Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Гигиеническая оценка микрофильтрационных трековых мембран в отношении индикации бактериального загрязнения воды различного вида водопользования

На правах рукописи

БОГАТЫРЕВА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МИКРОФИЛЬТРАЦИОННЬГХ ТРЕКОВЫХ МЕМБРАН В ОТНОШЕНИИ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ РАЗЛИЧНОГО ВИДА ВОДОПОЛЬЗОВАНИЯ.

14.00 07 - Гигиена

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003159669

Москва -2007

Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии Государственного учреждения Научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей среды им А Н Сысина РАМН

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Недачин Александр Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Михайлова Руфина Иринарховна

(ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А Н Сысина РАМН) кандидат биологических наук Тишкова Наталья Юрьевна

(Научный центр геоэкологии, г Москва)

Ведущая организация: ФГУН Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора РФ, г Ростов-на-Дону

Защита состоится «25» октября 2007 года в 11 00 на заседании Диссертационного Совета Д 001 009.01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им АН Сысина РАМН по адресу 119992, г Москва, ул Погодинская, д 10/15, строение 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А Н Сысина РАМН

Автореферат разослан «25» сентября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор

Беляева Наталия Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Роль водного фактора в распространении возбудителей кишечных инфекций различной этиологии была неоднократно показана в работах как отечественных, так и зарубежных авторов (Рахманин Ю А, 2007, Талаева Ю Г и соавт, 2006, Михайлова Р И и соавт, 2006, GF Craun and other, 2002, и др ) Снижение заболеваемости населения, связанной с водопотреблением фактором, является проблемой, решение которой во многом обусловлено своевременными профилактическими мерами на основе оценки качества воды по надежным микробиологическим критериям и методам исследования (Артемова Т 3 и соавт 2007)

В документах водно-санитарного законодательства для питьевой воды, воды, расфасованной в емкости, воды плавательных бассейнов, водных объектов в местах питьевого, хозяйственно-бытового и рекреационного пользования (СанПин 2 1 4 1116-02, 2 1 4 1074-01, 2 1 2 1188-03, 2 1 4 117502, 2 1 5 980-00) разработана нормативная база, предусматривающая контроль качества воды по широкому спектру показателей бактериального загрязнения Для реализации требований данных СанПиН необходимо наличие отечественных методов, дающих возможность проведения быстрой, адекватной и точной количественной оценки реального микробного загрязнения воды Наиболее полно этим требованиям отвечает технология мембранной фильтрации Для обеспечения надежности этого метода необходимо развивать современные технологии отечественного производства высококачественных мембран для бактериологического анализа воды на уровне зарубежных аналогов нетоксичных для микроорганизмов, удобных при подготовке к проведению анализа воды, высокоэффективных и относительно недорогих

В настоящее время в России для микробиологического контроля воды используют мембраны сетчатой структуры, которые выполнены из материалов, отличающихся по химическому составу на различной сырьевой и технологической основе, в результате чего они отличаются эксплуатационными свойствами и эффективностью при выделении микроорганизмов из воды Это приводит к несопоставимости результатов анализа, снижению эффективности метода, невозможности

проведения достоверной оценки эпидемической значимости воды при анализе причин формирования кишечной инфекционной заболеваемости населения России (Недачин А Е, 2004 г)

В нашей стране наряду с традиционными мембранами сетчатой структуры разработаны трековые мембраны (ТМ). Уже проведены исследования по применению трековых мембран при паразитологическом анализе воды поверхностных водных объектов (МУ 4 2 1884-04) и изучена их эффективность при оценке вирусного загрязнения воды (Санамян А Г, 2005) Трековые мембраны, обладают следующими физическими параметрами строго калиброванной структурой пор, малой сорбционной емкостью, оптической прозрачностью, зеркальной поверхностью Это обусловливает оптимальные функциональные и эксплуатационные свойства трековых мембран, что представляет научный и практический интерес при их оценке к использованию и для бактериологического контроля качества воды

На основании вышеизложенного целью работы являлась санитарно-бактериологическая оценка микрофильтрационных трековых мембран в отношении индикации бактериального загрязнения воды различного вида водопользования Поставленная цель достигалась решением следующих задач

1. Провести комплексное исследование трековых мембран для определения возможности их использования в бактериологической практике оценки качества воды,

2 Дать сравнительную оценку эффективности задержания различных видов микроорганизмов трековыми мембранами и сетчатыми мембранами, используемыми в настоящее время в лабораторной практике,

3 Апробировать трековые мембраны в натурных условиях при оценке качества питьевой воды, расфасованной в емкости, воды из поверхностных и подземных источников, а также сточной воды,

4 Разработать алгоритм оценки мембранных фильтров, используемых для бактериологических анализов воды

Научная новизна работы. Впервые:

1 Получены закономерности по эффективности задержания тест-бактерий на трековых мембранах в зависимости от диаметра пор, что

является теоретической основой возможности их применения для бактериологического исследования воды,

2 Дано научное обоснование высокой эффективности трековых мембран при использовании широкого спектра индикаторных и условно-патогенных микроорганизмов,

3 Установлены следующие преимущества трековых мембран по сравнению с сетчатыми мембранами, применяемыми в нашей стране стабильность физических параметров мембраны в процессе использования, высокая эффективность задержания модельных бактерий, быстрота оксидазной реакции, отсутствие сливного роста вырастающих колоний бактерий, четкая форма колоний с ровными краями, меньшее количество вырастающих посторонних бактерий при исследовании нативных вод,

4 Разработан алгоритм ускоренной оценки мембранных фильтров

Практическая значимость.

Результаты проведенной работы позволяют рекомендовать отечественные микрофильтрационные трековые мембраны с диаметром пор 0,40 мкм для практического использования при проведении санитарно-бактериологического анализа воды различного вида водопользования

Выявленные преимущества трековых мембран позволят практическим лабораторным службам при осуществлении контроля качества воды по микробиологическим показателям получать сопоставимые статистически достоверные результаты по разным регионам страны, отражающие реальную эпидемическую обстановку в отношении бактериального загрязнения воды водных объектов

Результаты исследований учтены при разработке ГОСТ Р 52426 - 2005 «Вода питьевая Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий Часть I Метод мембранной фильтрации» Для внедрения в практику разработан проект методических рекомендаций по использованию трековых мембран при санитарно-микробиологическом контроле качества воды

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проведенных в 2005, 2006, 2007 гг для специалистов бактериологических лабораторий Роспотребнадзора и

Водоканалов РФ по оценке качества воды водных объектов (исх № 03-3/416 от 20 06 07)

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Эксплуатационные свойства трековых мембран обеспечивают их использование для бактериологического исследования воды,

2 Эффективность задержания широкого спектра индикаторных и условно-патогенных микроорганизмов на трековых мембранах в сравнительном аспекте с сетчатыми мембранами, используемыми практическими лабораториями,

3 Приоритетность трековых мембран для проведения бактериологического исследования воды различного вида водопользования,

4 Алгоритм ускоренной оценки мембранных фильтров, используемых для бактериологических анализов,

Апробация материалов диссертации проведена на заседании межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А Н Сысина РАМН 3 июля 2007 года

Материалы исследования доложены и обсуждены на III Региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Техногенные системы и экологический риск» (г Обнинск, 26-28 апреля 2006г), Информационно-консультативных семинарах «Актуальные вопросы микробиологического контроля питьевых и сточных вод» (г Москва, 12-16 декабря 2005 г , 18-22 сентября 2006 г ), Научно-практической конференции «Вода, напитки, соки, технологии и оборудование» (Москва, ВВЦ 26-29 сентября 2006 г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 1 в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, 7 приложений Текст изложен на 113 страницах машинописи, содержит 9 рисунков, 13 таблиц Библиография включает 168 источников, в том числе 80 иностранных авторов

