Автореферат и диссертация по медицине (14.00.35) на тему:Разработка и сравнительная оценка вариантов иммуноферментного анализа для диагностики шигеллеза Зонне

3111 9,'А]

Щь г-1

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

ШТЫК

Аннета Юрьевна

РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВАРИАНТОВ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ШИГЕЛЛЕЗА ЗОННЕ

Специальность: 14.00.35 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в Ленинградском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Пастера МЗ РСФСР.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Ф. С. Носков; кандидат химических паук, ведущий научный сотрудник В. Н. Вербов.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А. М. Королю«; кандидат биологических наук А. П. Кашкин.

Ведущее учреждение: Военно-Медицинская академия им. Кирова.

заседании Специализированного совета (Д.001.23.02) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте экспериментальной медицины АМН СССР (197022, Ленинград, ул. акад. И. П. Павлова, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1991 года.

Ученый секретарь Специализированного совета,

доктор медицинских наук Л. А. Бурова

Защита состоится «'* »

1991 года в

часов на

¡УГСТВЕИШ

:5!ДОТШ г, С Р

хертдций-

• - 3 Ш.ИОС'Л) пшоломи

, Шигеллев является одним ив наиболее распространенных заболеваний среди острых кишечных инфекций (ОКИ). Анализ заболеваемости ОКИ в СССР на протяжении 23 лет, показал, что удельный вес вспышек дизентерии Зоние составил 58,7%. Одним из основных факторов, неблагоприятно влияющих на эффективность профилактических мероприятий по борьбе с дизентерией Зонне, является от-' зутствие метода надежной и быстрой диагностики этой инфекции (Пак, 1989).

Применяемый в настоящее время для обнаружения шигелл Зоннд Зактериологический метод, основанный на выделении и индикаций возбудителя, длителен и не всегда эффективен, особенно при исследовании молочных продуктов (одного иэ основных путей распространения дизентерии Зонне). В свяви с этим актуальной проб-пемой является разработка высокочувствительных и специфичных экспресс-'методов-обнаружения антигена шигелл Зонне, а также зпецифических антител к нему, выявление которых может быть ис-юльзовано не только для диагностики, но и в сероэпидемиологи-1еском анализе. Ведущая роль здесь принадлежит иммунологическим методам: реакции коагтлютинации (-РКОА), иммунофлюоресцен-И'Л (М'М), реакции непрямой гемагглютинации (РНГ'А) и др.. Одна-со большинство методов, используемы/, в лабораторной практике, х'Здадаш либо недостаточной чукстеительностыо, либо недоста-•счиой специфичностью. Достснерпыо результат».! могут быть получены с помощью радиойммуннсго анализа (РИЛ), однако, для практических целой утот метод не применяется из-за необходимости «пользования меченых изотопами реагентов и специального обо-;удованпя. '

В последние годы для выявления различных патогенов, в том теле бактериальных антигенов,, применяют методы иммунофермент-юго. анализа (ИФА), обладающие высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностыо и возможностью количественного уче-:а результатов. Все ж, до сих пор не разработаны общие крите-1ии достижения оптимальных значений параметров, определяющих ¡увствительность и специфичность метода. К таким параметрам от-

носятся: степень чистоты специфических реагентов, способы получения конъюГатов и их очистки, устранение неспецифических реакций, возмозшость использования "универсальных" конъюгатов' и т. д. С другой стороны; по мере совершенствования,биотехнологии появляются и становятся доступными высокоспецифичные и стандартные компоненты, такие как Р(аЬ'-фрагменты иммуноглобулинов, белок А, моноклональные антитела и др.. Такое разнооб раэие подходов свидетельствует о необходимости более детального изучения и сравнения параметров, оказывающих влияние на чувствительность и специфичность анализа при конструировании .иммуноферментных тест-сиотем. '

Цель и задачи работы.

Целью настоящего исследования явилось экспериментальное обоснование и разработка высокочувствительных и специфичных вариантов иммуноферментного.анализа для обнаружения О-антигена шигелл Зонне, . специфических антител к нему ' и циркулирующих иммунных комплексов. ■ '.

" В задачи исследования входило: .

