Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Прямое и опосредованное действие биогенных аминов на различные субпопуляции лимфоидных клеток

:0 ОД

КУБАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ЛАВРОВ

Олег Владимирович

ПРЯМОЕ И ОПОСРЕДОВАННОЕ ДЕЙСТВИЕ БИОГЕННЫХ АМИНОВ НА РАЗЛИЧНЫЕ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Краснодар - 1997

Работа выполнена в Самарском Государственном Медицинском Университете.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор И.П.Балмасова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик Академии наук Грузии, профессор Р.И. Сепиашвили

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Ростовского НИИ акушерства и педиатрии МЗ РФ В.Е.Вольф

Ведущая организация:

Пермский научно-исследовательский институт экологии и генетики микроорганизмов.

Защита состоите 1997 года на заседании диссертацион-

ного совета К 084.06.03 в Кубанской государственной академии (350690, Краснодар, ул.Седина 4).

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке академии. Автореферат разослан*^ 997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Н.Г.Соболева

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В настоящее время достаточно интенсивно развивается новое направление клинической иммунологии - экологическая иммунология (Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, Х.И.Исгамов 1995), а вместе с ней и проблема мониторинговых иммунологических исследований. Актуальность развития данной области знаний связана с существенным ухудшением экологической ситуации в различных регионах России, и в Самарской области, в частности. Этот процесс обуславливает воздействие антропогенных факторов на иммунную систему, исключительно сложную, многокомпонентную, мобильную систему адаптации, высокочувствительную к действию названных факторов (Р.В.Петров 1994), что является, вероятно, одной из главных причин существенного роста инфекционных (Б.Т.Былинский,1991; Н.В.Бережков 1991 ), аллергических (А.И. Поляк 1996), аутоиммунных (Islam D. et al. 1995), вирусных (О.В.Каверина 1994, Schweder S. 1995) и опухолевых заболеваний (Ushida А. et al. 1993, Whiteside T.L., Herberman R.B. 1994).

Актуальность работы определяется ещё одним обстоятельством. Исключительно важную роль в развитии инфекционных, а особенно вирусных и опухолевых заболеваний играют большие гранулярные лимфоциты (БГЛ), наименее изученная субпопуляция лимфоцитов крови человека (Р.М.Хаитов 1984, И.II. Балмасова 1990). До сих пор неясны многие регуляторные аспекты, формы проявления функциональной активности этих клеток, хотя их роль в особых проявлениях иммунопатологии является доказанным фактом (J.C.Roder, 1980, Schlciefenbaum В. et al 1995).

Прикладные аспекты данного исследования также придают ему актуальность. Проводится попытка улучшения методологического подхода к оценке иммунного статуса, определение региональных параметров иммунного статуса людей, что является важным не только с точки зрения проведения мониторинга, но и при определении наиболее рациональных способов организации иммунорсабилитации па-селения (Р.И.Сепиашвили,1997).

В работе много внимания уделяется одной из новых методик определения функциональной активности БГЛ по суммарному эффекту депонирования и высвобождения биогенных аминов в нагрузочном тесте (И.П. Балмасова 1990, П.И. Та-наегм 1996). Эта методика, будучи сравнительно легко воспроизводимой, пока ещё не нашла широкого внедрения в практику, поскольку степень сё информативности нуждается в дополнительном экспериментальном подтверждении. Последнее как раз и придаёт актуальность данной работе в методическом плане.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящего исследования является выявление аминорегуляторных эффектов in vitro в отношении отдельных субпопуляций лимфоцитов крови человека и опосредованности этих эффектов через систему макрофагов и больших гранулярных лимфоцитов. В соответствии с поставленной целью нами были определены задачи исследования, а именно:

1. Определить критерии иммунологического мониторинга для клинически здоровых жителей города Самары.

2. Определить количественный состав больших гранулярных лимфоцитов и их корреляционные взаимоотношения с другими субпоиуляциями лимфоцитов крови клинически здоровых людей.

3. Определить влияние биогенных аминов в тест-системе in vitro на субпопуля-ционный состав лимфоцитарных н макрофагальных клеток.

4. Установить степень участия системы макрофагов в амипорегуляторных аффектах in vitro, в отношении отдельных субпопуляций лимфоцитов крови клинически здоровых людей.

5. Установить степень и некоторые механизмы участия больших гранулярных лимфоцитов в амипорегуляторных эффектах in vitro в отношении отдельных субпопуляций лимфоцитов крови клинически здоровых людей.

6. Используя методы математической и статистической обработки и анализа полученных данных, разработать модель взаимного участия лимфоцитарных и макрофагальных клеток крови в аминорегулирующих эффектах in vitro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Проведенные исследования позволили получить новые сведения об особенностях аминорегуляторного влияния на отдельные субпопуляции лимфоцитов крови человека и опосредованное™ этих влияний через системы макрофагов и больших гранулярных лимфоцитов. Так впервые установлено, что:

-при мониторинговых иммунологических исследованиях целесообразно оценка иммунологических показателей с учетом высоких или низких значешш CD3+, CD8+, CD 16+, HLA-DR+ -клеток как наиболее информативных критериев оценки иммунного статуса;

-при мониторинговых исследованиях иммунного статуса целесообразно включать тесты по определению количества и функциональной активности больших гранулярных лимфоцитов;

- количественный состав больших гранулярных лимфоцитов проявляет зависимость от содержания в крови CD8-1-, CD16+ субпопуляций;

- биогенные амины влияют на субиоиуляционный состав лимфоцитов и макрофагов крови, а характер этого влияния зависит от вида биогенного амина и индивидуальных особенностей субпоггуляциошюго состава лимфоцитов крови человека;

- макрофаги опосредуют аминорегуляторные эффекты in vitro на отдельные субпопуляции лимфоидных клеток, а степень участия макрофагов в этих процессах зависит от вида биогенного амина и индивидуальных особенностей субпопуляци-ошюго состава лимфоцитов крови человека;

- большие гранулярные лимфоциты опосредуют аминорегуляторные эффекты in vitro на отдельные субпопуляции лимфоидных клеток, а степень их участия, в этих процессах, зависит от вида биогенного амина и индивидуальных особенностей субпопуляционного состава лимфоцитов крови человека;

- модель взаимодействия отдельных субпопуляций лимфоцитов, макрофагов и больших гранулярных лимфоцитов под влиянием адреналина, серотонина и гиста-мина in vitro имеет свои особенности.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Теоретическая значимость работы связана с получением новых фактов об особенностях участия макрофагов и больших гранулярных лимфоцитов в аминорегу-ляции лимфоидных субпопуляций in vitro. Проведенные исследования открывают широкие возможности для изучения этих процессов in vitro, расширяют наши представления о функциональной роли макрофагов и больших гранулярных лимфоцитов в общей системе иммунорегуляции.

