11 мг/г 80=0,19 ЯБ 0=0,95% X =0,81 мг/г 813=0,01 {«0=1,29% X =0,24 мг/г 80=0,008 11813=3,36 %

Точность к =99,74% БВ=0,95 11813=0,95 ДЯ=±0,81 Л =100,41% 80=1,48 Я8Б=1,48 ДЕ1=±1,27 Л =100,26 80=2,92 1180=2,91 ДЯ=±2,50

Правильность Л=100,27% 80=0,19 е=1,2% 1=0,65 К =100,00% 8Б=0,01 £=2,1% 1= 1,14 Л =100,00% 8Б=0,008 е=2,3% 1= 1,00

Диапазон применения 0,5 - 1,5 мг/мл 0,02-0,06 мг/мл 0,005 - 0,015 мг/мл

Результаты свидетельствуют о соответствии предлагаемой методики основным валидационным требованиям. Однако, наряду с достаточно подробным описанием процедур оценки большинства валидационных показателей, нет единого систематизированного подхода к исследованию робастности. Робастность подразумевает изучение стабильности результатов анализа веществ в зависимости от изменения тех или иных параметров выполнения эксперимента. Однако, наряду с параметрами, которые могут изменяться контролируемо (состав подвижной фазы, аналитическая концентрация раствора, наклон градиента и т.п.), существуют такие факторы, влияние которых на результаты анализа не поддается контролю. Это так называемые «случайные» факторы.

Поэтому изучение робастности методики заключалось в изучении влияния

«случайных» причин (температура окружающей среды, атмосферное давление, освещенность и т.п.) на результаты рутинного анализа. В основу эксперимента легла концепция контрольных карт Шухарта. Их целью является определение того, отличаются ли наблюдаемые значения размахов параллельных эксперименов и их средних значений от соответствующих стандартных значений больше, чем можно ожидать при действии только случайных причин.

Для определения робастности методики в процессе рутинного анализа выясняли стабильность показателей прецизионности и точности в зависимости от фактора «время», подразумевающего изменение таких параметров, как температура, давление, влажность, освещенность и т.п. Для выполнения эксперимента каждый день готовили по две модельные смеси с точно известным содержанием бутоконазола, нипагина и нипазола, которые анализирвали методом ВЭЖХ в условиях количественного определения.

В первую очередь для оценки стабильности методики анализировали Я - карту (карту размахов), поскольку она показывает изменчивость вариаций внутри подгрупп и позволяет оценить стабильность прецизионности методики. Для построения карты размахов были рассчитаны центральная линия и контрольные границы с использованием формул и коэффициентов, приведенных в таблицах 4-5.

Таблица 4 - Формулы расчета контрольных границ для карт Шухарта

Тип карты Центральная линия (СЬ) Контрольные границы

Я - карты ИЛИ Й?,СТ0 ись = Дст0 иСЬ = £>,сг0

X - карты Х„ или ц Х0+А-<т0 Х„-А-<Т0

Таблица 5 - Коэффициенты для вычисления линий контрольных карт

Число наблюдений в подгруппе Коэффициенты для вычисления контрольных границ

аг •О, А

2 1,128 0,000 3,686 2,121

3 1,693 0,000 4,358 1,732

Расчет проводили с использованием относительного стандартного отклонения, полученного в результате определения прецизионности методики (0,95) (табл. 6).

Таблица 6 - Контрольные границы карты размахов при оценке стабильности

показателя прецизио^

--Предел действия

Центральная линия (СЬ)

128x0,95=1,07

ОСЬ = /)2оу=0,95x3,686=3,5 ЬС1-отсутствует

меЖду значениями открываемое™ бутоконазола при анализе модельных смесей однородна в течение длительного времени.

и 5 10 15 20

Номер подгруппы

Рисунок 6 - Контрольная карта размахов содержания бутоконазола в модельной смеси,

ТГвГ"Г^бильнь* показателях прецизионности данной методики. Контрольные границы, рассчитанные для карты, являются численным выражением критериев робастности. Можно сделать заключение, что полученные результаты для двух параллельных определений будут являться достоверными, если

разница между значениями открываемое™ не превышает 3,5 %.

