Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка экспресс-тестов для определения IgE и аллергенспецифических IgE-антител

\п 12 9 2

ГОСКОМИТЕТ САНЭПИДНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

САЛЬМА АЛИ АБДАЛЛА

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-ТЕСТОВ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ^Е И АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ 1&Е-АНТИТЕЛ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/Л , Москва — 1992

/ /У 5 » ; , /-/ V - , . ) / , ч-; , с..- <

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте биотехнологии и Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук Р. Г. Василов кандидат медицинских: наук А. Ф. Киркин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор ЛИТВИНОВ В. И. доктор химических наук САВИЦКИЙ А. П.

на заседании специализированного совета К 084.18.02 Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт иммунологии МЗ РФ

Защита состоится «

1993 г. в час.

Автореферат разослан «

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О. В. КОТЕЛЬНИКОВА

РОССИЙСКАЯ

•лт^тм наЯ

ПРОБЛЕМЫ. Успехи в развитии медицины и, в частности, методов диагностики, привели к тому, что спектр услуг, оказываемых ранее только крупными диагностическими центра.', т, становится доступнш также небольшим клиникам и диагностическим кабинетам. Это стало возможным благодаря появления простых диагностических тестов, для постановки которых не требуется дорогостоящего оборудования и узкой специализации персонала. Разработка таких тест-систем основана на современных иммунохимических ызгодах с применением новых видов твердой фазы, высокоспецифнчиьк иммунореагентов, новых чувствительных маркеров н способов их детекции.

В связи с широкой распространенностью аллергических заболеваний особую актуальность приобретает совершенствование методов их диагностики. Одним из важных диагностических признаков атонического характера заболевания является повышенная концентрация 1дЕ п .'¿рови человека. Значительная роль в диагностике аллергических заболеваний отводится определению аллер-генспецифических 1д£ антител Iп »Нгз, особенно в тех клинических ситуациях, когда противопоказаны кожные и провокационные пробы : ранний детский возраст, обострение основного заболевания, прием гипосенсибилизирующих фармакологических препаратов.

Новейшие разработки в области иммунофармзнтного анализа позволяют значительно расширить спектр выпускаемых диагностн-кумов для определения уровня 1д£ (как общего, так и аллергенс-йедафнчаского), пригодных для клиник, не обеспеченных специальным оборудованием. Это является весьма актуальным, особенно для развивающихся стран, так как позволяет проводить быстрое.

-• 4 -

недорогое и эффективное обследование населения.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящей работы является создание простых, удобных в использовании имыунофермент-ных т#ст-систем на индикаторных полосках для определения igE и аллвргенсдецифических IgE антител, с визуальной оценкой результата. При выполнении работы ставились следующие задачи :

' .I. Разработка теста для полуколичественного определения уровня общего IgE на индикаторных полосках в диапазоне O-IOOO МЕ/мл.

2. Разработка инмунохроматографического экспресс-теста на индикаторных полосках для определения уровня общего IgE в сыворотке крови человека.

3. Разработка метода для определения аллергенспецифичбс-ких Igt антител на индикаторных полосках.

4. Разработка приборного обеспечения для серийного выпуска диагностических систем такого типа.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Разработана иммуноферментная тест-систома для полуколичдственного определения уровня общего IgE на индикаторных полосках - "Алтест", которая позволяет проводить визуальную оценку результатов в широком диапазоне (20 - 1000 МЕ/мл).

Впервые в мировой практике разработана иммунохроматогра-фическая тест-система для определения уровня общего IgE - "Ал-лергоскрин", основанная на методах "сухой химии". Тест-система позволяет визуально определять концентрацию IgE в диапазоне 0-1000-МЕ/мл. Система представляет из себя полоску полимерной мембраны на которую уже нанесены, в определенной последова-

тельности, все необходимьв иымунореагенты, В этой система выявляющие антитела связаны с частицами цветного латекса, что позволяет избегать длительные стадии инкубации и отдавки. Время анализа - 5 ганут.

Разработан ндаунофэрмепиалй кетод для определения специфических 1дЕ антител одновременно к 12 аллергенам - "Алс-крннч дЕАт". Данная тест-система значительно упрощает задачу выявления сенсибилизирующего агента (аллерпзна).

