Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигенов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки и обоснование ее применения в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом

На правах рукописи

РГь 09? 0? Э 9

к

ШПЬШОВ СТАНИСЛАВ НИКОЛАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ РИККЕТСИЙ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ И ОБОСНОВАНИЕ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА КЛЕЩЕВЫМ РИККЕТСИОЗОМ

(14.00.30 - эпидемиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ОМСК 1999

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки и здравоохранения Омском научно-исследовательском институте природноочаговых инфекций Минздрава России

Научный руководитель- доктор медицинских наук

Н.В.Рудаков

Официальные оппоненты'

доктор медицинских наук И.В.Боровский кандидат медицинских наук, доцент Т.М.Обухова

Ведущая организация- Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера

Защита диссертации состоится «.Л^ » 1999 г.

в -/(У час. на заседании диссертационного совета Д. 084.30.03. в Омской государственной медицинской академии по адресу: 644099, Омск, ул. Ленина, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «ЛТ'У) _1999 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доцент Р.Н.Готвальд

Р /91!, У% - * , 0

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы

Последние десятилетия 20 века характеризуются активизацией эпидемического проявления эндемических риккетсиозов, объединяемых в группу клещевой пятнистой лихорадки (КПП), в различных регионах мира (Бадаева Н.М. и др., 1993; Mansueto S. et al. 1986; Alexandrov E. et al.. 1996).

Одним из важнейших представителей группы КПЛ является клещевой риккетсиоз, эпидемически активные очаги которого распространены преимущественно в азиатской части России. Начиная с 30-х годов, с момента регистрации заболеваемости клещевым риккетсиозом отмечались периоды с различной эпидемической активностью очагов, свидетельствующие о цикличности эпизоотического и зависимого от него эпидемического процессов. Однако с 1979 г. отмечается непрерывный рост заболеваемости клещевым риккетсиозом. В период с 1979 г. по 1997 г. в России выявлено 23980 случая этой инфекции, с ростом показателей заболеваемости более чем в 8 раз.

Объективные данные, объясняющие рост заболеваемости, до настоящего времени отсутствуют. Изменения эпидемической активности очагов клещевого рихкетсиоза в определенной степени могут быть связаны с количественными и качественными изменениями популяций рикхетсий.

В связи с этим представляет несомненную ценность изучение количественной и качественной характеристик инфицированности риккетсиями группы КПЛ популяции переносчиков при эпидемиологической разведке территорий, в том числе при оценке их эпидемической активности.

Однако информативные методы, позволяющие проводить анализ этих изменений на больших территориях до настоящего времени отсутствовали.

При широком распространении возбудителей группы со сниженной вирулентностью такая экспериментальная модель как морская свинка не может быть пригодной для выявления и изучения авирулентных и слабовирулентных штаммов риккетсий (Тарасевич И.В., Макарова В.А., 1981; Макарова В.А., Тарасевич И.В., 1989). По результатам экспериментальных исследований в реакции непрямой гемагглютинации с иммуноглобулиновым диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ не выявляется антиген R.akari

(Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., 1992). Использование метода флюоресцирующих антител в гемоцитовом тесте в ряде случаев может давать отрицательные результаты даже при наличии риккетсий в клещах (Тарасевич И.В., Макарова В.А., 1981). В тоже время тест-системы на основе ИФА значительно превосходят по информативности метод биопроб и экспресс-методы выявления антигенов (МФА, РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом), экономичны, дают возможность объективного инструментального учета результатов.

Однако в риккетсиологии ИФА-методы выявления риккетсий (их антигенов) не нашли пока широкого применения. Разработана тест-система ИФА для выявления антигенов коксиелл Бернета (Горбачев E.H. и др., 1988). Имеются работы по определению иммуноферментным методом корпускулярных антигенов R.prowazekii и Rsibirica (Кузнецова A.B. и др., 1985; Недялков Ю.А. и др., 1985, 1988; Дробышевская Э.И. и др., 1989).

До настоящего времени иммуноферменгные методы в системе эпидемиологического надзора за риккетсиозами группы КПЛ не применялись. Отсутствуют сравнительные данные о специфичности и чувствительности конъюгатов для ИФА, приготовленных из иммунного сырья различных видов лабораторных животных, для выявления Rsibirica и других представителей труппы КПЛ, а также сопоставлении результатов исследований инфицированное™ переносчиков тест-системой ИФА с традиционными методами риккетсиологических исследований.

Таким образом, неоспорима целесообразность разработки чувствительной и специфичной тест-системы ИФА для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, позволяющей оперативно проводить исследования переносчиков и оценку изменений структуры популяций риккетсий в природных очагах. Необходимо отработать тактику применения тест-системы ИФА в комплексе с другими методами индикации возбудителей риккетсиозов группы КПЛ для мониторинга очагов клещевого риккетсиоза, оценки динамики количественных и качественных изменении популяций риккетсий группы КПЛ на эндемичных территориях и территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом, прогнозирования возможных изменений эпидемической активности очагов.

1.2. Основной целью работы является разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигенов риккетсий группы КПЛ, обоснование ее применения для изучения природных очагов клещевого риккетсиоза в различных ландшафтно-

эпидемиологических зонах, выявления риккетсий клещевого биотипа на эндемичных территориях и территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом.