Для изучения изменений показателей точности строили карту средних значении,

контрольные линии которых приведены в таблице 7.

Таблица 7 - Контрольные траницы карты средних значений при оценке стабильности показателя точности

Тип карты

X -

для ~ее"построёнйя_йшолняли с^олыюванием относительного стандартного отклонения точносш, полученного в результате валидации. Параметры контрольной карты средних значений рассчитывали исходя из того что истинное содержание вещества в препарате составляет 100%.

' Эта карта (рис. 7) показывает, насколько близки полученные результаты к

14

Центральная линия (СЬ)

= 100%

Контрольные границы

ись

100+2,121 х0,95=102,01

ЬСЬ

100-2,121x0,95=97,99

истинному значению. Как видно из представленного рисунка, нежелательные изменения между подгруппами отсутствуют, так как разброс средних значений открываемое™ однороден. Ни одна из точек не выходит за пределы контрольных границ, и все они расположены равномерно относительно центральной линии, что говорит о стабильности показателя правильности. Контрольные границы, рассчитанные для данной карты, являются допустимыми границами открываемое™ методики, которые составляют интервал от 98 до 102%.

102

0 5 10 15 20 25

Номер подгруппы

Рисунок 7 - Контрольная карта средних значений открываемоеги бутоконазола в модельной смеси

Таким образом, текущие контрольные карты свидетельствуют об отсутствии значимого влияния «случайных» факторов на результаты анализа.

Аналогичная процедура определения робастности была проведена и для других анализируемых компонентов крема: нипагина и нипазола. Рассчитанные значения для построения контрольных карт приведены в таблице 8. В качестве <т0 использовалось относительное стандартное отклонение, полученное в результате определения прецизионности методики.

Таблица 8 - Контрольные границы карт средних значений и размахов при оценке

Тип карты Центральная линия (СЬ) Контрольные границы

ись ЬСХ

Нипагин

И - карта 1,1281362=1,54 3,686-1,362=5,02 Отсутствует

X - карта =100% 100+2,121-1,362=102,89 100-2,121-1362=97,11

Нипазол

И - карта 1,128-3,06=3,45 3,686-3,06=11,28 Отсутствует

X - карта =100% 100+2,121-3,06=106,49 100-2,121 -3,06=93,51

По полученным результатам строили контрольные И,- и Х- карты для контроля

15

робастности методики анализа нипагина (рисунки 8-9) и ниназола (рисунки 10-11).

5 3

X

а

г 2

п а

П- ч

15 20

Номер подгруппы

Рисунок 8 - Контрольная карта размахов открываемое™ нипагина в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

15 20 25

Номер подгруппы

Рисунок 9 - Контрольная карта средних значений открываемое™ нипашна в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

15 20

Номер подгруппы

Рисунок 10 - Контрольная карта размахов открываемое™ нипазола в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

Рисунок И - Контрольная карта средних значений открываемое™ нипазола в модельной смеси, полученных в условиях повторяемости

Из представленных данных следует, что предложенная ВЭЖХ-методика

количественного определения бутоконазола нитрата, нипагана и нипазола стабильна

(робастна) в условиях изменяющегося фактора «время».

Таким образом, предложенная методика количественного определения

бутоконазола, нипагина и нипазола является валидной по всем показателям и может

быть рекомендована к использованию в серийном анализе.

Выбор условий ВЭЖХ-анализа для определения посторонних примесей в бугоконазоле, креме вагинальном, 20 мг/г Следующим этапом работы стало изучение возможности использования метода ВЭЖХ для определения посторонних примесей в лекарственном препарате. В оригинальном препарате Гинофорт допускается содержание единичной примеси не более 0,2%, и суммарное содержание примесей не должно превышать 1% по

отношению к бутоконазола нитрату.

Выбор условий хроматографирования осуществлялся с использованием растворов субстанции бутоконазола нитрата и модельной смеси. В связи с отсутствием стандартных образцов примесей и невозможности приготовления модельных смесей с последними, бутоконазола нитрат и парабены были подвергнуты деструктированию с использованием хлористоводородной кислоты концентрированной.

