Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Проявления и механизмы формирования иммуносупрессии на различных этапах репродуктивного процесса в норме и при патологии

На правах рукописи

ХОНИНА Наталья Алексеевна

ПРОЯВЛЕНИЯ И МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУНОСУПРЕССИИ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ РЕПРОДУКТИВНОГО ПРОЦЕССА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

14 00 36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск 2007

003062804

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Елена Рэмовна Черных

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Анна Вениаминовна Шурлыгина Ирина Анатольевна Орловская

доктор медицинских наук

доктор биологических наук, профессор

Александр Исаевич Аутеншлюс

Ведущая организация: Государственное учреждение Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН

заседании диссертационного совета Д 001 001 01 при ГУ НИИ клинической

иммунологии СО РАМН по адресу

630091, г Новосибирск, ул Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической

иммунологии СО РАМН по адресу

(630091, г Новосибирск, ул Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита состоится «.

»

2007 г в.

часов на

доктор биологических наук

О Т Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования обусловлена ухудшением демографической ситуации, связанной с одной стороны — с нарастанием числа бесплодных браков, а с другой - с увеличением случаев осложненного течения беременности При этом существующие на сегодняшний день современные методы лечения не всегда эффективны В последние годы появились данные, свидетельствующие о том, что все этапы репродуктивного цикла контролируются с участием иммунной системой На это указывают данные об экспрессии рецепторов на иммунокомпетентных клетках (ИКК) к половым гормонам [Henderson Т F et al 2003, Michimata N et al 2002], их влияние на функции ИКК, а также изменение продукции цитокинов в зависимости от фазы овуляторного цикла [Chegini N et al 2002] и накопление ИКК в эндометрии к моменту открытия имплантационного окна [Ozenci G G et al 2001]

Согласно современным представлениям, иммунные нарушения на ранних этапах репродуктивного цикла могут лежать в основе так называемого « бесплодия неясного генеза» [Chong Р J et al 1995], которое связывают с низким иммунным ответом на аллоантигены партнера из-за сходства по отдельным HLA-локусам, недостаточной продукцией блокирующих факторов (БФ) [Дрынов Г И 2004, Szekeres-Bartho et al 2002, Agarwal S et al 2002, Ramhorst R E et al 2005], а также с повышенным содержанием активированных натуральных киллерных (NK) клеток [Quenby S et al 2002, 2006] При этом использование иммунотерапевтических подходов, направленных на индукцию состояния иммуносупрессии, в частности, повышение продукции блокирующих факторов (при аллоиммунизации лимфоцитами партнера) позволяет добиться повышения фертильности

Обязательным условием для физиологического течения беременности является индукция толерантности к аллоантигенам плода, что достигается за счет формирования гестационной иммуносупрессии [Thellin О et al 2003], однако, механизмы ее формирования остаются во многом неясными Наибольшее значение придается активной цитокин-опосредованной супрессии, обусловленной смещением цитокинового баланса в сторону продукции ТЬ2/иммуносуирессорных медиаторов [Jones В М et al 2000, Erlebacher A et al 2001, Maksheed M et al 2002, Raghupathy R et al 2001] В свою очередь, нарушение цитокинового баланса, характерного для физиологической гестации, рассматривается в качестве причин осложнений беременности [Raghupathy R et al ,2001, Power L L et al 2002, Maksheed M et al 2001] Однако полученные за последние годы данные о продукции цитокинов у беременных с осложнениями гестации оказались во многом противоречивыми и неоднозначными Предполагается, что иммунные дисфункции в 1-ой половине гестации провоцируют развитие самопроизвольных выкидышей (УСВ) [Chaouat G et al 2004, Bates M D et al 2002, Zenclussen А С et al 2002] Иммунная дисрегуляция во II-ой половине беременности может служить причиной развития серьезного осложнения - гестоза [Посисеева JI В и др 2004, Rinehart et al 1999, Del GobboV etal 2000], который занимает 2—3 место в структуре материнской

смертности и сопровождается развитием перинатальных осложнений [Токова 3 3 и др 2004] Исследование иммунитета у беременных с гестозом в основном касается цитокинового баланса, при этом полученные результаты весьма противоречивы Так, по данным разных авторов, развитие гестоза может быть сопряжено с доминированием Thl-цитокинов [Посисеева J1 В и др 2004, Leszczy et al 2000, Freeman D S et al 2004, Bartha J L et al 2001], с повышенным содержанием Th2 медиаторов [Del Gobbo V et al 2000, Matthiesen L et al 2003, Olusi S О et al 2000], a также с отсутствием выраженных изменений [Benyo D F et al 2001, Velzing-Aarts F V et al 2002, Jonsson Y et al 2004]

Наряду с цитокин-опосредованной иммуносупрессией важную роль в подавлении иммунного ответа матери на аллоантигены плода могут играть естественные регуляторные CD4+CD25+ Т-клетки В литературе широко обсуждается роль CD4+CD25+ Т-клеток, в том числе и CD4+CD25hlgh, в контексте подавления трансплантационных реакций [Kanm M et al 2004, Fehervari Z et al 2004] Потому представляется актуальным их исследование при угрозе самопроизвольного выкидыша (УСВ) и гестозе Свой вклад в формирование иммуносупрессии могут вносить CD14+CD16+- моноциты, которые по разным данным способны продуцировать не только TNF-a, но и IL-10 [Belge К-U et al 2002, Skrzeczynska J et al 2002]

Несмотря на большой интерес к проблеме иммунной регуляции на различных этапах репродуктивного процесса, остается много нерешенных вопросов Так, до сих пор не ясно, на каком этапе происходит переключение иммунной системы на иммуносупрессивный тип реагирования и как иммунные дисфункции на ранних этапах репродукции могут быть связаны с развитием бесплодия Учитывая разнородные данные о балансе Thl/Th2 цитокинов при осложненном течении гестации, сложно сделать заключение о цитокин-опосредованных механизмах иммунных дисфункций, ассоциированных с развитием патологии Практически не исследована роль клеточно-опосредованных механизмов развития гестационной иммуносуперссии, в частности функции естественных регуляторных Т-клеток и моноцитов Недостаточное понимание механизмов формирования иммуносупрессии при бесплодии, физиологической и осложненной беременности в свою очередь обусловливают отсутствие патогенетически обоснованных подходов к лечению патологии репродукции, особенно позднего осложнения беременности - гестоза, который остается основной причиной детской и материнской смертности Опасность развития гестоза диктует необходимость поиска новых патогенетически обоснованных подходов к его профилактике и лечению Известно, что формирование УСВ и гестоза происходит на фоне неполноценной лютеиновой фазы, обусловленной недостаточной продукцией прогестерона [Сидельникова В M и др 2002, Empson M et al 2002] В этом аспекте представляется оправданным оценить эффективность пролонгированного назначения гестагена - дюфастон беременным с целью профилактики развития гестоза

На основании вышесказанного сформулирована цель работы и задачи исследования

Цель исследования: На основе комплексного анализа параметров иммунитета охарактеризовать механизмы формирования физиологической иммуносупрессии в различные фазы репродуктивного процесса и оценить их значение для развития беременности

Задачи исследования:

1 Охарактеризовать особенности локального и системного иммунитета у женщин в динамике овуляторного цикла

2 Изучить уровень продукции ТМЛЪ2 цитокинов и параметры клеточного звена иммунитета (пролифератавную активность Т-клеток, относительное содержание регуляторных сЬ4+СЮ25+-лимфоцитов и естественных кшшерных клеток) при физиологическом течении первой половины беременности

3 Проанализировать закономерности продукции ТЬ1ГТЪ2 цитокинов, содержания С354+С025+-Т-клеток, С014+С016+-моноцитов и субпопуляций естественных киллерных клеток во второй половине физиологической беременности

4 Охарактеризовать параметры иммунитета у женщин с бесплодием неясного генеза

5 Оценить продукцию ТЫ/ТЬ2 цитокинов и параметры клеточного звена иммунитета у беременных с угрозой самопроизвольного выкидыша

6 Охарактеризовать цитокиновый статус, количественное содержание С04+-лимфоцитов, СБ 14+СО16+-моноцитов и популяций естественных киллерных клеток у женщин с осложненной гестозом беременностью

7 Провести клинико-иммунологический анализ эффективности лечения бесплодия неясного генеза методом аллоиммунизации лимфоцитами партнера

8 На основании клинико-иммунологической характеристики женщин из группы риска по невынашиванию беременности оценить иммуно-модулирующий эффект аналога прогестерона — дюфастона и эффективность его использования для профилактики гестоза

Научная новизна. На основании проведенных исследований показано, что супрессорная реорганизация иммунной системы формируется уже в период овуляции как на системном, так и на локальном уровнях и обусловлена доминированием активности супрессорных факторов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости и увеличением в рециркуляции доли естественных регуляторных СБ4+СВ25+-клеток Впервые показано, что наступление беременности, диагностируемое по уровню ХГЧ, прямо коррелирует с супрессорной активностью фолликулярной жидкости (ФЖ) Состояние иммуносупрессии, характерное для физиологической беременности, наиболее выражено в I триместре гестации, постепенно снижается к исходу беременности и определяется долевым участием как гуморальных факторов, так и регуляторных клеток Получены новые данные о динамике содержания регуляторных Т-лимфоцитов (СБ4+СБ25+ и СБ4+С025ь'гь) и естественных цитотоксических клеток (СБ5б+С016\ СБ56+С016+, С056+С03+Ж) в различные триместры физиологической гестации Впервые показано, что при физиологической беременности в

периферической крови регистрируется снижение содержания TNFa/p+-моноцитов и возрастает доля CD14+ клеток с внутриклеточной продукцией IL-10

Дефект супрессорной реорганизации иммунной системы у женщин с первичной и вторичной формами бесплодия неясного генеза может проявляться как изолированными нарушениями (снижением продукции блокирующих факторов, повышением числа CD56+CD 16+МК-клеток), так и их сочетанным вариантом Продемонстрировано, что снижение иммуносупрессии у беременных с УСВ ассоциировано с одновременным смещением цитокинового баланса в сторону повышения Thl-медиаторов и уменьшением содержания CD4+CD25+T-KueTOK, включая CD4+CD25bgh

У беременных с тяжелым гестозом в периферической циркуляции регистрируется повышение продукции как Thl-, так и ТЪ2-цитокинов При этом оценка супрессорной активности сыворотки и соотношения отдельных ТЫ/ТЬ2-цитокинов указывают на снижение содержания факторов/цито-кинов с супрессорной активностью при развитии гестоза Впервые показано, что в повышении продукции цитокинов при гестозе участвуют CD14+-моноциты с внутриклеточной продукцией TNFa/p и CD14+CD16+IL-10+ моноциты

Выявлены новые данные о снижении у беременных с гестозом в циркуляции естественных регуляторных CD4 СБ25+-клеток, включая CD4+CD25bgh На основе анализа уровня пролиферативного ответа и апоптоза Т-клеток в анти-СОЗ-стимулированных культурах МНК охарактеризовано состояние функциональной активности Т-клеток при различных вариантах течения беременности Показано, что повышение при гестозе продукции ТЬ2-цитокинов и содержания CD14+CD16+-mohouhtob с внутриклеточной продукцией IL-10+ отражает включение механизмов feedback регуляции в ответ на усиление продукции провоспалительных цитокинов, а глубокое угнетении продукции IL-Юу беременных с ПЭ означает ее срыв

Установлено, что устранение дефекта иммуносупрессии, которое при бесплодии неясного генеза сопровождается повышением уровня блокирующих факторов в сыворотке крови и снижением содержания активированных CD56+CD16+ NK-клеток, ассоциировано с наступлением беременности Пролонгированный прием дюфастона в 1-ой половине гестации приводит к коррекции цитокинового баланса у женщин с риском развития гестоза и позволяет снизить частоту развития осложнений во П-ой половине беременности, что свидетельствует о патогенетической роли иммунных дисфункций в развитии гестоза

Теоретическая и практическая значимость. В результате выполнения работы получены новые данные о механизмах формирования и значимости иммуносупрессии для физиологического течения репродуктивного процесса Показано, что наряду с цитокинами важную роль в супрессорной реаранжировке иммунной системы играют регуляторные клетки, при этом их долевое участие на различных этапах варьирует Дефект иммуносупрессорной реорганизации может возникать на всех этапах

репродуктивного цикла, являясь причиной развития различных патологий — бесплодия, самопроизвольных выкидышей и гестоза Данные об обратной корреляционной зависимости между супрессорной активностью сыворотки крови и содержанием С04+С025+/СВ4+С025ЫгЬ Т-клеток со степенью тяжести гестоза подтверждают важность нарушения механизмов гестационной иммуносупрессии в развитии поздних гестационных осложнений

В процессе проведения работы выявлены новые иммунологические маркеры, которые могут служить дополнительным критерием при оценке степени тяжести гестоза Непосредственное клиническое значение имеют данные об эффективности иммунокоррекции с использованием метода аллоиммунизации лимфоцитами партнера у женщин с бесплодием неясного генеза, а также характеристика иммуномодулируюгцего эффекта гестагена дюфастон, что позволило разработать принципиально новый подход к профилактике гестоза в группах высокого риска, имеющий важное значение для предотвращения репродуктивных потерь

Основные положения, выносимые на защиту

1 Овуляторный период и физиологическое течение беременности ассоциировано с супрессорной реорганизацией иммунной системы, которая формируется к моменту овуляции яйцеклетки, максимально выражена в I триместре и снижается к исходу гестации

2 Формирование иммуносупрессии обусловлено действием гуморальных факторов, в том числе ТЪ2-цитокинов, и регуляторных клеток, включая С04+СБ25+Т-клетки и 1Ь-10+моноциты При этом долевое участие и выраженность клеточных и гуморальных механизмов иммуносупрессии меняется в течении репродуктивного процесса