Практическое значение вытекает из подтверждения информативности нагрузочных тестов с биогенными аминами для оценки иммунного статуса и при проведении мониторинговх исследований, кроме того, полученные данные подтверждают необходимость включения в перечень иммунологических параметров оценку количественного состава и функциональной активности больших гранулярных лимфоцитов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Мониторинговое исследование иммунного статуса становится более 1шфор-мативным, если его дополнить нагрузочными тестами с биогенными аминами, которые позволяют оценивать влияние на субпопуляционный состав лимфоцитов-макрофагов крови отдельных биогенных аминов и определять функциональную активность больших гранулярных лимфоцитов.

2. Макрофага опосредуют аминорегуляторные эффекты in vitro на субпопуляции лимфоидных клеток крови человека в соответствии с видом биогенного амина и индивидуальными особенностями субпопуляционного состава лимфоцитов крови.

3. Большие гранулярные лимфоциты опосредуют аминорегуляторные эффекты in vitro на субпопуляции лимфоидных клеток крови человека в соответствии с видом биогенного амина и индивидуальными особенностями субпопуляционного состава лимфоцитов крови.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты исследования докладывались на ежегодной научно-практической конференции Научно-исследовательского центра Самарского государственного медицинского университета (Самара 1996), Международном конгрессе по иммуно-реабилитологии (Сочи 1994,Израиль 1997), Международном кошрессе ICONE'95 (Санкт-Петербург 1995).

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ.

Полученные н ходе диссертационных исследований сведения о прямом и опос-редовашюм макрофагами и большими гранулярными лимфоцитами воздействии биогенных аминов на различные субпопуляции лимфоидных клеток включены в практические занятия по курсу клинической иммунологии, лекционный материал по курсам гистологии и патологической физиологии для студентов Самарского государственного медицинского университета. Разработанные в ходе исследования

критерии для оценки иммунного статуса здоровых людей используются для научных исследований на кафедре микробиологии Самарского государственного медицинского университета.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 30 таблицами, 51 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения. Список литературы содержит 267 наименований, из которых 102 отечественных и 165 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования являлась лимфоидно-макрофагальная взвесь периферической крови, взятой из локтевой вены у доноров отделения переливания крови Областного кардиологического диспансера г.Самары. Группа доноров состояла из 84 человек (41-женщииа, 43-мужчины), в возрасте от 20 до 50 лет. Все доноры были клинически здоровы. В каждой группе проводилось иммунологическое тестирование по следующей схеме:

1) Определение отдельных субпопуляций лимфоцитов крови в тест-системах с макрофагами и без них с использованием методов выделения фракции лимфоцитов/моноцитов осуществлялось общепринятым методом ценгрифугирования в ipa-диешге плотности фиколл-верографина ( Pharmacia chemical, Uppsala, Sweden), разделение фракции лимфоцитов/моноцитов производилось используя феномен адгезии на пластике (чашек Пегри) ( К.А.Лебедев,И.Д.Понякина 1990). Изучение суб-популяционного состава лимфоцитов крови доноров проводилось при помощи диагностического набора "Комплект моноклональных антител (МКА) для оценки иммунного статуса человека иммуноферментным методом" НПО "Диагнотех", включающего следующие МКА: DT-anti-CD22 , DT-anti-CD4 ,DT-anti-CD3 , DT-anti-HLA DR, DT-anti-CD8,DT-anti-CD16.

2) Определение количествешюго состава больших гранулярных лимфоцитов, несущих отдельные биогенные амины (И.П.Балмасова, 1990) проводилось, используя нагрузочный тест с адреналином, серотонином и гистамином в концентрации 10/-4 М с последующей обработкой клеточных взвесей цитохимическим методом Севки и подсчетом относительного количества лимфоидных клеток, содержащих в гранулах адреналин, серотонин, гистамин и вычислением суммарного коэффициента аминосодержания БГЛ по формуле:

СКА = К адр + К сер + К шет,

где К - коэффициент, характеризующий количественное соотношение БГЛ для каждого способа инкубирования в присутствии тестируемого биогенного амина. В свою очередь,

¡г _ Аи*Си+Си*Ги+Аи*Ги

где А - % БГЛ, несущих гранулы адреналина, С - % БГЛ, несущих гранулы серотонина, Г - % БГЛ, несущих гранулы гистамина; в числителе (с индексом "и")

- результаты определения для лимфоцитов, инкубированных с моноамином, для которого рассчитывается коэффициент; в знаменателе (с индексом "к") - показатели для интакгных лимфоцитов (контроль).

Оценка функциональной активности БГЛ проводилась в соответствии со специально разработанными критериями интервалов значений СКА (И.П.Балмасова 1990, Н.И.Танаева 1996): при СКА <2,1 БГЛ характеризуются высоким уровнем внутриклеточного цАМФ,умеренной цитотоксичностыо и низкой метаболической активностью; при СКА 2,1>СКА<3,6 БГЛ обладают наивысшей цитотоксической, невысокой метаболической активностью; при СКА >3,6 БГЛ проявляют в наибольшей степени метаболическую активность, но низкие цитотоксические качества. 3) Математическая и статистическая обработка полученных данных проводилась на персональном компьютере IBM AT с помощью пакета программ Microsoft Exel и пакета статистических программ SPSS, а также ориганальных авторских программ.