- экспериментальные исследования.по выбору схемы иммунизации для получения специфичных, высокоактивных гипериммунны> сывороток'от ЖИВОТНЫХ;

- оценка возможности использования в ИМ различных фракщ иммуноглобулинов, полученных в процессе высаливания ионобмен-ной и иммуноаффинной хроматографии;-, проведение модельных исследований и оптимизация воэмож-

'ных схем постановки №М для выявления антител и антигена шигелл Бонне; _ ' . •

-. сопоставление чувствительности разработанных'вариантов . ИФА с другими диагностическими тестами;. . .'. .

- апробация разработанных вариантов.ИФА в плане возможное; их использования при диагностике дизентерии'Зоине..

.Научная новизна.

В результате проведенных исследований научно обоснована и

экспериментально подтверждена возможность применения общегло-булиновых.фракций, как в качестве компонента, сорбируемого на твердую фазу, так и для получения высокоспецифичных конъюгатов.

Разработан оригинальный, высокочувствительный и специфичный вариант ИФА для обнаружения О-антигена шигелл Зонне с использованием Р(аЬ'^-фрагментов и кэнъюгата на основе белка. А. ; Обоснована и.подтверждена возможность использования в качестве "вторых" антител исключительно (первая фракция,полученная в ходе ионообменной хроматографии в градиенте хлористого натрия). Замена на 1дМ о качестве "вторых" антител приводит к полнрй потере чувствительности анализа, что йвляетоя доказательством отсутствия взаимодейстзия 1дМ кролика с белком А.

Предложен вариант постановки ЙФА для выявления специфических антител, использующий иммунохимический метод связывания антител с твердой фазой, предварительно сенсибилизированной ' белком А,- и конъюгат на основе липополисахарида.

. Разработана оригинальная схема ИФА для обнаружения циркулирующий иммунных комплексов в сыворотке крови больных дизентерией. Зонне. .

Практическая значимость.

: Практическая значимость работы заключается в разработке ряда оригинальных схем постановки ИФА для обнаружения антигена, антител и иммунных комплексов, пригодных для дифференциальной диагностики дизентерии Зонне и для оценки инфицированное™ различных биологических: субстратов и продуктов питания шигеллами Зонне.

Составлена и утвержденанаучно-техническая документация на иммунофермэнтнуго тест-систему для обнаружения О-антигена шигелл- Зонне. Комитетом' МИБП разрешено применение тест-системы в практике 'здравоохранения (протокол N 8 от 22 августа 1991 г.).

Эффективность и высокая чувствительность указанной тест-системы подтверждена положительными актами апробации из ряда практических бактериологических лабораторий, а также результатами Государственный непитаний, проведенных на базе Г11СК им. Тарасевича.

Получено положительное решение 'на заявку "Способ прогнозирования затяжного течения дизентерии Зонне" N 1677633 (опубликовано в К изобр. и откр. Б 34, 91).

Положения, выносимые-на защиту.

- Чувствительность и специфичность ИФА тест-системы для об ■наружения О-антигена шигелл Зонне . определяется оптимизацией качества специфических антител, которая может быть достигнута при определенном способе получения кроличьих'гипериммунных сы-.вороток и выделении иа них соответствующих.иммуноглобулинов.

- Использование разработанных вариантов ИФЛ позволяет с высокой степенью чувствительности и специфичности обнаруживать О-антиген шигелл Зонне и специфические антитела к нему в биологических субстратах. '

- Схема ИФЛ с использованием конъюгата на основе монокло-нальных антител к легким цепям иммуноглобулинов' человека дает возможность выявлять специфические.циркулирующие иммунные комплексы в сыворотках больных шгеллезом Зонне.

Апробация работы.

Основные результаты работы были доложены на У Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), на научно-практической конференции НИИЭМ им. Пастера (Ленинград, 1985, 1990 г.)', на УП'и УШ конференциях молодых ученых НИИЭМ им. Пастера (Ленинград 1986, 1907 г.);'на на научно-практической конференции "Практика ИФА" ВНЖВС (Ленинград, 1987 г.), на заседании секции иммунологии и иммунохимии совместно с секцией микробиологии и генетики бактерий . ИЭМ АМН СССР (Ленинград,. 1989 г),- на семинаре "Диагностика кишечных инфекций" (Петрозаводск, 1989 г), на совещании "Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций": (Оболенск, 1989г.). • • '

