Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка краткосрочной безадъювантной модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки

На правах рукописи

Крючков Николай Александрович

Разработка краткосрочной безадъювантной модели

г

экспериментальной ^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергена пыльцы тимофеевки

14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о А ДВГ 2008

Москва, 2008

003445726

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук М.Р. Хаитов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин доктор медицинских наук, профессор Т.И. Гришина

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «¿^»Селмм^ц. 2008 г в часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208 017 01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу. 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Тел/Факс: (495) 61710-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Автореферат разослан « >> аЛг^смшХ. 2008 г

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. К настоящему времени накоплен немалый объем знаний о причинах возникновения и закономерностях развития бронхиальной астмы (БА) - одного из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний человека. Вплоть до начала 80-х годов XX века основным способом изучения этой нозочогии были исследования с участием людей [GINA, 2006, Faul JL, 1997; Roche W.R., 1998] Благодаря им, в частности, удалось выявить патогенетическое значение хронического аллергического воспаления в ткани легких и связь большей части случаев БА с гиперпродукцией IgE-антител Однако, неустранимые этические и технические ограничения, свойственные такого рода исследованиям, не позволяли ответить на многие вопросы Это обстоятельство, а также трудности в создании новых классов противоастматических лекарственных средств, стимулировали поиск подходов к воспроизведению признаков заболевания у животных Оказалось, что введение аллергенов по определенным схемам приводит к развитию так называемой экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов [Torres R, 2005] Важно подчеркнуть, что у каждого из перечисленных млекопитающих удается воспроизвести свой спектр признаков астмы, обязательными из которых являются спонтанная или индуцированная бронхиальная гиперреактивность, высокий уровень IgE-антител в крови, типичные морфологические изменения в ткани легких и изменения клеточного состава бронхоальвеолярного ла-важа Бурное развитие этого научного направления началось в середине 1990-х годов с момента первого описания модели БА на лабораторных мышах [Kung Т Т., 1994] Мышиная ЭБА отличается высоким уровнем сопоставимости с патологическими признаками заболевания человека, а сами животные хорошо доступны для изучения в связи с наличием разработанных подходов селекции, генной инженерии, молекулярной биологии, лаборатор-но-инструментальной диагностики, Помимо прочего важным оказалось и удобство работы с мышами, обусловленное относительно низкими затратами

на их содержание и питание и коротким репродуктивным циклом [Sugita М, 2003, Torres R., 2005].

Бы то показано, что разные линии мышей различаются способностью реагировать на аллергены и развивать воспаление в тканях Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что одной из наиболее реактивных является чистая линия BALB/c, в то время как, например, С57ВЬ/6-мыши сенсибилизируются и провоцируются значительно хуже [Литвин Л С , 2006]

Для получения ЭБА наиболее часто используется овальбумин (OA) -аллерген с хорошо известными структурой и свойствами. К настоящему моменту разработано несколько схем моделирования. Наиболее часто на первом этапе проводится 2-3-кратное интраперитонеальное введение аллергена через 2-4 дня в дозе по 10 мкг/мышь в комбинации с гидроксидом алюминия Последний используется в качестве адъюванта для усиления Тх2-ответа и аллергического воспаления в дыхательных путях Однако, как выяснилось, введение OA в комбинации с алюмом вызывает появление обширных лимфоци-тарно-эозинофильных инфильтратов вокруг крупных бронхов, а инъекции монопрепарата аллергена индуцируют образование воспалительных очагов преимущественно около мелких бронхов [Epstein М М., 2006] Кроме того, не предполагается влияния адекватного по мощности адъюванта в процессе «естественной» сенсибилизации человека Поэтому все больший интерес привлекают безадьювантные модели, точнее имитирующие патогенез бронхиальной астмы и, в дополнение, позволяющие изучать влияние различных им-муномодулирующих агентов на маркеры заболевания [Крючков Н.А, 2008, Литвин Л С, 2007]. Тем не менее, воспроизведение ЭБА без применения адъювантов сопряжено со значительными трудностями и необходимостью подбора доз и кратности введения аллергена, достаточных для развития аллергического ответа, но не приводящих к развитию иммунологической толерантности В нашей стране выполнена серия работ, показавших действенность 7-кратных ежедневных или повторяющихся через день внутрибрю-шинных инъекций 10 мкг/мышь овальбумина [Литвин Л.С , 2007]. Через 2-3

недели после окончания интраперитонеальных или подкожных введений проводится провокация интраназальным введением OA Повторный контакт с антигеном в условиях предрасположенности к Тх2-ответу вызывает развитие иммунного воспаления, IgE-переключение, эозинофильную инфильтрацию стенок бронхиального дерева и после многократной экспозиции приводит к бронхиальной гиперреактивности