Для комплексной оценки субпопуляционного состава лимфоцитов крови, функциональной активности БГЛ, аминорегуляторных воздействий на различные субпопуляции лимфоцитов был применен корреляционный и системный многофак-торньш анализ (Б.А.Углов, М.В.Углова, 1987, М.В.Углова, 1988, Б.А.Углов с соавт., 1994).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Субпопуляционный состав лимфопдпо-макрофагальных клеток н больших гранулярных лимфоцитов в крови доноров, проживающих в городе Самаре.

В процессе проведения исследований было детально проанализировано содержание основных субпопуляций лимфоцитов и макрофагов в крови доноров, проживающих в городе Самаре, с целью выработки критериев регионального иммунологического мониторинга в группе клшшчески здоровых людей. Учлтывая неоднородность обследованного контингента и связанный с этим выраженный разброс значений полученных показателей, были использованы разнообразные методические подходы к оценке иммунологического статуса: в соответствии с возрастом и полом доноров, с учетом ачияния макрофагов на субпопуляцио!шый состав лимфоцитов, при группировке показателей по величине, наиболее часто встречающейся в каждой выборке данных, с включением в схему мониторинга изучения количества и функциональной активности больших фанулярных лимфоцитов.

В результате такого анализа было установлено, что пол обследованных практически не влиял на тестируемые показатели, а возрастные отличия проявились только по одному показателю - количеству СОЗ+-клеток, которое оказалось сниженным у лиц старше 40 лет - 62,0 + 1,2% (67,8 ± . 1,5% в остальных возрастных группах).

Более информативным оказался анализ фенотипических особенностей лимфо-идно-макрофагальных клеток крови в соответствии с исходно низкими и исходно высокими значениями каждого показателя субпопуляционного состава, включающего CD3+, CD4+, CD8+, CD22+, CD16+, HLA-DR+-imctkh. Количественным критерием такого разграничения, как указывалось, в каждом случае служила вели-

чина, наиболее часто встречающаяся в каждой выборке данных. Результаты подобного анализа иммунологических данных показали, что наиболее лабильными в индивидуальной характеристике иммунного статуса являются величины содержания в крови С08+, СБ 16+ и Ш,А-ГЖ+-субпопуляций. По этой причине было сочтено целесообразным при оценке результатов иммунологического мониторинга особое внимание обращать на количественный состав именно этих клеток, а в ходе дальнейших исследований проводить шггерпретацию данных в соответствии с тем, как количественно представлены в составе лимфоцитов/макрофагов крови С08+- субпопуляция (больше или меньше 32%), С016+-клетки (больше или меньше 20%), а также Н1А-ВК.+-клетки (больше или меньше 32%).

Что касается зависимости субпопуляционного состава клеток крови мононук-леарного ряда от наличия в тест-системе макрофагов, то здесь были выявлены следующие закономерности. Как и следовало ожидать, эти клетки, способные эксп-рессировать на своей поверхности СО 16 и ЩА-БЛ маркеры, значительно влияли на количественный состав указанных субпопуляций. Оказалось, что, во-первых, макрофаги в значительной степени определяют содержание С016+-клеток в составе лимофидно-макрофагальной взвеси из крови здоровых людей, а характер влияния зависит от принципа группировки данных; во-вторых, макрофаги составляют основную часть Н1-А-В11+-клсток только при сравнительно низком их содержании в составе лимфоидно-макрофагальной взвеси клинически здоровых лиц.

Особенность изучения количественного состава больших гранулярных лимфоцитов в крови здоровых людей - жителей города Самары, заключалась не только в морфологическом (точнее, цитохимическом) подходе к решению данной задачи, но и в характеристике сравнительно недавно зарегистрированного и, следовательно, мало изученного качества этой лимфоидной популяции - содержания в гранулах биогенных аминов. Данные по количественному составу БГЛ среди лимфоид-но-макрофагальных клеток крови доноров выглядят следующим образом: общее количество больших гранулярных лимфоцитов среди лимофидно-макрофагальных клеток крови -14,2 ± 1,1%; количество адреналинпозитивных БГЛ - 13,2 ± 1,0%; количество серотонинпозитивных БГЛ - 7,7 ± 1,6%; количество гистаминпозитив-ных БГЛ - 6,5 ± 1,9%; соотношение клеток, содержащих в гранулах адреналин, серотонин, гистамин соответственно - 93% : 54% : 46%.

По нашим данным, содержание БГЛ среди лимфоцитов/макрофагов крови у женщин достоверно ниже, чем у мужчин; чем старше обследуемый, тем выше содержание у него в крови больших гранулярных лимфоцитов. Половые и возрастные различия в содержании БГЛ среди лимфоцитов/макрофагов крови касались не только их количества, но и наличия тех или иных биогенных аминов в гранулах. У женщин достоверно выше содержание серотонина в гранулах БГЛ по сравнению с мужчинами. С возрастом вначале уменьшается процентное соотношение клеток, несущих серотонин и гистамин, после 40 лет этот процесс распространяется и на адреналин-позитивные клетки. БГЛ с точки зрения фенотипической характеристики довольно неоднородны (они не рестриктированы по НЬА, в основном, экспрессируют С02, СЭ16 и С056 маркеры, но при определенных ситуациях их состав может пополняться за счет С08+-клеток), поэтому определенный интерес представлял анализ

их количественного состава в группах доноров, содержащих разнос количество CD8+, CD16+ и HLA-DR+-KJieTOK.

Установлено, что общее количество БГЛ, как и количество адреналинпозитив-ных клеток, пе зависело от принципа группировки. В то же время на уровне серо-тоншшозитивных и гистаминпозитивных БГЛ определенные различия удалось зарегистрировать. У доноров, имеющих исходно низкое число CD8+ и С016+-кле-ток, количество БГЛ, несущих гранулы с серотонином и гистамином, оказалось достоверно сниженным. Удаление из тест-системы макрофагов путем 2-часового инкубирования в пластиковых чашках Петри количества разных категорий БГЛ не изменяло и не показывало снижения ссротонинпозитивных л гистаминпозитивных клеток. Не было соответствия между содержанием БГЛ в клеточной взвеси и различием в количестве IILA-DR+-icieTOK.