1.3. В соответствии с целью поставлены следующие основные задачи исследования:

1. Отработать оптимальные схемы для получения иммунного сырья, создать опытные серии тест-систем ИФА для выявления антигенов риккетсий группы КПЛ на основе иммунных сывороток крови различных видов лабораторных животных и провести их сравнительное изучение для выявления антигенов И^Штса, Какай, Ксопоги.

2. Сопоставить по чувствительности и специфичности ИФА и традиционные методы выявления риккетсий (биопроб, МФА, РНГА).

3. Апробировать тест-систему ИФА для выявления риккетсий группы КПЛ для изучения природных очагов клещевого риккетсиоза различных ландшафтно-эпидемиологических типов и выявления риккетсий группы КПЛ на территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом.

4. Отработать тактику применения тест-системы ИФА в комплексе с другими методами (РНГА, МФА) для решения эпидемиологических задач.

1.4. В итоге исследований, результаты которых изложены в диссертации, на защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработана тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антигенов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на основе полученного по модифицированной методике иммунного сырья.

2. Созданная тест-система ИФА является группоспецифичной, выявляя антигены КзЛтса, Какал, Ихопоги преимущественно в растворимой форме в разведениях от 1:200 до 1:1000 (в зависимости от серии антигена) от их рабочих разведений в РСК. По чувствительности тест-система ИФА как минимум в 10 раз превосходит РНГА при выявлении цельнорастворимых антигенов.

3. Тест-система ИФА для выявления риккетсий группы КПЛ высоко эффективна при исследовании переносчиков на эндемичных по клещевому риккетсиозу территориях и территориях с полным отсутствием заболеваемости. Тест-система ИФА обладает большей чувствительностью по сравнению с традиционными методами

выявления риккетсий (биопроба, МФА. РНГА) как при исследовании переносчиков в пулах, так и при индивидуальном исследовании.

4. Тест-система ИФА позволяет выявлять антигены риккетсий группы КПП на разных стадиях метаморфоза переносчиков. Результаты ИФА значительно выше при исследовании напитавшихся личинок и нимф по сравнению с исследованием голодных переносчиков.

5. Тест-система ИФА может эффективно применяться в комплексе с другими методами выявления риккетсий (биопроба, МФА, РНГА) как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом и выявлением вирулентных штаммов R.sibirica, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий, обеспечивая слежение за количественными и качественными изменениями популяций риккетсий.

1.5. Научная новизна: Осуществлена научно-технологическая разработка тест-системы ИФА для выявления антигенов риккетсий группы КПЛ на основе оптимизации схем иммунизации и выбора штаммов с высокой авидносгью, использовании иммунного сырья различной видовой принадлежности.

Результаты исследований с набором цельнорастворимых и корпускулярных антигенов риккетсий группы КПЛ, сыпного тифа, лихорадки Ку, хламвдий показали, что созданная тест-система ИФА является группоспецифичной, выявляя антигены R.sibirica, Rakari, R.conorii преимуществено в растворимой фазе. По чувствительности тест-система ИФА как минимум в 10 раз превосходит РНГА при выявлении цельнорастворимых антигенов.

Впервые отработана тактика применения тест-системы ИФА в комплексе с другими методами (РНГА, МФА) для мониторинга очагов клещевого риккетсиоза и изучения количественной и качественной характеристик популяций риккетсий. При этом выявлено, что достаточно высокие уровни индивидуальной инфицированности риккетсиями группы КПЛ переносчиков по данным ИФА и МФА характерны не только для территорий с высоким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом и циркуляцией высоковируленгных штаммов R.sibirica, но и для территорий с полным отсутствием случаев клещевого риккетсиоза. Впервые выявлены существенные отличия антигенной структуры риккетсий по данным ИФА, МФА и РНГА на эндемичных территориях и территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом. Наибольшая

частота положительных результатов при исследовании переносчиков отмечена по данным биопроб и РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом на территории республики Алтай с наиболее высоким уровнем заболеваемости.

Установлена возможность применения тест-системы ИФА как чувствительного метода при исследовании различных фаз развития переносчиков на зараженность риккетсиями группы КПЛ, а также изучения экспериментальной инфекции.

Впервые установлено, что цельнорастворимые антигены R.akari в отличие от антигенов R.sibirica в РНГА практически не выявляются, однако более активно работают в ИФА с тест-системой для выявления риккетсий группы КПЛ, что и было положено в основу дифференциации R.akari от R.sibirica. По результатам исследований получено авторское свидетельство на изобретение № 1756358 от 22.04.92 г. : «Способ дифференциации риккетсий вида Rickettsia akari от Rickettsia sibirica», авторы: Рудаков H.B. и Шпынов С.Н.

1.6. Научно-практическая ценность и реализация результатов работы

Разработаны лабораторно-экспериментальные и экспериментально-производственные серии тест-системы ИФА для выявления риккетсий группы КПЛ и соответствующая научно-техническая документация (научно-техническое задание, инструкция по изготовлению и контролю, проекты инструкции по применению, временной фармокопейной статьи и экспериментально-производственного регламента).

Впервые разработана и применена тест-система ИФА для выявления риккетсий группы КПЛ в комплексе с традиционными методами (МФА, РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом) при изучении популяций риккетсий группы КПЛ на основе анализа индивидуальной и пудовой инфицированности переносчиков на эндемичных территориях и территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом.