Анализируемые образцы подвергали хроматографированию в условиях количественного определения. При этом было установлено, что на хроматограмме

раствора бугоконазола нитрата, подвергнутого деструкции, наблюдаются пики, совпадающие по временам удерживания с нипашном и нипазолом на хроматотрамме раствора модельной смеси. Этот факт позволяет сделать вывод о непригодности данной хроматографической системы для определения посторонних примесей.

В связи с этим была проведена работа по поиску таких условий анализа, которые позволили бы провести достоверное разделение возможных примесей в препарате в присутствии парабенов. В результате был выбран режим традиентного элюирования с использованием 0,05 М раствора кислоты ортофосфорной: от 20 до 70% ацетонитрила за 50 минут. Типичная хроматографа деструктированного бугоконазола нитрата в присутствии нипагина и нипазола показана на рисунке 12.

кМ

I

I* К. <Х 2В

г* г* »* 4*

11 }4 к 1* 4® 42 44 **

Рисунок 12 - хроматотрамма раствора смеси бугоконазола нитрата, нипапша и

рисунке, все пики предпола.емых примесей отделены друг от друга и от пиков консервантов, что позволяет использовать

полученную методику для достижения поставленных целей.

Следует отметить, что количественное определение бугоконазола с использованием данной методики затруднено, поскольку параметры пригодности хроматотрафической системы для еш пика не соответствуют рекомендуемым критериям, а именно: коэффициент асимметрии пика значительно превышает величину 2,5. Пики примесей же, содержащихся в ощутимо меньших количествах, имеют удовлетворительные значения параметров пригодности хроматотрафической

системы и могут быть проанализированы.

Проведенная валидационная оценка предлагаемой методики определения посторонних примесей показывает, что она ^ специфична, и предел обнаружения ее

составляет 2,ЗхЮ~3мг/мл. Это позволяет сделать вывод о пригодности ее для использования.

В результате анализа образцов шести серий вагинального крема бутоконазола, которые были предоставлены ЗАО «Валента Фармацевтика», было установлено, что суммарное содержание примесей не превышало 1,0% от массы бутоконазола нитрата в препарате.

Стандартизация Бутоконазола, крема вагинального, 20 мг/г

Нормы качества Бутоконазола, крема вагинального, установленные на 6 сериях с использованием разработанных методик, представлены в таблице 8. Таблица 8 - Нормы качества на препарат Бутоконазол, крем вагинальный_

Показатель Метод Требования

Описание Визуальный Масса белого цвета с желтоватым оттенком и специфическим запахом

Подлинность ВЭЖХ Времена удерживания пиков на хроматограмме раствора крема должны совпадать с таковыми на хроматограммах растворов СО: нипагина, бутоконазола нитрата, нипазола

Посторонние примеси ВЭЖХ Сумма посторонних примесей должна быть не более 1,0% по отношению к бутоконазола нитрату

Количественное содержание -Бутоконазол ВЭЖХ 90-110% от 18,0 до 22,0 мг/г

-Нипагин ВЭЖХ 90-110% от 0,72 до 0,88 мг/г

-Нипазол ВЭЖХ 90-110% от 0,18 до 0,22 мг/г

Срок годности Згода

С учетом выявленных нормативов в условиях естественного хранения изучена стабильность исследуемого препарата и установлено, что срок его годности составляет

3 года.

Исследование степени всасывания бутоконазола из различных лекарственных препаратов и изучение мукоадгезивных свойств изучаемых

кремов

Следующим этапом работы стало изучение степени всасывания бутоконазола из различных лекарственных препаратов и изучение мукоадгезивных свойств препарата «Бутоконазол, крем вагинальный, 20 мг/г» в сравнении с Гинофортом. В найденных литературных источниках отсутствует информация о методах обнаружения и изучении накопления бутоконазола нитрата в биологических жидкостях, в частности, плазме крови. В этой связи была изучена возможность использования капиллярного электрофореза для этой цели.

Объектами исследования являлись раствор бутоконазола нитрата 1 мг/мл в 0,5М фосфатном буферном растворе с 50% ацетоншрила, сыворотка крови интактного животного, прошедшая предварительную пробоподготовку, а так же модельная смесь сыворотки с нитратом бутоконазола. Анализ проводили в среде фосфатного буферного раствора с рН 3,6. Условия анализа и типичная электрофореграмма бутоконазола в сыворотке крови представлена на рисунке 13.