Изучение корреляционных взаимоотношений между отдельными лимфоидны-ми клетками позволило прийти к заключению, что корреляция между количеством БГЛ и прочих субпопуляций лимфоцитов была особенно высока, когда в состав корреляционных пар входили гистаминпозитивные БГЛ.

Влияние биогенных аминов in vitro на субпопуляционный состав лимфоидно-макрофагальных клеток крови и большие гранулярные лимфоциты.

Известно, что биогенные амины обладают иммуномодулирующими эффектами, выявляемыми как на уровне целостною организма, так и в тест-системах in vitro (Е.А.Корнева,1988; R.Hellstrand, S.Hermodsson, 1986,1987).

В наших исследованиях инкубирование с эффективными in vitro концентрациями биогенных аминов влияло на экспрессию фенотипических маркеров на поверхности лимфоцитов и макрофагов (МФ). Так, инкубирование с адреналином приводило к достоверному росту относительного содержания клеток, экспрессирущих CDS-молекулы. Этот эффект снимался после удаления из тест-системы макрофагов. Причем, если в присутствии макрофагов соотношение иптактпых СГ)8+-кле-ток и таковых после инкубирования с адреналином составляло 100:114, то после удаления макрофагов оно стало составлять 100:87, то есть доля данной субпопуляции в отсутствии макрофагов снизилась на 21%. Менее значительно изменяли макрофаги при инкубировании с адреналином соотношение HLA-DR+- клеток: в тест-системе с макрофагами оно было 100:111, а в тсст-системе без макрофагов - 100:107. Присутствие серотошша в тест-системе лимфоидно-макрофагальных клеток также влияло на число СВ8+-лимфоцитов и HLA-DR+-k.tctok, увеличивая его соотве-ствсино на 13% и 16%. Аналогичные изменения наблюдались и в присутствии гис-•гамина, отличие в последнем случае заключалось только в том, что при инкубировании с гистамином регистрировалось достоверное увеличение числа клеток, эксп-рессирующих CD 16- маркер. Удаление макрофагов из тест-систем с серотонином и гистамином приводило в большинстве случаев к однозначным результатам: снижалась экспрессия CD3 и CD4 маркера, исчезали различия между числом инкубированных и интактных HLA-DR+- клеток, сохранялась достоверность изменений по количеству С08+-клеток. но, как и в случае с адреналином, изменялась доля этих субпопуляций в отсутствии макрофагов. В присутствии гистамина количество

с МФ

сач/А

сс 1 ы'^/' \ Л /

,С022'А C022/G

-JCD16/A coe-'G £ !

ЧС«/А COJ'G е

'СОЭ'С CD3/G

- интактныс с аминами

СС22/С СО221С

Рисунок 1. Соотношение субпопулядионного состава лимфоцитов крови доноров интакткых и после инкубирования с биогенными аминами в тест-системах in vitro с макрофагами и без них. (А-инкубирование с адреналином, С- с серотонином, G- с гистамином).

CD16+-KJICTOK после удаления макрофагов не давало увеличения и изменяло соотношение по сравнению с интактными клетками (рисунок 1).

В группе с высоким содержанием CD8+-kjictok биогенные амины изменяли экспрессию маркеров только в двух субпопудяциях - CD8+ и CD16+, и в том и в другом случае в сторону ее увеличения. Удаление макрофагов приводило к существенному изменению во влиянии всех испытуемых аминов. В группе с низким содержанием CD8+-kjictok в присутствии макрофагов изменений в количестве отдельных субпопуляций под влиянием биогешгых аминов не происходило. После удаления макрофагов достоверно снижалась экспрессия CD3 маркера, причем этот процесс не зависел от вида биогенного амина, а экспрессия CD16 маркера, наоборот, возрастала и только под действием гистамина.

В группе с высоким содержанием CD16+-ioieTOK влияние биогенных аминов па экспрессию рецепторов было почти полностью аналопгчным таковому в группе с высоким содержанием С08+-лимфоцитов. В то же время в группе с низким содержаниям CD16+-icictok были зарегистрированы особенности воздействия биогенных аминов на отдельные субпопуляции. В присутствии макрофагов независимо от характера биогенного амина увеличивалась экспрессия сразу нескольких маркеров: CD8, CD16, HLA-DR. После удаления макрофагов этот эффект сохранялся только в отношении CD16 маркера.

Влияние эффективных концентраций биогенных аминов in vitro на популяцию больших гранулярных лимфоцитов для общего контингента обследованных проявлялось в полной мере только после удаления макрофагов. Стали выявляться различия по количеству БГЛ в присутствии серотонина и гистамина, особенно это касалось адреналшшозитивных БГЛ, в меньшей степени - гистаминпозитивных. Значительно изменились и соотношения отдельных категорий этих клеток. Поскольку изменение соотношения инкубированных и интактных клеток учитывается при расчете СКА - суммарного коэффициента содержания биогенных аминов, то мы сочли необходимым провести определение этого показателя в пробах, содержащих макрофаги, и без макрофагов.

Как уже указывалось, величина СКА отражает функциональную активность БГЛ, при атом в интервале значений ниже 2,1 клетки показывают низкую метаболическую и питотоксическую активность; в интервале значений выше 3,6 - наивысшую метаболическую активность, но низкую цитотоксичиость; наконец, в среднем интервале значений величина СКА коррелирует с показателями высокой цитотокси-ческой активности (И.П.Балмасова,1990; Н.И.Тапасва,1996). Полученные результаты свидетельствовали о том, 1гто в отсутствии макрофагов функциональная активность БГЛ, связанная с действием па них эффективных in vitro концентраций биогенных аминов, возрастает за счет достижения клетками конечных этапов диф-ферепцировки, когда их цитотоксические свойства проявляются в наибольшей сте-

Рисунок 2. Влияние макрофагов на изменение значении суммарного коэффициента содержания биогенных аминов (СКА) .