В последние годы для модечирования БА стали использоваться причинно-значимые аллергены, в первую очередь, пыльцевые и пылевые [Крючков H А, 2008, Kryuchkov N А, 2007, Kumar R.K, 2002; Torres R, 2005], вызывающие аллергическую патологию у человека в естественных условиях Данный подход особенно актуален в связи с необходимостью разработки новых технологий и схем антиген-специфической терапии (АСИТ) и предварительного изучения ее эффективности и безопасности на доклинических этапах Принципы воспроизведения ЭБА с использованием причинно-значимых алчергенов и овальбумина аналогичны Как правило, вначале проводится системная сенсибилизация, а после ее окончания - провокация путем доставки аллергена в воздухоносные пути В качестве аллергена могут выступать экстракты пыльцы ветроопыляемых растений и домашней пыли, а также экстрагированные или рекомбинантные сенсибилизирующие компоненты Эффективные дозы препаратов и схемы их введения различаются, однако предпочтительнее использовать малые количества аллергенов в отсутствие адъю-вантов Уже получены мышиные модели с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли [Ahn J H, 2007, McKinley L, 2004], маслины [Conejero L., 2007], пыльцы амброзии [Wild J S , 2000] и березы [Daniel С , 2006] Однако перечень причинно-значимых сенсибилизирующих агентов, изученных на предмет способносш вызывать ЭБА-подобные изменения, пока чрезвычайно ограничен

Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную безадъ-ювантную модель бронхиальной астмы на лабораторных мышах линии

ВАЬВ/с с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой

Задачи исследования.

1 Разработать оптимальную схему моделирования экспериментальной бронхиальной астмы у мышей путем введения экстракта пыльцы тимофеевки в отсутствие адъюванта

2. Изучить динамику накопления аллерген-специфических гомоцитотроп-ных 1§Е-антител в крови мышей в ходе моделирования бронхиальной астмы

3. Провести оценку гистологических изменений легких мышей при моделировании БА

4 Разработать и провести первичную проверку применимости полуколичественной системы анализа гистологических изменений легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой

5 Оценить изменения относительного клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

6 Оценить изменения лейкоцитарной формулы периферической крови у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой

7 Провести пневмотахографическую оценку функции внешнего дыхания у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой

Научная новизна. Впервые в мире разработана и охарактеризована краткосрочная модель ¡^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой у мышей без использования адъюванта Полученная модель ЭБА характеризуется развитием ранней и поздней фазы аллергического ответа в дыхательных путях, повышением аллерген-специфических 1§Е-антител в периферической крови, выраженной гиперреактивностью бронхов на воздействие неспецифического бронхо-констриктора метахолина. Данные признаки адекватны патологическим из-

менениям, характерным для острого воспаления при атопической бронхиальной астме человека

Впервые предложен метод полуколичественного анализа гистологических изменений легких мышей при моделировании бронхиальной астмы

Практическая значимость. Разработанная модель БА на лабораторных мышах может использоваться для оценки эффективности и безопасности потенциальных лекарственных средств или их форм в процессе лечения и профилактики заболевания на доклиническом этапе, Особое значение имеет возможность применения данной модели для нахождения новых подходов к антиген-специфической терапии модифицированными аллергенами пыльцы тимофеевки

Предложенная модель может применяться и при изучении патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы

Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе на додипломном этапе высшего медицинского образования и в учебных программах повышения квалификации специалистов по аллергологии и иммунологии

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на VIII Российском конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня 2007 г., Москва, Россия), И Международном конгрессе «Иммунитет и болезни» (10-14 сентября 2007 г , Москва, Россия) XXVII конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (7-11 июня 2008 г, Барселона, Испания). Основные результаты диссертационной работы отражены в 6 публикациях

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 125 страницах машинописного текста Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов Диссертация иллюстрирована 11 таблицами, 26 рисунками,

включая фотографии. Список использованной литературы включает 153 источника из них 16 отечественных и 137 зарубежных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Собственные экспериментальные данные были получены с использованием самок мышей линии ВАЬВ/с весом 18-20 г, полученных из питомника ГУНЦБМТ РАМН Постановку реакции пассивной кожной анафилаксии проводили на беспородных белых крысах-самцах весом 200-280 г, полученных из питомника РОНЦ РАМН. Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом МЗиСР РФ №267 от 19 06 2003 г «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» и «Положением об этическом отношении к лабораторным животным ГНЦ Института иммунологии ФМБА России» В настоящей работе использовался лиофилизиро-ванный экстракт пыльцы тимофеевки полевой (получен и паспортизирован в лаборатории моделирования иммунологических процессов, зав - к м н А И Мартынов, контрольное определение массовой доли азота выполнено в табо-ратории микроанализа НИИ Элементорганических соединений им. А Н. Несмеянова РАН, зав - к х.н А Г Буяновская)

1.1. Схема краткосрочной модели ЭБА. Животных опытной группы (21 мышь) иммунизировали внутрибрюшинно 20 мкг/мышь экстракта пыльцы тимофеевки (из расчета по содержанию белка) в 0,5 мл физиологического раствора по схеме 7 раз через день. Через три недели после окончания интра-перитонеальных инъекций проводили 8-кратное ежедневное интраназальное введение аллергенного экстракта (вб) в дозе 500 мкг/мышь (в объеме 50 мкл) Контрольная группа (21 мышь) получала ложные иммунизацию и провокацию внутрибрюшинные и интраназальные введения физиологического раствора по вышеизложенной схеме Забор крови из ретроорбитального синуса проводили на 27 и 43 дни эксперимента Уровень анти-Об-^Е-антител в пуловых сыворотках определяли методом пассивной кожной анафилаксии. На 42-е сутки пневмотахографически определялись амплитуда и период ды-

8

хания (у 7 животных контрольной и опытной группы) На 43-й день эксперимента проводили забор БАЛ (у 7 мышей каждой группы) и легких (также у 14 животных) Схема эксперимента представлена на рис 1

Опытная группа

(Сб +/+)

13

Контрольная группа

(66 -/->

G6 20 мкг/мышь в/5

13

-гучппгу физ раствор в/б

+ *#

/ /

✓ /

27 34 I_

тттт

ч к

41 42 43

и-►

G6 500 мкг/мышь и/н

+ *#

/ / ^ / /

ч

27 34

ш

41 42 43

и-►

физ раствор и/н

* - забор крови

+ - лневмотахография

# - забор БАЛ и легких для гистологического исследования

Рисунок 1, Схема краткосрочной модели экспериментальной бронхиальной астмы на аллерген пыльцы тимофеевки

1.2. Определение awra-G6 IgE-антител. Постановку реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) проводили, руководствуясь описанной ранее методикой [Ovary Z, 1977] Результаты представляли в форме двоичного логарифма величины, обратной титру гомоцитотропных Об-специфических IgE-антител в пуловых мышиных сыворотках.