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для выполнения поставленных задач был применен комплекс гигиенических, бактериологических и математических методов, обеспечивающих реализацию экспериментальных и натурных исследований Объем и направления исследований представлены в таблице 1

Таблица 1

Направления и объем исследований _

Направления исследований Кол-во проб Число определений

1 Оценка параметров трековых мембран, определяющих возможность их использования для бактериологического анализа воды 1 1 Выбор диаметра пор трековой мембраны 12 Расчет «процента извлекаемости» для трековой мембраны 1 3 Оценка физических параметров мембранных фильтров 1 4 Определение возможного влияния материалов, из которых изготовлены мембраны, на ферментативные свойства бактерий 136 823

II Определение эффективности задержания модельных микроорганизмов трековыми мембранами 21 Определение эффективности задержания модельных микроорганизмов сетчатыми и трековыми мембранами 2 2 Определение эффективности задержания модельных микроорганизмов исходными и модифицированными трековыми мембранами 550 3860

III Апробация трековых мембран в натурных условиях в сравнительном аспекте с мембранами, используемыми в настоящее время 3 1 Определение скорости фильтрации воды через мембранные фильтры 3 2 Изучение морфологии колоний на мембранных фильтрах 3 3 Установление возможности проведения оксидазного теста на трековой мембране 3 4 Количественные соотношения показателей качества воды для сравниваемых мембран, при исследовании питьевой воды, расфасованной в емкости, воды из подземных и поверхностных источников и сточных вод 360 3280

Всего 1046 7963

В экспериментальных и натурных условиях исследовали исходные трековые мембраны из полиэтилентерефталата с различными диаметрами пор, ТМ, модифицированные водорастворимыми комплексообразующими

полимерами (ПАА и ПВП) в сравнении с отечественными и зарубежными сетчатыми мембранными фильтрами

В таблице 2 представлена краткая характеристика мембран,

исследованных в работе

Таблица 2

_Мембранные фильтры, исследуемые в работе_

Мембранный фильтр Страна производитель Диаметр пор, мкм Материал, из которого изготовлена мембрана

Исходная трековая мембрана, Россия 0,40 0,60 0,80 1,08 2,00 полиэтилентерефталатная пленка (ПЭТФ)

ТМ мод ПАА (С = 0,05 и 0,5 %) 0,40 полиэтилентерефталатная пленка, модифицированная полиакриламидом

ТМ мод ПВП (С = 0,05 %) полиэтилентерефталатная пленка, модифицированная поливинилпирролидоном

«МйНроге» США 0,45 нитрат целлюлозы (НЦ)

«Владипор» Россия 0,45 ацетат целлюлозы (АЦ)

«Владисарт» Россия* 0,45 нитрат целлюлозы (НЦ)

Стерилизующая мембрана «Сарториус» Германия 0,20 нитрат целлюлозы (НЦ)

* Фирма «Владисарт» является официальным представителем фирмы «Sartorius» в России

Экспериментальные исследования проведены на воде модельных водоемов, которые создавали путем внесения в стерильную дехлорированную водопроводную воду суточных культур штаммов модельных микроорганизмов Концентрацию микроорганизмов подбирали таким образом, чтобы при фильтрации 10 мл воды модельного водоема на фильтре с диаметром поверхности 37 мм вырастало от 15 до 60 колоний, в соответствии с требованиями МУ 2 1 4 1057 - 01 Исходную концентрацию тест-микроорганизма готовили, используя стандарт мутности, с последующим десятикратным разбавлением до указанного числа бактерий в единице посевного объема модельного водоема Концентрацию бактерий в каждом водоеме уточняли путем посева на соответствующие плотные дифференциальные питательные среды

В качестве тест-микроорганизмов были выбраны штаммы следующих бактерий Pseudomonas aeruginosa 10145, Escherichia coli 1257, Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 29212, которые являются приоритетными показателями при оценке качества воды различного вида

водопользования, имеют различную индикаторную значимость, форму, размер клеток, подвижность Штаммы микроорганизмов приобретены в ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л А Тарасевича

Натурные исследования проведены при анализе питьевой воды, расфасованной в емкости, воды из подземных и поверхностных источников, сточных вод Пробы сточной воды отбирали на Курьяновской станции после этапа биологической очистки, на станции очистки сточных вод г Волгограда, на станции перекачки хозяйственно-бытовых сточных вод и исследовали в течение года Пробы речной воды отбирали в реках Москва, Протва в весенне-летний период Питьевая вода подземных водоисточников (скважины Московской, Владимирской, Калужской областей, респ Дагестан) также исследовалась в весенне-летний период Проведен анализ бутилированных негазированных питьевых вод первой и высшей категории качества Оценку качества данных вод по микробиологическим показателям (ГКБ, ОКБ, ТКБ, Е coli, Ent faecalis) проводили, используя метод мембранной фильтрации, выполняемый с помощью прибора вакуумного фильтрования ПВФ - 35 и вакуумного насоса СП - 4 - 044

Для оценки основных параметров мембранных фильтров, необходимых для их использования в бактериологическом анализе воды, были проведены специальные исследования по разработке методик оценки физических параметров исследуемых мембран, определения возможного влияния материалов, из которых изготовлены мембраны, на ферментативные свойства бактерий, изучение фильтрата В работе использовали международный метод оценки мембранных фильтров, применяемых для микробиологических анализов (ISO 7704-85)

При проведении натурных испытаний трековых микрофильтрационных мембран применяли следующие методики

• ускоренная методика выполнения оксидазного теста (ГОСТ Р 52426-2005),

• определение показателей ГКБ, ОКБ, ТКБ, Е coli, энтерококков проводили согласно методическим указаниям для исследуемых нативных вод (МУК 4 2 1018-01, МУК 4 2 1884-04, МУ 2 1 5 800-99, МУ 2 1 4 1184-02)

Данные, полученные в результате экспериментальных и натурных исследований, обработаны с использованием программного обеспечения

Microsoft Windows, Microsoft Excel 2003 и пакета статистических программ -Statistic for Windows

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка параметров трековых мембран, определяющих возможность их использования для бактериологического анализа воды

Для решения первой задачи изучались следующие свойства трековых мембран, которые являются необходимыми при их рекомендации для проведения санитарно-бактериологической оценки качества воды различного вида водопользования размер пор мембраны, «процент извлекаемости» модельных микроорганизмов по отношению к прямому посеву, физические параметры мембраны, определение возможного влияния материала, из которого изготовлена мембрана, на ростовые и ферментативные свойства бактерий

Нормативные документы, как отечественные, так и зарубежные рекомендуют для проведения бактериологического анализа качества воды использовать мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм Такое требование установлено для сетчатых мембран, где дисперсия размера пор ~ 50% Трековые мембраны обладают принципиально другим строением поровой структуры дисперсия размера пор составляет всего 5 %, поры представлены калиброванными длинными узкими не перекрывающимися каналами, что определяет иной механизм фильтрации и задержания бактерий Кроме того, анализ размеров клеток нормируемых индикаторных бактерий (0,3-1,5 х 0,6-6,0 мкм, по Берджи, 1997), подлежащих концентрированию на мембранах, свидетельствует о том, что имеет место выраженный полиморфизм этого признака Поэтому, в исследованиях оценивали трековые мембраны с разными диаметрами пор для выбора оптимальной

Проводили фильтрацию 100 мл воды модельного водоема с внесенной туда взвесью Е coli 1257 на уровне п103 КОЕ/100 мл через трековые мембраны разных диаметров пор - 0,40, 0,60, 0,80, 1,08 и 2,00 мкм Фильтрат от каждой мембраны повторно концентрировали на стерилизующую мембрану «Сарториус» с диаметром пор 0,20 мкм Процент задержания микроорганизмов Е coli рассчитывали по отношению количества колоний на

исследуемой мембране к количеству колоний в фильтрате Изучали морфологию выросших колоний

Зависимость эффективности задержания бактерий Е coli 1257 от диаметра пор трековой мембраны представлена на рисунке 1 Установлено, что трековые мембраны с диаметрами пор 0,80, 1,08 и 2,00 мкм обладают низкой эффективностью задержания и пропускают бактерии в фильтрат, следовательно, не могут быть рекомендованы для бактериологического анализа воды

120 -,

К

X 100 -

я

*

а.

ff 80 -

i £ о ® 60 -

О £ а to 40 -

t?