Использование комплекса методов выявления риккетсий группы КПЛ (метод биопроб, РНГА, МФА, ИФА) позволило определить количественную и качественную характеристики популяций риккетсий при осуществлении эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом на изучаемых территориях. Применение этого подхода в течение нескольких эпидемических сезонов позволит выявить тенденцию изменения инфицированности переносчиков. Это может использоваться в системе эхшднадзора за клещевым риккетсиозом при

составлении эпидемиологических прогнозов, что будет способствовать эффективности проводимых мероприятий.

Результаты работы по созданию и применению тест-системы ИФА для выявления риккетсий группы КПП были использованы в учебном процессе при проведении республиканских курсов информации и стажировки для врачей эпидемиологов и бактериологов республиканских, краевых и областных СЭС: «Ранняя лабораторная и клиническая диагностика лихорадки Ку и клещевого риккетсиоза» для врачей практического здравоохранения (г. Омск, НИИПИ, 20-23 ноября 1990 г.).

Всесоюзным Центром по риккетсиозам МЗ СССР на базе НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР проведено испытание тест-системы ИФА для выявления риккетсий группы КПЛ, получено положительное заключение.

Экспериментально-производственные серии тест-системы ИФА прошли апробацию в практической работе вирусологической лаборатории Алтайского краевого ЦГСЭН, что позволило определить инфицированность риккетсиями переносчиков для оценки эпидемической ситуации на данной территории.

С использованием тест-системы ИФА для выявления риккетсий группы КПЛ выявлено и изолировано 5 штаммов Я. яЬтса. Получена справка о депонировании авторских штаммов «54/88-Горный», «37/89-Горный» во Всесоюзном музее риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

1.7. Материалы диссертации доложены на:

• - «круглом столе» Всесоюзной школы-семинара молодых ученых «Экология, эпидемиология и диагностика природно-очаговых инфекций» (г. Звенигород, Московской обл., 11-18 февраля 1989 г.);

• Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики риккетсиозов» (г. Москва, 16-17 ноября 1989 г.);

• Зональной научно-практической конференции «Вопросы эпидемиологии и профилактики природно-очаговых инфекций» (г. Омск, 19-20 ноября 1991 г.);

• Второй международной конференции : «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2-4 сентября 1998 г.);

• Всероссийской научно-практической конференции «Природноочаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения» (г. Омск, 20-21 октября 1998 г.).

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 1 изобретение.

1.8. Диссертация прошла апробацию на заседании Ученого совета Омского НИИПИ 6 мая 1999 г.

1.9. Объем и структура работы

Диссертация изложена на 143 стр. машинописного текста, включает 20 таблиц и 4 рисунка. Состоит из введения. 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 130 отечественных и 67 зарубежных работ.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Материалы и методы

В работе использован комплекс эпидемиологических, зоолого-паразитологических, риккетсиологических, серологических, физико-химических и статистических методов.

С целью подбора штаммов-продуцентов иммунного сырья проведено изучение пассажных историй 15 штаммов риккетсий группы КПП. Для иммунизации были отобраны штаммы риккетсий, обладающие наиболее выраженными иммунобиологическими свойствами, а именно штаммы И^Ьшса «105/87- Баево», «107/87-Баево», «20/84- Приморье», «91/85- Бурятия» и Какал штамм «Тогер».

Серологическим исследованиям были подвергнуты сыворотки крови лабораторных животных, используемые как иммунное сырье при создании тест-системы ИФА.

Создано 19 серий конъюгатов тест-системы ИФА, из них 16 серий на основе полученных нами кроличьих гипериммунных сывороток к риккетсиям группы КПП (Я. БШшса, Я. акап) и 3 серии из лошадиной гипериммунной сыворотки к КвШтса, полученной из НПО «Биомед» г. Пермь. Все серии ИФА-конъюгатов были подвергнуты последующему изучению на чувствительность и специфичность. Пять серий конъюгатов исследовали в течение 7 последующих лет на чувствительность, специфичность и активность при выявлении антигенов риккетсий группы КПП.

Отработаны оптимальные условия постановки ИФА с тест-системой для выявления риккетсий группы КПЛ.

Сбор материала (иксодовых клещей), используемого в эпидемиологической части работы, осуществлялся на территории республики Алтай, Алтайского края, Омской области и республики Казахстан (Карагандинская область). Сбор имаго иксодовых клещей

проводили с растительности по общепринятым методикам. Всего исследовано 7875 иксодовых клещей.

Сбор и исследование иксодовых клещей из республики Алтай проведены автором, определение видов членистоногих проведено к.б.н. Д.И. Ивановым, научн. сотр. А.К.Танцевым. Сбор и исследование переносчиков из лесостепной зоны Алтайского края проведены при содействии специалистов Алтайского краевого ЦГСЭН, заведующего паразитологическим отделом Н.С.Горбунова и заведующей вирусологической лабораторией Н.С.Гуляевой.

Изучение индивидуальной инфицированное™ иксодовых клещей из республики Казахстан и Омской области проведены при участии К.М.Н., ст.науч.сотр. Т. А. Решетниковой и науч.сотр. И.Е.Самойлекко.

Проведено изучение инфицированное™ переносчиков индивидуально и в пулах с использованием комплекса методов выявления риккетсий группы КПП (ИФА, МФА с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, люминесцирующими сухими, РИГА с иммуноглобулиновым эритроцигарным диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ и биопробой на морских свинках) на эндемичных территориях и территориях с отсутствием заболеваемости в различных ландшафтно-географических зонах.