1.3. Оценка клеточного состава периферической крови. Проводили забор периферической крови из ретроорбитального синуса Каплю полученной крови наносили на предметное стекло и получали мазок по методике, описанной в руководстве [Кисели Д., 1962] После высушивания проводили фиксацию материала в метиловом спирте в течение 10-15 минут. Затем мазки окрашивали азуром и эозином по Романовскому. В полученном препарате

под увеличением светового микроскопа 10x100 подсчитывали относительное содержание лейкоцитов (лейкоцитарную формулу) на 200-300 клеток, ней-трофилов, моноцитов, лимфоцитов и эозинофилов по известным морфологическим критериям [Никитин В М, 1949].

1.4. Получение и оценка клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Под эфирным наркозом животных умерщвляли, после чего препаровальными иглами закрепляли на предметном столике брюшной поверхностью вверх Кожные покровы передней части тела мышей обрабатывали 70% этиловьм спиртом Выполняли последовательные разрезы кожи, подкожной клетчатки, поверхностных фасций от нижнегрудинной области до верхнего отдела шеи, отсепаровывали мышцы, выделяли трахею В переднюю поверхность средней трети трахеи вводили затупленную инъекционную иглу Затем через нее шприцем вводили 0,5 мл предварительно подготовленной теплой среды (RPMI 1640, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 0,2% этилендиаминтетраацетат натрия)-Шприцем отсасывали введенную в легкие жидкость, перенося ее в отдельные стерильные пробирки объемом 1,5 мл типа Eppendorf Процедуру введения и забора среды из легких повторяли дважды, получая, таким образом, 1 мл клеточной взвеси от каждой мыши

Полученный БАЛ центрифугировали при 150g в течение 15 минут Сливали надосадочную жидкость, клеточный осадок ресуспендировали и наносили на предметное стекло Готовили и окрашивали мазок по методике, использованной при получении цитологических препаратов периферической крови С помощью иммерсионной световой микроскопии (увеличение 10x100) подсчитывали процентное содержание моноцитов, лимфоцитов, ней-трофилов, эозинофилов и эпителиоцитов бронхоальвеолярного тракта на 300400 клеток мазка.

1.5. Приготовление и гистологическое исследование микропрепаратов легких. Некропсия мышей методом шейной дислокации осуществлялась под эфирным наркозом Передняя поверхность грудной клетки обрабатывалась 70% этиловым спиртом Производились последовательные разрезы

кожи, поверхностных фасций, мышц. По правой парастернальной линии хирургическими ножницами разъединялись грудино-ключичные сочленения Затем поэтапно выделялись правое и левое легкие Полученные органы помещались в 10 мл флаконы с 10% раствором формалина. После длительной фиксации в формалине ручным способом проводили обезвоживание, проводку и заливку образцов в парафин Микротомированием парафиновых блоков получали срезы легких толщиной 5-6 мкм Полученные препараты окрашивались гематоксилин-эозином и фиксировались в пихтовом масле Гистологическое исследование микропрепаратов легких мышей осуществляли на световом микроскопе при увеличении 10x15 раз Помимо качественной проводили полуколичественную оценку воспалительных изменений и ремодели-рования бронхов (по методике [Ептз Б Р., 2005], с изменениями) При этом выраженность того или иного признака оценивалась в баллах (порядковой шкале) Приготовление микропрепаратов легких лабораторных мышей и их оценка проводилась в лаборатории моделирования иммунологических процессов ГНЦ Института иммунологии ФМБА России (зав - к м.н А И. Мартынов) Фотосъемка срезов легких выполнялась в лаборатории стандартизации групп крови Гематологического научного центра РАМН (зав - проф. С И. Донсков, ст науч сотрудник - к б н И.В Дубинкин)

1.6. Оценка бронхиальной гиперреактивности. Параметры ФВД регистрировались с помощью пневмотахографической установки, предоставленной нам Отделом токсикологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (г. Москва). Принцип регистрации базировался на записи кривой дыхательных движений передней брюшной стенки мыши Животных помещали в пенал и фиксировали с помощью подвижной задней стенки для ограничения локомоторной активности После периода адаптации (30 с - 1 мин) производили серию записей пневмотахограмм при постоянной скорости движения бумаги 10 мм/с и коэффициенте усиления напряжения входного сигнала полиграфа (10 мВ/см) Регистрацию параметров функции внешнего дыхания проводили до и после введения неспецифическо-