3 Дефект иммунносупрессорной реорганизации ассоциирован с развитием дисфункций в репродуктивной сфере и проявляется снижением продукции блокирующих факторов и повышением доли активированных №С-клеток при бесплодии, уменьшением супрессорной активности сыворотки крови, повышением соотношения ТЫЛЪ2-цитокинов и уменьшением количества С04+С025+/ С04+СБ25Ь'ЕЬ регуляторных Т-клеток при угрозе выкидыша, снижением супрессорной активности сыворотки крови на фоне существенного усиления продукции ТЫ/ТЬ2-цитокинов и уменьшением содержания С04+СВ25+/С04+С0251,1еЬ Т-клеток при гестозе

4 Коррекция дефекта иммуносупрессии при патологии репродуктивной функции позволяет добиться положительного клинического эффекта В частности, восстановление продукции блокирующих факторов на фоне аллоиммунизации лимфоцитами партнера приводит к повышению фертильности, а коррекция цитокинового баланса на фоне пролонгированного приема гестагена (дюфастон) - снижению частоты развития гестоза

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 8 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных

результатов, заключения, выводов и библиографического указателя Материал изложен на 161 странице машинописного текста, включающего 35 таблиц и 6 рисунков Прилагаемая библиография содержит ссылки на 375 литературных источника, в том числе, 356 иностранных

Апробация работы п публикации

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Всероссийских семинарах по проблемам бесплодия (Саратов, 2001, Екатеринбург, 2002), научно-практических конференциях врачей «Актуальные вопросы медицины» (Новосибирск, 2004, 2005, 2006), Международной научно-практической конференции «Цитокины Воспаление Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002), 1-ой республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), VII Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2005)

Апробация диссертационной работы состоялась 1 марта 2007 г на совместном научном семинаре ГУ НИИКИ и проблемной комиссии 56 08 «Иммунология» По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, в том числе 18 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования работ соискателей ученой степени доктора медицинских наук

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика женщин, включенных в исследование Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 705 женщин за период 2000-2006 гг Для исследования показателей иммунитета в динамике менструального цикла было сформировано 2 группы В 1 группу вошли 62 условно здоровые женщины с естественным менструальным циклом, 2 группу составили 125 женщин, которым проводилось лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) Ведущими факторами бесплодия у пациенток являлись трубно-перитонеальный, эндокринный и сочетанный факторы Исследования проводили в начале и в середине цикла, что соответствует периоду овуляции, или в день трансвагинальной пункции яичников Отдельную группу составили 143 женщины, у которых не было выявлено гинекологических или эндокринных заболеваний и диагностировалось бесплодие неясного генеза Группа беременных была подразделена на подгруппы женщин с физиологической гестацией (203 женщины) и с осложненным течением беременности (172 женщины) Забор крови для некоторых исследований проводили дважды в I и III триместрах гестации В I триместре было обследовано 42 женщины с физиологической гестацией и 55 беременных с угрозой самопроизвольных выкидышей (УСВ) УСВ диагностировалась на основании анамнеза, жалоб пациентов и данных УЗИ и проявлялась повышением тонуса матки, болевым синдромом и ухудшением кровоснабжения плода Исследуемые группы беременных были сопоставимы по возрасту (29,2 ±0,8 и 30,5 ±0,9) и срокам гестации

(13,7 ±0,7 и 12,9 ± 0,9 недель) В III триместре было обследовано 64 женщины с физиологической гестацией и 88 беременных с гестозом Беременные указанных групп были сопоставимы по возрасту (26,2 ± 1,0 vs 28,2 ± 0,9) и срокам гестации (31,0 ± 0,6 vs 32,5 ± 0,5) Группа беременных с гестозом включала женщин с различной степенью тяжести гестоза и преэклампсией Степень тяжести гестоза оценивалась по совокупности клинических и лабораторных показателей, данных УЗИ, КТГ и доплерометрии На момент забора крови женщины не имели хронических заболеваний в стадии обострения, острых инфекционных заболеваний и эндокринной патологии Забор крови проводился после получения информированного согласия у пациентов

Для проведения процедуры аллоиммунизации лимфоцитами (АИЛ) у партнера забирали 20,0 мл венозной крови, выделяли МНК, которые затем вводили подкожно в межлопаточную область женщине Процедура АИЛ проводилась в первую фазу менструального цикла и повторялась от 2-х до 6 раз Эффективность лечения оценивалась в 2-х группах у женщин с естественным циклом (п = 46) и у женщин с неудачными попытками ЭКО в анамнезе (п = 50), которым АШ1 проводилась перед следующей процедурой ЭКО Результаты лечения у женщин с естественным циклом оценивали через полгода после проведения АИЛ У женщин, прошедших процедуру ЭКО, наличие беременности регистрировали по уровню хорионического гонадотропина человека и по данным УЗИ

Для анализа влияния дюфастона было сформировано 3 группы беременных Первую группу составили 16 женщин с физиологическим течением гестации, вторую — 25 пациенток из группы риска по невынашиванию беременности, принимавших в связи с этим с 5-7 недели до 16-20 недели дюфастон (40мкг/сут), третью — 40 беременных с тяжелым гестозом, имевших в анамнезе УСВ, но не принимавших дюфастон Сформированные группы беременных были сравнимы по возрасту, срокам гестации и отсутствию тяжелых соматических заболеваний Средний возраст обследуемых в группах составил 25,1 ±0,7, 23,3 ±0,4 и 27,8 ±0,7 лет, соответственно Сроки гестации в контрольной группе составили 29 — 37 (в среднем 32,8 ± 0,7), во второй группе - 28- 35 (в среднем 34,0 ± 0,6), в 3-й группе — 28 — 36 (в среднем 32,0 ± 0,7) недель Все лечебные процедуры проводили после информированного согласия пациентов

Иммунологическое обследование. Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли стандартным методом и в концентрации 0,1х106 культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в полной культуральной среде RPMI-1640 при 37°С в С02 -инкубаторе Для стимуляции клеток использовали растворимые моноклональные анти-СЮЗ антитела (анти-СЕ>ЗмАТ, ICO-90, 1мкг/мл, «Медбиоспектр», Москва), конканавалин А (КонА, Serva, 15 мкг/мл), рекомбинантный IL-2 (50 ЕД/мл, Ронколейкин, ООО «Биотех», С-Пб) В отдельной серии экспериментов пролиферативный ответ клеток исследовали в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ),

где в качестве стимуляторов использовали лимфоциты партнера, инактивированные в течение 40 минут митомицином С (Serva, 40мкг/мл) Интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа (КонА-индуцированные культуры МНК) или 120 часов (CKJI) по включению 3Н-тимидина (ЮмкКю/лунку), добавленного за 18 часов до окончания культивирования

Супрессорную активность сывороток крови оценивали по их влиянию на КонА-стимулированный пролиферативный ответ МНК здоровых доноров Индекс супрессорной активности (ИСА) рассчитывали как соотношение уровней мигоген-индуцированного ответа МНК доноров в присутствии сывороток пациенток и в присутствии пулированных сывороток доноров Воспалительную активность сывороток крови измеряли по их влиянию на уровень продукции перекиси водорода нейтрофилами здоровых доноров Индекс воспалительной активности (ИВА) оценивали по соотношению между показателями продукции перекиси водорода в культурах клеток лейковзвеси, инкубированной с сывороткой пациенток и пулированной сывороткой доноров ИСА ниже 0,85 и ИВА более 0,83 свидетельствовали соответственно о наличии супрессорной или воспалительной активности Содержание блокирующих факторов в сыворотке крови женщин оценивали при сравнении уровня пролиферации клеток в CKJI в присутствии аутологичной и пулированной сывороток крови Соответственно, индекс влияния блокирующих факторов (ИВскл-бф) рассчитывали как соотношение уровней пролиферативного ответа в культурах с аутологичной сывороткой и пулированной сывороткой доноров ИВскл-бф ниже 0,85 свидетельствовал о наличие в сыворотке крови блокирующих факторов

Продукцию цитокинов (TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13) оценивали в 24-часовых супернатантах стимулированных Кон А (Sigma, 15 мкг/мл) клеток цельной крови, предварительно разведенных средой RPMI-1640 (1 4) Концентрацию цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 9-Р1ех (определяемый динамический диапазон 232000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя

Определение субпопуляций клеток методом проточной цитофлюориметрии проводили в соответствии с методикой Becton Dickinson, отработанной с небольшими модификациями в Лаборатории иммунопатологии ИКИ СО РАМН (зав лабораторией д м н В С Кожевников), используя меченные atnii-CD3, -CD4, -CD25, -CD16, — CD14, -CD56 моноклональные антитела (BD PharMingen, San Diego, CA, США, «Сорбент», Москва) Методом проточной цитофлюориметрии проводили также определение экспрессии внутриклеточных цитокинов IL-10, TNF-a в моноцитах (CD 14, CD14CD16) периферической крови После пермеабилизации клеток с помощью 0,2 %-ного раствора Твин-20их инкубировали с моноклональными анти-IL-lO или анти-TNFa антителами

Определение внутриклеточной экспрессии IL-Юв популяции CD14+CD16+ моноцитов периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACS Calibur, Becton Dickinson)

Уровень апоптоза оценивали среди свежевыделенных клеток лейковзвеси, а также среди МНК, культивируемых в безмитогенной среде (спонтанный апоптоз) и в анти-СОЗ-стимулированных культурах клеток (активационно-индуцированный апоптоз) Определение относительного количества апоптотических клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии по окрашиванию клеток пропидиумом иодидом (PI, Sigma, США)

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики с использованием nporpaMMbi«STATISTICA 5,0»

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Отправной точкой исследования стало изучение особенностей функционирования иммунной системы в динамике овуляторного цикла Для этого параметры иммунитета оценивали у женщин в естественном цикле и у пациенток в циклах стимуляции суперовуляции по программе ЭКО, у которых иммунологический фактор не являлся основной причиной бесплодия Оценка динамики показателей иммунитета выявила на пике овуляции достоверное снижение спонтанной пролиферации (1280 ±80 га 1580 ± 90 имп/мин, р < 0,05), количества CD16+NK (10,7 ± 0,8 vs 14,4 ± 1,3, р<0,05), повышение числа CD20+ В-лимфоцитов (12,0 ± 0,6 га 6,2 ±0,5, р < 0,05), HLA-DRhlgh-MOframiTOB (69,0 ± 2,6 га 42,0 ± 1,8, р < 0,05), а также усиление апоптоза нейтрофилов (12,9 ± 2,0 vs 7,8 ± 1,1, р<0,05) и тенденцию к снижению стимулированной пролиферации клеток Характерно, что в овуляторный период отмечалось появление супрессорной (СА) и противовоспалительной активностей в сыворотках крови как в естественном, так и в стимулированном циклах (Таблица 1) Согласно сложившимся ранее представлениям, переключение Thl/Th2 цитокинов может происходить в присутствии факторов, продуцируемых оплодотворенной яйцеклеткой Полученные нами данные о нарастании супрессорной активности сыворотки крови к моменту овуляции свидетельствуют о более раннем начале иммуносупрессорной перестройки В пользу данного предположения свидетельствует сходная динамика изменений биологической активности сыворотки крови как при гормональной стимуляции (ЭКО), так и в естественном менструальном цикле Кроме того, в сыворотках крови в период овуляции выявлялась повышенная проапоптогенная активность Известно, что противовоспалительные цитокины являются индукторами апоптоза [Ayala A et al 2001] С учетом данного факта усиление проапоптогенных свойств сыворотки и повышение апоптоза нейтрофилов можно рассматривать как проявление активности иммуносупрессорных факторов

Биологическая активность сыворотки крови женщин в различные фазы менструального цикла и стимулированного ооцитогенеза

Группы Активность регутяторных факторов, (расч ед)

ИСА ИВА

Здоровые доноры крови (п = 19) 1,4 + 0,1 1,05 ±0,04

2-4 сутки физиологического менструального цикла (п = 14) 1,08 + 0,17 0,99 + 0,04

Овуляторный период физиологического менструального цикла (п = 14) 0,87 ±0,03** 0,78 ±0,06**

Стимулированная суперовуляция по программе эко 0,78 + 0,02*** (п = 70) 0,68 + 0,04*** (п = 46)

Примечание данные представлены в виде средней и стандартной ошибки (М±т), *** — р < 0,001,"** — р<0,01, достоверность различий показателей по сравнению с группой здоровых доноров крови (Ри — критерий Вилкоксона-Манна - Уитни)

Наряду с традиционными показателями иммунитета было исследовано относительное содержание естественных регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток, осуществляющих контроль над пролиферацией аллореактивных Т-лимфоцитов [Kmgsley С I et al 2002, Karim et al 2004] и участвующих в формировании толерантности к аллоантигенам [Sanchez-Frueyo et al 2002, Karim M et al 2004, Fehervari Z et al 2004] На пике овуляции отмечалось достоверное возрастание циркулирующих CD4+CD25+ Т-клеток, которое регистрировалось у 75 % женщин (таблица 2) Характерно, что при этом уровень пролиферативного ответа Т-лимфоцитов в КонА-стимулированных культурах находился в обратной зависимости от содержания CD4+CD25+ Т-клеток (г = -0,5, р < 0,01)