При исследовании клещей в пулах индивидуальную инфицированность рассчитывали по методу В.Н. Беклемишева (1963).

Изучение возможности применения тест-системы ИФА для определения трансовариальной и трансфазовой передачи риккетсий группы КПЛ, проведено при исследовании преимагинальных стадий иксодовых клещей, полученных в экспериментальных условиях И.Е. Самойленко. Исследовано потомство экспериментальных линий двух видов иксодовых клещей (D.nuttalli, D.marginatus) ( 3200 яиц, 1507 личинок 193 нимфы, 35 имаго).

2.2. Разработка и обоснование конструирования иммуноферментных конъюгатов для выявления антигенов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки

Использование тест-системы ИФА для выявления и идентификации риккетсий группы КПЛ целесообразно только при условии достаточно высокой специфичности и чувствительности конъюгатов, а также оптимизации параметров постановки реакции. Указанные требования в определенной степени сопряжены с необходимостью отработки оптимальных условий получения высокоактивного иммунного сырья из сывороток крови лабораторных животных различных видов с

неодинаковой степенью видоспецифичности к риккетсиям группы КПЛ.

В качестве животных продуцентов антител использовались кролики, морские свинки, белые мыши. Иммунизацию проводили тестикулярными культурами штаммов К^Ьтса «105/87», «107/87» (депонированы в музее риккетсий, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) на кроликах в изогенной системе с использованием адъюванга без микробных компонентов на основе гидроокиси алюминия. На 15-17 сутки после второго цикла иммунизации для дальнейшей работы отбирали сыворотки, специфическая активность которых составляла не менее 1:1280 по данным РСК с коммерческим антигеном Я^Ьтса.

С использованием комплекса иммунохимических методов выделяли иммуноглобулины класса в и методом перйодатного окисления с последующим востановлением боргидридом натрия по ТуББеп И,, Кш^ак Е.,1984 получали иммуноферментные конъюгаты.

Всего было приготовлено 19 серий ИФА конъюгатов, из них 16 серий- на основе кроличьего иммунного сырья полученного нами и три серии- из лошадиной гипериммуной лиофилизированной сыворотки к Я-зЛтса, производства НПО «Биомед», г. Пермь.

Полученные на основе лошадиной и кроличьих сывороток серии конъюгатов имели высокую специфическую активность, их рабочее разведение было от 1:800 до 1:4000 перед сушкой и от 1:400 до 1:1000 после сушки. Оптимальное рабочее разведение определяли для каждой серии коньюгага «шахматным» титрованием в ИФА с контрольными коммерческими антигенами: «положительными»- цельнорастворимыми антигенами риккетсий группы КПЛ, гетерологичными контролями-цельнорастворимыми антигенами риккетсий группы сыпного тифа, С.ЬигпеШ, СЫ.рз1Иасп. Рабочим разведением считали то максимальное его разведение, которое давало минимальное значение уровня неспецифического «фона» с гетерологичным контрольным антигеном и выявляло антиген КзНзтса в наибольшем разведении.

Полученные серии конъюгатов-ИФА были лиофилизированы на аппарате типа Долина, с наполнителем (10 % препарата, 50 %

нормальной бычьей сыворотки, 40 % 0,01 молярного фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,4) в режиме 48 часов.

Показатели активности, чувствительности и специфичности этих серий конъюгатов были высоки, как сразу после изготовления, так и спустя 7 лет, при хранении в лиофилизированном состоянии при температуре - 20° С. При конъюгации с пероксвдазой хрена (ПХ) наилучшим было соотношение ^С-пероксидаза хрена 1,5:1,0.

Получение кроличьих иммунных сывороток к R.akari оказалось весьма проблематичным ввиду низкого титра специфических антител. Также из-за низких титров специфических иммуноглобулинов, полученных при иммунизации морских свинок (1:160) и белых мышей (1:20), и малого объема получаемых иммунных сывороток создание конъюгатов на их основе оказалось неперспективным.

Отработаны оптимальные условия постановки ИФА для выявления антигенов риккетсий группы КПЛ. При постановке ИФА использовали прямой вариант метода (Voller А. et al., 1978). Реакцию ставили в полистироловых планшетах с плоским дном для иммунологических реакций (ТУ 64-2-375-86, Ленинградского завода медполимеров), учет реакции осуществляли визуально или на Myltiskan-MCC/340P.

Лунки планшетов сенсибилизировали различными разведениями специфических иммуноглобулинов класса G (от 0,1 мкг/мл до 1000,0 мкг/мл), оптимальной оказалась концентрация белка 10 мкг/мл.

Для обеспечения максимальной чувствительности при низком уровне неспецифических реакций, в фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) для разведения конъюгата вводили твин-20 и нормальныю лошадиную сыворотку (НЛС). Оптимальным для постановки ИФА было разведение конъюгата на 0,01 М ФСБР pH 7,2 с 50% НЛС и 2 % твин-20.

Выделенные для подложки кроличьи и лошадиные иммуноглобулины класса G (концентрация 10 мкг/мл) и полученные на их основе коньютаты (разведение 1:1000), были подвергнуты перекрестному изучению в ИФА с набором коммерческих и полученных в лабораторных условиях антигенов риккетсий группы КПЛ.

Самым оптимальным сочетанием «IgG-конъюгат» являются кроличьи IgG для подложки и конъюгат, изготовленный на основе лошадиных IgG, меченных пероксидазой хрена.