Рисунок 13 - Электрофореграмма модельной смеси сыворотки с бутоконазола нитратом, полученная с использованием 0,5М фосфатного буферного раствора

Из рисунка следует, что предложенная методика КЭФ позволяет достоверно

определять бутоконазола нитрат в сыворотке крови в присутствии балластных веществ

и может быть использована для изучения фармакокинентики бутоконазола нитрата.

Изучение последней проводили на кафедре биологии и физиологии

Пятигорской ГФА на самках белых крыс линии \Vistar. Животные были поделены на

три группы. Первой и второй труппам вводили ишравагинально крем бутоконазола и

Гинофорт. Третьей группе, контрольной, в эквивалентных дозах внутрибрюшинно

водили 2,0% раствор бутоконазола нитрата в диметилсульфоксиде. Кровь для анализа

отбирали после декапитадии животных через равные промежутки времени. Анализ

сыворотки проводили с использованием метода капиллярного электрофореза. В

результате эксперимента получили данные о накоплении бутоконазола в сыворотке

крови, на основании которых были построены кинетические кривые бутоконазола

нитрата при различных способах введения (таблица 9).

Таблица 9 - Величины площадей под кинетическими кривыми

--—----Пл.япптаипна ПР

Способ введения

Раствор бутоконазола, внутрибрюшинно

Гинофорт, крем, интравагинально

Бутоконазол, крем, интравагинально

Рассчитанная величина площади под кривой кинетики мкг/мл*ч

148,82

79,35

99,59

0 1 2 3 4 5

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 --ГиноФорУ — -Бутоконазол.крем -Бутоконазол^

Рисунок 14-График накопления бугоконазола нитрата в крови крыс

По полученным результатам рассчитывали площади под кривыми (таблица У), величины которых позволили сделать вывод о том, что всасывание субстанции из

крема бутоконазола сопоставимо с Гинофортом.

По сравнению с раствором субстанции, вводимом внутрибрюшинно, концентрация обнаруженного в крови бутоконазола, всосавшегося со слизистой влагалища из разработанного препарата и прототипа, значительно ниже. Это говорит о том, что препарат системным действием практически не обладает.

' Также была проведена работа по оценке времени нахождения крема бутоконазола в органе-мишени по сравнению с Гинофортом. Исследование проводили ш vivo. В качестве подопытных животных были выбраны самки беспородных морских свинок. Животным вводили шправагинально крем бутоконазола или Гинофорт. Затем на 2-6 сутки делали смывы с поверхности влагалищ животных. Полученные смывы хроматографировали в условиях количественного определения, затем рассчитывали концентрацию бутоконазола в смыве. Результаты приведены в таблице 10. Таблица 10 - Результаты определения бутоконазола нитрата в смыве из влагалищ опытных животных. Расчеты (п=6) проводились с использованием уравнения

у JX-í-ltp - Гинофорт Бутоконазол

Сутки Площади пиков Концентрация в смыве, мкг/мл Найдено во влагалище, мкг Площади пиков Концентрация в смыве, мкг/мл Найдено во влагалище, мкг

2 149,8 20,1 40,2 193,65 25,97 51,94

3 134,52 18,0 36 152,14 20,4 40,8

4 63,0 8,4 16,8 86,6 11,6 23,2

5 40,5 5,4 10,8 60,13 8,1 16,2

6 - - - -

Как следует из представленных данных, в течение 5 суток после введения двух изучаемых препаратов во влагалищах морских свинок присутствует бутоконазола нитрат в сопоставимых количествах. По истечении 6 дней бутоконазол в смыве не обнаруживали. Таким образом, мукоадгезивные свойства изучаемого препарата можно

считать сопоставимыми с таковыми для Гинофорта.