В последние годы появились данные о повышенном содержании CD4+CD25+ Т-клеток в периферической циркуляции и децидуальной ткани при беременности [Sasaki Y et al 2004, Somerset D A et al 2004], однако, сообщения об их содержании на пике овуляции отсутствуют Полученные данные о наличии CD4+CD25+ Т-клеток в ФЖ, сопоставимые с их количеством в периферической крови, свидетельствуют об участии естественных регуляторных Т-клеток в формировании локального иммуносупрессорного фона Анализ взаимосвязи количества CD4+CD25+T-клеток с уровнем различных цитокинов выявил наличие обратной корреляционной связи между содержанием CD4+CD25+ Т-клеток и концентрацией TNFa (г = -0,35, р < 0,05), а также прямой связи с содержанием IL-4 (г =0,31, р<0,05) С учетом выявленных фактов можно полагать, что CD4+CD25+ Т-клетки прямо или опосредованно участвуют в супрессорной реорганизации иммунной системы в овуляторный период

Содержание СБ14+СП16+ моноцитов и С04+С025+Т-клеток в периферической крови и фолликулярной жидкости у женщин в овуляторный период и здоровых доноров

Группы CD14+CD16+ моноциты (%) CD4+CD25+ Т-клетки (%)

Здоровые доноры крови (п = 16) 8,9 ±1,2 5,4 ±0,5

Пациенты ЭКО периферическая кровь (п = 45) фолликулярная жидкость (п = 10) 12,3 ± 1,0 Нет данных 10,3 ± 0,7** 7,8 ±1,1

Примечание относительное количество моноцитов и Т-клеток оценивали методом проточной цитометрии в популяции свежевыделенных МНК ** — достоверность различий показателей по сравнению с группой здоровых доноров крови (р < 0,01, и-критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

В формировании супрессорной перестройки могут быть задействованы и клетки моноцитарно/макрофагального ряда Так, на пике овуляции выявлялась тенденция к увеличению численности CD14+CD16+- моноцитов (на 27 %) Из данных литературы следует, что CD14+CD16+- моноциты в зависимости от условий активации могут продуцировать как TNFa, так и ILIO, обладая, соответственно, про- или противовоспалительной активностью [KatayamaR et al 2000, Loercher А E et al 1999, Skrzeczynska J etal 2002] Возможно, что в овуляторный период преимущественно накапливаются моноциты, продуцирующие иммуносупрессорные цитокины Так, известно, что в плаценте содержатся макрофаги, продуцирующие IL-10 [Motran С С et al 2002] Данный тип клеток генерируется при альтернативной активации макрофагов и в норме присутствует только в легких и плаценте

Еще одним подтверждением иммуносупрессорной реорганизации являются данные о выраженной супрессорной активности фолликулярной жидкости, которая отражает перестройку местного иммунитета, необходимую для подготовки к имплантации эмбриона (таблица 3) На пике овуляции в ФЖ идентифицировались как Thl (IFNy, TNFa, IL-2) -, так и Th2 (IL-4, IL-10, IL-13) - цитокины Тем не менее, при интегральной оценке биологической активности — ФЖ проявляла выраженное супрессорное действие При этом не было выявлено зависимости между отдельными цитокинами и супрессорной активностью ФЖ Вероятно, спектр биологически активных факторов не ограничивается цитокинами, исследуемыми в данной работе, а включает и другие медиаторы, такие как TGFß, PGE2, IL-lRa, растворимые рецепторы цитокинов sTNF-R I и II типа, sILl-R II типа, SIL2-R

Содержание ТМ/провоспалительных и Т112/противовоспалительных цитокинов в супернатантах КонА-стимулированных клеток цельной крови у беременных и здоровых женщин

Группы цитокинов Цитокины (пг/мч) Небеременные женщины (п = 8) Физиологическая беременность (п=13)

ТЫ/провоспали-тельные ЮТ-а 264±112 47 ± 15*

1Ш-у 183 ±68 59± 4р

1Ь-2 132 ± 51 113 ±64

1Ы2 9,0 ±1,4 14,3 ± 2,2

ОМ-СЬТ 13,8 ±5 10,2 ±3,9

ТЬ2/противовоспа-лительные ТЬ-5 5,7 ±1,9 8,0 ± 2,0

1Ь-4 6,4 ±4,3 6,2 ±3,9

1Ь10 70,0 ± 21 64,3 ±27

1ЫЗ 5,6 ±1,5 20,0 ± 9,2*

Соотношение ТЫ/ТЬ2 цитокинов ЮТ-аЯЬ-Ю 7,0 ±1,2 0,9 ±0,2*

ШЧ-уЯЬ4 27,7 ±7,0 8,9 ±2,1*

1Ш-у/1Ь-13 61,0 ±11,2 4,7 ± 2,4*

ИСА 1,2 ±0,1 (п = 29) 0,64 ±0,04* (п = 26)

Примечание * — р < 0,05 — достоверность различий между группами (11-кри-терий Вилкоксона - Манна - Уитни)

Следует особо отметить, что формирование иммуносупрессии имеет первостепенное значение для позитивного исхода ЭКО Об этом свидетельствует достоверная корреляционная связь между индексом супрессорной активности ФЖ и биохимическим показателем беременности — уровнем хорионического гонадотропина человека (г = -0,59, р = 0,05) Полученные данные согласуются с исследованиями Бт^еЫ М [БптЦеИ М

а1 2002], согласно которым ФЖ в успешных циклах оказывала более выраженное супрессорное действие на митоген-индуцированную пролиферацию ИКК Кроме того, ФЖ характеризовалась наличием в ней регуляторных Т-клеток, количество которых было сопоставимо с содержанием СВ4+СБ25+ клеток в периферической крови у женщин на пике овуляции

Следовательно, в овуляторный период формируется состояние транзиторной иммуносупрессии, которое характеризуется доминированием супрессорной активности сывороточных факторов и увеличением доли регуляторных СВ4+СБ25+ Т-клеток, что наиболее демонстративно проявляется у женщин на фоне стимуляции суперовуляции в циклах ЭКО

Указанные изменения могут лежать в основе супрессорной реорганизации иммунной системы, имеющей важное значение для имплантации бластоцисты, и опосредуется с участием как растворимых супрессорных факторов, так и регуляторных клеток

На следующем этапе были исследованы параметры иммунитета у беременных в I триместре гестации Необходимым условием для формирования гестационной имммуносупрессии является переключение продукции цитокинов в сторону увеличения содержания иммуносупрессорных факторов Однако динамика продукции отдельных цитокинов и выраженность иммуносупрессии в различные триместры беременности изучены в меньшей степени В настоящем исследовании определение концентрации цитокинов проводилось в культурах клеток цельной крови, что является одним из наиболее «физиологичных» подходов к изучению продукции цитокинов и наиболее адекватно отражают ситуацию ш vivo, поскольку исключает элемент активации ИКК при их выделении, а с другой стороны, позволяет изучить продукцию цитокинов в условиях естественного микроокружения

Исследование параметров иммунной системы у женщин в 1-ом триместре беременности выявило наличие выраженной СА сывороток крови, которая ассоциировалась со смещением баланса в сторону доминирования иммуносупрессорных цитокинов На это указывало достоверное снижение уровня продукции TNF-a и IFN-y и повышение уровня IL-13 Наиболее ярко изменение цитокинового баланса проявлялось в резком снижении индекса соотношения IFN-y/IL-13

Оценка CD4+CD25+ клеток, в том числе с высокой экспрессией CD25-молекул, обладающих наибольшей супрессорной активностью [Baecher-Allan С et al 2001], показала, что у беременных их количество достоверно повышено (таблица 4) На важную роль регуляторных Т-клеток при беременности указывает тот факт, что повышение содержания CD4+CD25+ и CD4+CD25bgh клеток отмечалось в подавляющем большинстве случаев (77 % и 83 % соответственно)

Таблица 4

Относительное содержание регуляторных Т-клеток у беременных в I триместре гестации и здоровых женщин

Показатель Непеременные женщины Физиологическая

(п = 12) беременность

CD4+CD25+ 5,4 ± 0,5 12,9 ±1,4**

(п = 31)

CD4+CD25 hlgh 0,88 ±0,09 2,4 ±0,3*

(п = 24)

Примечание * — р<0,05, ** — р<0,01 — достоверность различий между группами (Л-критерий Вилхоксона - Манна - Уитни)

Чтобы оценить, каким образом супрессорная перестройка сказывается на функциях эффекторных клеток, параллельно исследовали уровень пролиферации Т-лимфоцитов, а также содержание различных субпопуляций естественных цитотоксических клеток Уровень пролиферации в ответ на стимуляцию анти-СОЗ антителами у беременных был достоверно снижен (18193 ± 2060 34713 ± 6419 имп/мин, р < 0,05) и не восстанавливался в присутствии 1Ь-2 Также отмечалась тенденция к снижению ответа в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) на аллоантигены, что может быть обусловлено подавлением генерации аллореактивных Т-клеток Корреляционный анализ выявил обратную взаимосвязь между пролиферацией Т-лимфоцитов и содержанием С04+С025ЬгЬ-клеток (г = -0,57, р < 0,05)

Исследование количественного содержания естественных киллерных клеток при физиологической беременности выявило тенденцию к снижению относительного количества всех субпопуляций №С-клеток, причем снижение активированных С056+СБ16+ отмечалось в 60 % случаев (таблица 5) Снижение доли активированных №С-клеток может быть обусловлено действием С04+С025+ Т-клеток, которые подавляют генерацию цитотоксических ЫК, продуцирующих провоспалительные цитокины и, таким образом, потенциируют ТЪ2-ответ [Иа1 апнппа N е1 а1 2007, РгеНЬпег Б е1 а1 2006]

Таблица 5

Относительное содержание естественных цитотоксических клеток у беременных в I триместре гестации и здоровых женщин

Показатель Небеременные женщины (п = 12) Физиологическая беременность (п = 17)

СБ56+С016-СВЗ- 2,8 ±0,9 1,3 ±0,2

СБ56+СБ16+СВЗ- 6,0 ± 1,2 4,4 ± 0,7

СБ56+СБЗ+ 4,5 ±0,8 3,5 ± 0,4

Примечание * — р < 0,05, ** — р < 0,01 — достоверность различий между группами (И-критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

Таким образом, I триместр беременности характеризуется выраженной супрессорной реорганизацией иммунной системы, которая проявляется повышением содержания супрессорных факторов в сыворотке крови и угнетением пролиферации Т-клеток, что обусловлено смещением цитокинового баланса в сторону П12-медиаторов и возрастанием числа естественных регуляторных Т-клеток

Анализ динамики показателей иммунитета у женщин во П-ой половине гестации показал, что в Ш-ем триместре у подавляющего большинства беременных (85 %) сохраняется супрессорная активность сывороток крови, уровень которой сопоставим с аналогичными значениями в Том триместре' В то же время смещение цитокинового баланса в сторону 1Ъ2-цитокинов

было гораздо менее выраженным Снижение продукции ПТ^-у и усиление 1Ь-13 проявлялось только в виде тенденций, и хотя индекс соотношения 1ИЧуЛЬ-13 был достоверно снижен (22,9 ± 5,9 V« 61,0 ± 11,2, р < 0,05), но в меньшей степени, чем в 1-ом триместре Поскольку сыворотки крови обладали супрессорной активностью, а изменение продукции ТЫ/Т112-цитокинов было менее выраженным, мы предположили, что источником супрессорных факторов могут быть активированные моноциты Действительно, в Ш-ем триместре отмечалось снижение Т№-а+моноцитов и повышение доли моноцитов с внутриклеточной секрецией 1Ь-10, причем как в С016+, так и С016"-субпопуляциях (таблица 6) Таким образом, можно полагать, что иммуносупрессорная перестройка в Ш-ем триместре физиологической беременности реализуется с участием моноцитов, секретирующих 1Ь-10

Таблица 6

Относительное содержание С014+СШб+клеток и моноцитов с внутриклеточной экспрессией Т№а/р и 1Ь-10 в периферической крови у беременных

СБ14+СЮ16 + СБ14+ШРо/р+ аз14+1ь-1о+

моноциты (%) моноциты (%) моноциты (%)

Непеременные 9,0+4,6 10,7 ± 1,6 2,4 ±0,1

женщины (п = 16) (п = 24) (п = 16)

Беременные 10,0 ±0,6 5,5 ± 1,4* 4,1 ±0,2*

(и = 23) (п = 14) (п = 14)

Примечание здесь * — достоверность различий между группой небеременных и беременных женщин (ри < 0,05, и — критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

Проведенные нами исследования показали, что содержание СБ4+С025+ клеток в Ш-ем триместре оставалось повышенным, а доля С025Ь'8Ь клеток снижалась до значений в группе небеременных На фоне ослабления гестационной иммуносупрессии снижение пролиферации Т-клеток в ответ на стимуляцию анти-СОЗмАТ было менее выраженным и проявлялось только в виде тенденции Соответственно, пролиферативный ответ клеток в Ш-ем триместре был достоверно выше, чем в 1-ом триместре (таблица 7) По сравнению с группой небеременных Ш-ий триместр гестации характеризовался достоверным повышением активированных С056+С016+ ]ЧК-клеток, тенденцией к снижению 1ЧКТ-лимфоцитов и увеличению С056+СБ16"1ЧК-клеток Соответственно, по сравнению с 1-ым триместром доля активированных ИК-клеток к исходу гестации возрастает Возможно, что повышение содержания ИК-клеток ассоциировано с подготовкой к предстоящим родам [1игейс Е е1 а1 2004].