о

■Я- 20 -

■Я-

Л

0 -

ООО 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00 2,20 Диаметр пор мембраны, мкм

Рис 1 - Зависимость эффективности задержания бактерий Е coli 1257 от диаметра пор трековой мембраны

В тоже время у трековых мембран с диаметрами пор 0,40 и 0,60 мкм

проскок бактерий в фильтрат отсутствует При этом на ТМ 0,60 мкм

вырастает достоверно меньше колоний, чем на ТМ 0,40 мкм (48 ± 15 и 111 ±

26 соответственно, р < 0,05)

В результате проведенных исследований установлено, что для

бактериологического анализа воды целесообразно использовать трековые

мембраны с диаметром пор 0,40 мкм, что согласуется с требованиями к

сетчатым мембранам в отечественных и зарубежных методических

документах (ИСО 9308 - 1 2000, МУ 4 2 1018 - 04)

На моделях 4-х тест-микроорганизмов (Е coli 1257, Ps aeruginosa 10145,

Staph aureus 906, Entfaecalis 29212) определен основной параметр трековой

мембраны - «процент извлекаемое™», который рассчитывали по

отношению среднего количества колоний на мембране при посеве методом

мембранной фильтрации к среднему количеству колоний, выросших на чашках при прямом поверхностном посеве (согласно ИСО 7704-85) В таблице 3 представлены полученные результаты

Таблица 3

«Процент извлекаемое™» модельных микроорганизмов трековыми

мембранами

Используемый штамм Е coli 1257 Ps aeruginosa 10145 Staph aureus 906 Ent faecalis 29212

«Процент извлекаемости» (95 ± 7) % (91 ±9)% (95 ± 3) % (93 ±19)%

Получены высокие значения «процента извлекаемости» разных видов модельных микроорганизмов, которые превышают допустимый порог, определенный международным стандартом ИСО 7704-85 (> 80%), и, следовательно, удовлетворяют требованиям существующего стандарта Не установлено достоверных различий значений «процент извлекаемости» для исследованных тест-бактерий (р<0,05)

При оценке физических параметров трековой мембраны установлено, что при подготовке к использованию (в частности, стерилизация кипячением) и в процессе работы трековая мембрана не меняет своих линейных размеров, поверхность ее остается гладкой и не деформируется, сохраняет прочность на всех этапах проведения анализа В противоположность этому при стерилизации кипячением поверхность сетчатой мембраны «Владипор» необратимо деформируется - происходит скручивание мембраны, уменьшение диаметра диска мембраны на 2 мм, мембраны «Владисарт» деформируются обратимо в 50% образцов без изменения линейных размеров, а также при неосторожном обращении в процессе анализа легко ломаются и разрываются

Изучено влияние материалов, из которых изготовлены трековые мембраны и применяемые в практике сетчатые мембраны, на ростовые и ферментативные свойства бактерий Е coli на примере теста ферментации лактозы, который является основным при идентификации колиформных бактерий Посевы, сделанные на мембранных фильтрах, выращивали на дифференциальной среде Эндо Контролем служила скорость ферментативной реакции бактерий Е coli, посеянных газоном на эту же питательную среду

Установлено, что скорость роста колоний бактерий Е coli одинакова как на трековых, так и на сетчатых мембранах и сопоставима со скоростью роста бактерий при прямом посеве на такую же питательную среду

Данные таблицы 4 показывают, что скорость ферментативной реакции бактерий Е coli, посеянных с трековой и сетчатых мембран, оказалась одинаковой и практически не отличается от контроля

Таблица 4

Скорость ферментативной реакции бактерий Е coli, выросших на сетчатых и

трековых мембранах

Мембранный фильтр Материал фильтра Время появления кислоты (начало реакции) Время появления газа Время окончания реакции

ТМ ПЭТФ 2ч Зч 4ч

«Владисарт» нц 2ч Зч 4ч

«Владипор» АЦ 2ч 3,5ч 4ч

Контроль - 2ч 2ч Зч

Эксперименты показали, что как полиэтилентерефталат (трековая мембрана) так и ацетат целлюлоза («Владипор») и нитрат целлюлоза («Владисарт») не влияют на ростовые и ферментативные свойства бактерий Е coli, что свидетельствует о нейтральности для бактерий материалов, из которых изготовлены исследуемые мембраны

Таким образом, экспериментальными исследованиями показана возможность использования трековых мембран для бактериологического исследования воды определен оптимальный размер пор трековой мембраны (0,40 мкм), установлен высокий «процент извлекаемости» тест-микроорганизмов по отношению к прямому посеву (91-95 %), показано преимущество по стабильности физических параметров, доказана нейтральность для бактерий ПЭТФ - материала, из которого изготовлена мембрана

Определение эффективности задержания модельных микроорганизмов трековыми мембранами

Для решения второй задачи в экспериментальных исследованиях проведена оценка эффективности задержания модельных микроорганизмов трековыми мембранами по сравнению с сетчатыми мембранами отечественного и зарубежного производства, применяемыми в настоящее время в нашей стране, а также модифицированными трековыми мембранами

13

Сравнительная эффективность задержания бактерий трековыми я сетчатыми мембранами «Миллипор», «Владипор», «Владисарт» была изучена в отношений следующих штаммов модельных микроорганизмов: Е.соП 1257, Рз.аепщшоза 10145, 81арЬ.адгеиз 906, Еп(.&еса1Ь 29212. За 100% была принята эффективность задержания зарубежной сетчатой мембраны «Миллипор», сертифицированной по международным стандартам. Полученные данные представлены на рисунке 2.

J40 120 loo

8

3 60 : -ш

■а. 20

Л

о

118

117

104

100

ТМ Владипор Владисарт Мкшнпор бактерии E.teH J2S7 (А)

120 -I 100 i-

I #48- во 4-

I JO — й

4 20 — n

0 -I—

100

1TO

ТМ Птадипор Ипадисарт Мигшипор бактер I nr ?y aeruginosa 10145 (Б)

120 ? ,

5

I 80

SO 40 20 0

g-

I fi

■e-

fi

1 1

1

1U7 97 100 100

ТМ Владипор Владисарт Мнпггипор бактерий Stiph.aurtus 906 (В)

120 100 80 60 40 20 О

ТМ ВпадшАр B;woi«pi Миллипор

бактерий EntJaccalU 29112 (Г)

Рис. 2 - Сравнительная эффективность задержания бактерий: А - E.coii, Б - Ps.aeruginosa, В - Staph,aureus, Г - Ent.faecalis трековыми и сетчатыми мембранами - «Владипор», «Владисарт», Миллипор»

Установлена наибольшая эффективность трековых мембран по задержанию бактерий E.coii 1257 и Staph.aureus 906, которая составила (118 ± 19)% и (107±18)% соответственно. Ps.aeruginosa лучше задерживались мембраной «Владисарт» (100±4) %; Ent.faecalis - «Владипор» (1 11 ±8) %. При определении достоверности различия средних значений величии «эффективность задержания» для мембран «Владипор» и «Владисарт» относительно трековых мембран установлено, что различие между сравниваемыми средними величинами статистически не достоверно, за

исключением значений для бактерий Ps.aeruginosa Ю145 эффективность задержания которых на трековых мембранах (85±9 %) достоверно ниже, чем на других сравниваемых мембранах (р<0,05).