Испытание тест-системы ИФА было проведено на антигенах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов. Использовали коммерческие антигены R.prowazeki, C.burnetii, орнитозный, а также полученные нами цельнорастворимые антигены R_akari штаммы «Тогер», «МК/Каплан», R conorii штамм «М-1», R.sibirica штаммы «Сидро», «Алтай 24/86», «Баево 107/86», «Баево 105/87», «Горный 54/88», «Горный 37/89». Результаты исследований свидетельствуют, что тест-система ИФА выявляет все антигены риккетсий группы КПЛ, т.е. является группоспецифичной. Более высокие значения оптической плотности получены при исследовании цельнорастворимых антигенов R.akari и R.sibirica при отрицательных

результатах с гетерологическими антигенами группы сыпного тифа, лихорадки Ку, хламидий.

Впервые установлено, что растворимые антигены R.akari, в отличие от R.sibirica в РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом практически не выявляются, однако более активно работают в ИФА с тест-системой для выявления антигенов риккетсий группы КПП. Указанная закономерность может быть использована для идентификации риккетсий группы КТО! По результатам исследований разработан способ дифференциации и получено авторское свидетельство на изобретение № 1756358 от 22 апреля 1992 т.: «Способ дифференциации риккетсий вида Rickettsia akari от Rickettsia sibirica.

Таким образом, тест-система ИФА является группоспецифичной, цельнорастворимые антигены R.sibirica. R.akari, R.conorii выявляли в ИФА в разведениях от 1:200 до 1:1000 (в зависимости от серии антигена) от их рабочих разведений в РСК. В РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом антигены R.sibirica выявляли, как правило, в разведении 1:32-1:64 от рабочего в РСК, то есть ИФА как минимум в 10 раз чувствительнее РНГА при выявлении цельнорастворимых антигенов. В то же время исследование в ИФА корпускулярных антигенов R. sibirica, содержащих по данным МФА большое количество риккетсий (до ++++), выявило лишь слабоположительные результаты. Это свидетельствует о том, что тест-система ИФА выявляет антигены преимущественно в растворимой форме.

Природа растворимого антигена, выявляемого в ИФА и РНГА, различна. Как показали наши исследования, ИФА выявляет антиген и до и после термической обработки, а в РНГА после термической обработки антиген не выявляется.

В интервале температур 20-37° С, 37-60° С активность антигенов в ИФА оставалась на высоком уровне с последующим снижением в интервале температур 60-80° С в два раза. По данным РНГА термическая обработка антигенов в интервале 37-60° С дает резкое снижение гемагглштинирующей активности, а при 60-80° С вызывает полную инактивацию антигенов. Близкие данные в отношении R.rickettsii приводят американские исследователи (Anacker R. et al., 1985 а, б, 1987).

Выявление антигена в корпускулярной форме при помощи ИФА происходит только после воздействия градиентом температур, ультразвуком или других обработок, приводящих к переходу части корпускулярного антигена в растворимую форму. Метод флюоресцирующих антител выявляет антиген риккетсий группы КПЛ в

корпускулярной форме, а иммуноферменгный анализ-преимущественно в растворимой. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии полной корреляции между данными ИФА и МФА и их взаимодополняемости.

2.3. Сопоставление возможностей метода биопроб, ИФА и традиционных методов экспресс-выявления риккетсий группы КПД

Методы обнаружения риккетсий сложны и трудоемки, особенно при индивидуальном исследовании переносчиков. В связи с этим вызывало определенный интерес возможность применения ИФА тест-системы в сравнении с другими методами для выявления антигенов риккетсий группы КПЛ на различных стадиях метаморфоза иксодовых клещей. Для этого в пулах и индивидуально было исследовано потомство экспериментальных линий двух видов иксодовых клещей (D.nuttalli. D.marginatus) : 3200 яиц, 1507 личинок 193 нимфы, 35 имаго.

Индивидуальная инфицированность имаго клещей составила по данным ИФА- 38,9 %, в МФА- 58,3 %, в РИГА получены отрицательные результаты (рис. 1).

100 %

58,3 %

1 2 3

1- ИФА; 2- МФА; 3- РИГА.

Рис. 1. Сравнительная оценка инфицированости имаго иксодовых клещей по данным различных методов

При исследовании яиц процент инфицированных проб составил в ИФА и МФА 100 %. Инфицированность личинок составила в ИФА- 60 %, МФА- 20 %, в РИГА получены отрицательные результаты (рис.2).

100%

60%

1 2 3

1-ИФА; 2- МФА; 3 РИГА.

Рис. 2. Сравнительная оценка инфицированности личинок иксодовых клещей по данным различных методов

Зараженность проб нимф Б.таг^паШз во всех методах составила 100%.

Полученные результаты свидетельствуют, что при исследовании яиц, личинок, нимф и половозрелых иксодовых клещей тест-система ИФА позволяет выявлять антигены риккетсий группы КПЛ на всех стадиях развития переносчиков наравне с методом флюоресцирующих антител. Следовательно, ИФА является эффективным и адекватным методом изучения экспериментальной инфекции у переносчиков.

Применение ИФА позволило в краткие сроки (в течение эпидемического сезона) провести массовый скрининг риккетсий в переносчиках в различных ландшафтных зонах Алтайского края, в то время как для решения такой же задачи с помощью метода биопроб на морских свинках в связи с громоздкостью и трудоемкостью такого рода

исследований требуется несколько лет (Рудаков Н.В. и др., 1989). Таким образом, преимуществом ИФА в сопоставлении с методом биопроб, наряду с большей чувствительностью и информативностью, является высокая производительность, экономичность и оперативность.