го бронхоконстриктора метахолина в хвостовую вену мыши (через 1, 3 и 5 мин) На пневмотахограммах первично оценивались амплитуда и период дыхательных актов в эпохах записи не менее 30 с. При этом, анализу подвергался временной интервал, в течение которого амплитуда сигнала варьировала минимально (до 10%) Измеряли и рассчитывали следующие итоговые для каждого животного показатели среднюю амплитуду дыхания по многократным измерениям амплитуд волн на пневмотахограме (мм и мВ) за эпоху анализа, среднюю продолжительность дыхательных актов по многократному измерению расстояний между вершинами двух ближайших волн на пневмо-тахограмме (мм и мс), отношение средней амплитуды дыхания через 1, 3 и 5 мин после введения метахолина к средней амплитуде дыхания до введения бронхоконстриктора, принимаемого за 100% (%), отношение средней продолжительности дыхательных актов через 1, 3 и 5 мин после введения метахолина к исходному значению этого параметра до введения метахолина, принимаемого за 100% (%),

1.7. Алгоритм статистического анализа. Проводился описательный анализ количественных и порядковых данных с расчетом значений среднего арифметического (М), стандартного отклонения (SD), 95% доверительного интервала (ДИ) для среднего, медианы (Med) и интерквартильного размаха (IQR) для всех экспериментальных групп Сравнение достоверности различий количественных и порядковых признаков между группами проводилось по следующему алгоритму После проверки допущений для применения параметрического многофакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями (GLM), проводился расчет статистической значимости модели по критерию След Пилая В случае обнаружения достоверных различий при уровне альфа ошибки 0,05 проводилось межгрупповое сравнение значений признаков с использованием t-критерия Стьюдента или статистики Манна-Уитни (в зависимости от характера выборочных распределений, равенства дисперсий и других допущений) С учетом поисковой специфики исследования, поправки на множественные сравнения не проводилось Для оценки зна-

чимости различий экспериментальных групп по значениям полуколичественных шкал патоморфологических изменений легких дополнительно применялся критерий Хи-квадрат, А результаты, полученные в ПКА, также обрабатывались с учетом специального эмпирического критерия, предложенного Fox DA [Fox DA, 1976] Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программного пакета SPSS 13.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Через 14 дней после завершения фазы сенсибилизации титры анти-Ge антител в реакции ПКА не определялись и были ниже пороговых 1 4 Однако после проведения провокационных введений G6 было зафиксировано выраженное повышение концентрации специфических IgE в пуловой сыворотке крови мышей опытной группы (до величины 1 128), подтвержденное параллельной постановкой реакции ПКА на 4 крысах (соответствующие уровни антител. 7, 7, 7, 6). Для сравнения, в контрольной группе ни на 27-й, ни на 43-й день aHTH-G6-IgE не обнаруживались Многомерный двухфакторный анализ (GLM) показал достоверность модели (р<0,001, критерий След Пиллая), а последующее сравнение медианных уровней антител контрольной и опытной групп доказало высокую значимость различий (р<0,001, критерий Манна-Уитни) Динамика уровней анти-06-1§Е-антител в пуловых сыворотках крови мышей контрольной и опытной групп представлена на рис 2

Проведенный анализ относительного лейкоцитарного состава крови не выявил статистически значимых различий в содержании нейтрофилов (р=0,654), лимфоцитов (р=0,847), моноцитов (р=0,301) и эозинофилов (р=0,084), оцениваемых по непараметрическому критерию Манна-Уитни Однако обращало на себя внимание различие средних арифметических и медиан процентного содержания эозинофилов (абсолютный прирост в опытной группе - 2%, относительный прирост - более 1,5 раз), а также величина статистической значимости, незначительно превышающая установленный уровень альфа-ошибки 0,05 Эти данные могут говорить в пользу тенденции по-

вышения относительного содержания эозинофилов в периферической крови у мышей при моделировании ЭБА.

Дни »кспериментп

-епытная группа -----контральная группа

оо

Рисунок 2. Динамика уровней анти-Об-^Е-антител в пуловых сыворотках крови мышей ВАЬВ/с при моделировании экспериментальной бронхиальной астмы (показаны средние значения по данным ПКА на четырех крысах, направленными вверх стрелками отмечены дни начала и окончания внутрибрюшинных инъекций, направленные вниз стрелки указывают дни интраназальных введений аллергена; сплошные стрелки - начало процедур, пунктирные - их завершение)

У модельных мышей также регистрировались ассоциированные с ЭБА сдвиги относительного клеточного состава БАЛ Проведенный непараметрический анализ с использованием критерия Манна-Уитни показал достоверные различия относительного содержания эозинофилов и эпителиальных клеток у мышей опытной и контрольной групп Так среднее содержание эозинофилов в контрольной группе составляло 3,3% (95% ДИ 0,54,6,06), а в экспериментальной - 7,2% (95% ДИ 3,12, 11,29) Однако выборочные рас-

пределения характеризовались выраженной асимметричностью и медианы признака имели близкие значения (4 и 5% соответственно) Тем не менее, пограничная величина доверительной вероятности р=0,046 позволила сделать вывод о статистической значимости выявленных различий Также было зарегистрировано некоторое уменьшение относительного содержания эпителиальных клеток в БАЛ мышей с экспериментальной бронхиальной астмой (р=0,027) Процентное содержание нейтрофилов (р=0,302), макрофагов (р=0,714) и лимфоцитов (р=0,522) достоверно не изменялось Таким образом, увеличение относительного содержания эозинофилов может служить косвенным признаков аллергического воспаления в дыхательных путях мышей с ЭБА Результаты клеточного анализа бронхоальвеолярного лаважа, полученного от животных опытной и контрольной групп, представлены на рис 3 и 4

10,9-

Т

щ-

опытиая гоугоа контрольная група

Группа

Рисунок 3. Относительное содержание эпителиоцитов в БАЛ мышей ВАЬВ/с при моделировании ЭБА * р=0,017 (критерий Манна-Уитни).