Разработанная.диагностическая.тест-система для обнаружения О-антигена шигелл Зонне экспонировалась на выставках: "Биотехнология (Ленинград, 1987), "Охрана матери и ребенка в СССР" (ПНР, 1987), ВДНХ СССР павильон,"Здоровье" (Москва, 1989), па

" , -

международной ярмарке (Югославия, ,1989) и на-выставке в ВМА им. Кирова'(Ленинград, 1990). Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения и выводов. Збъем работы составляет 206 страниц машинописного текста. -Порченные результаты иллюстрированы 24 таблицами и 23 рисукка-W. Список литературы включает 233 наименования, из них 166 шостранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования проводились с использованием ряда штаммов мик-оорганизмов нигелл Зоине, идентифицированных в НИИЭМ им. Пас-ера. .Шигеллеаные антигены получали кипячением в течение 2 ч грубый антиген) и методом водно-фенолыюго экстрагирования по естфалю (липополисахарид). '

. Контроль специфичности проводили с грубыми антигенами сле-ующих бактериальных культур: Shigella boydii 4; Sh. floxneri; scherichia coli: 028 ac; 01; 055; 0119; 0151; 0111; 0142; 144; 0112; 0124; 0164; OIS ac; Salmonella: S. derby; ? /phi mûri uni; S. haï fa; S. mission; S. oranieriburg; S. infant 15; nerçport; S. bovis rcorbificans; S. londorr, S. senftenberg; enteritidls: S. panara;, ■ S. gallinarum-pullorum; Proteus ilgaris; P. mirabilis и др.. •

Источником специфических антител служили гипериммунные торотки, полученные от кроликов,.' иммунизированных культурой гелл Зонне (прогретой 2 ч при 60 С) по двум различным схемам с'разным количеством циклов реиммунизации.

Иммуноглобулины (l£) выделяли'методом осаждения сульфатом мония, полиэтиленгликолем ( ПЭГ) М. м. 6000, ионообменной хро-г гографшй на /ХЕАЕ-целлюллозе в градиенте хлористого натрия, зтые антитела получали методом пммуноаффинной хроматографии колонках: сефароза '1В-липополисахарид и агароза-липополиса-эид. Хроматографию проводили под контролем профиля злюций о лощью спектрофотометров "Увщорд-2" и СФ-26, зглись профиля

- а - ..

- на самописце "Рекордер". Сбор фракций- на автоматическом коллекторе "Ультрарак" (ЛКБ, Швеция).

Концентрирование иммуногло&улиновых препаратов осуществляли е исмоифю ПЭГ (Um. 20000),. либо сахарозы. ,

F(ab') ^-фрагменты приготовлены при фр&гментировании Ig пепсином.

Контроль степени очистки и специфической активности антите льных препаратов проводили в реакциях: развернутой агглютина-; ции (РРА), двойной диффузии (ДЦ), радиальной иммунодиффуэии (РИД), реакций непрямой гемагглкгсшации (РИГА), в иммунозлект-рофорезе (ИЭФ) и в иммуноферментном анализе. (ИФА). .

Концентрацию белю определяли методом Лоури (1951),- а также. спектрофотометрическим способом (Clark, 1977).

В работе была использована пероксидаза хрена (ИХ) производства "Биолар" (г. Олайне, ЛатЬийской ССР, марка A,. R1--2,?), Концентрацию фермента определяли спектрофотометрическим методом по формуле: С(ПХ)' - 0Л(403нм) х 0,44 х разведение.

, Пероксидазные конъюгаты получали двухступенчатым методом глутаральдегидного сшивания (Awaineas, .1969) , и методом перио-датного окисления в двух модификациях- (Hakane, 1974) \i (Wilson, 1978).