На рисунке 3 представлены результаты по эффективности задержания тест-бактерий Е.соМ 1257 исходными и модифицированными трековыми мембранами. Из литературных данных известно (Митрофанова Н.В.. 2003; Хохлова Т.Д., 2001; Нечаев А.Н. и соавт., 2000), что химическое модифицирование проводится для увеличения гидрофильносги и улучшения адсорбционных свойств поверхности мембраны. Исходная трековая мембрана модифицировалась комплексообразующи ми полимерами: полиакриламидом (ПАА) в концентрациях 0,5 и 0,05 %; поливиниллирролидоном (ПВП) в концентрации 0,05%. Эффективность исходных трековых мембран была принята за 100 %. На рисунке 3 представлены результаты, из которых видна тенденция к увеличению эффективности задержания микроорганизмов модифицированными трековыми мембранами, особенно выраженная при модификации полиакриламидом в концентрации 0,5 %, однако различия полученных значений статистически не достоверны (р < 0,05).

140 -I

120 -

1 100 -

1 ко -

3 и 60 -

л 40 -

о 20 -

100

118

120

108

TM ТМ ПАА 0,05 ТМ ПАА 0,5 ТМ ПВП 0,05

Рис. 3 - Эффективность задержания бактерий E.coli исходными и модифицированными трековыми мембранами

В бактериологическом анализе при использовании метода мембранной фильтрации является недопустимым наличие проскока искомых бактерий в фильтрат, в противном случае можно получить дожноотрицательный результат, а в дальнейшем упустить из вида развитие эпидемической

ситуации Поэтому в экспериментальных и натурных условиях проведено исследование фильтрата Фильтрат получали 1) после фильтрации воды модельного водоема с внесенными тест-микроорганизмами Е coli 1257, Ps aeruginosa 10145, Staph aureus 906, Entfaecalis 29212, в агравированно высоких концентрациях - п104 КОЕ/100 мл, 2) после фильтрации нативных вод с высоким уровнем бактериального загрязнения (поверхностные воды)

Проведенные исследования показали высокий концентрирующий эффект трековых мембран с диаметром пор 0,40 мкм, аналогично мембранам «Миллипор», «Владисарт», «Владипор» в отношении микроорганизмов с различной формой и размером клеток при исследовании модельных и натурных вод Проведено 20 серий исследований, ни в одной серии в фильтрате не было обнаружено клеток используемых бактерий, как на стерилизующей мембране, так и при использовании наиболее чувствительного метода - путем помещения фильтрата в среду накопления Это указывает на высокую надежность трековых мембран при проведении бактериологического анализа

В соответствии с третьей задачей работы была проведена апробация трековых микрофильтрационных мембран в натурных условиях при анализе питьевой воды, расфасованной в емкости, воды из подземных и поверхностных источников, сточной

Оценку качества данных вод выполняли по следующим бактериологическим показателям глюкозоположительным, общим и термотолерантным колиформным бактериям (ГКБ, ОКБ, ТКБ), Е coli, Entfaecalis При этом изучали 1) скорость фильтрации 100 мл питьевой воды, 2) морфологические особенности вырастающих колоний, 3) возможность проведения оксидазного теста и скорость проявления реакции, 4) количественные соотношения определяемых показателей качества воды

На первом этапе натурных исследований оценена важная характеристика мембранного фильтра - скорость фильтрации Наравне со степенью задержания бактерий это свойство определяет применимость мембран для микробиологического анализа питьевой воды Для оценки скорости фильтрации измерено время прохождения 100 мл питьевой воды через трековые мембраны, сетчатые мембраны «Владипор», «Владисарт» с последующим пересчетом на площадь фильтрующей поверхности

Установлено (таблица 5), что наиболее быстро происходит фильтрация через сетчатые мембраны, изготовленные из нитроцеллюлозы - «Владисарт» (40 сек), несколько медленнее фильтруется этот же объем воды на мембранах из ацетатцеллюлозы - «Владипор» (45 сек) В пределах 1 минуты происходит фильтрация 100 мл исследуемой воды через трековые мембраны Время фильтрации воды на трековых мембранах достоверно отличается от времени фильтрации на сетчатых мембранах «Владипор» и «Владисарт» (р<0,05) Отличие во времени фильтрации не влияет на скорость проведения анализа воды и вполне удовлетворяет современным требованиям, предъявляемым к мембранным фильтрам

Таблица 5

Скорость фильтрации исследуемых мембран_

Мембранный фильтр Время фильтрации, сек Скорость фильтрации Г мл / сек см21

ТМ 61 ±4 0,29

«Владисарт» 40 ±5 0,44

«Владипор» 45 ±6 0,39

На следующем этапе натурных исследований при определении глюкозоположительных, общих и термотолерантных колиформных бактерий, а также Е coli установлено, что колонии микроорганизмов на мембране «Владипор» часто имеют вытянутую форму, размытые неровные края, наблюдается много сросшихся колоний, на мембране «Владисарт» блеск лактозоположительных колоний, выросших на среде Эндо, не всегда ярко выражен На трековых мембранах колонии микроорганизмов растут изолированно, четко контурированные, выпуклые, правильной формы, легко снимаются с фильтра

При бактериологическом анализе проб воды на присутствие колиформных бактерий (ГКБ, ОКБ, ТКБ и Е coli) неотъемлемой частью на этапе идентификации выросших на мембранных фильтрах колоний является постановка оксидазного теста В работе установлена возможность выполнения на трековой мембране ускоренного метода определения оксидазной активности непосредственно на мембранном фильтре Это позволяет быстро, без этапа пересева колоний на питательный агар, исключить из учета оксидазоположительные не относящиеся к колиформным бактерии, что существенно упрощает и уточняет анализ Поэтому в исследованиях изучена скорость и равномерность проявления реакции на

трековых мембранах, достоверность ответа по сравнению с классическим методом (после посева па питательный агар).

Установлено, что оксидазная реакция проявляется равномерно на всей поверхности исследуемых мембранных фильтров. Временные характеристики оксидазной реакции на трековых мембранах, мембранах «Владипор», «Владнсарт» представлены на рисунке 4.

Впервые было установлено, что при использовании трековых мембран время проведения оке ид аз но го теста достоверно уменьшается в 1,5-2 раза (р<0,05), что сокращает скорость проведения идентификации выросших бактерий. Кроме того, снижается время контакта исследователя с ОксидаЗНым реактивом, в состав которого входят канцерогенные вещества. Различие в скорости реакции объясняется главным отличием трековых мембран - строением поровой структуры. По-видимому оксидазному реактиву легче подняться к колонии по прямому цилиндрическому каналу длинной ~ 10 мкм, нежели по извилистому длиной — 150 мкм.

Показано, что бактерии проявляют одинаковую оксидазную активность как непосредственно на трековой мембране, так и после пересева на питательный агар.