л ад-

т

т

опышая группа

шпрсдаш група

Группа

Рисунок 4. Относительное содержание эозинофилов в БАЛ мышей ВАЬВ/с при моделировании ЭБА * р=0,046 (критерий Манна-Уитни)

Морфологический анализ легких у животных контрольной группы, получавших физиологический раствор, показал отсутствие патологических изменений. А именно, выявлялась нормальная воздушность тканей и толщина межальвеолярных стенок, отсутствие деформации бронхов и воспалительно-клеточной инфильтрации Эпителий бронхов крупного и среднего калибра обычной структуры - однослойный многорядный мерцательный, без признаков гиперплазии, метаплазии и повышенного слущивания. Эпителий терминальных бронхов и бронхиол однослойный однорядный кубический. Базаль-ная мембрана слизистой нормальной толщины. Ассоциированная с бронхами лимфоидная ткань слабо выражена, представлена преимущественно плазмо-цитами и лимфоцитами. Межальвеолярные стенки состоят из сосудистой сети, окруженной рыхлой волокнистой соединительной тканью, основными клеточными элементами которой являются фибробласты и макрофаги (рис

5). В одном из семи микропрепаратов контрольной группы обнаружено умеренное количество эозинофилов в межальвеолярной ткани.

Рисунок 5. Легкие мыши контрольной группы. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х200.

В легких мышей опытной группы обнаружены выраженные воспалительные изменения (рис. 6). Стенки бронхов среднего, мелкого калибра и бронхиол деформированы. Эпителий слизистой гиперплазирован с признаками деструкции, некробиоза и десквамации. В просвете многих мелких бронхов и бронхиол - клеточный детрит и вязкая слизь. Собственная пластинка слизистой, подслизистая основа и перибронхиальная соединительная ткань инфильтрированы гранулоцитами и агранулоцитами, значительную часть которых составляют эозинофилы, нейтрофилы и лимфоциты. В некоторых участках микропрепаратов выявляются мощные перибронхиальные и периваскулярные клеточные инфильтраты. Мелкие сосуды гиперемированы. Межальвеолярные стенки утолщены за счет наличия большого количества макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов. Описанные воспалительные изме-

нения наблюдались у всех мышей группы ЭБА. однако их выраженность варьировала, несмотря на одинаковые условия эксперимента и содержания животных. Данный факт, вероятно, обусловлен индивидуальными особенностями включенных в исследование мышей.

Рисунок 6. Легкие мыши с экспериментальной бронхиальной астмой. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х200.

Деструкция и десквамация эпителия слизистой бронха, выраженная периб-ронхиальная и периваскулярная клеточная инфильтрация, гиперемия сосудов, утолщение межальвеолярных стенок.

С целью формализовать обнаруженные патологические признаки, нами было решено проверить возможность использования шкал гистологических изменений легких, ассоциированных с ЭБА. Поскольку, всего в одном образце опытной группы были обнаружены признаки умеренной метаплазии эпителия слизистой бронхов, то различия по этому параметру между группами оказались статистически незначимыми (р=0,82, критерий Манна-Уитни; р=0,363, критерий Хи-квадрат). Также в связи с наличием в контрольной группе образцов без гиперплазии эпителия (два из семи) и малым объемом

18

выборки, не удалось подтвердить достоверность различий и по данному признаку (р=0,214, критерий Манна-Уитни; р=0,24б, критерий Хи-квадрат) Гипертрофия гладких мышц была зарегистрирована только в одном из семи микропрепаратов группы с ЭБА и ни у одного из таковых контрольной группы (р=0,28, р=0,261) Однако были установлены статистически значимые различия по содержанию эозинофилов (р=0,016, р=0,042) и нейтрофилов (р=0,016, р=0,042) в перибронхиальной и периваскулярной ткани Уровень же лимфоцитов достоверно не различался (р=0,189, р=0,321). Важно отметить, что условие применимости критерия Хи-квадрат не выполнялось (наличие ячеек таблице сопряженности с абсолютной частотой меньше 5), поэтому представленные значения р являются лишь ориентировочными Таким образом, предложенная шкала учета гистологических изменений в процессе краткосрочного моделирования бронхиальной астмы на лабораторных мышах линии ВАЬВ/с не вполне отражает обнаруживаемые качественные сдвиги, Тем не менее, очевидно, что критерии «содержание эозинофилов и нейтрофилов в перибронхиальной ткани» опросника вполне могут использоваться в предложенной форме

Одним из базовых компонентов модели БА является повышенная реактивность бронхов в ответ на специфические и неспецифические стимулы, имитирующая бронхоконстриктивную готовность у больных астмой людей Метахолин (МХ), являясь прямым агонистом М-холинорецепторов, вызывает сокращение гладкой мускулатуры бронхов, степень которого зависит от предшествующих патологических изменений в легких В ответ на внутривенное введение этого препарата ухудшается доставка воздуха в респираторный отдел дыхательных путей и компенсаторно изменяются частота дыхания, продолжительность (период) и амплитуда дыхательных актов

На следующий день после завершения интраназальных инсталляций (42-е сутки эксперимента), выполнялась пневматахографическая оценка функции внешнего дыхания у мышей контрольной и опытной групп (по 7 животных). Проводился одномерный многофакторный анализ с повторными

измерениями (процедура GLM) отдельно для относительных и абсолютных изменений продолжительности и амплитуды дыхательных актов Однако, т к. условия применимости (допущения) для данного статистического метода не выполнялись полностью, его результаты рассматривались как дополнительные Основным считалось непараметрическое сравнение по критерию Ман-на-Уитни.