Динамика показателей иммунного статуса у беременных

Показатель I триместр Ш триместр

ИСА (расч ед) 0,64 ± 0,04 0,67 ±0,02

анти-СБЗмАТ пролиферация (имп/мин) 18193 ±2060 27776 ±1919*

С056+СБ16+ (%) 4,4 ±0,8 9,8 ± 1,1*

С04+С025+(%) 12,9 ± 1,4 9,9 ± 0,9

СБ4+СВ25Ьч!11 (%) 2,4 ±0,3 1,0 ±0,1*

1ШуЯЬ-13 (расч ед) 4,7 ±2,9 22,9 ±5,9*

Примечание * — достоверность различий между группами беременных женщин (ри < 0,05, II-критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

На основании анализа динамики параметров иммунитета (таблица 7) можно заключить, что снижение выраженности иммуносупрессии в Ш-ем триместре гестации проявляется усилением пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, увеличением активированных МК-клеток и обусловлено уменьшением содержания СВ4+СЕ)25Ы®Ь клеток и менее выраженным смещением цитокинового баланса в сторону ТЬй/иммунносупрессорных факторов

Следующий фрагмент работы был посвящен исследованию механизмов супрессии и их проявлениям при патологии репродуктивного процесса Как известно, иммунные дисфункции на ранних этапах репродуктивного процесса могут быть ассоциированы с развитием бесплодия Одной из причин бесплодия является низкий иммунный ответ на аллоантигены партнеров, имеющих сходство по отдельным НЬА-локусам В результате низкого ТЫ-ответа замедляется переключение на ТЬ2-ответ и снижается продукция блокирующих антител, прикрывающих соответствующие антигенные детерминанты зиготы Зигота подвергается иммунной атаке со стороны аллореактивных Т-лимфоцитов и активированных НК-клеток, что приводит к нарушению формирования трофобласта и спонтанному прерыванию беременности на ранних сроках Среди обследованных пациенток выделялась группа женщин с бесплодием неясного генеза, у которых не было выявлено эндокринной патологии или гинекологических заболеваний как основной причины бесплодия Исследования показали, что при бесплодии неясного генеза в 71 % случаев выявлялся дефицит продукции блокирующих факторов (БФ) То есть, если пролиферативный ответ клеток в СКЛ в присутствии аутологичной сыворотки у фертильных женщин был ниже, чем в присутствии пулированной сыворотки доноров, то

в исследуемой группе этого не наблюдалось (таблица 8) Соответственно, индекс влияния (ИВ) блокирующих факторов при бесплодии был достоверно выше, особенно при первичном бесплодии По данным литературы, низкий уровень БФ встречается у большинства женщин с вторичным бесплодием, имеющих в анамнезе самопроизвольные выкидыши [Pandey М К et al 2003,2006, Orgad S et al 1999] В наших исследованиях показано, что снижение содержания БФ регистрируется не только при вторичном бесплодии, но и при первичной форме бесплодия, причем в большем проценте случаев (61 % и 76 %, соответственно)

Таблица 8

Уровень пролиферации МНК в однонаправленной смешанной культуре

лимфоцитов пациенток в присутствии аутологичной сыворотки крови

Пролиферативный ответ МНК в CKJI Частота

Группы М±п (имп/мин) Диапазон квартальных значений ИВскл-бф (расч ед) встречаемости пациенток с ИВскл-бф>0,85

Ферт ильные женщины (п = 9) 3509±1847 640-2221 0,59 ±0,1 22 % (2/9)

Женщины с бесплодием (п = 59) 4948 ±661 651-8506 1,34 ±0,1* 71 % (42/59

первичное бесплодие (п = 46) 4735 ± 739 839-8101 1,37 ±0,1* 76 % (34/46)

вторичное бесплодие (п = 13) 5702 ±1514 592-8506 1,03 ±0,2 61 % (8/13)

Примечание * — р < 0,05 - достоверность различий между подгруппами женщин с бесплодием и группой фертильных жешцин (U-критерий Вилкоксона - Манна -Уитни) Индекс влияния блокирующих факторов (ИВскл-бф) рассчитывали как соотношение уровней пролиферативного ответа при добавлении аутологичной сыворотки и в присутствии пулированных сывороток доноров

В последние годы в литературе обсуждаются данные о значении повышенного уровня NK-клеток в эндометрии у женщин с бесплодием Увеличение доли активированных CD56+ клеток рассматривается как неблагоприятный фактор, связанный с их способностью лизировать клетки трофобласта и направлять дифференцировку Т-хелперов по Thl-пути [Preithner S et al 2006, Zhang С et al 2006]

При исследовании содержания естественных киллерных клеток в периферической крови у женщин с бесплодием регистрировалось достоверное повышение всех исследуемых субпопуляций NK-клеток преимущественно за счет подгруппы с первичным бесплодием (таблица 9) Так, у каждой второй женщины количество CD56+CD16+ NK превышало

верхний порог нормативного диапазона, характерного для группы фертильных женщин (>8,7 %) Полученные результаты в основном согласуются с данными литературы о повышении числа С05б+ клеток при бесплодии [Ма[яиЬауазЬ1 Н й а! 2001] Однако, увеличение их количества отмечается у женщин с вторичным бесплодием, в то время как согласно наш1м данным, наиболее высокий уровень 1МК-клеток выявляется при первичном бесплодии Проведенные исследования показали, что у 79 % женщин с бесплодием неясного генеза выявляются иммунные нарушения в виде снижения продукции БФ или повышения содержания активированных №С-клеток При этом у 34 % пациентов регистрируются комбинированные нарушения иммунитета, т е одновременное изменение исследуемых показателей Из представленных результатов следует, что комбинированные нарушения наиболее часто выявляются у женщин с первичным бесплодием Таким образом, одним из основных дефектов при иммунологической форме бесплодия является дефицит в сыворотке крови БФ, подавляющих ответ на аллоантигены, и повышение количества киллерных клеток

Таблица 9

Содержание различных субпопуляций киллерных клеток в периферической циркуляции у женщин с бесплодием_

Субпопуляции киллерных клеток % пациенток

Группы СВ56+СБ16+ (%) СВ56+С016" (%) С056+СГ)16 (%) с содержанием С056+С016+ >8,7 %

Ферт ильные женщины (п = 15) 6,0 ±1,2 2,8 ±0,8 4,4 ± 0,8 13 % (2/15)

Женщины с бесплодием (п = 62) 10,0 ±0,12* 7,3 + 0,5* 9,0 ±0,6* 56 % (35/62)

первичное бесплодие (п = 50) 10,4 ±0,74** 7,0 ±0,6* 9,3 ±0,7* 60 % (30/50)

вторичное бесплодие (п = 12) 7,0 ± 1,1 8,3 ±0,3* 7,6 ±1,1 33 % (4/12)

Примечание * — достоверность различий между группами женщин с бесплодием и фертильными женщинами, # - достоверность различий между подгруппами женщин с бесплодием (Р < 0,05, ГГ-критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

Далее мьг исследовали особенности иммунитета при ранних и поздних осложнениях гестации Иммунные нарушения при угрозе самопроизвольных выкидышей в основном связывают с цитокиновым дисбалансом Однако, мнения авторов в отношении доминирования ТЫ- или ТЬ2-цитокинов у беременных с УСВ расходятся

Полученные нами результаты свидетельствуют о снижении супрессорной активности сывороточных факторов, ассоциированной с повышением

продукции ТМ-цитокинов на фоне неизменной продукции ТЬ2-медиаторов (таблица 10) Соответственно, индекс 1НЧуЛЬ-13 у беременных с УСВ повышается в 4 раза

Таблица 10

Содержание ТЫ/ТЬ2 цитокпнов в супернатантах КонА-стимулированных

клеток цельной крови в группах беременных в 1-ом триместре гестации

Цитокины (пг/мл) Физиологическая беременность (п = 13) Угроза самопроизвольных выкидышей (п = 18)

TNF-a 47 ±15 154 ± 60,9

IFN-y 59 ±41 188 ±61*

1Ь2 ИЗ ±64 193 + 78

IL-12 14,3 ±2,2 14,5+5,0

GM-CSF 10,2 ±3,9 25,4 ± 12,2

1Ь5 8,0 ±2,0 8,0 + 2,5

1Ь4 6,2 + 3,9 8,0 ±1,4

BL-10 64,3 ± 27 61,5 ±10,5

IL-13 20,0 ±9,2 26,1 ±11,0

ЮТ-оЛЬ-10 0,9 ± 0,2 4,7 ±1,4

IFN-y/IL-4 8,9 ±2,1 19,4 ± 7,8*

IFN-y/IL-13 4,7 ±2,4 17,2 ± 3,4*

ИСА 0,64 ± 0,04 (п = 26) 0,77 ±0,03* (п= 18)

Примечание * — р < 0,05 — достоверность различий между группами (II-критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

Снижение выраженности иммуносупрессии у женщин с УСВ ассоциировано также с уменьшением количества С04+С025+, в том числе и С04+С025ь'г11-клеток, которое отмечалось, соответственно, у 87 % и 72 % беременных (таблица 11) Полученные данные о важной роли регуляторных Т-клеток в поддержании физиологического течения беременности подтверждаются на экспериментальной модели спонтанных выкидышей у животных. Перенос С04+С025+-клеток от животных с физиологической беременностью предотвращал у них спонтанные выкидыши и, таким образом, способствовал развитию беременности [2епс1ш8еп А С е! а! 2005] С этой позиции СБ4+СЕ)25+ Т-лимфоциты можно рассматривать как потенциальные регуляторные клетки для проведения адоптивной иммунотерапии, направленной на регуляцию репродуктивного процесса

Характерно, что дефицит С04+С025+-клеток сопровождался достоверным 2-кратным усилением пролиферации Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию анти-СБЗмАТ (27626 ± 2062 ул 18193 ± 2060имп/мин, р < 0,05) и тенденцией к усилению ответа на аллоантигены партнера (6295 ± 1321 г.у 2917 ± 1001 имп/шш) Кроме того, в противоположность физиологической гестации у беременных с УСВ регистрировалось достоверное повышение доли активированных СВ56+СВ16+НК-клеток более чем в 2 раза

Таблица 11

Относительное содержание регуляторных Т-клеток и субпопуляций кгиллерных клеток в группах беременных

Показатель Физиологическая Угроза %

беременность самопроизвольно беременныха

го выкидыша

Регуляторньге Т-клетки

CD4+CD25+ 12,9 ± 1,4 7,6 ±0,7* 87 % < 8,6

(п = 31) (п = 24)

СВ4+СБ25Ь«Ь 2,4 ± 0,3 0,59 ±0,08** 72 % < 1,6

(п = 24) (п = 22)

Киллерные клетки

CD56+CD16"CD3" 1,3 ±0,2 1,8 ±0,6 77,2 % > 1,9

(п=17) (п = 22)

CD56+CD16+CD3" 4,4 ± 0,8 10,9 ± 1,9** 81,8 % > 5,5

(п = 17) (п = 22)

CD3+CD56+ 3,5 ±0,8 1,7 ±0,5 50 %< 1,7

(п = 17) (п = 22)

Примечание а — % беременных с УСВ со значениями, выходящими за границы нормативного диапазона, * — р < 0,05,** — р < 0,01 — достоверность различий межд> группами (и-критерий Вилкоксона — Манна-Уитни)

Следовательно, смещение цитокинового баланса в сторону Thl-факторов и снижение содержания регуляторных Т-клеток являются основными механизмами, приводящими к усилению пролиферации аллореактивных Т-лимфоцитов и повышению доли цитотоксических НК-клеток, что, в конечном итоге, отражает снижение выраженности гестационной иммуносупрессии

Анализ параметров иммунитета при поздних осложнениях беременности включал раздельные исследования в подгруппах беременных с гестозом и преэклампсией (ПЭ), учитывая данные об их возможной патогенетической разнородности Данные литературы о закономерностях продукции различных цитокинов при гестозе не позволил сделать однозначный вывод о доминировании Thl/провоспалительных или ТЪ2/противовоспалительных цитокинов [Matthiesen L et al 2003, Jonsson Y et al 2004, Freeman D S et al

2004] Вместе с тем, исследование цитокинового профиля у беременных имеет важное значение, поскольку может являться предиктором манифестации гестоза [Hamai Y et al 1997, Xu W et al 1997, Williams et al, Eneroth E et al 1998, Nakabayashi M et al 1998] Анализ биологической активности сыворотки крови у беременных с гестозом показал значимое снижение CA, которое коррелировало с нарастанием тяжести заболевания (таблица 12) Группа беременных с ПЭ оказалась гетерогенной у половины женщин выявлялась супрессорная активность, у других пациенток она отсутствовала

Таблица 12

Показатели суирессорной активности сыворотки крови в группах беременных с _различной степенью тяжести гестоза_

Группы ИСА(расч ед) % беременных с отсутствием супрессии

Здоровые беременные (п = 41) 0,67 ±0,02 15%

Гестоз (общая группа)(п = 68) 0,79 ±0,03* 47%

Гестоз легкой и средней степени (п = 44) 0,81 ±0,06* 42%

Гестоз тяжелой степени (п = 16) 0,87+0,03* 69%

Преэклампсия (п = 8) 0,73 ±0,11 50%

Примечание * — Р < 0,01 — достоверность различий между группами (II-критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

Анализ продукции цитокинов при гестозе выявил значимое возрастание как ТЫ-СГОТ-а, ПРМ-у), так и ТЬ2-цитокинов (ГЬ-4, ГЬ-10, 1Ь-13) Соответственно, индекс соотношения ТЬ1/ТЬ2 цитокинов при гестозе значимо не менялся У беременных с ПЭ на фоне повышения продукции №N-7, 1Ь-4, 1Ь-13 отмечалось глубокое угнетение продукции 1Ь-10, что наиболее наглядно отразилось в резком повышении индекса ТЫР-а/1Ь-10 (таблица 13) Роль провоспалительных цитокинов при патологии беременности активно обсуждается многими авторами В экспериментальных моделях на животных показано, что введение ТОТа беременным самкам вызывает апоптоз клеток трофобласта, повреждение плаценты и преждевременное прерывание беременности [СЬаошИ в е1 а1 1990] Рядом авторов также отмечается повышенное содержание ТЫ/провоспалительных цитокинов (ОТЧ-у, ТИР-а, 1Ь-1(3, 1Ь-6, 1Ь-8) у женщин с гестационной гипертензией [Медвинский В идр 2003,1л К й а1 1999] Что касается продукции иммуносупрессорных цитокинов при развитии гестоза, то данные литературы не однозначны Учитывая одновременное увеличение продукции ШЧ-у и 1Ь-4, можно полагать, что развитие гестоза сопряжено с активацией либо предшественников (ТЬ0), способных продуцировать как ТЫ-, так и ТЬ2- цитокины, либо обеих