Все три разработанные тест-системы "Алтест", "Аллергоск-ркн", "Ало 1српп-1 дЕАт" позволяет проводить быструю визуальную оценку урозгл I о£ ( общего г дБ - "Алтест" и "Аллергоскрин") и я лле р гв не гю цнфн' ю с к их I дЕ антител ("Алскрин-ГдЕЛт") в сыворотка крови человека, что важно при скрининга иммуного статуса человека, первичной диагностике аллергических заболеваний, им-муиодефищггов, паразитарных инвазий и парапротеинемий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Утверждены медико-технические требования и лабораторный регламент на производство описанной тест-системы "Алтест". Разработанная тест-система "Алтест" для полуколичественного определения уровня 1д£ в диапазоне 0-1000 МЕ/мл прошла лабораторные и клинические испытания.

Утверждены медико-технические требования, подготовлены проекты технических условий и инструкция по использованию ди-агностикума "АллергоскршГ. Проведены лабораторные испытания.

Разработан экспериментальный комплект приборов для опытного производства иимунохимических тест-систем, В состав комплекта входит многоканальный линейный дозатор, предназначенный для нанесения реагентов на мембрану, ' и устройство для нарезания индикаторных полосок. Проведены испытания эксперименталь-

ных образцов приборов для-опытного производстба' 'Дгог!Кост!:ч5:с-ких систем

Предложенные технологии могут быть использованы для разработки и производства простых и надежных тест-систем, необходимых для диагностики различных заболеваний.

ПОЛОКЕШШ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: I. Разработка ишуноферментной тест-системы "Алтест" на индикаторных полосках для полуколичественного определения уровня общего IgE в сыворотке крови человека, в диапазоне 0-1000 МЕ/мл.

2. Разработка экспресс-теста "Аллергоскрин" для определения уровня общего IgE, основанного на применении методов имму-нохроматографии и "сухой химии".

3. Разработка иммуноферментной тест-системы "Алс-крпн-l дЕАт" на индикаторных полосках для определения аллер-генспецпфическнх IgE антител в сыворотке крови человека.

4. Разработка методических подходов и приборного обеспечения для серийного выпуска диагностических тест-систем, основанных на ишунофермзнтных и иммунохроматографических методах.

АППР0БАЩ1Я РАБОТЫ Диссертация аппробирована 28 октября 1992г на коллоквиуме отдела медицинских диагностикумов НПО "Биотехнология". Материалы диссертации были представлены на II Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990), на Международном симпозиуме по аллергии и клинической иммунологии "Regulation and Clinical significance of IgE" (Москва,.1990), на IX Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Зеленоград, 1991), на XIv Международном конгрессе по аллерго-

- 7 -

логин и иммунологии (Киото, I9SI).

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной час-ян, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 179 работ. Работа изложена на 103 страницах, содержит 10 рисунков и 7 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. РАЗРАБОТКА ПОЛУКОЛИЧБСТВЕННОГО ТЕСТА "AJITECT"'

НА ИНДИКАТОРНЫХ ПОЛОСКАХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ IgE В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОЗЕКА

В сыворотке крови здоровых людей содержание IgE невелико, но резко увеличивается при аллергических заболеваниях атопн-ческого типа, паразитарных и глистных инвазиях, вирусных и бактериальных инфекциях и некоторых ишунодефицитных состояниях. Поэтому определение содержания IgE имеет вакное значение в постановке правильного диагноза, необходимо перед проведением ряда лечебных мероприятий, а такта для оценки иммунологического статуса человека и обоснования лечения.

В НПО "Биотехнология" ранее были получены моноклональные антитела к иммуноглобулину Е человека серии Ig£/EI и на основе пары антител IgE/II-З и lgE/lI-5 бйла разработана иммуноферментная тост-система для определения концентрат™ IgE в диапа-

зоне 25-1000 ME/мл. В качестве твердой фазы использовались 96-луночные полистпроловые планшета

Основная задача данной работы - конструирование максимально упрощенных быстрых тестов на общий и аллергенспецифи-ческий igE, с визуальной оценкой результатов, которые мошю было бы широко использовать в лабораториях и клиниках, не обеспеченных специальны.! оборудованием, в том числе в развивающихся странах, для быстрого, недорогого и эффективного обследования населения.

Для разработки таких тестов необходимы антитела, обладающие очень высокой чувствительности л специфичности).

Для создания полуколичественной иммуноферментной тест-системы для визуального определения уровня IgE в сыворотке крови человека была отобрана пара моноклональных антител IgE/11-1 - I gE/II-4.