До внутривенного введения метахолина животным видимых изменений локомоции, периода и амплитуды дыхания не наблюдалось. После инъекции 50 мкг/кг МХ у б из 7 мышей контрольной группы двигательная активность оставалась неизмененной, тогда как у всех животных опытной группы наблюдались заметные отклонения, а 4 из них занимали положение на боку Через минуту после внутривенной инъекции одна мышь группы ЭБА погибла Введение 200 мкг/кг МХ также вызывало более выраженные визуально обнаруживаемые изменения у животных опытной группы, причем в течение первой минуты погибла одна мышь с ЭБА, а через 5 минут - животное контрольной группы

При анализе результатов пневматахографии были обнаружены статистически значимые различия относительного периода дыхания (продолжительности дыхательных актов) Тотн. (рис 7), а именно, через 1, 3, 5 минут после введения 50 мкг/кг МХ и через 1 минуту после введения дозы 200 мкг/кг (р=0,002, р=0,063; р=0,045, р-0,032 соответственно, критерий Манна-Уитни) При этом у мышей опытной группы пиковые увеличения медианы периода дыхания наблюдались через 1 минуту после введения обеих доз препарата и достигали 194%, а животные контрольной группы демонстрировали однотипную, относительно слабую реакцию на метахолин (максимальное значение Тотн.=148,5% регистрировалось после введения второй дозы брон-хоконстриктора) Абсолютные значения продолжительности дыхательного акта Табс. демонстрировали тот же характер изменений (рис 8), а достоверные различия по критерию Манна-Уитни обнаруживались уже на всех временных точках после введения обеих доз МХ (р=0,002; р=0,022, р=0,017;

р=0,005, р=0,028, р=0,025) Исходные уровни параметра в контрольной и опытной группах не различались (р=0,205)

220,00200,00180, йШ-

л

| 1бС,00-Н

140,00120,00-1опло-

-1-1-П-1-1-1-

ЗОш-УкгМХ, 50жокгМХ, 50 мпЛсг МХ, гОСшЛхМХ, 200мго'юМХ, 200щЛгМх; через * мж. через Зщн чврез5иав через 1 мил через З.лнн черезЗиин

Дом мета, олнна (мкг) и время после шсдекин (мин)

опытная "рулла -—«онтрольна? труппа

Рисунок 7. Изменения средней продолжительности дыхательных актов у мышей контрольной и опытной групп после введения метахолина (МХ) относительно исходных значений до введения МХ (Т отн., %). * р<0,05 (критерий Манна-Уитни, межгрупповое сравнение)

* *

и й

200-

I I I 1 | 1 1

Домедвки ЗОжг/кгЩ; Ямг/кгМХ, ЯнвйгЩ; 300йкс^г(Ш^ КОшпЫШС, ЗКГшАгЬК,

ВД! Змяв 1шт 3 мин Змии

Доза метахолина (мкг) и время после введения (дан)

-епшнад группа -- —вдграпшая группа

Рисунок 8. Изменения средней продолжительности дыхательных актов у мышей контрольной и опытной групп после введения метахолина (МХ) (Т абс., мс)

* р<0,05 (критерий Манна-Уитни, межгрупповое сравнение)

Средняя амплитуда дыхания после введения бронхоконстриктора снижалась в обеих группах (рис. 9,10) Однако степень изменения этого показателя в группе ЭБА была более выраженной Статистически значимые различия относительной амплитуды Аотн. регистрировались через 1 и 5 минут после введения 200 мкг/кг МХ (р=0,063, р=0,004 соответственно). Медианные значения абсолютной амплитуды дыхания Аабс у мышей контрольной и опытной групп достоверно различались через 5 минут после введения первой дозы препарата (р=0,043) и через 1,3,5 минут после инъекции второй дозы (р=0,026; р=0,041; р=0,004 соответственно) Отметим, что как относительная, так и абсолютная амплитуда дыхания значительно варьировала у мышей одной и той же экспериментальной группы, что может свидетельствовать о важности индивидуальных особенностей животных, не связанных с

*

*

действие изучаемого фактора Выявленные особенности реакции респираторного тракта на последовательные введения возрастающих доз метахолина свидетельствовали о развитии неспецифической гиперреактивности бронхов у мышей линии ВАЬВ/с с ^Е-зависимой экспериментальной бронхиальной астмой

'ООД*] 90,0080,00ч©

70,00.