; Очистку конъюгатов проводили: а) методом гель-фильтрации на сефадексах G-100, G-200 и сефакриле S-200; б). высаливанием сульфатом аммония и в) методом аффинной хроматографии на колонке с конканавалином А-сефаро?ой.: j

ЦФА проводили в плоскодонных'.планшетах фирм "Дайнатеч", "Линбро", "ilyiiK", "Кохинор" и "Медполимер" (Ленинград). При этом были иснользфванн следующие схемы постановки реакции:

1. Для определения антигена:'

— - AT - АГ - К j - С . ' ' й)

— F(ab'^ - АГ - AT, - К2- С б) Для выявления специфических антител:'

— AT - - 0 : ' . . ' • в) 6А - AT - К4- С ' ... г)

-- AT - AT - Кс . - С •': • • ; . д)

. ■• а - ■

3. Для выявления иммунных комплексов:

-- ЛТ - СЛГ - ЛТ) ~ К6 - С ■ е),

где АТ - специфические антитела; АГ - антиген; (АГ-АТ). - комплекс антиген-антитело; ОЛ - белок А; О - субстрат; К];- кроличьи шигеллевны? антитела, меченые ПХ; К ^ белок А, меченый ПХ-, К^-- липополиоахарид шигелл Эонне, меченый ПХ; К^- козьи антитела к легким цепям иммуноглобулинов кролика, меченые ПХ; К^- козьи антитела к 1дМ кролика, меченые ПХ; К^- моноклональ-ные антитела к легким цепям человек,' меченые ПХ.

В качестве субстрата использовали о-фенилендиамин дигидро-хлорид в концентрации 0,4 иг/мл в присутствии перекиси водорода (конечная концентрация 0,05%), рЫ-5,0.

Учет результатов реакции проводили спекгрофотометрически на "Миниридере-П" при длине волны 490' нм.

Для сравнительной оценки диагностической значимости использовали-. МФА; РТ11ГЛ, РИД,. РКОА, РИГА, ДЦ.

. Обработку результатов исследований проводили с применением методов Еариационной статистики (Ашмарин, 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка "сэндвич"-варианта ИФА для обнарунения О-антиг* на шигелл Ит.ше. При рьзровотке различных вариантов И-М прежрв есого /встй5 г. вопрос о получении гиперяумуншх сывороток, метопах вип"из них ошгцкфическиг. ангт-сл и получении на их основе !':;П1'К!?'с'Лов. Большое значение гаж имеет выбоо оптимальных схем прохождения анализа и подбор физико-химических параметров, (Л'.-спе'швнющих наибольшую чувствительность и специфичность. • '

Сра'р.чиус ::.'Ная оценка гипеоиммуииых сывороток, полученных зри иммуил: - .чип кроликов инаитипированной культурой шигелл Зон-в лкъ;г>уаел и б) по комбинированной схеме (подкожное + знутривеннсе введение антигена) показала, что наиболее предпо-ггительня ксмбпЕировитюя схема! иммунизации с, последующими ьзю-'ократиыми циглт'и роиммуиизации. -Применение такой схемы поз-зодяет получить идоскоа#иняые антитела, и следовательно, более

' - ] о -

высокую чувствительность аиилиза.' Установлено, что коммерчое-ски« юш-сдлй'зиио сыворотки, полученные по короткой схеме имм; низании, включающей один, максимум два цикла реиммунизации (н. смотря на высокие титры'с реакции агглютинации), не могут быть испольуованы для выделения специфических антител, т. к. их при менение не позволяет добиться высокой чувствительности в ИФА. связи с этим необходимо отметить, что титры, полученные в РР и Р1ГГА при оценке сывороток, не могут служить достаточным кри терием их пригодности в ИФА. .

Результата сравнительного анализа различных фракций, полу ченных г ходе ионообменной хроматографии в .граиенте хлористого натрия: бессолевая (1); 0,07 !ОаС1 (П); 0,17 М МаС1 (Ш); 0,38 М Ыа01 (1У) показали, что специфическая активность (по данным РРЛ) распределяется по -всем фракциям,' что зависит с параметров исходной сыворотки. ■ Сопоставление средних удельнь титров (п-15) этих четырех фракций' выявило отсутствие достс верных различий в распределении специфических .антител.

.Установлено, что использование, общеглобулиновых, 1 и фракций, полученных в ходе ионообменной хроматографии обесш чивает'практически одинаково высокую чувствительность ( -10^ Ю^кл/мл), £1 применение Ш и 1У фракций приводит к достоверно) снижению чувствительности в "сэндвич"-варианте. Аналогичш зависимость выявлена и при использовании различных фракций д. получения конъюгатов. . ''

Полученные результаты позволяют, значительно упростить со дание, ИФА тест-системы-, используя в качестве антител' для сор ции на твердую фазу и для получения конъюгатов общеглобулин вые .фракции. '■ '

Исследования., проведенные по. использованию чистых антите ИФА показали, что,'хотя все фракции, полученные.в ходе иммун аффинной хроматографии содертат значительные количества спеи .фических антител (по данным 'РТНГА)', их. применение .приводит н появлению высоких, значений "фонового" сигнала ^соответствен к резкому снижению чувствительности' анализа. Это не позволяе использовать их в настоящее'.время ни в- качестве антител ?