пени. Особенно наглядно этот вывод можно проследить с помощью рисунка 2, на котором учтен порядок изменения величины коэффициента у конкретных допоров.

Задачами исследования предусматривалось выявление аминорегуляторпых воздействий in vitro на лимфоидные субпопуляции с участием БГЛ, в связи с этим было решено попробовать сгруппировать все полученные данные в соответствии с интервалами значений СКА, характеризующими состояние функциональной активности тестируемых клеток. Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов и аминочувствительности последних этот принцип был применен впервые. Этот раздел исследовании выявил наиболее значимые изменения в экспрессии тестируемых маркеров на поверхности лимфоцитов под влиянием биогенных аминов, особенно это касалось CD3+, CD8+, CD16+, HLA-DR+-ioictok, что наглядно можно проиллюстрировать на примере СОЗ+-лимфоцитов с помощью рисунка 3.

Вся совокупность полученных данных позволила сделать следующие предварительные выводы: 1) для выявления особешюстей действия биогенных аминов in vitro на БГЛ и CD-субпопуляции лимфоцитов наиболее целесообразным способом классификации данных является деление их па группы в соответствии с интервалами значений СКА - < 2,1; от 2,1 до 3,6; > 3,6; 2) в разных интервалах значений СКА лимфоидные субпопуляции проявляют разную чувствительность к биогенным аминам in vitro, па характер которой влияет присутствие в тсст-систсмс макрофагов;

Рисунок 3.Относительное содержание CD3 в крови доноров in vitro под влиянием

блогенных аминов при группировке данных поинтервалам значений СКА.

3) при низких и высоких значениях СКА изменения показателей и корреляционных связей между ними выражены в большей степени, чем в среднем интервале значений коэффициента; 4) характер корреляции между CD-субпопуляциями лимфоцитов и отдельными категориями БГЛ определяется в наибольшей степени ве-личшюй СКА, но не стабильностью взаимосвязей между тестируемыми CD-субпопуляциями и БГЛ. Эти же данные показали целесообразность статистического обоснования участия макрофагов и больших гранулярных лимфоцитах в механизмах аминорегуляшш.

Опосредующая роль больших гранулярных лимфоцитов и макрофагов в аминорегуляции субнопуляций лимфоцитов.

Системный многофакторпьш анализ роли БГЛ и макрофагов как посредников в действии биогенных аминов на лимфоцдные субпопуляции показал, что при инкубировании с биогенными аминами степень количественных изменений показателей, отражающих отклонение интегральных данных по количественному составу

с мф !

Рисунок 4. Интегральные показатели содержания в крови доноров СО-субпопующии лимфоцитов, интактных и инкубированных с биокнными аминами в гест-системах с макрофагами и без них. ($епе$1 - Интактные клетки).

без мф ;

CD-субпопуляций, зависит от величины СКА, характеризующего функциональное состояние БГЛ. При высоких значениях СКА степень отклонения интегральных показателей значительно больше, чем при средних и низких значениях коэффициента. Присутствие в тест-системах макрофагов увеличивает степень отклонения интегральных показателей для интакгных клеток и уменьшает для инкубированных, как это можно показать на примере тест-системы с гистамином (рисунок 4).

Системный многофакторный анализ и определение парной корреляции позволили выявить также амгаюрегуляторные влияния как всей совокупности БГЛ, так и их аминосодержащих фракций, на отдельные субпопуляции лимфоцитов, а также роль макрофагов в этом процессе. Подобные воздействия далеко не однозначны, что отчетливо можно проиллюстрировать с помощью таблицы. Меняется не только перечень фенотипов, но и характер изменения экспрессии маркеров, а также тех условий, при которых наблюдаются эти изменения в тест-системе интакгных клеток. Из условий, влияющих на выявление фенотипа, чаще всего регистрируется зависимость последнего от величины СКА, а также от количества СВ16+-клеток. Поскольку в состав последней субпопуляции входят естественные киллеры, в основном формирующие пул БГЛ, и макрофага, то посреднические функции тех и других клеток сомнений практически не вызывают (таблица 1).

Наконец, еще один аспект, вытекающий из содержания проведенных исследований. Участие опосредующих клеточных факторов в иммуномодулирующих эффектах биогенных аминов in vitro зависит не только от количества и функциональ-юй активности БГЛ и макрофагов, но и от вида биогенного амина, присутствую-цего в "стрессовых" концентрациях в тест-системе. Совокупность сведений, Полуниных в процессе выполнения данной работы и на основе данных литературы, сасающихся действия биогенных аминов in vitro на иммунокомпетентиые клетки и .мкрофаги, представлена на схемах 1-3.

ВЫВОДЫ:

1. Оценка результатов иммунологического мониторинга с определением субпо-[уляционного состава лимфоидно-макрофагальных клеток крови здоровых людей олжна проводиться с учетом пола, возраста обследуемых, а также различия критериев при высоком и низком содержании CD3+- (больше или меньше 60%), CD8+-больше или меньше 32%), CD16+- (больше или меньше 20%), HLA-DR+-iaieTOK больше или меньше 32%).

2. Одним из информативных показателей иммунного статуса является количе-тво больших гранулярных лимфоцитов, а также содержание в их гранулах биоген-ых аминов, которое при определении в нагрузочном тесте отражает аминорегуля-эрные свойства этих клеток и выражается количественно в форме коэффициента

:ка.

3. Количество больших 1ранулярных лимфоцитов и содержание в них биоген-ых аминов зависит от пола и возраста обследуемых, корреляционно связано с удержанием CD8+- и С016+субпопуляций лимфоцитов в крови.