<

60.Р0-

50,00-

30,00-

*

-У

-1-1-!-1-—1-1-

ЗОшт/иМХ ЯмиАгМС, 50мхЛгМХ, ЗООМяиМС, 2Шмкг/кгМХ; 20ОмнЖгМХ, через ^ерезЗщм через 5 мин через! ша через 3 мин через 5 мин

Дзд а метахолина (мкг) и время после введения (мин)

-епытая группа —■контрсшьтгрупга

Рисунок 9. Изменения средней амплитуды дыхания у мышей контрольной и опытной групп после введения метахолина (МХ) относительно исходных значений до введения МХ (А отн, %) * р<0,05 (критерий Манна-Уитни, межгрупповое сравнение)

*

8 15,011-

-1-1-1-|-1-1-1-

Ьоиедюга ЯНиМК, ЗСмкг&гЖ 30 шйг МХ, 300 КиЛтИС 280 юг&г'МХ, 200 «нАг МХ, их Ч(рм1ыйн червзЗмик чфззЗшн вдреПнин чгряЗшк 'чермЗмин

Доза метахолинл (миг) и вротя после введения (мш) ——«пьгаш грудпа -- —контропми группа

Рисунок 10. Изменения средней амплитуды дыхания у мышей контрольной и опытной групп после введения метахолина (МХ) (А абс , мВ) * р<0,05 (критерий Манна-Уитни, межгрупповое сравнение).

ВЫВОДЫ

1 Разработана краткосрочная безадъювантная модель бронхиальной астмы у лабораторных мышей линии ВАЬВ/с с использованием аллергена пыльцы тимофеевки.

2. Выявлено достоверное повышение титров аллерген-специфических антител в сыворотке крови животных с экспериментальной бронхиальной астмой после завершения курса интраназальных введений аллергена

3 Установлено статистически значимое повышение процентного содержания эозинофилов и снижение относительного количества эпителиальных клеток в бронхоальвеолярном лаваже после окончания провокационных введений аллергена пыльцы тимофеевки у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой Не выявлено достоверных изменений лейкоцитарного состава периферической крови у животных с моделью бронхиальной астмы

4. Обнаружены выраженные патоморфолошческие изменения в легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой, признаки аллергического воспаления с повышением содержания эозинофилов, нейтрофилов и яим-

фоцитов в периброниальной и периваскулярной ткани, деструкция и деск-вамация эпителия слизистой бронхов, деформации стенки бронхов, утолщение межальвеолярных стенок, гиперемия мелких сосудов.

5 Предложенные шкалы для полуколичественной оценки содержания эози-нофилов и нейтрофилов в перибронхиальной и периваскулярной ткани легких отражают качественные изменения патоморфологии у «модельных» животных

6 У мышей с экспериментальной бронхиальной астмой обнаружены пнев-матахографические признаки неспецифической пптерреактивности бронхов значимое снижение частоты и амплитуды дыхания в ответ на введение метахолина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Kryuchkov N А, Babakhra А А, Khaitov М R, Martinov AI Adjuvant-free mouse model of bronchial asthma on causally relevant G6 allergen The Proceedings of II International Congress IMD, Moscow, 2007

2 Kryuchkov N.A., Bashkatova Yu N, Khaitov M R., Litvin L S IgE Immune response in vivo to timothy grass allergen. Allergy, 2008, v,63 (s 88), p 256.

3 Крючков H A, Бабахин A.A, Хаитов M P Моделирование бронхиальной астмы у лабораторных мышей общие принципы и значение. Физиология и патология иммунной системы, 2008, №3, с 3-7

4 Н А. Крючков, А А. Бабахин, Л. Д Козмин, Ю Н Башкатова, Г.Г Барси-гян, ИВ Андреев, MP Хаитов, А И. Мартынов Разработка модели IgE-зависимой бронхиальной астмы на лабораторных мышах с использованием аллергена пыльцы тимофеевки Российский иммунологический журнал, 2008,, TbZt*D, "/¿-Л -

5 Крючков Н А, Хаитов М Р Выявление антиген-специфических популяций Т-клеток с использованием МНС-пептидных тетрамеров Иммунология, 2008, №3, с. fSJ- -/»/.

6 Крючков Н.А., Бабахин А А., Башкатова Ю.Н, Козмин Л.Д, Барсигян Г,Г, Хаитов М.Р., Мартынов А И Краткосрочная безадьювантная модель IgE-зависимой бронхиальной астмы у лабораторных мышей с использованием аллергена пыльцы тимофеевки Российский аллергологический журнал, 2008, №4

Подписано в печать £ 0 06,08 г. Формат 60x84/16 Тираж 200 экз Заказ 46 ? Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОЩ РАМН им Н Н Блсхина РАМН 115478, Москва, Каширское ш, 24

Бронхиальная астма (БА) - одно из наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), в мире живет 300 млн. человек, болеющих астмой, а ежегодная смертность от этой патологии составляет 100-250 тыс. человек [2,18,19,27,28]. Примерно 1% от всех потерь лет жизни с поправкой на нетрудоспособность (DALY) обусловлены этой патологией. По данным поперечных исследований, в нашей стране 5,6-7,3% взрослых и 6-11% детей страдает астмой {2,4,7,15,16]. Имеются данные, свидетельствующие о росте числа новых случаев болезни за последнюю четверть века. Около половины всех случаев заболевания считаются атопическими, связанными с аллергической реакцией на антигены помещений и окружающей среды [16,70].

К настоящему времени, течение БА контролируется стандартной терапией, замедляя развитие заболевания и радикально улучшая качество жизни пациентов. Однако у 10-20% больных заболевание протекает в тяжелой форме, плохо поддающейся терапевтической коррекции противовоспалительными и антибронхоконстрикторными препаратами [7].