Хотя Kaff антител IgE/II-З и IgEAl-5 не значительно отличается от Kaff антител lgE/11-I и IдЕ/II—4, предпочтение было отдано IgE/lI-I и IgE/II-4, в связи с тем, что чувствительность иммуноферментной тест-системы оказалась на порядок выше.

При получении коньюгата антител (I gЕ/11-1) с пероксидазой хрена были внесены некоторые изменения в традиционный протокол периодатного окисления по Hakane (1974). Было определено оптимальное соотношение анти-lgE антител и пероксидазы. Результаты оценивали в ИФА и по профилю гель-фильтрации на колонке с Се-факрилом $-300. При весовом отношении пероксидаза: антитела 1:2 - I: 3 количество непрореагировавших иммуноглобулинов и пероксидазы было минимально, а пик, содержащий высокомолекулярные полимеры, практически отсутствовал. Чтобы снизить вероятность образования высокомолекулярных полимеров, диализ был заменен

hs гвль-фил^траци» Таким образом было достигнуто достаточно высокое i;a-:ooTso и воспроизводимость при получении разных партии коньюгатэв.

Были подобраны оптимальные концентрации реагентов и режим иу нанесения на мзмбраны, а та ¡ска тип мембран, наиболее подходящий для проведения теста.

В качестыэ твердой фазы использовали полоски, приготовленные из листов микропористой полимерной мембраны (shletcher à Schuel 1, 0.45 жм). Блоки ¡шроцеллюлозной мембраны приклеивали на листы полужесткой основы, наносили необходимые имыуно-рзагентн - енти-lgE антитела 1дЕ/Г1~4 (конц. 3 кг/мл) в виде тонкой линии шириной Г. 3 m и разрезали на отдельные индикаторные полоск.т. Нанесение реагентов и приготовление индикаторных полосок осуществляли на разработанном комплекте приборов.

Анализ проводили следующим образом : в пробирку содержащую исследуемую сыворотку и коныогат ! gE/'II-I антител с перок-сидазой хрена в соотношении I: I опускали индикаторную полоску, с уже иммобилизованными антителами I g Е/11-4. После 2х-часовой инкубации индикаторную полоску тщательно отмывали и проявляли субстрат-хромогенной смесью (15 мин). Концентрацию IgE в исследуемой сыворотке определяли визуально путем сравнения интенсивности окрашивания с образцами с известной концентрацией I gE (О, 20, 120, 500, IOOOME/мл), используемыми в качестве стандартов (рис. I).

Рис.1 Индикаторные полоски для определения общего 1дЕ "Алтест" б сыворотках крови больных, с помощью стандартов : 1-0 МЕ/мл; 2-20 МЕ/мл; 3 - 120 МЕ./мл; 4 - 500 МЕДта; 5 - 1000 Ж/мл.

Для приготовления стандартов, псполъзуеыых при получении индикаторной шкалы, отбирали сыворотки аллергических больных. Сыворотки центрифугировали и после соответствующей обработки (добавления ингибиторов протеаз, стабилизаторов) измеряли содержание I дЕ с помощью коммерческих наборов. Путей смешивания сывороток с разной (высокой и низкой) концентрацией 1дЕ, получали образцы с содержанием 1дЕ : 20, 120, 500 и 1000 МЕ/мл, которые использовали в качостве стандартов. Для приготовления контрольной пробы, не содержащей IдЕ (0 МЕ/мл), использовали сыворотку лошади.

- II -

Были подобраны оптимальные условия проведения анализа. Основные аналитические характеристики разработанной тест-системы "Алтест" и результаты проведенных лабораторных испытаний представлены в таблице I.

ТАБЛИЦА I. Основные характеристики и результаты, полученные в ходе лабораторных испытаний полуколичественного теста "Алтест" для определения уровня общего IgE.

измеряемый параметр основная характеристика

Принцип метода Одностадийный, твердофазный

ИФА, с использованием пары

мкАт разной специфичности

Твердая фаза Нитроцбллшозные индикаторные

полоски с разм. пор 0. 45 мкм

Общее время анализа 2ч 15 мин

Обьем пробы 60 МО

Диапазон измерений 0-1000 МЕ/мл

Чувствительность 20 МЕ/мл

Воспроизводимое^ КВ%) 4-5%

Оценка результатов визуа,льная, полуколичественная

Испытания тест-системы "Алтест" проводили на 181 сыворотке больных. Измерение IgE велись паралелльно в системах "Алтест" .и "IgE-ElA" (Pharmacia). Проведенные испытания показали, что в 98% случаев результаты, полученные в двух системах совпали.