Рис. 4 - Время проявления оксидазной реакции колоний бактерий, выросших на различных мембранах на среде Эндо, при исследовании

нативных вод

На заключительном этапе натурных исследований определены

количественные соотношения показателей качества воды, полученные методом мембранной фильтрации, при использовании трековых мембран и сетчатых мембран, на которых работают практические лаборатории страны («Владипор», «Владисарт») Эксперименты проведены при оценке качества питьевой воды, расфасованной в емкости, воды из подземных и поверхностных источников и сточной Эффективность мембран «Владисарт» принята за 100%

Таблица 6

Количественные соотношения ОКБ и ТКБ при исследовании качества воды _водных объектов на трековых и сетчатых мембранах_

Мембранный фильтр Водный объект

Подземный Поверхностный Сточные воды

ОКБ, % ТКБ, % ОКБ, % ТКБ, % ОКБ, % ТКБ, %

ТМ 97 ±5 98 ±5 95 ±25 152 ±30 108 ±34 93 ± 18

Владипор 94 ± 10 98 ±5 99 ±44 158 ±38 116 ±32 104 ± 12

Владисарт 100 100 100 100 100 100

Установлено (согласно таблице 6), что количество нормируемых индикаторных микроорганизмов, при исследовании нативных вод, на трековых мембранах статистически не отличается от таковых на сетчатых мембранах - «Владипор», «Владисарт» (р<0,05) При исследовании бутилированных вод, в основном, отвечающих установленным требованиям по микробиологическим показателям, не было обнаружено индикаторных микроорганизмов, как на трековых, так и на сетчатых мембранах

В натурных исследованиях был оценен важный для характеристики изучаемых мембран параметр - рост посторонней микрофлоры, который ограничивает использование метода мембранной фильтрации при анализе вод, где численность вырастающих водных бактерий преобладает над индикаторными (ГОСТ Р 52426-2005)

Таблица 7

Количество посторонней микрофлоры на сетчатых мембранах относительно

трековых, выраженное в процентах, при исследовании нативных вод

Водный объект Кол-во посторонних бактерий в % от ТМ

МФ «Владипор» МФ «Владисарт»

Поверхностная вода 158 ±30 166 ±43

Подземная вода 214 ±40 213 ±32

Сточная вода 349± 36 335 ±49

При сопоставлении данных о посторонней микрофлоре, вырастающей на изученных мембранных фильтрах при исследовании поверхностных,

подземных и сточных вод, установлено (таблица 7), что количество посторонних бактерий на трековых мембранах по сравнению с сетчатыми мембранами было достоверно ниже в ~ 1,5 - 3 раза, в зависимости от вида водного объекта (р<0,05)

Изучение данных литературы по размеру бактериальных клеток (Берджи, 1997) показало, что индикаторные микроорганизмы, относящиеся к ОКБ, имеют в среднем размер палочковидной клетки (0,3-1,5x0,6-6,0) мкм, посторонние микроорганизмы в свою очередь имеют практически такой же диапазон размеров клеток - (0,3-1,6x0,5-15) мкм Поэтому, исходя только из размера клеток, не представляется возможным объяснить тот факт, что на трековых мембранах растет меньшее количество посторонней микрофлоры Причиной этого различия, на наш взгляд, может быть химическое строение сетчатых мембран, которые состоят из эфиров органических полимеров -нитрата и ацетата целлюлозы Многие подвижные бактерии родов Су1ор1^а, 8рогосу1орЬа§а, НегреЮБфЬоп, Бога^шт, не являющиеся санитарно-значимыми и обитающие в пресных водоемах, в очистных сооружениях, в качестве источника углерода используют хитин, пектин, крахмал, целлюлозу, следовательно имеют дополнительный источник для роста при попадании их на сетчатые мембраны после фильтрации Трековые мембраны, являющиеся полиэфиром этиленгликоля и терефталевой кислоты, в своем составе не имеют легко усвояемых для бактерий органических веществ, и поэтому рост посторонних бактерий на них менее выражен

В результате, трековые мембраны благодаря инертному материалу, из которого они состоят, обеспечивают преимущество роста колиформных бактерий при выращивании на дифференциальных средах с лактозой Посторонние бактерии не мешают учету индикаторных бактерий из-за меньшего количества, небольшого размера и отсутствия сливного роста Структура поровой поверхности трековой мембраны, а также состав полимера более благоприятны для роста бактерий, являющихся показателями санитарного благополучия водного объекта

Таким образом, в натурных исследованиях полностью подтверждены результаты экспериментов о возможном использовании трековых мембран для бактериологического анализа воды различного вида водопользования.

Методический раздел диссертационной работы включал в себя разработку алгоритма ускоренной оценки мембранных фильтров по

расчету «процента извлекаемое™» тест-бактерий относительно прямого посева Методика проведения анализа, изложенная в международном документе ISO 7704-85, является основной для оценки новых типов мембранных фильтров, впервые используемых в бактериологии, применяется для оценки мембранных фильтров разных марок различных производителей, для сравнительной оценки стабильности качества вновь приобретаемых партий фильтров Этот метод является длительным (с момента первого посева и до учета результатов проходит 4 дня), трудоемким в исполнении, контроль ведется только по одному модельному микроорганизму Нами был разработан ускоренный метод оценки мембранных фильтров в котором

- исключен предварительный этап приготовления разведения модельных микроорганизмов и хранения его в холодильнике до непосредственного использования, поскольку в таком случае концентрация микроорганизмов в приготовленном разведении может измениться как за счет частичного отмирания клеток бактерий, так и оседании их на стенках пробирки,

- предложено внесение посевной дозы непосредственно в воронку фильтровального прибора, содержащую стерильный разбавитель, исключая стадию внесения посевной дозы сначала в пробирку с разбавителем, а потом в воронку,

- контроль проводится на двух штаммах модельных микроорганизмов, с различной формой клеток палочковидной - Е coli 1257 и кокковой -Ent faeeahs 29212

На схеме 1 представлены алгоритмы проведения оценки мембранных фильтров действующий в настоящее время и изложенный в МУ 2 1 4 105701 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды» и разработанный ускоренный

Разработанный ускоренный метод контроля эффективности мембранных фильтров сокращает время проведения исследования на 1 сутки, упрощает проведение посева методом мембранной фильтрации, повышает надежность анализа из-за введения второго модельного микроорганизма, с другими формами и размером клеток

Контроль эффективности МФ по МУ 2.1.4.1057-01 1 день

Пересев тестовой культуры E.coli М1 7-02

Ускоренный метод контроля МФ

Пересев тестовых культур: E.coli 1257,Ent faecalis 29212

1 день

2 день

109 кл/ад

103кл/мл 1О-'кл/мл

разведение

Посев г» 0,1 мл Инкубация при 37°С 24ч. Перенос пробирок с разведениями в холодильник

3 день

Расчет посевной дозы (ПД} Посев методом мембранной фильтрации ПД„_ 20 мл стер.разб. ГЩ

I

11 Отфильтровывают

III Ополаскивают пробирку и отфилыровыааают

IV Дважды ополаскивают воронку Инкубируют мембранные фильтры с посевами

Посев прямым поверхностным методом

Инкубация посевов на чашках при 37°С 24 ч.

d-и день Расчет «процента извлекав мости»

ПД

010s к л/мл С разведение L

!03 к л/мл 2день

разведение

II Посав методом мембранной фильтрации

20 мл

стер, раз eN^ РИмД

103 кл/мл

{ отфильтровывают III Ополаскивают воронку Инкубируют мембранные фильтры

Посев прямым поверхностным методом

103 кп/мл

0,1мл

Инкубация посевов на чашках при 37°С 24 ч.

3 день

Расчет «процента извлекав мости»

Схема I - Алгоритмы оценки мембранных фильтров, используемых для бактериологических анализов волы

ускоренный н действующий в настоящее время

Проведенные экспериментальные и натурные исследования дают основание для рекомендации трековых мембран в практику контроля качества воды различного вида водопользования.