- 11 -•

орбции ив твердую фазу, ни для получения коиъюгатоь.'

Сопоставление результатов исследования в ЙФА конъюгатов, мученных' различными методами, показало, что наибольшую чувс-вителыюеть обеспечивает использование метода периодатного кксления (Will.--ij.on, 1970). При этом некоторое увеличение чувствительности- может быть достигнуто за счет получения более го-эгенного конъюгата при увеличении молярного соотношения АТ: ПХ г 1:2 до 1:4. Это позволяет избежать и стадии очистки конъ-гата. Незначительное увеличение "фонового" сигнала может быть шжено, за счет введения в копъюгат нормальной кроличьей сы-эротки е конечной концентрации 1%. .

- Использование в качестве наполнителя белково-сахарозного габилизатора позволяет добиться значительного срока хранения юфилизиропанных конъюгатов (24-36 месяцев, без заметной поте-I активности). ...

В ходе отработки технологической схсмы-(а) (см. раздел Ма-фиалы и методы) производства тест-системы оптимизированы еле-'ющие параметры: концентрация антител, сорбируемых на твердую 1зу, рабочая концентрация конъюгата, рН буферного. раствора и сорбции антител, время инкубации, состав промывного и раз-дащего буерных растворов, тип полистироловых планшетов, -а 1кже изучена возможность повышения зкспресеноети анализа за ¡ет адновроменного внесения антигена й конъюгата без заметно-снижения уровня чувствительности и специфичности.

Чувствительность ®А при титровании липополисахарида (оха-.ктеризовапного в весовом отношении), составила 1 нг/мл, а при тровании "грубого" антигена (охарактеризованного концентра-

4

ей кл/мл) -- 10 кл/мл.

Тест-система характеризуется высокой специфичностью, что дтверждено: отсутствием перекрёстных реакций с 34 гетероло-чными антигенами, результатами анализа смешанных культур ■ и кусствешю инфицированных биологических субстратов, а также ижением уровня регистрируемого сигнала после нейтрализации язавшегооя на иммуносорбенте антигена. Воспроизводимость. ре-льтатов составила 913%.

- 7 12 -

Лаиорач'0р110-аксасрим0нта.льиые серии разработанной тест-системы были апробированы в ВМА им. Кирова при исследовании материала от различных групп больных и от здоровых лиц (табл. 1).

Таблица 1. Частота подтвервдения диагноза дизентерии Зонне различными лабораторными методами.

Нозологическая форма Количество обсл-х ИФА( X) м е т о МФА( X) Д Ы Р?НГА(%) РИД(%)

1. Острая дизен-

терия Зоине х 54 ' 92,6 87,0 68, b 64,8'

р<0,01 р<0,05 р< 0,05 р<0,05

2. Острая дизенте-

рия Флекснера* 26 0,0 0,0 . 3,7.- 3,7

р<0,05 р<0,05

3.ОКИ неустанов-

ленной этиологии 17 29,4. 41,2 5,9 5,9'

р<0,05 р<0,05 р<0,05 ■ р<0,05

4. ЗдороЬые 50 . 0,0 . ■ 0,0 • 0,0 • 0,0

х/ Нозологические формы 1 и 2 подтверждены результатами "бактериологического исследования. :

В результате апробации данной тест-системы при исследовании молочных продуктов показана принципиальная возможность обнаружения в них 0-антигоиа шигелл'Зонне. Заключение о наличии киз-неспофобных бактерий делали • на основании' . сравнительного анализа двух проб кавдога образца: исходной пробы и пробы' пос-^ ле подращивания в течение 10-12 ч. на мясо-пептонном бульоне. .