Полученные результаты дают основание утверждать, что основные характеристики разработанной тест-системы - высокая чувствительность (20 МЕ/мл) и воспроизводимость (4-5%), а так-

же простота использования и возможность визуального учета результатов отвечают современным требованиям, предъявляемым к подобным тест-системам.

2. РАЗРАБОТКА ЭКС ПРЕС С-ТЕС ТА "АЛЛЕРГОСКРИН" ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1дЕ С ПОМОЩЬЮ КММУНОХРОМАТОГРАФШ И "СУХОЙ ХИ1.МИ"

Тест-система "Аллергоскрин" предназначена для полуколичественного определения 1дЕ в крови человека и основана на применении пммунохроматографии и "сухой химии". Схема анализа упрощена максимально:' единственно0, что нужно сделать - это нанести несколько капель исследуемой сыворотки в окошечко индикаторного устройства, и можно визуально оценивать результат уже чорез 5 минут. Все необходимые реагенты уже нанесены на полоски, что позволяет избежать стадии инкубации и отмывки, и дает возможность максимально сократить время проведения анализа. Такие тест-системы могут быть использованы в лабораториях, не имеющих специального оборудования, врачебных кабинетах и полевых условиях.

Активным компонентом индикаторной полоски являются 2 типа моноклональных антител, способных специфически связыватся с различными антигенным« детерминантам! молекулы 1дЕ. Первые (I дЕ/11-4) - нанесены на мембрану, вторые (I дЕ/П-1) кокьюги-рованы с частицами цветного латекса. Были подобраны оптимальные концентрация и режим нанесения на мембрану первых антител; подобран размер пор мембраны, позволяющий частицам латекса свободно перемещатся вдоль мембраны вместе в фронтом жидкости. Кроме того, мы выбрали наиболее подходящий метод конъюгации антител с латексом. Так оптимальным оказался метод ковалентно-

го связывания, с использованием карбодиимида ( 1-е t h >1-3-(3-di methyl ami nopropyl) в качестве сшивающего реагента, описанный G. Quash et al (1978).

Для приготовления индикаторных полосок использовали нит-роцеллюлозную мембрану с размером пор 5 мкм (sh7eicher 4 Schuel 1, Германия). Необходима реагенты наносили на блок мембраны с помощью многоканального линейного микродозатора, затем инкубировали блок с индифферентным белком (1% BSд) и разрезали его на отдельные полоски.

Каждая полоска заключается в пластмассовый корпус и представляет собой диагностическое (индикаторное) устройство. Каждое индикаторное устройство герметично упаковывается во влагонепроницаемый пакет. Для дозирования исследуемого образца прилагается пластмассовая капельница одноразового использования. В корпусе устройства имеется три окошечка : для добавления образца, учета результатов и контрол.. реакции. .

В окошечко для приема образца индикаторного устройства вносятся 3 капли сыворотки. За счет капиллярных сил начинается перемещение образца и моноклональкых антител, коньюгпрованных с латексом, вдоль полоски мембраны, образующийся комплекс 1 gЕ/11-4 - IgE - I gE/II-I антитела-латекс концентрируется в зоне нанесения 1дЕ/11-4антител. Учет результатов реакции проводится визуально через 5 минут. В итоге формируются 2 окрашенные линии (рис. 2). На первой линии образуется комплекс : моноклональные lgE/II-4 антител - IgE - моноклональные I gЕ/11-1 антитела-латекс, на второй линии : поликлональные ан-ти-мьшиныэ антитела - моноклональные lgE/ÏI-I антитела-латекс. Интенсивность окрашивания первой линии пропорциональна уровню IgE в образце, который определяется визуально по цветной инди-

• - 14 -

каторной шкале, помещенной на пластмассовом корпусе (или в прилагаемой инструкции к набору), в значениях : <20; >2СХ120; >120<500; >500<100; >1000 МЕ/мл. Бгорая окрашенная полоска является внутренним положительным контролем тест-системы.