4. Биогенные амины проявляют иммуномодулирующие качества in vitro в форме гпосредственного влияния на экспрессию CD-маркеров: адреналин снижает чис-

ло CD8+-kjictok и увеличивает число HLA-DR+-k/ictok в тест-системе, ссротонин и гистамин угнетают экспрессию CD3-, CD4-, CDS-маркеров.

5. Макрофаги опосредуют влияние биогенных аминов in vitro на отдельные субпопуляции лимфоидных клеток: увеличивают экспрессию С08-маркеров в присутствии адреналина, серотонина, гистамина; увеличивают экспрессию HLA-DR-mo-лекул в присутствии серотонина, гистамина и уменьшают таковую под действием адреналина.

6. Большие гранулярные лимфоциты оказывают аминорегуляторное влияние in vitro на отдельные субпопуляции лимфоидных клеток: адреналинпозитивные БГЛ способствуют повышению экспрессии CDS, CD22, С016-маркеров; серотонинпозитивные БГЛ угнетают экспрессию CD8 и С016-маркеров; гастамин-позитивные БГЛ повышают экспрессию CD3, С08-маркеров и угнетают ее у CD4+, CD22+, CD16+-KneroK.

7. Макрофаги опосредуют влияние биогенных аминов на содержание последних в гранулах БГЛ: в присутствии адреналина и гистамина они уменьшают долю серо-тонинлозитивных клеток, а в присутствии серотонина снимают угнетающее влияние последнего на содержание в гранулах БГЛ адреналина и гистамина.

8. Функциональное состояние больших гранулярных лимфоцитов, выраженное величиной СКА, является определяющим для проявления аминорегуляторных качеств БГЛ в отношении прочих лимфоидных субпопуляций: избирательная амино-регуляция у этих клеток в наибольшей степени проявляется при высоких значениях коэффициента, мало зависит от вида амина при его ьшзких значениях и модулирует в значительных пределах в соответствии с видом амина при средних значениях СКА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Содержание в крови CD3+, CD8+, CD16+, HLA-DR+-icieTOK, а также количества и аминорегуляторные качества БГЛ должны учитываться при проведении иммунологического мониторинга различных категорий населения.

2. Нагрузочные тесты с биогенными аминами несут дополнительную информацию о способности отдельных лимфоидных субпопуляций к экспрессии диффе-репцировочных CD-маркеров, а также способности лимфоидных клеток реагировать на высокие концентрации названных биологически активных веществ, что может использоваться в иммунодиагностике.

3. При изучении патологических процессов, связанных с ростом уровня биогенных аминов в крови (стресс, аллергия, некротические и воспалительные процессы различной этиологии и т.д.), определение количества и аминопозитивных качеств больших гранулярных лимфоцитов позволяет не только оценить функциональное состояние данной популяции, но и установить возможность ее участия в амиюре-гуляции иммунной системы.

4. При преподавании патологической физиологии, общей и клинической иммунологии необходимо ввести в содержание учебного процесса сведения об иммуно-модулирующих свойствах биогенных аминов и роли в аминорегуляции больших гранулярных лимфоцитов и макрофагов.

Таблши 1.

Соответствие между содержанием в гранулах БГЛ биогенных аминов и уровнем экспрессии фенотипических маркеров лимфоцитов.

Фенотип

лимфоци- Эффект,

Категория тов, дающих юменепяя количества сопровождающий рост Условия получетм

БГЛ числа БГЛ этой категории эффекта

Адреналин СШ+ -уменьшение числа клеток, -если число С016+-клеток

позитивные экспрессирующих маркер меньше 20%

БГЛ СР22+ -увеличение числа клеток, экспрсссирующих маркер -уменьшение числа клеток, экспрессирующих маркер -если БГЛ имеют СКА ниже 2,1 -если БГЛ имеют СКА выше 3,6

С016+ -уменьшение числа клеток, экспрессирующих маркер -если БГЛ имеют СКА выше 3,6

Н1А-1Ж+ -уменьшение числа клеток, экспрессирующих маркер -если БГЛ имеют СКА выше 3,6

Серотошш СОЗ+ -увеличение числа клеток, -если БГЛ имеют СКА ниже 2,1

позитивные экспрсссирующих маркер

БГЛ С04+ -уменьшение числа клеток, -если БГЛ имеют СКА ниже 2,1

экспрессирующих маркер

СЙ8+ -увеличение числа клеток, экспрессирующих маркер -если число СЕ>16+-клеток меньше 20%, а БГЛ имеют СКА выше 3,6

СШ6+ -уменьшение числа клеток, экспрессирующих маркер -если БГЛ имеют СКА ниже 2,1

ШАОШ- -увеличение числа клеток, экспрессирующих маркер -уменьшение числа клеток, экспрессирующих маркер -если БГЛ имеют СКА ниже 2,1 -если БГЛ имеют СКА выше 3,6

Гистамин СОЗ+ -уменьшение числа клеток, -если БГЛ имеют СКА выше 3,6

позитивные экспрессирующих маркер

БГЛ С04+ -увеличение числа клеток, -если число С016+-клеток

экспрессирующих маркер меньше 20%

СП16+ -уменьшение числа клеток, экспрсссирующих маркер -если БГЛ имеют СКА ниже 2,1

Н1Л-Ш+ -увеличение числа клеток, экспрсссирующих маркер -если число С08+-клеток меньше 32%, а БГЛ имеют СКА выше 3,6

АДРЕНАЛИН, Ю-4 М, in vitro

CD-СУЕПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ

МАКРОФАГИ

_медиаторы?.

БОЛЬШИЕ ГРАНУЛЯРНЫЕ ЛИМФОЦИТЫ

CD16+

клетки,

1 1 I г

:D8+ CD16+ CD8+ БГЛ БГЛ клетки

CD8+ клетки

CD8+ клетки

падение экспрес-

ссли<20% если <32$

рост экспрессии маркера (в большей степени у женщин и в возрасте моложе 30 лет)

БГЛ

СКА<2,1 2Д<СЗД<М)

рост эксп- рост экспрессии рессик сии мар- маркера (в маркера кера (в большей (в боль-большей степени в шей сте-степени у возрасте лени у женщин к старше 40 мужчин) ь возрасте лет) старше 40 лет)

высвобождение всех биогенных аминов?