Тымм образом, этот метод может быть рекомендован для. обнаружения Оантигена в материале от больных и продуктах питания. Еоэмол-и! как' визуальный, так и инструментальный учет резуль-атов. Бремя проведения анализа'составляет 3,0-3,5 часа, при условии использования планшетов с предварительно , сорбированными антителами. ':

л

- 13 -

Разработка двойного "сандвич"-варианта для обнаружения О-антигена шнгелл йснне - схема(С) (см. раздел мат. и мет.)

В качестве альтернативного варианта для определения О-антигена разработана схема двойного "сэндвича", основанная на использовании ЬДаЬ' £ -фрагментов, сорбированных на твердой фазе и конъюгата па основе белка А. Такая схема имеет ряд преимуществ перед наиболее распространенным вариантом двойного "сэндвича ": 1) допустимо получение Г(аЬ'^ -фрагментов и "вторых" антител от одного вида ашвотньх-продуцеитов; 2) применение стандартного

коммерческого конъюгата бА-ПХ'и 3) повышение чувствительности за счет снижения уровня "фонового"'сигнала при использовании вместо антител Г(аЬ* У,-фрагментов.

Сравнение Р(а1У £-фрагментов, выделенных из оищеглобулино-вых фракций, а также из 1, • П, Ш фракций после ионообменной хроматографии показало, что только в случае применения'1 фракции могут быть получены продукты пептического гидролиза, не взаимодействующие с белком А. .

С целью выбора возможных "вторых" антител проведен анализ распределения различных классов 'иммуноглобулинов но фракциям в ИФА, с использованием класс-специфических конъюгатов и конъюга-1 та на основе белка А. Показано, что 1 фракции содержат в основ-' •ном антитела класса Б, Ш и1У фракции представляют собой IдМ с незначительными примесями 1^6, а П фракции кроме и в некоторых случаях содержат антитела класса А. Сравнительная оценка этих, а также общеглобулиновых фракций .доказала, что в качестве' "вторых" антител могут быть использованы только 1 фракции, применение же- общеглобулиновых и П фракций приводит к резкому снижению чувствительности, а использование Ш и 1У. вооб-.ще .не имеет смысла, так как невозможно'их взаимодействие 'с белком А. В то же время в качестве "вторых" антител допустимо использование чистых антител. ' .

Проведенными исследованиями по выбору "вторых" антител показано,, что кроличьи антитела класса-М. не взаимодействуют с белком' А.

При изучении физико-химических параметров постановки реак-

ции онрул'злеки оптимальные концентрации, которые составили: для К(аЬ')? -фрагментов - 12,5 мкг/мл и для "вторых" антител -<10 мкг/мл., Учтено такжз влияние и других параметров: рН буферного раствора для сорбции, состав промывного буферного раствора, время инкубации и др.. '

Па основе изучения кинетических параметров взаимодействия специфических реагентов установлена возможность повышения зкс-прессности реакции за счет одновременного внесения "вторых" антител и конъюгата (6Л-ПХ), .что не' снижает чувствительности ан-лиза. ' '

Сравнительная оценка двух вариантов ША (схемы /а/ и /б/) для обнаружения.О-антигена шигелл Зонне показала, что по чувствительности двойной "сэндвич" на порядок превосходит "сэнд-вич"-вариант (0,1 нг/мл по ЛПС, или Шчш/мл по "грубому" антигену) при одинаковой специфичности. Основной недостаток этого варианта - нестабильность Р( аЬ' - фрагментов при хранении. Максимальный срок хранения , без заметной потери активности последних,составляет 5 месяцев.

Разработка вариантов ИФА' для обнаружения антител к шигеллам Зонне схемы (в), • (г) и.-(д) и специфических иммунных комплексов ~ схема (е). • • ' . На модельной системе: 0-антиген шигелл Зонне - кроличьи гипериммунные сыворотки - апробированы различные варианты обнаружения суммарных и класс-специфических антител.

Исследованиями по выбору природы антигена и способа его сорбции на твердой фазе в непрямом варианте ИФА (схема /д/) установлено, .что наибольшая чувствительность достигается при использовании липонолисахарида в концентрации 1 мкг/мл или "грубого,"' антигена-10'кл/мл, сорбированных в 0,05 М.'карбонатно-би-кар'бонатном буферном растворе при рН 9,5-9,6. Оптимальное время взаимодействии антител с .иммуносорбентом составляет 40-60 минут. Сравнение результатов, полученных в трех вариантах непрямого, метода УМ, с данными РРА, ДЦ и РИГА показало (табл..2), что титры антител в И'М на 1-2 порядка превышают титры в РРА и РИГА и на 3 порядка и более в ДД.