В целом по Алтайскому краю в групповых пробах в ИФА исследовано более 7 тысяч иксодовых клещей, их инфицированность риккетсиями составила в среднем 1,7% (от 0,4% до 43,0% по отдельным ландшафтным зонам). В то же время риккетсиофорность клещей по данным РИГА по краю составила 0,71%, в биопробах -0,52% (Рудаков Н.В. и др., 1996). Сопоставление полученных данных с результатами биопроб и РИГА показало, что чувствительность ИФА при исследовании в пулах выше традиционных методов, что согласуется с ранее полученными нами экспериментальными данными (Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., 1991). Результаты проведенных исследований свидетельствуют также о соответствии результатов исследований клещей по зонам в ИФА эпидемиологическим данным, что подтверждает связь эпидемической активности очагов клещевого риккетсиоза с инфицированностью переносчиков. Наиболее высокие показатели инфицированное™ переносчиков выявлены в зонах Западного и Центрального Алтая, характеризующихся наиболее высокими показателями заболеваемости населения (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительные результаты исследования в ИФА переносчиков в сопоставлении с заболеваемостью населения клещевым риккетсиозом в Алтайском крае

Ландшафтно- Количество Инфициро- Заболеваемость

эпидемиологическая исследованных ванность в на 100 тысяч

зона (подзона) переносчиков ИФА (%) жителей

Типчаково-ковыльная 1324 0,39 19,9

степь

Лесостепь 3638 1,04 28,5

Северный Алтай 1316 1,7 36,4

Центральный Алтай 469 14,9 115,3

Западный Алтай 260 43,0 231,5

Юго-Восточный Алтай 210 3,4 15,9

Всего по Алтайскому 7217 1,7 29,3

краю

Представляло интерес сравнение инфицированности переносчиков по данным МФА, РНГА и ИФА при исследовании в пулах и индивидуально.

При индивидуальном исследовании переносчиков процент инфицированных проб значительно выше (в 4 раза), чем при исследовании в пулах, что свидетельствует о большей эффективности экспресс-методов при индивидуальном исследовании по сравнению с исследованиями переносчиков пулами (табл. 2). Возможно это связано с методикой пересчета процента инфицированных проб по В.Н. Беклемишеву, разработанной применительно к методу биопроб и более адекватной при низкой инфицированности переносчиков.

Таблица 2

Сопоставление значений инфицированности переносчиков при исследовании индивидуально и в пулах

Метод исследования Индивидуальная инфицированность при исследовании в пуле (%± ш) Инфицированность при исследовании индивидуально (%±т)

ИФА 20,1 ±2,1 86,2 ± 4,5

МФА 16,1 ± 1,9 78,2 ± 6,4

РНГА 14,1 ±1,8 60,4 ± 7,0

Наибольшие положительные результаты получены при исследовании переносчиков, как в пулах, так и индивидуально в ИФА, т.е. и чувствительность ИФА выше по сравнению с другими методами экспресс-выявления риккетсий (МФА и РНГА).

Появившиеся в последние годы данные об различиях антигенных типов риккетсий в очагах клещевого риккетсиоза (Рудаков Н.В. и др., 1996, 1997) определяют необходимость сравнительного изучения ИФА и других методов выявления риккетсий на эндемичных территориях и территориях с отсутствием заболеваемости.

С этой целью проведено исследование индивидуальной риккетсиофорности иксодовых клещей, собранных с четырех территорий: эндемичных- горных степей республики Алтай и равнинно-степной зоны Алтайского края (Славгородский район) и территорий с отсутствием заболеваемости - лесостепи Омской области (Омский район) и степной зоны Карагандинской области республики Казахстан (табл. 3).

Таблица 3

Результаты выявления риккетсиофорности иксодовых клещей на эндемичных территориях и территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом (в процентах)

Метод исследования республика Алтай Славгородский район Алтайского края Карагандинская область Омская область

ИФА 86,2 ±4,5 51,0 ±7,1 40,8 ±2,4 21,4 + 3,1

МФА 78,2 ±6.4 57,1 ±7,0 27,9 ±2,2 42,8 ±6,1

РИГА 60,4 ±7,1 2,0 ± 1,9 15,4 ± 1,8 0.6 ±0,9

Достаточно высокие уровни индивидуальной инфицированности переносчиков по данным ИФА и МФА характерны как для эндемичных территорий, так и для территорий с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом, однако на территориях с отсутствием заболеваемости эти показатели всеже ниже. Так, в зоне Центрального Алтая с высоким уровнем заболеваемости (115 на 100 тысяч населения) и циркуляцией высоковируленгных штаммов Л^Штса индивидуальная инфицированность основного переносчика-клещей Б.пийаШ имеет высокое значение по данным ИФА. МФА и РИГА и 0,97 % - по данным биопроб на морских свинках.

В степной зоне Алтайского края (Славгородский район) с существенно более низким уровнем заболеваемости (19,9 на 100 тысяч населения) индивидуальная инфицированность клещей О.геисиЫш по данным ИФА и МФА достоверно ниже, по данным РИГА с иммуноглобулиновым диагностикумом- практически не выявляется.