CD22+

клетки

I

падение экспрессии маркера

СШ+-клетхи, если число С016+-клеток <20% I

падение экспрессии маркера

CD4+-клетки I

падение экспрессии маркера

С08+-клетки I

падение экспрессии маркера

CD22+-клетки

падение экспрессии маркера

HLA-DR+-клетки, если число CD8+-клсток>32% I

падение экспрессии маркера

БГЛ

БГЛ

СКА>3»6 2,1<СКА<3,6

снижение снижение

доли доли БГЛ-адр+ БГЛ-адр+ БГЛ-сер f БГЛ-ТИСТ+

Г

БГЛ СКА>3,6

увеличе- снижение снижение увеличение доли доли доли ние доли БГЛ-сер+ БГЛ-сер+ БГЛ-адр+ БГЛ-гаст+

высвобождение адреналина, серотонина?

СШ+-клетки, если число С016+-клсток <20% I

рост экспрессии маркера

HLA-DR+-клетки, если число CDS+-клеток>32%

рост экспрессии маркера

CD8+-клетки 1

рост экспрессии маркера

CD2 2+-клетки I

рост экспрессии маркера

высвобождение адреналина, депонирование серотонина и гис-тамина?

С1)4+-клетхн

I

рост экспрессии маркера

CD22+-клетки

падение экспрессии маркера

(Л)8+-клетки

I

падение экспрессии маркера

CD16+-KneTKM I

падение экспрессии маркера

CD 16+-клетки

HIA-DR+-клетки

I

рост экспрессии маркера

рост экспрессии маркера

I I

МОДУЛЯЦИЯ МЕХАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ И РЕГУЛЯЦИИ ИНТЕНСИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В СООТВЕТСТВИИ С КОЛИЧЕСТВОМ CD8+-, CD16-H-ЛИМФОЦИТОВ, А ТАКЖЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ БОЛЬШИХ ГРАНУЛЯРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ

Схема 1. Регуляторное воздействие адреналина в концентрации 104М in vitro на CD-субпопуляшми лимфоцитов, макрофага, БГЛ

СЕРОТОНИН, Ю-4 M,in vitro

СО-СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ

CD3+ клетки

паление экспрессии маркера (в большей степени в возрасте 31-40 лет, или если число

СР16+-кле-

ток>20#)

МАКРОФАГИ

I .

БОЛЬШИЕ ГРАНУЛЯРНЫЕ ЛИМФОЦИТЫ

CD4+

клетки

паление экспрессии маркера (в большей степени в возрасте старше 30 лет)

cd8+ клетки, если <32%

падение экспрессии маркера (в большей степени, если число

СБ16+-кле-

ток>20%)

-DR+CD 8+ bj;

IILA-DR+

клетки

рост экс« прессии маркера (в большей степени у женщин, или если число CD16+-' кле-

токС0%)

клетки, ес;ти <32%

БГЛ СКА<2,1

БГЛ 2Д<СК

ili С 1

Bfjl СКА>3,6

ЬГЛ 2,]<СКА<3.6

медиаторы?

CD22+-

кдетки I

падение экспрессии маркера

рост экспрессии маркера (в большей степени у мужчин, или если число С016+-кле-

ток<20Я)

CD3+-клетки, если число СП1б+-кле-ток <20%

рост ^KCnpCCCMVt маркера

CD8-*--клетки

I

рост экспрессии маркера

БГ СКА>3,6

сниже- снижение доли ние доли БГЛ-алр+ БГЛ-адр+ БГЛ-сер+ БГЛ-ГИСТ+

увеличе- сниже- сниже- увеличение доли ние доли ние доли ние доли БГЛ-сер+ БГЛ-сер+ БГЛ-адр+ СПЛ-гии4-

высвобождение всех биогенных аминов?

высвобождение адреналина, серото-нинч?

CD3+-клетки, если число CD 16 + -клеток <20%

I

рост экспрессии маркера

СП8+-клеткн {

рост экспрессии маркера

С016+-клетки I

падение экспрессии маркера

высвобождение адреналина, депонирование серотонина и ги ста мина? СШ+-клетки

I

рост экспрессии маркера (ч большей степени, если число СВ16+-клсток <20Ъ)

CD4+--K.ieTKH

I

рост экспрессии маркера

CD2 2клетки

рост экспрессии маркера

СП 16+-клетки рост эксп^ссии

ПРЯМОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ УГНЕТАЕТ ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРИ ВЫСОКОМ СОДЕРЖАНИИ В КРОВИ CD8+ И CD 16+ ЛИМФОЦИТОВ, А ОПОСРЕДОВАННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ МОДИФИЦИРУЕТ ПРЕЖДЕ ВСЕГО ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ В СООТВЕТСТВИИ С КОЛИЧЕСТВОМ СП1б+-ЛИМФОЦИТОВ, А ТАКЖЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ БОЛЬШИХ ГРАНУЛЯРНЫХ ЛИМФОЦШОВ.

Схема 2. Регуляторное воздействие серотонина в концентрации 10~4М in vitro ка CD-субпопуляциии лимфоцитов, макрофаги, БГЛ

ГИСТАМИН, 104 М, in vitro

cd-субпоиуляции лмл1фоцмтои

макрофаги

cd3+ cd4+

клетки клетки

падение экспрессии маркера (в большей степени в возрасте

старше 30 лет)

паление эксл-рессии маркера (н большей степсяи в возрасте

счаршс

30 лет,

или

если

число

СП8+-

кле-

ток>32%, а число С016+. кле-

-юк>20?с)

„медиаторы!.

большие гранулярные лимфоциты

CD8+ I1LA-DR+ CD8+ клетки клетки клетки

cd 16+ бг.