Рис. 2 Принцип иммунохимического анализа уровня IgE, основанного на методах тонкослойной хроматографии и "сухой химии"

1. Зона иммобилизованных антител к иммуноглобулинам мыши

2. Зона иммобилизованных моноклональных антител I gE/II-4

3. Зона моноклональных антител igEAl-I, конъюгированных с цветным латексом

4. Формирование комплекса мкАт 1дЕД1-4 - IgE - ыкАт IgE /11-1-латекс

5. Формирование комплекса антитела против иммуноглобулинов мыш--мкАт IgE/11-1 - латекс

6. Линия индикации

7. Линия контроля

- 15 -

Для разработки индикаторной шкалы были использованы стандартные сыворотки, содержащие 0, 15, 20, 120, 500 и 1000 МЕ/мл.

Разработанная тест-система прошла лабораторные испытания. В настоящее время подготовлена.вся необходимая документация и изготовлены опытные партии наборов для прохождения межведомственных испытаний.

Экспресс-тест "Аллергоскрйн" основан на иммунохроматогра-фип и "сухой химии" и предназначен для полуколичественного определения уровня igE в сыворотке и'плазме крови человека. Кан-дая индикаторная полоска содержит в себе все реагенты для проведения анализа, включая положительный и отрицател: чый контроле Результаты учитываются визуально, через 5 минут, по цветной индикаторной шкале в 5 уровнях : <20; >2СК120; >120<500; >500<1000; >1000 МЕ/мл.

3. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТВ&1 " АЛСКРШ-I дЕАт" ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕКСПЕПИФИЧЕСКИХ I дЕ АНТИТЕЛ

В связи с расширением спектра веществ, выступающих в качестве сенсибилизирующих агентов (аллергенов), актуальным яв-ляотся разработка тест-систем для быстрого определения повышенной чувствительности организма к конкретному аллергену.

Наиболее перспективной, с нашей точки зрения, являются полуколичественные скрининговые тест-системы, основанные на ДОТ-взрианте иммуноферментного анализа. Такие тест-системы уже выпускаются рядом зарубеженых фирм ("снс", Швеция; "qui del", США). Одной из задач нашей работы являлась разр.эбо гкз тест-системы для выявления аллергенспецпфических IgF ашчтел

на основе моноклональных антител IgE/lI. В работе использовались наиболее распространенные в Европейской части России аллергены, которые наносили на нитроцеллюлозныз мембраны с помощью линейного микро доз агора в концентрации 600 мкг/цл. Были приготовлены 4 блока с различными комбинациями аллергенов.

А - D. pteronyssi ñus, 0. farlnae, эпидермис и шерсть кошки,

собаки, пыльца Alternarla, Aspergillus sp. в - пыльца березы, тимофеевки, полыни, амброзии, подорожника, подсолнуха С - пыльца тимофеевки, рхси, костера, рейграса, ежи, пырэя О - пыльца овсяницы, мятлика, подсолнуха, одуванчика,

амброзии, полыни На лист полужесткой подложи наклеивали сразу по два блока нитроцеллюлозы - по одному на каждую сторону, и затем лист разрезали на отдельные полоски (50x6мм). Для предотвращения неспецифического связывания полоски блокировали индифферентным белком

Индикаторные полоски затем инкубировали с сыворотками больных f1ч с неразведэнной сывороткой или I. 5ч при разведении 1:1),- отмывали, инкубировали с конъюгатом моноклональных lgE/11-I антител с пэроксидазой храна (1ч) и проявляли систему с помощью субстрат-хромогенной смаси. Сыворотки с известным уровнем специфических igE антител к пыльце тимофеевки, соответствующие I -IV классам RAST, использовали в качестве стандартов для получения индикаторной шкалы (рис.3).

А.

П

1У шп! ¡1 2 3 4 5 6

Рис. 3 Индикаторные полоски для определения аллер^енспецифи-ческих igE-антител

A. Специфические IgE-антитела к пыльце тимофеевки, соответствующие и-iv классам rast

B. Пример положительных результатов анализов к различным аллергенам: I) 0. pteronyssl nus; 2) подсолнечник;

3) тимофеевка, полынь, амброзия; 4) D. farlnae; 5) оду-' венчик; 6) рейграс.

Результаты реакции учитывали визуально по цветной индпсэ-торной шкале. Для получения цветной шкалы использовали г'.онт- • рольные сыворотки из набора rast ("Pharmaciа", Швеция). Оценка интенсивности окрашивания проводили с помощью денситометра (cahag tlc scanner ii, Швеция). В качестве стандарта использовали сыворотку крови человека, содержащую специфические ige антитела, соответствующие ii классу rast. В качестве рефе-ренс-теста использовался коммерческий набор Phadezym 'RAST (Pharmaci а).