Серийный выпуск трековых мембран позволит решить важную задачу обеспечения практических лабораторий федерального и ведомственного значения надежными средствами аналитического контроля качества воды на основе высокоэффективных мембранных фильтров, изготовленных из более дешевых отечественных материалов, как альтернатива дорогостоящим импортным и менее качественным отечественным мембранам

ВЫВОДЫ

1 Трековые мембраны обеспечивают высокую извлекаемость тест-бактерий по отношению к прямому посеву (91-95%), что соответствует международным требованиям ИСО (>80%), показана нейтральность для бактерий материала, из которого изготовлена мембрана, определен оптимальный диаметр пор трековой мембраны, предназначенной для бактериологического исследования воды (0,40 мкм)

2 Эффективность задержания на трековых мембранах тест-бактерий в эксперименте (85-118 %) и показателей бактериального загрязнения в натурных исследованиях (94-108 %) не отличается (р<0,05) от эффективности задержания на сетчатых мембранах

3 К параметрам, по которым трековые мембраны превосходят используемые в настоящее время мембраны, относятся стабильность физических свойств, при их подготовке к анализу, рост четко оформленных с ровными краями колоний, отсутствие сливного роста, проявление характерных дифференциальных признаков колоний при выращивании на лактозных средах, ускорение этапа идентификации колиформных бактерий за счет быстрого (в 1,5-2 раза) протекания оксидазной реакции на трековой мембране в сравнении с сетчатыми мембранами

4 При исследовании нативных вод установлено, что на трековых мембранах по сравнению с сетчатыми, вырастает в 1,5-3 раза меньше посторонней микрофлоры (р<0 05), мешающей определению индикаторных бактерий

5 Разработанный алгоритм ускоренной оценки мембранных фильтров, используемых для бактериологических анализов воды, исключает этапы,

удлиняющие и усложняющие исследования, снижающие точность результатов Надежность анализа повышается из-за введения второго модельного микроорганизма (ЕЩ Гаесакв) и с иной формой и размером клеток

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Богатырева И А, Недачин А Е Жданов Г С Экспериментальное обоснование возможности использования трековых мембран при выполнении санитарно-бактериологического анализа воды // Водоснабжение и санитарная техника, 2007 - № 5 - С 17-20

2 Колбасникова И А. Недачин АЕ Использовании е отечественных трековых мембран для микробиологического контроля питьевой воды// Материалы пленума научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Современные проблемы медицины окружающей среды» М, 2004 - С 293-295

3 Санамян А Г, Колбасникова И А Оценка эффективности концентрирования вирусов на мембранном фильтрующем элементе // Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Суздаль, 2005 - С 190-191

4 Колбасникова И А . Санамян А Г Метод мембранной фильтрации для микробиологического контроля питьевой воды с использованием трековых мембран // Материалы всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Суздаль, 2005 - С 355-357

5 Колбасникова И А , Недачин А Е Отечественные трековые мембраны в микробиологическом контроле питьевой воды // 1-ая Международная научно-практическая конференция «Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике» Санкт-Петербург, 2005 -С 210-211

6 Алешня В В , Журавлев П В , Головина С В , Панасовец О П , Недачин А Е , Артемова Т 3, Иванова Л В , Талаева Ю Г, Загайнова А В, Буторина Н Н, Ибрагимова Л М, Колбасникова И А Значение индикаторных микроорганизмов в оценке микробного риска при питьевом водопользовании // Материалы пленума научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Экологически обусловленные ущербы здоровью методология, значение и перспективы оценки» М , 2005 -С 178-180

7 Недачин А Е , Артемова Т 3 , Талаева Ю Г , Иванова Л В., Загайнова А В , Колбасникова И А . Буторина Н Н , Ибрагимова Л М Сравнительное значение индикаторных бактерий в оценке потенциальной опасности возникновения кишечных инфекций при питьевом водопользовании // Сборник докладов «Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды» М , 2005 - С 48-63

8 Колбасникова И А. Недачин А Е Отечественные трековые мембраны в бактериологическом контроле питьевой воды // Тезисы докладов III Региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Техногенные системы и экологический риск» Обнинск, 2006 - С 46-49

9 Колбасникова И А. Недачин А Е Перспективы использования отечественных трековых мембран для санитарно-бактериологического анализа воды // Материалы научно практической конференции «Вода, напитки, соки, технологии и оборудование» М , 2006 - С 29-30

10 Недачин А Е Артемова Т 3 , Иванова Л В , Колбасникова И А Загайнова А В , Буторина Н Н, Ибрагимова Л М Состояние и перспектива регламентирования качества питьевой воды по бактериологическим показателям // Материалы научно практической конференции «Вода, напитки, соки, технологии и оборудование» М , 2006 - С 25-26

11 Недачин А Е , Артемова Т 3 , Дмитриева Р А , Доскина Т В , Талаева Ю Г, Иванова Л В , Буторина Н Н , Лаврова Д В , Санамян А Г , Загайнова А В , Колбасникова И А . Ибрагимова Л М, Алешня В В , Журавлев П В , Головина С В , Панасовец О П , Савилов Е Д, Мамонтова Л М, Анганова Е В Основы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России // Сборник докладов «Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды Экология человека, гигиена и медицина окружающей среды на рубеже веков состояние и перспективы развития» М , 2006 - С 107-127

12 Богатырева И А. Недачин АЕ Новые мембраны для эффективного контроля качества питьевой воды // Материалы пленума научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Современные проблемы гигиены города, методология и пути решения» М , 2006 - С 39-41

13 Богатырева И А Трековые мембраны Оценка и перспективы использования при анализе питьевой воды // Материалы научно-практического конгресса III Всероссийского форума «Здоровье нации -основа процветания России, раздел Питьевые воды России - 2007» М , 2007 -С 169-170

14 Богатырева И А Оценка эффективности трековых мембран в отношении индикации бактериального загрязнения воды // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Рязань, 2007 - С 205-206

Заказ № 163/09/07 Подписано в печать 19 09 2007 Тираж 100 экз Усд пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 умт ф ги, е-тай ш/о@с/г ги

Актуальность проблемы

Обеспечение эпидемической безопасности населения России при различных видах водопользования является одной из наиболее важных проблем в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора [67]. Значительная роль водного фактора в распространении возбудителей кишечных инфекций различной этиологии была неоднократно показана в работах как отечественных, так и зарубежных авторов [69, 70, 105]. Снижение заболеваемости населения, связанной с водопотреблением, является проблемой, решение которой во многом обусловлено своевременными профилактическими мерами на основе оценки качества воды по надежным микробиологическим критериям и методам исследования

5].

Проблема качества питьевой воды по микробиологическим показателям продолжает оставаться острой в связи с целым рядом неблагоприятным факторов. Основными причинами распространения возбудителей инфекций водным путем являются низкое исходное качество воды источника водоснабжения, недостаточная обработка питьевой воды на водопроводных станциях, изношенность распределительной сети и нарушения правил ее эксплуатации [53]. Вода является одним из факторов передачи среди людей патогенных микроорганизмов - возбудителей кишечных инфекций бактериальной, вирусной и паразитарной этиологии [49]. Это диктует необходимость совершенствования микробиологических методов контроля воды различного вида водопользования.

В настоящее время в документах водно-санитарного законодательства - СанПиН 1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», СанПин 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения», СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества», СанПин 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества» - разработана нормативная база, предусматривающая контроль качества воды по показателям бактериального загрязнения: глюкозоположительным, общим и термотолерантным колиформным бактериям, общему микробному числу, Staph.aureus, Ps.aeruginosa [7].

При превышении допустимых уровней санитарно-показательных микроорганизмов в воде водных объектов показано непосредственное прямое определение патогенных бактерий. Для контроля воды различного вида водопользования по этим показателям необходимо наличие эффективного отечественного методического обеспечения, дающего возможность осуществления быстрой, адекватной и точной количественной оценки реального микробного загрязнения воды.