Разработка новых подходов к лечению, диагностике и профилактике астмы остается актуальной задачей и невозможна без выяснения патогенетических механизмов развития болезни. Многочисленные исследования с участием людей, связанные, главным образом, с применением бронхоскопии и гистологического исследования материалов, полученных при биопсии и аутопсии, внесли значительный вклад в понимание проблемы. Но непреодолимые ограничения этического и технического характера не дают возможности ответить на множество вопросов, касающихся этиологии и патогенеза БА. Поэтому все более широкое применение находят биологические модели, позволяющие воспроизводить характерные признаки патологии у животных.

Уже разработаны методы индукции экспериментальной бронхиальной астмы (ЭБА) у крыс, морских свинок, овец, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов. Использование каждого из перечисленных животных имеет свои , преимущества и недостатки [29,74,142,143]. Однако, после успешного вос-' произведения признаков гиперпродукции ^Е, аллерген-индуцированного воспаления дыхательных путей и гиперреактивности бронхов у лабораторных мышей, стало ясно, что именно эти млекопитающие оптимальны для моделирования БА [78,84,132,142]. И тому есть несколько причин. Во-первых, удается обеспечить высокую степень соответствия ключевых гистологических, иммунных и функциональных феноменов экспериментальной патологии и астмы человека. Во-вторых, имеются эффективные лабораторно-инструментальные методы оценки функции внешнего дыхания, иммунологических показателей и морфологических изменений у грызунов. В-третьих, хорошо отработана технология получения чистых линий, трансгенных и но-каутных мышей. В-четвертых, мыши являются удобным экспериментальным объектом по причине невысоких материально-трудовых затрат на их содержание и питание и короткого репродуктивного цикла.

Наиболее используемым аллергеном для моделирования БА является овальбумин. Этот препарат имеет хорошо изученную структуру, свойства, налажен его коммерческий выпуск, что в сочетании с невысокой стоимостью делает его доступным для рутинного применения в исследовательской практике. С целью сенсибилизации ОА вводят интраперитонеально, при этом часто комбинируя с адъювантом, например, гидроксидом алюминия (алю-мом) или неполным адъювантом Фрейнда [10,120,142]. Наиболее используемые схемы предусматривают 7-8-кратное введение через день по 10-20 мкг аллергена или 2-3-кратное через 2-4 дня по 10 мкг в комбинации с алюмом. Адъювант способствует быстрой перестройке иммунного ответа в ТЬ2напралении и развитию ярких проявлений ^Е-ответа в ущерб точности и 8 физиологичности» воспроизведения маркеров БА. Поэтому все большее место отводится безадьювантным моделям, точнее имитирующим патогенез заболевания человека [11,51].

Кроме того, резко возрос интерес к использованию в процессе индукции ЭБА так называемых причинно-значимых аллергенов, вызывающих развитие и обострение заболевания у человека. Уже получены мышиные модели с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли [17, 71,73,76,77,93,94], маслины [39], пыльцы амброзии [134,147,79] и березы [46]. Такой подход, помимо прочего, позволяет изучать эффективность и безопасность антиген-специфической иммунотерапии (АСИТ) на доклинических этапах. К настоящему времени отсутствуют модели ЭБА с использованием большей части клинически-значимых аллергенов. Среди последних особое значение для нашей страны имеет пыльца дикорастущих и сельскохозяйственных трав: тимофеевки, полыни, овса и др.

В России к началу 2008 была воспроизведена лишь одна модель БА -краткосрочная с использованием овальбумина, подробно описанная в нескольких русскоязычных работах [8-11]. В то же самое время, было найдено 837 зарубежных исследований, посвященных той же проблеме. Это свидетельствует о необходимости заметно активизировать отечественную исследовательскую работу в этом направлении.

Цель работы: разработать и охарактеризовать краткосрочную безадъ-ювантную модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы у мышей с использованием экстракта пыльцы тимофеевки полевой. Задачи:

1. Изучить 1§Е-ответ мышей линии ВАЬВ/с на введение экстракта пыльцы тимофеевки.

2. Разработать оптимальную схему моделирования экспериментальной бронхиальной астмы у мышей путем введения экстракта пыльцы тимофеевки в отсутствие адъюванта.

3. Изучить динамику накопления аллерген-специфических гомоцито-тропных ^Е-антител в крови мышей в ходе моделирования бронхиальной астмы.

4. Провести оценку гистологических изменений легких мышей при моделировании БА

5. Разработать и провести первичную проверку применимости полуколичественной системы анализа гистологических изменений легких мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

6. Оценить изменения относительного клеточного состава бронхо-альвеолярного лаважа у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

7. Оценить изменения лейкоцитарной формулы периферической крови у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

8. Провести пневмотахографическую оценку функции внешнего дыхания у мышей с экспериментальной бронхиальной астмой.

Научная новизна работы:

Впервые в мире разработана и охарактеризована краткосрочная модель ^Е-зависимой бронхиальной астмы с использованием аллергенного экстракта пыльцы тимофеевки полевой у мышей без использования адъюванта

Впервые предложен метод полуколичественного анализа гистологических изменений легких мышей при моделировании бронхиальной астмы. Практическая значимость:

Разработанная модель бронхиальной астмы на лабораторных мышах может использоваться для оценки эффективности и безопасности потенци

10 альных лекарственных средств или их форм в процессе лечения и профилактики заболевания на доклиническом этапе. Особое значение имеет возможность применения данной модели для нахождения новых подходов к антиген-специфической терапии модифицированными аллергенами пыльцы тимофеевки.

Предложенная модель может использоваться и при изучении патогенетических механизмов развития бронхиальной астмы.