Было проведено сравнительное изучение определения I дЕ антител, специфических к пыльце тимофеевки в разработанном тесте "АлскринЧдЕАт" и тесте Pharmacia Phadezym rast. Результаты приведены в таблице 2. Из 267 использованных сывороток, отобранных по результатам тестирования в кожных пробах, 149 были положительны, а остальные 118 - были отрицательны. В тесте "Алскрин-I дЕАт" 105 сывороток давали положительные результаты, а в тесте Phadezym rast - только 79. Таким образом, чувствительность "Алскрин-i gЕАт" оказалась выше (70,4% - для "Алс-крин~1дЕАт", и 53% - для rast). Из 118 отрицательных по результатам кожных проб сывороток в тесте Phadezym rast отрицательными были 101, а в тесте "АлскринЧдЕАт" - 94. Таким образом, специфичность системы Phadezym rast оказалась - 85,6%, toi'да кап специфичность "АлскринЧдЕАт" -79.6%.

ТАБЛИЦА 2. Определение аллергенспецифических igE-антител в сыворотке крови больных поллинозами с помощью тест-системы "АлскринЧдЕАт" И "Phadezym RAST" (Pharmacia)

Кожные пробы

Кожные пробы

+

+

АлскринЧдЕ-АТ +105 24 Phadezym RAST -44 94

+79 17 -70 101

ВСЕГО

267

267

Чувствительность 105Д49=70. Л% Специфичность 94/118=79.6% Точность' 199/267=74.5%

Чувствительность 79Д49=53. 0% Специфичность 101/118=85.6% Точность 180/267=70.0%

- 19 -

Разработан полуколичественньш скрининговый тост д-^я ления сенсибилизирующего агента. Оценка результатов ко:::с? производиться визуально, путем сравнения с реферэнс скгсрсткямя ' II, III и IV классов rast. Тест-систему отличает высокая чувс-■ твительность (70.4%), специфичность (79.6%), точность (74. 5%) н простота проведения анализа.

4. РАЗРАБОТКА ПРИБОРНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ СЕРИЙНОГО ВЫПУСКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕГЛ В результате исследований, проведен"ьк совместно с НПО "Биоприбор" , был создан экспериментальный образец комплекта приборов для разработки и опытного производства иг^лунохкмичес-' ких тест-систем на основе мембранных носителей (комплект при-, боров для ИХА). ' '

В состав комплекта приборов входит линейный mhöi .канальный полуавтоматический микродозатор и устройство для нарезания индикаторных полосок из мембранных блоков (рис. 4). Линейный многоканальный полуавтоматический дозатор обеспечивает нанесение растворов биополимеров (в данном случае - моноклональиыа антитела или аллергены) на блок мембраны (нитроцеллюлоза, нейлон) на подложке из полужесткого пластика в виде пепрзривньгс параллельных линий . Имеются два съемных узла нанесения жидкости с объемами наносимого без перезаправки раствора пс кал- -дому каналу 0.5 или 3 ил.

Меняя наносящие головки, моино менять количество нанесенных линий и расстояние между ними. В состав комплекта'",дозатора входят 3 запасные головки. На головке 1-8 каналов, росстоя-мэх-ду соседними линиями головки Т - Змк Расстояние между соседними линиями головки 2-9 мм, число каналов - 2. Расою-

Рис. 4 Комплект приборов для разработки и опытного производства имыунохимичоских тест-систем:

а) линейный многоканальный ыикродозатор;

б) трибор для нарезания индикаторных полосок.

яние мэвду соседним! линиями головки 3 - 13мм, число каналов -2. Ширина линий может варьировать в пределах от 0. 9 до I. 3 им.' Для обеспечения ширины линий объемная подача раствора устянав-i ливается в пределах от 0. 8 до 3 мкл/сек. Скорость продвижения полоски мембраны варьирует в пределах от 10 до 55 км/сек.

Устройство для нарезания индикаторных полосок обеспечива- . ет разрезание мембранного блока шириной от 30 до 50 мм и длиной до 300 м на индикаторные полоски шириной от 4 до 8 мм. _ Устройство для нарезания индикаторных полосок обеспечивает производительность не менее 30 полосок в чинуту в режиме резания и оборудовано приемником полосок.