Наиболее полно этим требованиям отвечает технология мембранной фильтрации. Для обеспечения надежности этого метода необходимо развивать современные технологии отечественного производства высококачественных мембран для бактериологического анализа на уровне зарубежных аналогов.

В настоящее время в России для микробиологического контроля воды используют мембраны сетчатой структуры, которые изготовлены из материалов, отличающихся по химическому составу, выполнены на различной сырьевой и технологической основе, в результате чего, они отличаются эксплуатационными свойствами и эффективностью при выделении микроорганизмов из воды [31]. Это приводит к противоречивым конечным результатам анализа, снижению эффективности метода, делает невозможным проведение достоверной оценки эпидемической значимости воды при анализе причин формирования кишечной инфекционной заболеваемости населения России [48].

В связи с этим, актуальной задачей является разработка унифицированной системы микробиологического контроля качества воды в Российской Федерации, при которой практические лабораторные службы могли бы использовать единые показатели качества воды, единые методики их определения, единые высокоэффективные мембраны, дающие возможность получать сопоставимые и достоверные результаты. Для решения этой задачи необходимой составляющей является разработка стандартных отечественных мембранных фильтров: нетоксичных для микроорганизмов, удобных при подготовке к проведению анализа воды, высокоэффективных и относительно недорогих.

В нашей стране наряду с традиционными мембранами сетчатой структуры разработаны трековые мембраны. Уже проведены исследования по применению трековых мембран при паразитологическом анализе воды поверхностных водных объектов [75] и изучена их эффективность при оценке вирусного загрязнения воды [72]. Трековые мембраны, обладают следующими физическими параметрами: строго калиброванной структурой пор, малой сорбционной емкостью, оптической прозрачностью, зеркальной поверхностью. Это обусловливает оптимальные функциональные и эксплуатационные свойства трековых мембран, что представляет научный и практический интерес при их оценке к использованию и для бактериологического контроля качества воды.

На основании вышеизложенного целыо работы являлась санитарно-бактериологическая оценка микрофильтрационных трековых мембран в отношении индикации бактериального загрязнения воды различного вида водопользования. Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Провести комплексное исследование трековых мембран для определения возможности их использования в бактериологической практике оценки качества воды;

2. Дать сравнительную оценку эффективности задержания различных видов микроорганизмов трековыми мембранами и сетчатыми мембранами, используемыми в настоящее время в лабораторной практике;

3. Апробировать трековые мембраны в натурных условиях при оценке качества питьевой воды, расфасованной в емкости, воды из поверхностных и подземных источников, а также сточной воды;

4. Разработать алгоритм оценки мембранных фильтров, используемых для бактериологических анализов воды.

Научная новизна работы. Впервые:

1. Получены закономерности по эффективности задержания тест-бактерий на трековых мембранах в зависимости от диаметра пор, что является теоретической основой возможности их применения для бактериологического исследования воды;

2. Дано научное обоснование высокой эффективности трековых мембран при использовании широкого спектра индикаторных и условно-патогенных микроорганизмов;

3. Установлены следующие преимущества трековых мембран по сравнению с сетчатыми мембранами, применяемыми в нашей стране: стабильность физических параметров мембраны в процессе использования; высокая эффективность задержания модельных бактерий; быстрота протекания оксидазной реакции, отсутствие сливного роста вырастающих колоний бактерий, четкая форма колоний с ровными краями, меньшее количество вырастающих посторонних бактерий, при исследовании нативных вод;

4. Разработан алгоритм ускоренной оценки мембранных фильтров.

Практическая значимость

Результаты проведенной работы позволяют рекомендовать отечественные микрофильтрационные трековые мембраны с диаметром пор 0,40 мкм для практического использования при проведении санитарно-бактериологического анализа воды различного вида водопользования.

Выявленные преимущества трековых мембран позволят практическим лабораторным службам при осуществлении контроля качества воды по микробиологическим показателям получать сопоставимые статистически достоверные результаты по разным регионам страны, отражающие реальную эпидемическую обстановку в отношении бактериального загрязнения воды водных объектов.

Результаты исследований учтены при разработке ГОСТ Р 52426 - 2005 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации». Для внедрения в практику разработан проект методических рекомендаций по использованию трековых мембран при санитарно-микробиологическом контроле качества воды.

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проведенных в 2005, 2006, 2007 гг для специалистов бактериологических лабораторий Роспотребнадзора и Водоканалов РФ по оценке качества воды водных объектов (Акт исх. № 033/416 от 20.06.07).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эксплуатационные свойства трековых мембран обеспечивают их использование для бактериологического исследования воды;

2. Эффективность задержания трековых мембран по широкому спектру индикаторных и условно-патогенных микроорганизмов в сравнительном аспекте с сетчатыми мембранами, используемыми практическими лабораториями;

3. Приоритетность трековых мембран для проведения бактериологического исследования воды различного вида водопользования;

4. Алгоритм ускоренной оценки мембранных фильтров, используемых для бактериологических анализов;

ЧАСТЬ I

ВЫВОДЫ

1. Трековые мембраны обеспечивают высокую извлекаемость тест-бактерий по отношению к прямому посеву (91-95%), что соответствует международным требованиям ИСО (>80%); показана нейтральность для бактерий материала, из которого изготовлена мембрана; определен оптимальный диаметр пор трековой мембраны, предназначенной для бактериологического исследования воды (0,40 мкм).

2. Эффективность задержания на трековых мембранах тест-бактерий в эксперименте (85-118 %) и показателей бактериального загрязнения в натурных исследованиях (94-108 %) не отличается (р<0,05) от эффективности задержания на сетчатых мембранах.

3. К параметрам, по которым трековые мембраны превосходят используемые в настоящее время мембраны, относятся стабильность физических свойств, при их подготовке к анализу; рост четко оформленных с ровными краями колоний, отсутствие сливного роста, проявление характерных дифференциальных признаков колоний при выращивании на лактозных средах; ускорение этапа идентификации колиформных бактерий за счет быстрого (в 1,5-2 раза) протекания оксидазной реакции на трековой мембране в сравнении с сетчатыми мембранами.

4. При исследовании нативных вод установлено, что на трековых мембранах по сравнению с сетчатыми, вырастает в 1,5-3 раза меньше посторонней микрофлоры (р<0.05), мешающей определению индикаторных бактерий.

5. Разработанный алгоритм ускоренной оценки мембранных фильтров, используемых для бактериологических анализов воды, исключает этапы, удлиняющие и усложняющие исследования, снижающие точность результатов. Надежность анализа повышается из-за введения второго модельного микроорганизма (Ent.faecalis) и с иной формой и размером клеток.

ГЛАВА 7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящее время для проведения санитарно-бактериологического исследования воды методом мембранной фильтрации выпускается широкий спектр фильтрующих мембран, производимых как в нашей стране, так и за рубежом. Зачастую это так называемые сетчатые мембраны, получаемые из растворов полимеров (производных целлюлозы, полипропилена, поликапроамида) по разным технологиям. При использовании практическими лабораторными службами разных мембранных фильтров они могут получать не достоверные результаты по разным регионам страны. Органы Минздравсоцразвития могут упустить из вида развитие опасной эпидемической ситуации, которая может привести к тяжелым последствиям.

Важно, чтобы практические лаборатории страны использовали единые показатели качества воды, единые методики их определения, единые высокоэффективные мембраны, дающие возможность получа'гь сопоставимые и достоверные результаты. В связи с этим, разработанная и апробированная нами как в экспериментальных, так и в натурных экспериментах микрофильтрационная трековая мембрана может являться единой, высокоэффективной, что очень важно дешевой мембраной для контроля качества воды, различного вида водопользования в Российской Федерации.