Близкие к данным по Славгородскому району Алтайского края результаты в ИФА, МФА и РИГА получены при исследовании иксодовых клещей в Карагандинской области при отсутствии регистрации случаев клещевого риккетсиоза. На территории Омской области, характеризующейся полным отсутствием заболеваемости, инфицированность переносчиков по данным РИГА также практически отсутствует при более низких, чем по другим обследованным территориям, данным ИФА.

2.4. Обоснование тактики применения ИФА в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом

Основными направлениями эпидемиологического надзора за риккетсиозами являются оперативный и ретроспективный эпидемиологический анализ, эпидемиологическое слежение

(мониторинг) за очаговыми территориями, включая эпидемиологическую разведку и углубленное изучение очагов (Тарасевич И.В., 1988). Составной частью эпидемиологического надзора является мониторинг риккетсий с определением гетерогенности их популяций. При этом несомненное значение имеет совершенствование методов индикации и идентификации возбудителей.

В последние годы с использованием техники моноклональных антител и клещевой экспериментальной модели на территориях с полным отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом (Омская область, Карагандинская область республики Казахстан) в клещах выявлены и охарактеризованы риккетсиальные агенты, существенно отличающиеся по вирулентности, трансовариальной передачи и антигенным характеристикам от возбудителя клещевого риккетсиоза-ИвНипса (Рудаков Н.В. и др., 1997, 1998).

Это обстоятельство заставило нас пересмотреть оценку уровней индивидуальной инфицированности переносчиков, так как ранее его рассчитывали применительно к методу биопроб, выявляющему только вирулентные штаммы риккетсий. В результате проведенных исследований отработана тактика применения тест-системы ИФА в комплексе с другими методами выявления риккетсий группы КПП при исследовании переносчиков как на эндемичных территориях с циркуляцией вирулентных штаммов ИиЫпса, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных вариантов риккетсий группы КПП. При этом показатели индивидуальной инфицированности переносчиков полученные при помощи ИФА и МФА позволяют судить об инфицированности переносчиков риккетсиями группы КПЛ в целом, а показатели индивидуальной инфицированности переносчиков по данным метода биопроб и в РНГА-преимущественно о вирулентной части популяций риккетсий.

Использование материалов по заболеваемости клещевым риккетсиозом и комплекса экспресс-методов выявления риккетсий подтвердило результаты ранее проведенного эпидемиологического районирования Алтайского края и Омской области (Рудаков Н.В. и др., 1988, 1991; Ястребов В.К., 1971, 1993) и позволило уточнить результаты дифференциации указанных территорий по риску заражения населения Л^Штса. Так, обследованные территории республики Алтай отнесены к территориям с высоким риском заражения населения, степной зоны Алтайского края (Славгородский район)- к среднему риску, Омской области- к территориям с

отсутствием реального риска заражения возбудителем клещевого риккетсиоза.

С учетом полученных результатов можно рекомендовать комплексное применение ИФА-РНГА (МФА-РНГА) при эпидемиологической разведке и углубленном изучении очагов, в том числе оценке их эпидемической активности.

Использование тест-системы ИФА позволяет проводить исследование иксодовых клещей как в пулах по 5-50 экземпляров, так и индивидуально. Количество иксодовых клещей в пробах зависит от объема сборов членистоногих, что определяется целями и масштабами проводимых исследований. При массовом исследовании переносчиков при эпидемиологической разведке больших территорий рекомендуется проводить исследование иксодовых клещей пулами по 5 и 50 экземпляров. Установлены преимущества ИФА при исследовании большого количества переносчиков в оперативных целях: высокая производительность при достаточной чувствительности, быстрота получения результатов, особенно в сопоставлении с методом биопроб. Вместе с тем, определение инфицированное™ клещей в ИФА имеет индикаторное значение и не исключает применения традиционных риккетсиологических методов выделения и изучения штаммов риккетсий. Наиболее результативно применение ИФА, а так же других методов микроанализа- МФА и РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом, при исследовании индивидуальных экземпляров переносчиков.

Подводя итог вышесказанному можно сказать, что разработанная тест-система ИФА является групгоспецифичной, выявляя антигены риккетсий группы КПП преимущественно в растворимой форме, и по чувствительности превосходит традиционные методы выявления риккетсий. Отработана тактика применения тест-системы ИФА в комплексе с другими методами выявления риккетсий (биопроба, МФА, РНГА) как на эндемичных территориях с высоким уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом и выявлением вирулентных штаммов Я^Ьшса, так и на территориях с отсутствием заболеваемости и циркуляцией авирулентных штаммов риккетсий.

Применение этого подхода в течение нескольких эпидемических сезонов позволит выявить тенденцию изменения инфицированное™ переносчиков. Это может использоваться в системе эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом при составлении эпидемиологических прогнозов, что будет способствовать эффективности проводимых мероприятий.

2.5. Выводы:

1. Впервые на основе полученного по модифицированной методике иммунного сырья разработана тест-система ИФА для выявления антигенов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки.

2. Тест-система ИФА для выявления антигенов риккетсий группы КПП является группоспецифичной, выявляя антигены И^Ыпса, Какал, Ксопогл преимущественно в растворимой форме в разведениях от 1:200 до 1:1000 (в зависимости от серии антигена) от их рабочих разведений в РСК. Тест-система ИФА как минимум в 10 раз чувствительнее РИГА при выявлении цельнорастворимых антигенов.