Комплект обеспечивает нанесение твердофазных ; еагентов на различные типы микропористых полимерных мембран, приготовления блока мембраны на полужесткой основе, и нарезание его на отдельные индикаторные полоски. Важным свойством разраб. ганного комплекта приборов является его универсальность, т. е. он может быть использован для создания дкагностикумов, основанных на использовании методов иммунохроматографии и "срой химии" для определения широкого спектра биологических молекул.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан полуколичественный тест "Алтест" для определения уровня общего I дЕ в сыворотке крови человека в диапазоне от 0 до I0G0 МЕ/мл, позволяющая проводить визуальную оценку результатов. Разработанная тест-система является одностадийным методом. Тест-систему отличает высокая чувствит ельность (20 !ЛЕ/мл), воспроизводимость (4-5^).

2. Разработан экспресс-гетод "Аллергоскрин" д.лч цолучолн-

чественного визуального определения уровня общего 1дЕ в сьто-ротке крови человека на основе метода иммунохроматографии н "сухой химии", с использованием цветного латекса, что позволяет сократить время анализа до 5 мкн. Простота проведения анализа достигается за счэт того, что все необходимые реагенты нанесены на полоску нитроцеллншозной мембраны. Тест-систему отличает высокая чувствительность (20 МЕ/мл), воспроизводимость (10%).

3. Разработана тест-система "Алскрин-1 дЕАт" для определения аллергенспецифичэских 1дЕ антител на индикаторных полосках. Тест-систома позволяет визуально оценивать уровень специфических I дЕ антител одновременно к. 12 аллергенам. Тест-систома обладает высокой чувствительностью (70.4%), специфичность» (79. 6%), и точностью (73. 8%) анализа.

• 4. Разработано приборное обеспечение для серийного выпуска диагностических систем на индикаторных полосках. В комплект оборудования входят: линейный многоканальный никродозатор для нанесения иммунореагентов на мембрану и прибор для нарезания блока мембраны на отдельные индикаторные полосоки. Комплект приборов может быть использован в производстве наборов для определения широкого спектра биологических веществ, использующих принципы иммунохроматографии и "сухой химии".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I.' ИФА тестсистомы на дипстиках для визуального определения I дЕ и аллергенспецифических 1дЕ-антител / Р. Г. Василов, Власов Г.С., Сердак 0. А. и др. //Мат. И Всесоюзной конференции "Современные тенденции развития медицинских да-

- 23 -

агностикумов". / Москва, 1990, с. 88.

2. Хроматографлческие катоды имиунохшшческого анализа на микропористых полимерных мембранах. / Власов Г. С., -Абдзл-ла С. Л., Папазов И. П. и др. // Мат. 11 Всесоюзной конференции "Современные тенденции развития медицинских диаг-ностикумов". / Москва, 1990, с. 90.

3- Test-strips' з 11 srgen-specl f 1 с' IgE enzyme Immunoassay / Vlasov G. S., Serdjufc 0. Л., Smlrnova E. Y. et al. // International Symposium on Allergy and Clinical Immunology /'Moscow, Apr 1990, p.70.

1. Determination of blood serun IgE levels based on dry chemistry and 1 mmunochromatography methods / f.bdalla S., Vlasov G., Serdjuk 0. et al. // XII International Congress of Allergology S Clinical Immunology / Kyoto, Oct. 1991, p. 382.

>. Inhibition of a microdot 1 mminoenzyme assay In the estimation and standartlzatlon of specific activity of allergen preparations / Vlasov G., Krasnoproshlna L-, Kanochurina N. et al. // XII International Congress of Allergology Л Clinical Immunology / Kyoto, Oct. 1991, p. 268.

. Современное положение и тенденции в использовании микропористых полимерных мембран в импунохлмичзском анализе / Власов Г. С., Снегирева 1L С., ЛЗдалла С. А. и др. //' Мат. I X Всесоюзного сш.?позиум? "Синтетические полторы медицинского назначения" / Зеленоград, 1991.

. Разработка технологии иммунохшппесг.нх тест-систем на дипстиках / Власов Г. С., Абдзлла С. к , Смирнова Е. Я. и др. // Пат. конференции ЕИП1 dntmxmmnm "Современн**}

- 24 -

направления развития биотехнологии" / Москва, 19Э1,«. <5\ 0. Иадицикские диагностикумы основанные на биоиижэнерных методах, ишунохроиатографии и сухой хпыиа / Власов Г. С,, Абдалла С. А. // Мат. конференции ВНИИ биотехнологии "Сов-решяныэ направления развития биотехнологии", '3<и,е. М.