В работе впервые проведен объективный подробнейший анализ мембранных фильтров, выпускаемых на сегодняшний день для нужд бактериологии. Зачастую производители не стоят на месте, а выпускают мембраны облегчающие работу практического бактериолога (мембраны различной цветовой гаммы для разных групп микроорганизмов, мембраны с нанесенной сеткой для быстрого подсчета количества выросших колоний бактерий). Несомненно, эти нововведения ускоряют бактериологический анализ, но вместе с тем, не стоит упускать из вида экономическую сторону таких новшеств (такие мембраны чаще дороже стандартных), а также тот факт, что красители, мигрируя в питательную среду, влияют на рост санитарно-показательных бактерий. Кроме того, микроорганизмы практически не растут на линиях калибровочной сетки, нанесенных на мембрану[97]. На наш взгляд применение простых и дешевых аналитических средств анализа в бактериологии сможет легко упорядочить и систематизировать получаемые ежедневные результаты анализа воды различного вида водопользования.

Цель диссертационной работы - гигиеническая оценка микрофильтрационных трековых мембран, предназначенных для бактериологического анализа воды - подразумевает обзорное исследование трековых мембран, ее свойств, влияющих на качество микробиологического исследования воды. Достоинством работы, является то, что трековые мембраны рассматривались и изучались в сравнительном аспекте с используемыми в мире и в нашей стране мембранными фильтрами. В исследованиях не было задачи преднамеренно показать недостатки используемых сетчатых мембран. Главным было объективно выявить все положительные и отрицательные стороны исследуемых мембранных фильтров - трековых и сетчатых.

Производство сетчатых мембран имеет отлаженную технологию уже порядка 100 лет, и за это время мембраны продолжают пользоваться большим спросом, и фирмы их производящие стали практически монополистами в производстве мембран и мембранной техники для микробиологических исследований. В настоящее время практическое использование трековых мембран только набирает обороты, и с каждым годом появляются все новые области применения трековых мембран.

При проведении исследований соблюдался принцип максимального приближения к натурным условиям в отношении выбора водных объектов, спектра модельных микроорганизмов и их концентраций.

В данной диссертационной работе мы постарались максимально подробно осветить все эксплуатационные свойства трековых мембран, играющие роль при бактериологическом анализе воды используя метод мембранной фильтрации.

В работе были исследованы трековые мембраны с широким диапазоном размера пор: (0,40 - 2,00) мкм, но оказалось, что только мембраны с диаметрами пор 0,40 и 0,60 мкм не пропускают исследуемые бактерии в фильтрат. В ходе дальнейших испытаний было установлено, что высокой эффективностью задержания тест-бактерий и бактерий нативного водоема, а также оптимальной скоростью фильтрации обладают трековые мембраны с диаметром пор 0,40 мкм. Поэтому в дальнейших исследованиях оценивались трековые мембраны только с диаметром пор 0,40 мкм.

Оказалось, что данные мембраны соответствуют международным требованиям ИСО по эффективности задержания модельных бактерий. Кроме того, такая проверка осуществлялась на 4-х штаммах микроорганизмов, имеющих различную форму и размер клеток - Ecoli 1257, Ps.aeruginosa 10145, Staph.aureus 906, Ent.faecalis 29212. «Процент извлекаемое™» данных бактерий был в интервале (91 -95)%, что превышает допустимый порог, определенный международным стандартом ИСО 7704-85 (> 80%>), и, следовательно, удовлетворяет требованиям данного стандарта.

Трековые мембраны подтвердили свои стабильные физико-химические свойства, необходимые для проведения бактериологического анализа -сохранение линейных размеров и отсутствие деформации при кипячении в дистиллированной воде; нейтральность для бактерий материала, из которого изготовлена мембрана. Эти преимущества по сравнению с сетчатыми мембранами обусловлены свойством полиэтилентерефталата - полимера, из которого изготовлена трековая мембрана. ПЭТФ характеризуется высокой прочностью при растяжении, устойчивостью к истиранию и многократным деформациям; сохраняет основные эксплуатационные характеристики в диапазоне рабочих температур (от - 60 до 170 °С); обладает стабильными физико-химическими свойствами в процессе эксплуатации.

При сопоставлении эффективностей задержания тест-бактерий (E.coli 1257, Ps.aeruginosa 10145, Staph.aureus 906, Ent.faecalis 29212) на трековых и сетчатых мембранах установлено, что трековые мембраны ничуть не уступают сертифицированным по международным стандартам и используемым в нашей стране мембранам «Миллипор», а с экономической точки зрения точки зрения даже превосходят, поскольку состоят из более дешевых отечественных материалов. Данные этих экспериментальных исследований в очередной раз подтвердили пригодность использования принципиально нового типа мембран - трековых мембран - для проведения бактериологических исследований воды.

Такая же тенденция отмечалась и в натурных исследованиях при использовании в методе мембранной фильтрации для анализа бутилированных, подземных, поверхностных и сточных вод, трековых мембран и отечественных сетчатых - «Владипор», «Владисарт».

Несомненным преимуществом трековых мембран при анализе натурных вод является рост контурированных, выпуклых колоний, четко дифференцированных по цвету. Из-за уникальных особенностей поровой структуры поверхности трековой мембраны питательная среда не окрашивает фильтр, как это происходит у сетчатых мембран с рыхлой поверхностью и большой дисперсностью размера пор. Колонии микроорганизмов на сетчатых мембранах часто имеют вытянутую форму, размытые неровные края, наблюдается много сросшихся колоний, что, несомненно, отрицательно сказывается при их дальнейшем исследовании.

Основным достоинством трековых мембран, полученным при анализе натурных вод, оказалось достоверно более быстрое протекание оксидазной реакции (в 1,5-2 раза), что сокращает скорость проведения идентификации выросших бактерий. Кроме того, снижается время контакта исследователя с оксидазным реактивом, в состав которого входят канцерогенные вещества.

Различие в скорости реакции объясняется главным отличием трековых мембран - строением поровой структуры.

Кроме того, установлено, что на трековых мембранах в 1,5-3 раза меньше чем на сетчатых наблюдался рост «посторонней» микрофлоры, мешающей учету индикаторных микроорганизмов. На наш взгляд это обусловлено химическим строением полимеров, из которых изготовлены мембраны. Сетчатые мембраны в своем составе имеют легко усвояемое питательное вещество - целлюлозу, которое является источником дополнительного органического питания для многих сапрофитных бактерий, обитающих в пресных водоемах, в очистных сооружениях.

В результате, трековые мембраны благодаря инертному материалу, из которого они состоят, обеспечивают преимущество роста только индикаторных колиформных бактерий при выращивании на средах с лактозой. Посторонние бактерии не мешают учету индикаторных бактерий из-за меньшего количества, небольшого размера и отсутствия сливного роста.

Таким образом, обобщая обширные теоретические, экспериментальные и натурные наблюдения, можно сделать вывод о том, что трековые мембраны по своим надежным физико-химическим свойствам, высоким эффективностям задержания индикаторных и тест-бактерий, росту четко оформленных колоний с характерными дифференциальными признаками, по достоверно более низкому росту посторонних бактерий превосходят мембраны, выпускаемые на данный момент в нашей стране, и не уступают зарубежным сертифицированным мембранам.

Проведенные экспериментальные и натурные исследования дают основание для рекомендации трековых мембран в практику контроля качества воды различного вида водопользования.

Серийный выпуск трековых мембран позволит решить важную задачу обеспечения практических лабораторий федерального и ведомственного значения надежными средствами аналитического контроля качества воды на основе высокоэффективных мембранных фильтров, изготовленных из более дешевых отечественных материалов, как альтернатива дорогостоящим импортным и менее качественным отечественным мембранам.