субпопуляций Т-хелперных клеток С другой стороны, имеющиеся противоречия ставят под сомнение представления об однозначности негативного влиянии ТЫ/провоспалительных цитокинов и позитивного влияния ТЬ2/противовоспалительных цитокинов на течение беременности Не исключено, что отдельные цитокины из обеих функционально оппозитных групп играют важную роль при беременности и именно их оптимальное соотношение, в конечном счете, определяет нормальное течение беременности и роды

Таблица 13

Содержание Thl/Th2 цитокинов в супернатантах КонА-стимулированных клеток цельной крови в группах беременных в III триместре гестации

Цитокины (пг/мл) Физиологическая беременность (n = 37) Гестоз (n = 30) Преэклампсия (n = 5) Pu*

1 2 3

TNF-a 243 ± 135,2 416,0 ±100,3 205 ± 71 Pi 2 < 0,05

IFN-y 149 ±41,2 364,2 ± 142 463 ± 232 P, 2 < 0,05, Pi 3 < 0,05

IL-2 140 ± 74,1 163,9 ± 82,2 81,0 ±66

1Ь12 17,8 ±2,1 10,6 ±1,7 14,1 ± 1,5

GM-CSF 14,6 ±4,89 20,1 ±5,0 10,8 ±5,3

IL-5 8,0 ± 2,0 14,6 ± 4,5 4,4 ±0,1

IL-4 9,6 ±5,9 20,1 ± 8,5 22,1 ±9,4 Pi 2 <0,01, Pi 3 < 0,05

IblO 74,6 ±25,3 122,8 ±47,1 2,9 ±1,1 P, 2 < 0,05, Pi 3 < 0,05, P2 3 < 0,05

IL13 12,7 ±9,2 34,0 ±11,7 31,2 ± 16,4 Pi 2 < 0,05

IFN-y/IL-13 22,9 ±5,9 35,3 ± 15,8 14,3 ±3,7

TNF-a/IL-10 6,7 ± 1,7 8,1 ± 1,8 80,0 ±31 P2 3 < 0,01, P,.3 < 0,05

Примечание р^г < 0,01 — достоверность различий в подгруппах беременных с осложненной гестацией по сравнению с группой женщин с физиологической беременностью (ТТ-критерий Вилкоксона-Манна - Уитни)

Как известно, источником продукции цитокинов в периферической крови могут быть не только Т-хелперные клетки, но и моноциты Действительно, несмотря на однонаправленный характер изменения продукции исследуемых цитокинов при гестозе, прямой корреляционной связи между концентрацией 1Ь-4 и 1Ь-10, а также между уровнем №N-7 и Т№-а, выявлено не было

Участие моноцитов в патогенезе осложненного течения беременности представляется весьма обоснованным Так, повышенный уровень Тда-а при гестозе, включая преэклампсию, описан в периферической циркуляции и плаценте многими авторами Однако до настоящего времени нет прямых данных, указывающих на увеличение при гестозе количества ТНРа-продуцирующих моноцитов

Проведенные нами исследования показали, что содержание С014+С016+ клеток и моноцитов с внутриклеточной экспрессией Т№а/р не изменяется при физиологической беременности, но многократно возрастает у беременных с гестозом (таблица 14) Причем, между количеством Т№о./р+ моноцитов и степенью тяжести гестоза отмечалась прямая корреляционная связь (г = 0,45, р < 0,05) Однако корреляционный анализ не выявил достоверной связи между количеством СШ4+С016+ клеток и числом Т№сс-моноцитов, но выявил достоверную зависимость между С014+С016+ клетками и количеством 1Ь-10-секретирующих моноцитов (г = 0,61, р = 0,03), а также уровнем продукции 1Ь-10 (г = 0,59, р < 0,05) У беременных с ПЭ содержание моноцитов не возрастало, но при этом увеличивалась доля Т№а+-моноцитов На первый взгляд, полученные данные показались несколько неожиданными С другой стороны, в литературе имеются сообщения о возможной иммуносупрессорной активности СБ14+СБ16+ клеток при ряде патологий, например у пациентов с болезнью Кавасаки [Ка1ауата Я е[ а1 2000], больных раком яичника [ЬоегсЬег А Е е1 а1 1999], у новорожденных и детей младшего возраста с сепсисом [БкггесгупБка 1 е1 а! 2002] При этом увеличение числа СШ4+СВ16+ моноцитов сопряжено

Таблица 14

Относительное содержание СО!4+СВ16+клеток и моноцитов с внутриклеточной

экспрессией Т№а/р и 1Ь-10 в периферической крови у беременных

Группы СВ14+Т№а/р+ СВ14+СБ16+11Л0+ СБ14+СЕ>16+

моноциты (%) моноциты (%) моноциты (%)

Здоровые беременные 5,5 + 1,4 1,7 ±0,2 10,0 + 0,6

(п = 14) (п = 14) (п = 23)

Гестоз (общая группа) 10,5 ± 2,3 * 3,1 ±0,8* 20,6 ± 2,7*

(п = 18) (п = 8) (п = 20)

Гестоз легкой и средней 4,9 ±3,7 15,3 ±3,2

степени (п = 5) - (п = 5)

Гестоз тяжелой степени 10,2 ± 2,6# 3,1 ±0,8* 26,1 ± 4,9 *#

(п = 9) (п = 7) (п = 10)

Преэклампсия 16,2 + 4,6* 1,0 10,8 ±3,4

(п = 4) (п= 1) (п = 4)

Примечание здесь контрольная группа - небеременные женщины - доноры крови, * — достоверность различий между группой женщин с физиологической беременностью и подгруппами беременных с гестозом и преэклампсией, # — достоверность различий внутри подгрупп беременных с осложненной гестацией, (Ру < 0,05, и — критерий Вилкоксона - Манна - Уитни)

с повышенной концентрацией IL-Юв сыворотке крови Вероятно, Th2-цитокины и ассоциированные с беременностью гликопротеиды [Mues В et al 1989] способствуют активации моноцитов по альтернативному пути, сопряженному с продукцией противовоспалительных цитокинов При таком рассмотрении увеличение доли CD14+CD16+ клеток при тяжелом гестозе можно интерпретировать как компенсаторную реакцию, направленную на ограничение воспалительного ответа, опосредованного моноцитами с внутриклеточной экспрессией TNFoî/(3

В отличие от физиологической беременности, при гестозе увеличения CD4+CD25+-iuieTOK, включая субпопуляцию С025Ь1£Ьклеток, не наблюдалось (таблица 15) Более того, обращало внимание наличие обратной зависимости между степенью тяжести гестоза и содержанием СТ)4+СТ)25+-клеток (г = -0,48, р = 0,00017) и CD4+CD25h,êh-iuieTOK (г = -0,6, р = 0,00016) Напротив, у беременных с ПЭ сохранялось повышенное содержание регуляторных Т-клеток Исходя из полученных данных, можно предположить, что одной из причин развития гестоза может являться нарушение механизмов формирования активной иммуносупрессии, опосредованной регуляторными Т-клетками

Таблица 15

Относительное содержание CD4+CD25+n CD-l+CD25hlBh Т-клеток

у женщин с гестозом

Группы CD4+CT>25+ (%) CD4+CD25lugh (%)

Здоровые беременные (п = 23) 9,9 ± 0,9 1,0 ±0,1

Беременные с гестозом (общая группа) (п = 33) с легкой степенью (п = 24) с тяжелой степенью (п = 9) 5,6 ±0,6* 6,4 ± 0,8* 5,2 ±1,1* 0,59 ± 0,08* 0,8 ± ОД 0,46 ± 0,08*

Преэклампсия (п = 6) 11,9 ±2,3 2,8 ±0,5*

Примечание * — достоверность различий между подгруппами беременных с гестозом и группой женщин с физиологической гестацией (р < 0,05, И-критерий Вилкоксона - Манна - У итни)

Оценка функциональной активности Т-клеточного звена в Ш-ем триместре беременности очень важна, так как состояние реактивности Т-клеток может определять исход гестации и течение послеродового периода Учитывая снижение супрессорной активности сыворотки крови и количества регуляторных клеток, можно было ожидать усиления пролиферации Т-клеток Между тем, пролиферативный ответ на стимуляцию анти-СБЗмАТ у беременных с гестозом оказался снижен (20639 ±2311 27776 ± 1919 имп/мин, р < 0,05) Поскольку снижение пролиферативного ответа лимфоцитов может быть связано как с функциональной недостаточностью, так и с количественным дефицитом

отвечающей популяции Т-клеток, был исследован уровень апоптоза лимфоцитов Анализ данных показал усиление как спонтанного (9,8 ± 1,1 га 6,18 ± 0,9, р < 0,05), так и индуцированного апоптоза (11,0 ± 1,4 га 8,4 ± 1,2, р < 0,05), с чем, вероятно, и было связано снижение пролиферации лимфоцитов Считается, что состояние Т-клеточной иммуносупрессии благоприятно для развития первой половины беременности, но ее сохранение к завершению периода гестации может осложнять роды и послеродовый период, способствуя развитию инфекционных заболеваний

На фоне ослабления иммуносупрессии у беременных с гестозом увеличивалось количество активированных СЕ)56+С016+-клеток В то же время количество 1ЧК-клеток с низкой цитолитической активностью (С056+С016~) и N0 клеток при гестозе снижается, опускаясь ниже исходного уровня, характерного для контрольной группы небеременных Учитывая, что СВ56+С016+-клетки обладают способностью индуцировать дифференцировку Т-хелперов по ТЬ1 -пути [РгеиЬпег Б е1 а1 2006], повышение их количества на фоне снижения оппозитной субпопуляции НК-клеток, может усиливать ТЫ-ответ

Таким образом, развитие гестоза сопряжено со снижением гестационной иммуносупрессии, выраженность которой обратно коррелирует с тяжестью заболевания Нарушение механизмов иммуносупрессии связано с активацией продукции провоспалительных цитокинов Т-хелперными клетками и моноцитами и снижением числа регуляторных Т-клеток Усиление продукции ТЪ2-цитокинов и 1Ь-10 моноцитов при гестозе можно рассматривать как компенсаторную реакцию на запуск воспалительного ответа, а снижение продукции 1Ь-10 у больных с преэклампсией - как срыв компенсаторной реакции

Выявленные иммунные нарушения репродуктивной функции, с одной стороны, свидетельствуют о важной роли супрессорной реаранжировки иммунной системы в репродуктивном процессе, а с другой — позволяют обосновать новые методы иммунокоррекции в лечении бесплодия и патологии беременности В качестве таковых мы исследовали эффективность 2-х иммунотерапевтических подходов Сущность первого заключалась в аллоиммунизации лимфоцитами партнера (АИЛ) с целью стимуляции продукции блокирующих факторов при иммунологическом бесплодии Как показали сравнительные исследования в сопряженных парах, проведение аллоиммунизации лимфоцитами сопровождалось повышением содержания БФ в сыворотке крови женщин При этом число лиц с дефицитом блокирующих факторов снижалось с 82 % до 27 % (таблица 16) После курса АИЛ достоверно снижалось содержание активированных ИК (СБ56+СВ16+) и 1МКТ (СБ56+СОЗ+) лимфоцитов и возрастала доля СБ56+СБ16"-клеток

Ретроспективная оценка эффективности АИЛ была проведена в 2-х группах В 1-ую группу вошли женщины с неудачными попытками ЭКО в анамнезе, у которых АИЛ проводилась перед следующей процедурой ЭКО 2-ю группу составили женщины с естественным циклом Как следует из

Таблица 16

Сравнительная характеристика нролиферативною ответа Т-клеток в СКЛ да и после проведения аллоиммунизации лимфоцитами партнера

Показатель Группы

До лечения (п = 29) После лечения (п = 29)

Уровень пролиферации 15 СКЛ (имп/мин) — в присутствии аутологичной сыворотки — в присутствии АВ (ГУ) сыворотки доноров 4225 ±1152 6896 ±1538 1966 ± 449* 5140 ± 926

ИВскл-бф (расч. ед.) 1,37 ±0,3 0.53 ± 0.07*

СТЛбЧЛИбЧТИ- НК (%) 12,6 ±1,9 7,6 ±1.0*

С05б+ СГЛб'СОЗ' 5.7 ±0,7 7,4* 1 3

СОЗ+СТ>56+ 9,1 ± 1,0 6,0 ±0,8*

Примечание: ИВекл-бф — индекс влияния блокирующих факторов рассчитывали как соотношение уровней пролиферативного ответа при добавлении аутологичной сыворотки и а присутствии пулированных сывороток доноров, * - достоверность различий между группами (р < 0.05; И-критерий Вилкоксоиа - Манна - Уитни).

рисунка I, в 1-й группе беременность наступила в 52 % случаев и на момент повторного опроса у 28 % женщин закончилась родами. Во 2-й группе у 40 % женщин беременность прогрессировала и у каждой третьей уже завершилась родами.