3. Показана эффективность применения тест-системы ИФА для выявления риккетсий группы КПП для исследования переносчиков как на эндемичных территориях с циркуляцией вирулентных штаммов КБШтса, так и на территориях с отсутствием заболеваемости клещевым риккетсиозом и циркуляцией авирулентных вариантов риккетсий. Тест-система ИФА обладает большей чувствительностью по сравнению с традиционными методами выявления риккетсий (биопроба, МФА, РИГА) как при индивидуальном исследовании переносчиков, так и в пулах.

4. Применение ИФА тест-системы позволяет выявлять антигены риккетсий группы КПЛ на разных стадиях метаморфоза переносчика наравне с МФА. При исследовании напитавшихся личинок и нимф результаты ИФА значительно выше, чем при исследовании голодных.

5. Усовершенствованы методы индикации и идентификации риккетсий группы КПЛ и обоснована тактика применения методов мониторинга очагов клещевого риккетсиоза с использованием новых методических подходов для оценки количественных и качественных изменений популяции риккетсий группы КПЛ в природных очагах.

6. Тест-система ИФА в связи с экономичностью, специфичностью и информативностью, обусловленной возможностью выявления с ее помощью различных представителей группы КПЛ существенно расширяет возможности осуществления эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом.

2.6. Основные положения отражены в следующих публикациях:

1.Шпынов С.Н., Рудаков Н.В. Методические подходы к получению иммуноферментных конъюгатов для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки // Вопросы риккетсиологии: матер. 4 Всесоюз. конф. -М., 1989.-С. 156-157.

2. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В. Конструирование иммуноферментной тест-системы для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой

лихорадки // Природноочаговые болезни человека:Респ.сб.науч.работ,-Омск, 1990.-С. 93-99.

3. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В. Иммуноферменгная тест-система для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки // Лабораторное дело. М. - 1991. - № 11 - С. 67-69.

4. Ястребов В.К., Матущенко А.А., Бусыгин Ф.Ф., Рудаков Н.В., Смирнов П.Л., Обгольц А. А., Богданов И.И., Ботвинкин А.Д., Сидоров Г.Н., Тшценко Г.А., Калмин О.Б., Шпынов С.Н., Вахрушев А.В. Оценка и прогнозирование эколого-эпидемиологической обстановки по природно-очаговым инфекциям в зоне предполагаемого строительства Катунской ГЭС // Природноочаговые болезни человека: Респ.сб.науч.работ.-Омск, 1991,-С. 3-20.

5. Шпынов С.Н., Горбунов Н.С., Гуляева Н.С., Рудаков Н.В. Результаты применения тест-системы иммуноферментного анализа для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки при изучении очагов клещевого риккетсиоза в Алтайском крае // Природноочаговые болезни человека: Респ.сб.науч.работ,- Омск, 1991. - С. 125-128.

6. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: матер.науч.конф,- Томск, 1991,- С. 157-158.

7. Рудаков Н.В, Шпынов С.Н. Способ дифференциации риккетсий вида Какай от ЦздЬтса: Авторское свидетельство 1756358, 1992. МКИС1201/04. 2е.

8. Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., Шпынов С.Н., Решетникова Т. А., Якименко В.В., Танкибаев М.А. Современное состояние очагов клещевого риккетсиоза // ЗНиСО: ежекварт.информ.бюл., 1998.- № 1С. 12-14.

9. Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., Решетникова Т.А., Шпынов С.Н. Актуальные аспекты эпидемиологии клещевого риккетсиоза // 2 междунар.конф. посвящ. 75 летию ин-та им. Пастера: матер, конф,- С-Петербург, 1998. - С. 165.

10. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., Танкибаев М.А. Результаты применения иммуноферментной тест-системы для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в переносчиках на эндемичных и неэндемичных территориях // 2 междунар.конф. посвящ. 75 летию ин-та им. Пастера: матер, конф. - С-Петербург, 1998,- С. 172-173.

11. Рудаков Н.В., Танкибаев М.А., Решетникова Т.А., Самойленко И.Е., Шпынов С.Н. Новые данные о риккетсиях группы клещевой

пятнистой лихорадки в Казахстане // Природноочаговые инфекции в России: Соврем.эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения : Всерос. научно-практ.конф. (тез.докл).- Омск, 1998.С. 172173.

12. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Самойленко И.Е. Возможные пути применения ИФА тест-системы для выявления риккетсий группы КПП //Всерос. Научно-практ.конф. (тез.докл.)- Омск, 1998. С. 173-175.

13. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Самойленко И.Е, Танкибаев М.А. Результаты применения различных методов выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки для иследования переносчиков на эндемичных и неэндемичных по клещевому риккетсиозу территориях // Всерос. научно-практ.конф. (тез.докл.)- Омск, 1998. С. 175-176.

14. Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., Шпынов С.Н., Якименко В.В., Решетникова Т.А., О.Н.\*/а1кег. Танкибаев М.А. Актуальные аспекты изучения эпидемиологии клещевого риккетсиоза и экологии риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в природных очагах // Актуальн. вопросы инфекционной патологии: матер, научно-практ. конф.- Барнаул, 1999,- с. 166-168.

15. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., Решетникова Т.А. Результаты изучения инфицированности риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки переносчиков в Алтайском крае и сопредельных территориях // Актуальн. вопросы инфекционной патологии: матер, научно-практ. конф,-Барнаул, 1999. - с. 212-214.