Таким образом, в результате проведенных исследований изучено хроматографическое поведение бутоконазола ншрата, нипапша и нипазола. Разработаны способы контроля качества лекарственного препарата бутоконазола в виде ваганальното крема, проведена его стандартизация, изучена стабильность, определены сроки годности. Выбраны оптимальные условия элеюрофоретического определения бутоконазола в биологических жидкостях, в частности сыворотке крови, проведено сравнительное исследование фармакокинетики, противохрибковой

активности и мукоадгезивных свойств предлагаемого препарата и прототипа - крема

Гинофорт.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1 Выбраны оптимальные условия хроматографирования для идентификации и количественного определения бутоконазола нитрата, нипагина и нипазола при "^ присутствии в вагинальном креме. Определена оптимальная ан—ская область концентраций для проведения количественного анализа

ВЭЖХ методика определения посторонних примесей, позво— достоверно разделить пики примесей (продукты деструкции бутоконазола) от

ГТГлС^ионная оценка методик количественно:, опред— и обнаружения посторонних примесей в бутоконазоле, креме финальном, 20мг/г по основным шказателям. Расчитан предел обнаружения для бутоконазола ншрата и

Гиз^Гр^Г6енноп, определения бутоконазол, нипагина и нипазола с использованием карт Шухарта. Установлено, что в условиях и"щеГОся фактора «время» показатели прецизионности и точности результатов

анализа остаются стабильными

анализа ос ^ ^ „а бутоконазола с использованием

капиллярного электрофореза. Методика может быть использована для изучения

ПгЖГ— ' НИГРаТа В СЬШ°"ства

^ыс при различных способах введения. Изучены ^¡ГТ свои т бутоконазола, крема вапшального в сравнении с Гинофортом. В результате

исследований установлено, что исследуемые объекты сопоставимы по изучаемым

7ВОИСПроведена стандартизация бугоконазола, крема вагинального, 20 мг/г согласно требованиям ОСТа 91500.05.001-00, установлены нормы его качества. Проведено исследование сроков годности бугоконазола, крема вагинального, 20 мг/г. Установлено, что крем бугоконазола остается стабильным в течение 3 лет

наблюдения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1 Использование метода капиллярного электрофореза для изучения фармакокинетики бугоконазола нтрага/С.П. Сенченко, К.С. Чеченева, М.В. Гаврилин [и др.]// Хим, фармац. журн,- 2009.- Т.43, №11.- С.7-10.

2 Ларская КС. Разработка методики определения посторонних примесеи в ' бутоконазоле, креме вагинальном, 20 мг/г методом ВЭЖХ/К.С. Ларская//

Естественные и технические науки. - 2011. -Вып. 54. - №4. - С. 291-294.

3 Сенченко СП. Поиск оптимальных условий анализа бугоконазола нитрата в ' модельной смеси методом ВЭЖХ/ СЛ. Сенченко, К.С. Чеченева, М.В. Гаврилин;

под ред М.В. Гаврилина// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Шгагорск: Пятигорская ГФА, 2008. Вып. 63. С. 331-333.

4 Изучение противокандидозной активности бугоконазола, крема вагинального 20 мг/г/ ЛИ. Карпеня, Л.С. Ушакова, М.В. Гаврилин, К.С. Чеченева; под ред М.В. Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Выл.64.- С.430-432.

5 Изучение специфической активности бугоконазола, крема вагинального 20 мг/г/ ЛИ Карпеня, Л.С. Ушакова, М.В. Гаврилин, К.С. Чеченева; под ред М.В. Гаврилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып.64, С.432-

434.

6. Ларская, К.С. Выбор условий одновременного количественного определения бугоконазола, нипагина и нипазола в креме вагинальном, 20 мг/г/К.С. Ларская // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: материалы И-Междунар. науч.-практ. конф..- Владикавказ, 2011. - 4.1. - С. 254-258. 7 Ларская К С. Использование метода ВЭЖХ для количественного определения бугоконазола нитрата в присутствии консервантов/К.С. Ларская// Аптека 2007: тез. докл. научн. конф./ 23-26 окт. 2007 г. -С. 159-160.

ЛАРСКАЯ КСЕНИЯ ( I I',' I I ВИЛ

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ АНАЛИЗА БУТОКОНАЗОЛА НИТРАТА В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Подписано к печати¿V Формат бумаги 60x84 1/16.

Бумага кннжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»(357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)