1 группа

2 группа

[]] Без эффекта Щ Выкидыш Роды Беременность

Рис. 1. Показатели клинической эффективности лечения бесплодия с использованием метода аллоиммушзании лимфоцитами партнера

В отдельно сформированной группе женщин с изначально высоким уровнем антиспермальных антител (АСАТ) после проведения АИЛ регистрировалось достоверное снижение показателей АСАТ (рис. 2). Причем е группе с клиническим эффектом (наступление беременности) уровень АСАТ снижался до нормативных значений ( < 60ЕД).

В качестве 2-го подхода была проведена апробация гестагена (дюфастон) для профилактики развития гестоза в группах риска. Поскольку развитие гестоза происходит на фоне неполноценной лютеиновой фазы, связанной с нарушением продукции прогестерона, предложено пролонгированное назначение гестагена. Известно, что назначение прогестерона или его аналогов (дюфастон) при НЛФ успешно внедряется в клиническую практику и позволяет сохранить беременность у женщин с угрозой ее прерывания. Одновременно мы попытались выяснить, может ли коррекция иммунных дисфункций в Той половине беременности предотвратить развитие осложнений гестации во П-ой половине. Оценка влияния дюфастона была проведена в 3-х группах: у женщин с физиологической гестацией; у беременных из группы риска по развитию гестоза, принимавших дюфастон; и у женшин с тяжелым гестозом, входивших в группу риска, но не принимавших дюфастон.

Согласно проведенным исследованиям, назначение гестагена — дюфастон в 1-ой половине гестации женщинам с угрозой невынашивания беременности и риском развития гестоза сопровождалось коррекцией цитокино в ого баланса, при котором уровень ТЫ- и ТЪ2-цитокинов практически соответствовал показателям, характерным для Ш-его триместра физиологической гестации. Иммуномодулирующий эффект дюфастона отчетливо виден на рисунке 3, где данные представлены в виде процентного выражения концентрации цитокинов от нормативных значений, принятых за 100 %. Наряду с исследованием цитокинового профиля, была проанализирована пролиферативная активность Т-клеток в исследуемых группах. Анализ данных показа:!, что интенсивность анти-

□ АСАТ до АИЛ О АСАТ после АИЛ

Беременность+

Беременность-

Рис. 2. Показатели эффективности АИЛ в занисимости от динамики снижения титра АСАТ

СОЗ-стимулированной пролиферации у женщин с развившимся гестозом была достоверно ниже, чем при физиологической беременности (18087 ± 2209 у.й9330 ± 2903 имп/мин; р<0,05). У беременных, принимавших дюфастон, пролиферативная активность Т-клеток была сопоставима с таковой при физиологической гестации и значимо превышала аналогичный показатель в группе беременных с гестозом (26691 ± 2667 18087 имп/мин; р < 0,05),

Позитивная динамика параметров иммунитета в исследуемой группе сопровождалась клиническим эффектом, а именно, снижением частоты развития поздних осложнений гестации и, что особенно важно, отсутствием наиболее тяжелых форм гестоза. Так, анализ частоты развития гестоза показал, что у беременных из группы риска, которые не принимали дюфастон — гестоз выявлялся в 37% (15/40) случаев, причем в 15 % — тяжелый гестоз. У беременных из группы риска, принимавших в 1-ой половине дюфастон, гестоз регистрировался в 16 % и при этом не было ни одного случая тяжелого гестоза или ПЭ.

Рис. 3. Показатели содержание цитокинов и группах женщин с гестозом (а) и беременных, принимавших дигидрогестерон (б), представленные и процентном выражении от нормативных значений в контрольной группе, принятых за 100 %

Механизм действия дюфастона, вероятно, связан с его структурой, аналогичной натуральному прогестерону. Согласно данным литературы, регуляторное действие прогестерона реализуется посредством активации CDST-клеток, которые продуцируют прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (PIBF). При низком содержании прогестерона и недостаточной продукции PLBF усиливается действие Т-хелперов 1-го типа, которые продуцируют Thl/провоспалительные цитокины [Сидельникова В. М. и др. 2002; Empson M. et al. 2002]. Кроме того, 1грогестерон стимулирует выработку лимфоцитами белка с м. в, 34 кД, ингибирующего цитотоксическую активность NK-клеток (Miyaura H. et al. 20021. В наших исследованиях у женщин, принимавших вследствие угрозы самопроизвольных выкидышей дюфастон, уровень продукции ТЫ-цитокинов

достоверно снижался по сравнению с беременными, у которых развился гестоз Выявленное нами усиление продукции ТЬ2-цитокинов при гестозе, вероятно, отражает компенсаторную противовоспалительную реакцию, направленную на ограничение воспалительного ответа Можно предположить, что при умеренной выраженности ТЫ-ответа противовоспалительная реакция развиваться не будет И действительно, у беременных, принимавших дюфастон, усиление продукции ТЫ- цитокинов было умеренным и недостоверным, а продукция ТЬ2-цитокинов - сравнима с таковой при физиологической беременности Коррекцией цитокинового баланса можно, по-видимому, объяснить и сохранную пролиферативную активность Т-клеток при их стимуляции анти-СБЗмАТ у беременных, принимавших дюфастон Учитывая, что прием препарата в первой половине гестации позволяет нормализовать продукцию цитокинов во второй ее половине, можно предположить, что формирование поздних осложнений гестации закладывается в первом триместре беременности на фоне цитокинового дисбаланса Действительно, формирование фетоплацентарной недостаточности, как одного из важных причинных факторов развития гестоза, происходит в раннем периоде беременности Поэтому можно полагать, что применение дюфастона в ранние сроки беременности позволяет сбалансировать продукцию цитокинов и купировать формирование НЛФ и, таким образом, предотвратить не только угрозу прерывания беременности, но и профилактировать развитие поздних осложнений гестации Полученные нами данные о позитивном влиянии дюфастона на состояние иммунитета в Ш-ем триместре беременности является дополнительным аргументом в пользу данного метода терапии

ВЫВОДЫ

1 Состояние физиологической иммуносупрессии, формирующееся в овуляторный период, обусловлено действием регуляторных С04+СЭ25+ Т-клеток и гуморальных супрессорных факторов, активность которых прямо коррелирует с биохимическим показателем ранней беременности - уровнем хорионического гонадотропина человека, что свидетельствует о важном значении иммуносупрессорной перестройки в наступлении беременности

2 Супрессорная реорганизация иммунной системы наиболее выражена в 1-ом триместре физиологической беременности, проявляется усилением супрессорной активности сыворотки крови и снижением митоген-индуцированного пролиферативного ответа Т-клеток и обусловлена смещением цитокинового баланса в сторону ТЬ2/иммуносуирессорных факторов и увеличением содержания регуляторных СЮ4+СВ25+ Т-клеток

3 К Ш-ему триместру физиологической беременности выраженность иммуносупрессии ослабевает Это проявляется усилением пролиферативной активности Т-клеток и увеличением доли активированных С056+СЕ)1б+ ЫК-клеток и ассоциировано со снижением содержания регуляторных

CD4+CD25bgh Т-клеток и уменьшением степени поляризации цитокинового баланса в сторону ТЬ2-медиаторов

4 Иммунные дисфункции при бесплодии неясного генеза сопряжены с дефицитом в сыворотке крови блокирующих факторов, подавляющих ответ на аллоантигены, и повышением содержания различных субпопуляций киллерных клеток, в том числе активированных CD56+CD16+NK

5 Беременность у женщин с угрозой самопроизвольных выкидышей ассоциирована с нарушением формирования гестационной иммуносупрессии, о чем свидетельствует снижение супрессорной активности сыворотки крови, усиление пролиферации Т-клеток и повышение доли активированных CD56+CD16+ NK Выявленные изменения связаны с усилением продукции Thl-цитокинов и снижением количества регуляторных CD4+CD25+/CD4+CD25hgh Т-клеток

6 Осложненная гестозом беременность характеризуется дефектом механизмов гестационной иммуносупрессии, что проявляется снижением супрессорной активности сыворотки крови и увеличением доли активированных NK-клеток и обусловлено снижением содержания регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+/CD4+CD25hlgh), усилением продукции ТЬ1/ТЬ2-цитокинов и количества TNFa/p+ и IL-10+ секретирующих моноцитов Усиление продукции ШЕ-цитокинов и 1Ь-10+-секретирующих моноцитов при гестозе является проявлением механизмов feed-back регуляции в ответ на запуск провоспалительных цитокинов, поскольку развитие наиболее тяжелого проявления гестоза - преэклампсии сопровождается резким снижением продукции IL-10

8 Наличие обратной корреляционной зависимости тяжести гестоза с супрессорной активностью сыворотки крови и относительным содержанием CD4+CD25+/CD4+CD25hlgh Т-клеток свидетельствует о важности нарушений механизмов гестационной иммуносупрессии в развитии поздних осложнений беременности

9 Повышение уровня блокирующих факторов в сыворотке крови и снижение содержания активированных CD56+CD16+ NK-клеток на фоне аллоиммунизации лимфоцитами партнера ассоциировано с наступлением беременности, что свидетельствуют о необходимости индукции иммуносупрессии для повышения фертильности у женщин с бесплодием неясного генеза

10 Пролонгированный прием гестагена (дюфастон) в Той половине гестации приводит к коррекции цитокинового баланса у женщин с риском развития гестоза и позволяет снизить частоту развития осложнений во И-ой половине беременности, что свидетельствует о патогенетической роли иммунных дисфункций в развитии гестоза

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Хонина H А Айзикович И В, Ладыгина Е А, Дегтярев M А, Черных Е Р Особенности иммунитета у женщин, страдающих бесплодием //Тез докладов Всероссийского семинара по проблемам бесплодия — Саратов —2001 —С 106

2 Хонина H А Айзикович И В , Ладыгина Е А , Белова А Е , Дегтярев M А, Черных Е Р Роль иммунных механизмов в фолликулогенезе у женщин репродуктивного возраста // Актуальные вопросы современной медицины —Новосибирск —2002 —С 57

3 Хонина H А , Шевела Е Я , Айзикович И В , Ладыгина Е А , Белова А Е , Дегтярев M А, Черных Е Р Биологическая активность и уровни цитокинов в фолликулярной жидкости у женщин со стимулированным фолликулогенезом //Тез докладов Международной научно-практической конференции »Цитокины Воспаление Иммунитет» — С-Пб 2001 — Цитокины и воспаление — 2002 — Т1,№2 — С 155

4 Айзикович И В , Ладыгина Е А , Хонина H А , Белова А Е , Дегтярев M А , Шевела Е Я , Черных Е Р Роль интерлейкина-2 в развитии синдрома гиперстимуляции яичников // Тез докладов Всероссийского семинара «Современные подходы к лечению бесплодия» — Екатеринбург, 2002 — С 4-5

5 Хонина H А Айзикович И В , Ладыгина Е А , Белова А Е , Черных Е Р, Пасман H А Системные и локальные проявления иммуносмупрессии у женщин в период овуляции // Тез докладов Всероссийского семинара «Современные подходы к лечению бесплодия» — Екатеринбург, 2002 — С 176-177

6 Хонина H А, Бурухина А H, Айзикович И В , Ладыгина Е А, Белова А Е , Сычева H В , Черных Е Р, Пасман H А Использование метода сочетанной экстракорпоральной антибактериальной и иммунокорригирующей терапии при лечении резистентных случаев урогенитальной инфекции //Там же, Екатеринбург, 2002 — С 177-178

7 Айзикович Б И, Останин А А, Хонина H А, Черных Е Р Доброкачественная гиперплазия предстательной железы иммунологические аспекты патогенеза и лечения // Бюллетень СО РАМН — 2002 — №2 — С 96-101

8 Хонина H А , Тихонова M А , Шевела Е Я, Леплина О Ю , Пасман H M , Айзикович И В , Черных Е Р Иммуносупрессорная перестройка при контролируемой стимуляции суперовуляции как необходимый этап имплантации эмбриона // Иммунология, иммуногенентика, иммунопатология (Мат 6-ой отчетной сессии ИКИ СО РАМН) — Новосибирск, 2003 —С 97-101

9 Хонина H А, Дударева А В, Тихонова M А, Леплина О Ю, Останин А А , Пасман H M, Черных Е Р Нарушение механизмов активной иммуносупрессии при беременности, осложненной гестозом // Бюллетень СО РАМН — 2003 — № 3 — С 73-76

10 Серов В Н , Пасман Н М , Черных Е Р , Останин А А , Хонина Н А, Дробинская А Н, Дударева А В Интенсивная терапия критических состояний в акушерско-гинекологической клинике с использованием эфферентных иммунокорригирующих методов // Вестник НГУ, серия биология, клиническая медицина — 2004 — Т 2, № 2 — С 63-65

11 Хонина Н А , Айзикович И В , Останин А А , Черных Е Р Роль цитокинов в овариальной функции // «Система цитокинов Теоретические и клинические аспекты», Новосибирск — 2004 — С 96-109

12 Пасман Н М, Черных Е Р, Останин А А, Дударева А В, Дробинская А Н, Хонина Н А, Опарина М П, Семенова Н В Роль дидрогестерона в профилактике гестационных осложнений // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии —2004 —Т 3, №3 —С 21-25

13 Айзикович Б И, Леплина О Ю, Тихонова М А, Хонина Н А, Черных Е Р , Останин А А Доброкачественная гиперплазия предстательной железы состояние иммунитета и тактика консервативного лечения // Материалы IV Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической иммунологии» — Кемерово, 2004 — С 82-94

14 Черных Е Р , Семенова Н В , Пасман Н М , Хонина Н А , Дударева А В Особенности иммунного статуса и диагностическая ценность определения некоторых показателей иммунитета при гестозе // Вестник НГУ, серия биология, клиническая медицина — 2004 — Т 2, № 4 — С 82-89