- ib -

Таблица 2. . ' .

Средние значения титров антишигеллезных сывороток, полученных н различных методах.

Сыворотка РРА м е т о ДД РИГА Д ы ■ Иммуноферментный анализ alg-HX aIgM-ПХ- 6Л-ПХ

Гипериммуи- 16БО±. 6,6t 997+ 2-1200+ 12000+ 80ЙЗ+

ная шигел-' 487 2,2 389 ■ 8282 2679 1Q35

лезная

Нормальная 0 0 0 0 410+ 0

■ 145

Альтернативным способом выявления IgG-антител является использование в качестве иммуносорбента белка А и конъюгата па'основе липополисахарида.

' В ходе разработки этой, схемы оптимизированы условия присоединения- пероксидазы к липополисахариду и определена рабочая концентрация-конъюгата-(32 мкг/мл). По. чувствительности такая - схема ИФА сопоставима с непрямым вариантом (схема /д/), использующим в' качестве конъюгата бА-IIX и на порядок чувствительнее прямого варианта. '

Совместно с сотрудниками BMA им. Кирова разработан вариант ИФА для определения циркулирующих иммунных комплексов (схема /е/). ..:-..• , ' ' - ' -

'. ' Возмоаносгь использования метода продемонстрирована из модельной системе с искусственно полученными комплексами: сыворотка больного дизентерией ЁоГше с титром антител 1:600, предварительно инкубированная при температуре 3?°С в течение 1 ч с различными концентрациями липополис-ахарида. .

Доказательством выявления ß ИФА иммунных комплексов служат опыты по их частичному разрушению при прогревании' (100° С, 5 мин).- При.параллельном исследовании проб в ИФА й.методом оса«-

дежш полизтиленгликодем 6000 (ПЭР) выявлена высокая корреляционная связь., . которая составила - 0,92 (р<0,01) для проб до прогревания. ' .

Специфичность метода доказана как по отсутсвию сигнала при замене ЛГ1С шигелл ЗонНе на гетерологичныо антигены в модельной системе, так и при анализе сывороток от здоровых и больных на наличие циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в ИФА и методе осаждения ПЭГ. При атом коэффициент корреляции в этих двух методах для положительных сывороток составил -0,935, р<0. 01.

Апробация разработанного варианта ИФА проведена при исследовании 75 сывороток больных с диагнозом - острая дизентерия Зонне, среди которых были лица с бакгериовыделением менее-16 дней, 15-90 дней и более .90 дней, на фоне курса антибиотикоте-рапии. -В контрольную группу ( 155 ^еловек ) входили здоровые, больные дизентерией Флекснера и сальмонелле'зом. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Таблица 3. Обнаружение ЦИК в сыворотках крови, больных дизентерией Зонне и контрольных лиц

Группа

Число

рбел-х

Из- них выявлены ЦИК

Средние значения титров ЦИК

1. Дизентерия Зонне 75 из них:

а)с антигеном в фекалиях до 15"дней 48

б)с антигеном в фекалиях более 15 дней 15

в)с антигеном в фекалиях более 90 дней 12

2. Дизентерия (Олскснера 40

3. Сальмонеллез 30

4. Здоровые . Ь;5

67

40

15

12

1:2390±948 (р<0,05)

'1:8200+2802 (р<0,05)

1: 25500±14405(р<0. 05) 1: 184±74 (р<0,05) 1:167+83 (р<0,05) 1:25+5 (ь<0,0Б^

- 17.-

За положительные Оыли приняты сыворотки-, имеющие в ИФА гадтр равный или более 1.-ЗСО.