бгл

БГЛ

ыл

бгл

бгл

прение экспрессии

маркера (в боль-щей

степени в возрасте

старше 30 лет)

клетки СКА<2,12Л<СКЛ<3,6СКА>3}6 СКА>2,1 г2Д<ОД<46 СКА>3

рост экспрессии

маркера (в большей стегтени ужен-шин, или если число CD8+-кле-

ток<32%. а число СШ6+-кле-

ток<20*)

рост экспрессии сиижс-маркера (в боль- ние шей степени у доли мужчин и в возра- БГЛ-сте старше 40 лет) пр+ БГЛ-сер+ БГЛ-

ГИСТ+

медиаторы?

cd22+

клетки

I

падение экспрессии «аркора

снижение доли БГЛ-

ГИСГ+

увел ¡г*<-ни: доли БГЛ-:~э-<-

сни- сниже жение ние доли доли

снихе- увеличе-

БГЛ-адр+

нле доли БГЛ-адр+ БГЛ-БГЛ»сер+ алр+ БГЛ-

ГИСТ+

те доли БГЛ-

ГИСТ+

высвобождение всех ¡биогенных аминов?

СШ+-клетки

падение экспрессии маркера

С08+-1сдстки

падение экспрессии маркера

С1)16+-клетш

i

рост экспрессии маркера

I.

СДО+-клетки, ес1и число СР1б+-клсгок

I

падение экспрессия маркера

ср4+- клетки I

плпелие экспрессии маркера

С158+-клетки I

прение экспрессии маркера

СР22+-клет1л

I

рост экспрессии шркера ^

0>1б+-клс1кн I

р<ст экспрессии мьркера

высвобождение адреналина, депонирование серотонина и гистами-

на'' |

СМ-»--клетки I

падение экспрессии маркера (в большей степени,

если число СШ6+-клеток

<20%) |

СВ4+-клетки

падение экспрессии маркера

с1322+-клетки I

росг экспрессии маркера

СШ6+-клетки I

рост экспрессии маркера ^

тл-ш$+-

падение экспрессии маркера

:poi!h <

прямое воздействие угнетает иммунный ответ при высоком содержании В крови СОЯ+ ii €016+ лимфоцитов, ОиОСПЛОИМШОЬ через макрофаги воздействие модифицирует иммунный ответ, а воздействие опосредованное через бгл или макгофаги и бгл, способствует преобладанию супрес.сорных эффектов, степень которых зависит от функционального состояния этих клеток.

СхемаЗ. Рсгуляторное воздействие гистамина в концентрации 10/-4М in vitro на CD-субпоиуляциии лимфоцитов, макрофаги, ЫГЛ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Large granular lymphocytes in dioxin ecopathology /тезисы докдада/ International Journal of Immunorehabilitation. -1994. -P.46 I.P.Balmasova,T.R.Nikitina, N.I.Tanaeva.

2. Some results of clinical and immunological examinations of the patients with dioxin ecopathology /статья/. Dioxin'94. -Japan. Kyoto. -1994. -Vol. 21. -P. 167- 168-2. I.P.Balmasova, T.R.Nikitina,V.P.Reshetnikova.

3. Special features of immunodepressive status in dioxin ecopathology /тезисы доклада/. Environmental Pollution (ICEP'95) and Neuroimmuno Interactions and Environment (ICONE'95). Abstracts. -St.Peterburg, Russia. -1995. -P.93., I.P.Balmasova, V.V. Kosarev, T.R. NLkitina.

4. Анализ содержания Т-лимфопитов и БГЛ у лиц с экопатолотей,вызванной преимущеспвепным действием диоксинов /статья/. Иммунологические и гуморальные аспекты клинической патологии. Под ред.С.М.Бабкина и В.Г.Подковкина.-Самара. -1995. И.П.Балмасова, Т.Р.Никитина.-С.35-38. Депонирована в ВНИИМИ 15.01.96 г. N Д24936.

5. Иммунопатологические нарушения у лиц с экопатолотей, вызванной диоксинами /статья/. Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии. Сборник трудов. Москва. -1997. -С.235. И.П.Балмасова, Т.Р.Никитина.

6. Иммунодиагностические аспекты нагрузочных тестов с биогенными аминами /тезисы/ International Journal of Immunorehabilitation. Moscow. -1997. -N 4.-P.6. И.П.Балмасова, Е.С.Ефратова.

7. Влияние адреналина на экспрессию CD16 маркеров больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) в тестсистеме in vitro /тезисы/. International journal of immunorehabilitation. Moscow. -1997. -N 4. -P.188. И.П.Балмасова, Т.P.Никитина.

8. Immunodiagnostic aspects of loading tests with biogenic amines /тезисы/ International journal of immunorehabilitation. Moscow. -1997. -N 5. -P.76.1.P.Balmasova,E.S.Efratova.

9. Epinephrine effect upon CD16 markers of large granular lymphocytes (LGL) in test system in vitro /тезисы/. International Journal of Immunorehabilitation. Moscow. -1997. -N 5. -P.85. T.R.Nikitina.

10. The influence of macrophages upon the ability of large granular lymphocytes to deponizc and release biogenic amines /тезисы/. Allergy, European jomal of allergy and clinical immunology -N37, -Vol. 52. -1997. The Annual of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Rhodes, Hellas June 1997. -P. 39. /088/ I.P.Balmasova, F.M.Ivanov.

11. The influence of macrophages on biogenic amines immunomoduling effects in vitro/тезисы/. Le medecin Biopatologiste -N43-44. Paris 1997. -P.60. E.S.Efratova, M.F.Ivanov.

12. Adrenaline and ultrastructure of large granular lymphocites (LGL) /тезисы/. The Immunologist, Supplement 1, 1997. Abstracts of the Fourth International Symposium on Clinical Immunology, June 1997, Amsterdam. -P.104. /11.p.15/. I.P.Balmasova, N.I.Tanaeva.

13. Marcers of large granular lymphocites (LGL) under the influence of epenephrine in vitro/тезисы/. Immunology Letters -Vol.56. -N-l-3. -1997. P.100. /P.2.03.10/E.S.Efratova.