15 Дударева А В , Хонина Н А , Пасман Н М , Черных Е Р , Нарушение цитокинового баланса при беременности, осложненной гестозом //Мат тез 14-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины» —Новосибирск —2004 —Т2 —С 5-6

16 Хонина Н А , Дударева А В , Пасман Н М , Поздняков И М , Селедцова Н В , Тихонова М А , Романовский Д М , Останин А А, Черных Е Р Влияние дидрогестерона на иммунный статус женщин с высоким риском преждевременного прерывания беременности // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. — 2006 — Т 5, № 4 — С 20-25

17 Хонина Н А, Дударева А В, Тихонова М А, Демина С Г, Пронкина Н В , Кожевников В С , Пасман Н М , Останин А А , Черных Е Р Дисфункции моноцитарного звена иммунитета при гестозе // Материалы Всерос научно-практич конференции с межд участием «Метаболические механизмы иммунореактивности» — Красноярск, 2004 — С 75

18 Хонина Н А, Дударева А В, Тихонова М А, Демина С Г, Дробинская А Н , Пасман Н М , Черных Е Р Иммунные дисфункции как возможные причины патогенеза гестоза // Материалы Всерос научно-практич конференции с межд участием «Метаболические механизмы иммунореактивности» — Красноярск, 2004 — С 74

19 Пасман Н М, Черных Е Р, Серов В Н, Хонина Н А, Останин А А , Дударева А В , Тихонова М А , Дробинская А В Иммунологические

изменения при физиологической и осложненной гестозом беременности//Мат Y1 Российского Форума «Мать и дитя», Москва, 12-15 октября

2004 —-С 260-261

20 Хонина Н А, Дударева А В , Тихонова М А, Пронкина Н В , Кожевников В С , Дробинская А Н , Демина С Г , Пасман Н М , Останин А А, Черных Е Р Особенности продукции цитокинов и характеристика моноцитов при осложненной гестозом беременности // Иммунология —

2005 — №3 —С 156-161

21 Хонина Н А, Дробинская А Н, Тихонова М А, Леплина О Ю, Пасман Н М, Черных Б Р, Кустов А А, Останин А А Системная воспалительная реакция у больных с акушерской патологией // Вестник НГУ, серия биология, клиническая медицина — 2005 — Т 3, № 2 — С 104-111

22 Черных Е Р , Останин А А , Хонина Н А , Дробинская А Н, Пасман Н М, Безменова С И, Демина С Г , Никонов С Д, Дударева А В Экстракорпоральная антибиотикотерапия и иммунотерапия в лечении хронических персистирующих урогенитальных инфекций у гинекологических больных // Вестник НГУ, серия биология, клиническая медицина —2005 — Т 3, № 2 — С 111-115

23 Хонина Н А, Айзикович И В, Шевела Е Я, Тихонова М А , Ладыгина Е А , Белова А Е , Дегтярев М А , Пасман Н М , Останин А А , Черных Е Р Регуляторные факторы и цитокины в сыворотке и фолликулярной жидкости у женщин при контролируемой овариальной гиперстимуляции //Цитокины и воспаление —2005 —Т4, №2 —С 38-44

24 Пасман Н М, Хонина Н А, Дударева А В , Тихонова М А, Дробинская А Н , Останин А А , Черных Е Р Т-клеточно-моноцитарные дисфункции при осложненной гестозом беременности //Russian journal of immunology —2005 — Vol 9 — №2 — P 175

25 Хонина H A , Дударева А В , Тихонова M A , Пасман H М , Черных Е Р Субпопуляция регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток при физиологической и осложненной гестозом беременности //Russian journal of immunology —2005 — Vol 9 — №2 — P 183

26 Хонина H A , Тихонова M A , Дударева А В , Дробинская A H, Пасман H M, Черных E P Баланс цитокинов при физиологической и осложненной гестозом беременности // Тез докладов конференции «Дни иммунологии в Сибири» — Красноярск, 2005 — С 118-119

27 Семенова Н В , Хонина Н А , Тихонова М А , Пасман Н М , Черных Е Р Гестационная иммуносупрессия у беременных с угрозой невынашивания в зависимости от уровня дегидроэпиандростерона сульфата //Там же, Красноярск, 2005 — С 115-116

28 Семенова Н В , Хонина Н А , Тихонова М А , Пасман Н М, Черных Е Р Характеристика показателей иммунитета при беременности на фоне гиперандрогении //Тез материалов конференции молодых ученых — Новосибирск —Сибмедиздат —2005 —С ИЗ

29 Хонина Н А , Тихонова М А , Дударева А Н , Дробинская А В , Пасман Н М, Останин А А, Черных Е Р Характеристика CD4CD25 Т-лимфоцитов и CD14CD16 моноцитов при физиологической и осложненной гестозом беременности //Цитокины и воспаление — 2005 — Т 2, № 4 — С 102

30 Черных Е Р , Дробинская А Н Хонина Н А , Пасман Н М , Леплина О Ю , Останин А А , Безменова С И , Демина С Г Экстракорпоральная антибиотико- и иммунотерапия в лечении урогенитальной инфекции у больных акушерско-гинекологического профиля //Сборник работ по мат 7-ой научно-прак конференции «Актуальные вопросы медицины» — Новосибирск, 2005 —С 352-355

31 Дробинская А Н, Хонина Н А, Пасман Н М, Останин А А, Черных Е Р, Тихонова М А , Леплина О Ю Критические состояния в акушерско-гинекологической практике с позиции ССВО //Там же, Новосибирск, 2005 — С 337-344

32 Дробинская А Н, Хонина Н А , Тихонова М А, Пасман Н М, Черных Е Р, Останин А А Клинико-иммунологические особенности системной воспалительной реакции у больных с акушерской и хирургической патологией // Там же, Новосибирск, 2005 — С 344-364

33 Черных Е Р , Серов В Н, Хонина Н А , Пасман Н М, Дударева А В , Тихонова М А , Пронкина Н В , Кожевников В С , Дробинская А Н , Демина С Г, Останин А А Иммунологические основы профилактики гестоза //Мат YII Российского форума «Мать и дитя», Москва, 11-14 октября 2005 — С 294-295

34 Дробинская А Н , Хонина Н А, Черных Е Р , Пасман Н М, В С , Леплина О Ю , Останин А А , Безменова С И, Демина С Г , Никонов С Д, Дударева А В Оптимизация лечения хронических персистирующих инфекций путем применения экстракорпоральной антибиотикотерапии и иммунотерапии (ЭАИТ) //Мат YII Российского форума «Мать и дитя» — Москва, 11-14 октября 2005 — С 375-376

35 Дробинская А В , Хонина Н А , Тихонова М А, Черных Е Р , Останин А А, Пасман Н М Клинико-иммунологические особенности системной воспалительной реакции у больных с акушерской и хирургической патологией //Мат 11 научно-практ конф »Современные аспекты анестезиологии и интенсивной терапии»- Новосибирск, 2005 — С 1-11

36 Айзикович Б И, Айзикович И В , Хонина Н А , Черных Е Р , Останин А А Иммунологические аспекты регуляции ранних этапов репродуктивного процесса // Проблемы репродукции — 2005 — №6 — С 7-14

37 Айзикович Б И, Айзикович И В , Леплина О Ю , Хонина Н А , Черных Е Р, Останин А А Иммунологический мониторинг в динамике физиологического и стимулированного овуляторного цикла //Репродукция — 2006 — № 1 —С 39-46

38 Хонина Н А Пасман Н М, Останин А А, Черных Е Р Особенности продукции цитокинов при физиологической и осложненной беременности //Акушерство и гинекология — 2006 —№2 —С 11-15

39 Серов В Н, Хонина Н А, Дробинская А Н, Тихонова М А, Леплина О Ю , Стрельцова Е И, Пасман Н М , Черных Е Р , Останин А А Клинико-иммунологические особенности системной воспалительной реакции у больных с акушерской и хирургической патологией // Акушерство и гинекология — 2006 — № 2 — С 36-42

40 Хонина Н А, Селедцова Н В , Тихонова М А, Останин А А, Пасман Н М, Черных Н М Иммунные механизмы регуляции репродуктивной функции // Материалы 7-ой отчетной сессии ИКИ СО РАМН —Новосибирск, 2006 — С 232-237

41 Хонина Н А ,_Селедцова Н В , Тихонова М А, Пасман Н М, Останин А А, Черных Е Р Механизмы активной иммуносупрессии, опосредованной регуляторными Т-клетками, при физиологической и осложненной беременности // Мат Всеросс науч-практ конференции »Дни иммунологии в Сибири» — Красноярск — 2006 — С 127-129

42 Селедцова Н В , Хонина Н А , Тихонова М А, Пасман Н М, Черных Е Р Дендритные клетки в патогенезе самопроизвольного аборта при надпочечников ой гиперандрогении // Там же, Красноярск — 2006 — С 125-127

43 Селедцова Н В , Хонина Н А, Дударева А В, Тихонова М А, Пасман Н М, Останин А А, Черных Е Р Параметры Т-клеточного иммунитета у беременных с повышенным и нормальным уровнем сывороточного дегидроэпиандростерона сульфата// Мед иммунология — 2006 — Т 8, №2-3 —С 319-320

44 Селедцова Н В , Хонина Н А, Дударева А В , Тихонова М А, Останин А А , Пасман Н М , Черных Е Р Нарушение иммунорегуляторных механизмов у беременных с гиперандрогенией // Бюллетень СО РАМН — 2006 — № 119 — С 35-40

45 Seledtsova N V , Chomna N А , Tichonova М А , Ostanin А А , Pasman N М, Chernykh Disfunctions of T-cell immunity at pregnant women with an increased serum level of dehydroepiandrosterone sulfate // 1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology 16th European Congress of Immunology - ECI September 6-9, 2006 — Pans, France — P 273

46 Селедцова H В , Хонина H A, Пасман H М, Черных Е Р Роль дегидроэпиандростерона в регуляции функциональной активности иммунокомпетентных клеток // Бюллетень СО РАМН — 2007 — № 1 — С 40-46

Подписано в печать 19 04 07 г Формат 60 х 84/16 Уел печ л 2,0 Тираж 100 экз Изд № 28п/07 Заказ № 135п

Оригинал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат» НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383)225-24-29 E-mail sibmedisdat@rambler ru

Отпечатано в типографии НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383) 225-24-29

Актуальность темы исследования обусловлена ухудшением демографической ситуации, связанной с одной стороны - с нарастанием числа бесплодных браков, а с другой стороны - увеличением случаев осложненного течения беременности. По данным статистики у каждой 15-ой семейной пары регистрируется нарушение репродуктивной функции, требующее тщательного обследования и лечения. Современные методы диагностики и лечения гинекологических и эндокринных заболеваний позволяют добиться их излечения, однако, в ряде случаев, это не сопровождается восстановлением репродуктивной функции. Поэтому, в последние годы особое внимание стало уделяться иммунным дисфункциям, ассоциированным с нарушением репродуктивных процессов. Соответственно, характеристика показателей иммунитета у фертильных женщин на всех этапах репродуктивного цикла и исследование иммунных нарушений при патологии представляется исключительно важной задачей для выяснения роли иммунных дисфункций в развитии патологии репродукции.

Из данных литературы известно о тесном взаимодействии иммунной и эндокринной систем на различных этапах реализации репродуктивной функции. Об этом свидетельствуют данные о влиянии половых гормонов на функции иммунокомпетентных клеток (ИКК) и наличие на них рецепторов к этим гормонам [62, 139, 220, 221, 341]. Показано, что к моменту имплантации в эндометрии накапливаются ИКК, среди которых доминируют натуральные киллерные (НК) клетки с низкой цитолитической активностью [17, 97, 253]. Имеются данные об изменении уровня продукции цитокинов в зависимости от фазы овуляторного цикла [67, 154, 359]. Современные достижения репродуктивной медицины позволили вплотную подойти к исследованию микроокружения фолликулов и продемонстрировали важную роль ИКК и продуцируемых ими цитокинов в созревании ооцитов, от степени зрелости которых во многом зависит наступление беременности [134, 200, 346]. Согласно современным представлениям иммунные нарушения могут приводить к развитию патологических изменений репродуктивной системы, включая самые ранние этапы - оплодотворение яйцеклетки и имплантацию бластоцисты, что в конечном итоге провоцирует развитие бесплодия. Подобные нарушения относят к так называемому "иммунологическому бесплодию", которое, по некоторым данным, регистрируются в 50% всех случаев бесплодных браков [73]. В современной литературе обсуждается несколько причин иммунологического бесплодия. Прежде всего, это низкий иммунный ответ на аллоантигены партнера из-за сходства по отдельным HLA-локусам и низкое содержание в сыворотке крови блокирующих факторов [2, 21, 270, 311]. В данном случае процедура аллоиммунизации лимфоцитами партнера (АИЛ) усиливает продукцию блокирующих факторов и индуцирует состояние иммуносупрессии [254, 255]. Иммунные дисфункции у женщин с бесплодием могут проявляться повышением содержания активированных натуральных киллерных (НК) клеток (CD56+CD16+), которые способны разрушать клетки формирующегося трофобаста [264, 265, 313]. Причем, важное значение имеет не только субпопуляция эндометриальных НК, но и циркулирующих НК, которые могут рекрутироваться в зону имплантации [104, 173]. Высокое содержание у женщин антиспермальных антител (АСАТ) также может являться препятствием к оплодотворению и успешной имплантации бластоцисты. [2]. Следовательно, снижение продукции блокирующих факторов, повышение содержания активированных НК, наряду с усилением продукции АСАТ, могут препятствовать успешной имплантации эмбриона.