Отмечено, что величины титров специфических иммунных комплексов коррелируют с характером течения заболевания у больных дизентерией Зонне, в то время как у контрольной группы специфические комплексы обнаружены только в низких титрах..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Б результате ' проведенных исследований разработаны три группы различный вариантов ИФА: для обнаружения О-антигена ши-г.елл Зонне, специфических антител к нему (суммарные антитела,

или 1цМ), а также специфических иммунных комплексов. Их практическая апробация на .примере обнаружения О-антигена и специфических иммунных комплексов показала, что данные методы обладают высокой диагностической значимостью и могут иметь большое значение при проведении клинических, лечебно-профилактических и санитарно-гигиенических мероприятий, а .также при осуществлении эпидемиологического надзора за инфекцией. . '

Кроме того, данные по изучению влияния различных факторов на чувствительность, специфичность*и экспрессность ИФА,- могут быть использованы при конструировании аналогичных тест-систем для других инфекционных заболеваний.

• выводь!

1, Предложена схема получения-, кроличьих гипериммунных сывороток и методы.выделения специфических антител (общеглобули-, новые .фракции, 1дВ, -Р(ф' Э^-фрагменты), обеспечивающие высокую эффективность щ использования в различных вариантах ИФА, •

.' .2. Разработанный "сэндвич"-вариант ИФА для обнаружения О-антигена шигелл Зонне. обладает высокой чувствительностью (1 нг/мл цо липополисахариду или 10^ кл/мл.по "грубому" антигену) при достаточной степени специфичности, воспроизводимости и пригоден для.выявления антигена в клиническом'материале и продуктах литания. .•..

. 3. Использование Р(аЬ')^ фрагментов и конъюгата'белок А -

«

- 18 - ■

- ПХ в новом варианте И'ГЛ: Р( оЬ' )о - АГ - ЛТ2- К(бА-ПХ) . для обнаружения О-антигена шигелл Зонне обеспечивает 10-кратное увеличение чувствительности метода (0,1 нг/мл по ЛПС или 10 га/мл по "грубому" антигену) по сравнению с "сэндвич"-вариантом при равноценной чувствительности.

4'. Отработанные на модельных системах варианты прямого и непрямого ИФА позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять как суммарные, так и класс-специфические антитела. - , . . . ;

5. Использование белКа А для получения иммуносорбента и

и конъюгата на основе липополисахарида оказалось_ эффективным при обнаружении антител класса ДО в оригинальной схеме постановки ИФА: б А - АТ - К {ЛПО-ПХ).

6. Применение в ИФА конъюгата на основе моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека в схеме: АТ(антишигеллезные) - исследуемая сыворотка - К (анги*-^-ПХ) оказалось пригодным для обнаружения 'специфических иммунных ком-

1 плексов в сыворотках больных дизентерией Зонне.• ^

7. Экспериментальное подтверждение отсутствия взаимодействия 1дМ кролика с белком Л может быть использовано при разработке схем иммунологического анализа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ДОгык А. ¡0. , Вербов В. Н., Николаева Т. А. Разработка'им-муноферментной тест-системы1 'для обнаружения 0-антигена 'шигелл Зонне.//Тез. докл. Всесоюз. симпозиума.' Кобулети, 1985, С. 183.

2. Шгык Л. 10. , Вербов В. 11 , Плотникова В. А. , Вассер ЕР.,. Носков Ф. С. •Иммуноферментная тест-систбма для. обнаружения О-антигепа шигелл Зонне. // Сб. "Твердофазный иммунофермэнтный анализ", Л. , 1988, С. 155-157. ';

3.' Иванов К. С. , Щгык Л. К). , Сбойчаков В. Б. , Жданов В. А., ... .Поменов С. В. , Краснов Ю. С. , Сакаль Е Е Применение иммунофер-ыеитной тест-системы для обнаругдания О-антигена шигелл Зонне в клинической практике'. // Сб. "Твердофазный . кмыуноферментный

- 19 -

анализ", JI. , 1988, С. 155-157. •

4. Поляков C.B. , Штык А. Ю. , Сакаль ЕЕ Сравнительная эффективность иммунологических ме^одо^, определения антигена ши-гелл Зонне в фекалиях больных острой дизентерий. //Сб. научных работ"Материалы ЖП итоговой научной конференции института им. .Д. И; Ульянова", Куйбышев, 1989, вып. ХУЛ. С. 140.

Б. Штык А. Ю., Вербов В. Е , Вассер Е Р., Плотникова В. А., Артюхов А. И. , Носков Ф.С. Иммуноферментная тест-система для обнаружения О-антйгена шигелл Зонне. //Материалы рабочего совещания "Состояние' проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций. Оболенск, Ï990, С. 42.