Наступление беременности ассоциировано с индукцией толерантности к аллоантигенам плода, что достигается посредством иммунологической перестройки, направленной на формирование физиологической иммуносупрессии [121, 325]. Индукция и поддержка гестационной иммуносупрессии достигается в результате сложного взаимодействия цитокин-опосредованных и клеточных механизмов регуляции иммунитета у беременных [23, 30, 81, 152]. В то же время развитие иммунных дисфункций, по данным литературы, ассоциировано с осложненным течением беременности [151, 179, 205, 206, 267, 268].

Известно, что физиологическая беременность сопровождается активной цитокин-опосредованной супрессией, направленной на смещение цитокинового баланса в сторону продукции ТЪ2/иммуносупрессорных медиаторов [106, 154, 205, 206, 267, 268, 286]. Переключение иммунного ответа по ТЫ типу приводит к угнетению активности натуральных киллерных клеток и цитотоксических CD8+T-лимфоцитов [257]. Ранние осложнения гестации проявляются угрозой невынашивания беременности и в ряде случаев носят характер повторяющихся самопроизвольных выкидышей. Однако, данные о нарушениях иммунитета у беременных с угрозой самопроизвольных выкидышей (УСВ), касающиеся цитокинового статуса, носят неоднозначный характер. Большинство сообщений свидетельствует об активации Thl-клеток и, соответственно, усиленной продукции провоспалительных цитокинов [100, 205, 206, 258, 261, 267, 268]. В других исследованиях не находят значимых различий цитокинового профиля при физиологической беременности и угрозе невынашивания [65]. В последних сообщения представлены данные о повышенной продукции Th2 - цитокинов у женщин со спонтанным прерыванием гестации [39, 63, 370].

Учитывая, что в последние годы в литературе широко обсуждается роль CD4+CD25+ Т-клеток в контексте подавления трансплантационных реакций при аллогенных пересадках органов и тканей [113, 162, 175, 291], представляется актуальным исследование их роли при беременности. Особенно, это важно при самопроизвольных выкидышах, которые по сути являются отторжением аллотрансплантанта. В единичных работах сообщается о повышении содержания CD4+CD25+-KneTOK при физиологической беременности и снижении их количества у женщин с УСВ [292, 293, 303]. Как показывают последние данные, CD4+CD25+-ioieTKH регулируют не только пролиферацию Т-лимфоцитов, но и могут ингибировать В-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты и подавлять активность НК-клеток [269, 297, 315, 372]. Роль CD16+CD56+ НК-клеток, индуцирующих дифференцировку в направлении Thl-клеток [80, 263, 337], особенно важна в период имплантации эмбриона и на раннем этапе гестации. "Имеются данные о том, что повышение содержания CD16+CD56+ НК-клеток в эндометрии и периферической крови является угрожающим фактором для вынашивания беременности [101]. Особый интерес представляет также минорная субпопуляция CD14+CD16+- моноцитов с полифункциональной активностью, которые по разным данным могут продуцировать как TNFa [40], так и IL-10 [164, 301] и, таким образом, влиять на характер иммунного ответа.

Исследования параметров иммунитета у беременных во второй половине гестации в основном касаются цитокинового статуса. Показано, что беременность сопровождается цитокин-опосредованной супрессией, ассоциированной с Thl/Th2,Th3 переключением в сторону продукции ТЪ2/иммуносупрессорных медиаторов [206, 268]. Предполагается, что иммунная дисрегуляция во второй половине беременности может служить одной из причин развития серьезного осложнения - гестоза и его наиболее тяжелой формы - преэклампсии [8, 87, 91, 170, 276, 356]. До настоящего времени гестоз остается наиболее тяжелым осложнением, так как занимает 2-3 места в структуре материнской смертности и даёт наиболее высокий процент перинатальных осложнений [9, 15]. В основном все сообщения касаются цитокинового дисбаланса при развитии преэклампсии у беременных, в меньшей степени исследовано содержание цитокинов при других формах гестоза. Но даже при оценке цитокинового профиля у беременных с гестационными осложнениями результаты часто противоречивы. Развитие гестоза может быть сопряжено не только с доминированием Thl цитокинов [7, 14, 5, 38, 43, 119, 187, 188, 357], как считалось ранее, но и с повышенным содержанием Th2 медиаторов [91, 215, 246], а также с отсутствием изменений в продукции Thl и Th2 цитокинов [42, 155, 194, 338]. Несмотря на противоречивые данные определение цитокинового баланса может иметь важное значение для прогноза течения беременности. Так, показано, что преобладание продукции ТЫ/ провоспалительных цитокинов задолго предшествует клинической манифестации гестоза. В частности было выявлена взаимосвязь между повышенным во втором триместре уровнем интерлейкинов: IL-6, IL-8 [239], IL-2, TNF-a [133], IL-2R [103], а также растворимых рецепторов IL-2R [103], sTNFp55 [357] и развитием у беременных впоследствии преэклампсии. Учитывая, что в периферической циркуляции содержится большое количество биологически активных факторов, в том числе и цитокинов, представляется сложным оценить их суммирующее действие. С этой позиции суммарным показателем баланса цитокинов может служить оценка биологической активности сыворотки крови, которая адекватно отражает феномен Thl/Th2,3 переключения и может быть использована в качестве скринингового метода.

Данные статистики, свидетельствующие о том, что гестоз остается основной причиной детской и материнской смертности, диктуют необходимость поиска патогенетически обоснованных критериев его профилактики и лечения. Известно, что развитие гестоза ассоциировано с неполноценной лютеиновой фазой (НЛФ), формирование которой связано с недостаточной продукцией прогестерона [12, 13, 102]. Назначение гестагена -дюфастон обычно применяется при угрозе невынашивания беременности и основано на его способности индуцировать Thl—>Th2/Th3 переключение, следствием которого является формирование физиологической цитокин-опосредованной иммуносупрессии [12, 223]. В этом аспекте представляется оправданным назначение дюфастона женщинам с риском развития гестоза и оценка его иммунокорригирующего влияния.

Несмотря на большой интерес к проблеме иммунной регуляции репродуктивной функции, остается много нерешенных вопросов. До сих пор не ясно, в какой момент включаются механизмы иммунносупрессии и как иммунные дисфункции на ранних этапах репродукции могут быть связаны с развитием бесплодия. Практически не исследована роль клеточно-опосредованных механизмов развития гестационной иммуносуперссии, в частности не изучены функции естественных регуляторных Т-клеток и моноцитов. Недостаточно охарактеризован при физиологическом и патологическом репродуктивном процессе компартмент естественных цитотоксических Т-клеток, которые обладают не только эффекторными, но и иммунорегуляторными свойствами. Недостаточное понимание механизмов формирования гестационной иммуносупрессии при бесплодии, физиологической и осложненной беременности в свою очередь обусловливают отсутствие патогенетически обоснованных подходов к лечению патологии репродукции, особенно ее поздних осложнений. Так, несмотря на то, что гестоз остается основной причиной детской и материнской смертности, до сих пор не существует эффективных методов его профилактики и лечения. Принимая это во внимание, представляется обоснованным оценить опыт по применению аналога прогестерона -дюфастона для снижения частоты развития гестоза.

Таким образом, согласно представленным данным иммунная дисрегуляция является одной из причин нарушения репродуктивной функции у женщин, что может проявляться как иммунологическим бесплодием, так и развитием осложнений при беременности. Вместе с тем до настоящего времени отсутствует цельное представление о механизмах нарушения регуляторной функции иммунной системы на этапах имплантации и развития беременности. Учитывая представленные выше данные, сформулирована цель работы:

- на основе комплексного анализа параметров иммунитета охарактеризовать механизмы формирования физиологической иммуносупрессии в различные фазы репродуктивного процесса и оценить их значение для развития беременности.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:

1. Охарактеризовать особенности локального и системного иммунитета у женщин в динамике овуляторного цикла.

2. Изучить уровень продукции Thl/Th2 цитокинов и параметры клеточного звена иммунитета (пролиферативную активность Т-клеток, относительное содержание регуляторных С04+С025+-лимфоцитов и естественных киллерных клеток) при физиологическом течении первой половины беременности.

3. Проанализировать закономерности продукции Thl/Th2 цитокинов, содержания СБ4+С025+-Т-клеток, CD 14+CD16+-моноцитов и субпопуляций естественных киллерных клеток во второй половине физиологической беременности.

4. Охарактеризовать параметры иммунитета у женщин с бесплодием неясного генеза.

5. Оценить продукцию Thl/Th2 цитокинов и параметроы клеточного звена иммунитета у беременных с угрозой самопроизвольного выкидыша.

6. Охарактеризовать цитокиновый статус, количественное содержание CD4+-лимфоцитов, CD14+CD16+-moho4Htob и популяций естественных киллерных клеток у женщин с осложненной гестозом беременностью.

7. Провести клинико-иммунологический анализ эффективности лечения бесплодия неясного генеза методом аллоиммунизации лимфоцитами партнера.

8. На основании клинико-иммунологической характеристики женщин из группы риска по невынашиванию беременности оценить иммуномодулирующий эффект аналога прогестерона - дюфастона и эффективность его использования для профилактики гестоза.

Научная новизна. На основании проведенных исследований показано, что супрессорная реорганизация иммунной системы формируется уже в период овуляции как на системном, так и на локальном уровнях и обусловлена доминированием активности супрессорных факторов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости и увеличением в рециркуляции доли естественных регуляторных CD4+CD25+-KneTOK. Впервые показано, что наступление беременности, диагностируемое по уровню ХГЧ, прямо коррелирует с супрессорной активностью ФЖ. Состояние иммуносупрессии, характерное для физиологической беременности, наиболее выражено в 1-ом триместре гестации, постепенно снижается к исходу беременности и коррелирует с супрессориой активностью ФЖ. Состояние иммуносупрессии, характерное для физиологической беременности, наиболее выражено в 1-ом триместре гестации, постепенно снижается к исходу беременности и определяется долевым участием как гуморальных факторов, так и регуляторных клеток. Получены новые данные о динамике содержания регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+CD25+ и CD4+CD25high) и естественных цитотоксических клеток (CD56+CD16", CD56+CD16+, CD56+CD3+ НК) в различные триместры физиологической гестации. Впервые показано, что при физиологической беременности в периферической крови регистрируется снижение содержания Т№а/|3+-моноцитов и возрастает доля CD14+ клеток с внутриклеточной продукцией IL-10.

Дефект супрессорной реорганизации иммунной системы у женщин с первичной и вторичной формами бесплодия неясного генеза может проявляться как изолированными нарушениями (снижением продукции блокирующих факторов, повышением числа CD56+CD16+НК-клеток), так и их сочетанным вариантом. Продемонстрировано, что снижение иммуносупрессии у беременных с УСВ ассоциировано с одновременным смещением цитокинового баланса в сторону повышения Thl-медиаторов и уменьшением содержания CD4+CD25+ Т-клеток, включая CD4+CD25hlgh.

У беременных с тяжелым гестозом в периферической циркуляции регистрируется повышение продукции как Thl-, так и ТИ2-цитокинов. При этом оценка супрессорной активности сыворотки и соотношения отдельных Th 1/ТЬ2-цитокинов указывают на снижение содержания факторов/цитокинов с супрессорной активностью при развитии гестоза. Впервые показано, что в повышении продукции цитокинов при гестозе участвуют CD 14+-моноциты с внутриклеточной продукцией TNFa/(3 и CD 14+CD16+IL-10+ моноциты.

Выявлены новые данные о снижении у беременных с гестозом в циркуляции естественных регуляторных CD4+CD25+-imeTOK, включая CD4+CD25high. На основе анализа уровня пролиферативного ответа и апоптоза Т-клеток в анти-СБЗ-стимулированных культурах МНК охарактеризовано состояние функциональной активности Т-клеток при различных вариантах течения беременности. Показано, что повышение при гестозе продукции ТЬ2-цитокинов и содержания CD 14+CD16+-моноцитов с внутриклеточной продукцией IL-10+ отражает включение механизмов feedback регуляции в ответ на усиление продукции провоспалительных цитокинов, а глубокое угнетении продукции IL-10 у беременных с ПЭ означает ее срыв.

Установлено, что устранение дефекта иммуносупрессии, которое при бесплодии неясного генеза сопровождается повышением уровня блокирующих факторов в сыворотке крови и снижением содержания активированных CD56+CD16+ НК-клеток, ассоциировано с наступлением беременности. Пролонгированный прием дюфастона в 1-ой половине гестации приводит к коррекции цитокинового баланса у женщин с риском развития гестоза и позволяет снизить частоту развития осложнений во П-ой половине беременности, что свидетельствует о патогенетической роли иммунных дисфункций в развитии гестоза.

Теоретическая и практическая значимость. В результате выполнения работы получены новые данные о механизмах формирования и значимости иммуносупрессии для физиологического течения репродуктивного процесса. Показано, что наряду с цитокинами важную роль в супрессорной реаранжировке иммунной системы играют регуляторные клетки, при этом их долевое участие на различных этапах варьирует. Дефект иммуносупрессорной реорганизации может возникать на всех этапах репродуктивного цикла, являясь причиной развития различных патологий -бесплодия, самопроизвольных выкидышей и гестоза. Данные об обратной корреляционной зависимости между супрессорной активностью сыворотки крови и содержанием CD4+CD25+/CD4+CD25hieh i -клеток со степенью тяжести гестоза подтверждают важность нарушения механизмов гестационной иммуносупрессии в развитии поздних гестационных осложнений.

В процессе проведения работы выявлены новые иммунологические маркеры, которые могут служить дополнительным критерием при оценке степени тяжести гестоза. Непосредственное клиническое значение имеют данные об эффективности иммунокоррекции с использованием метода аллоиммунизации лимфоцитами партнера у женщин с бесплодием неясного генеза, а также характеристика иммуномодулирующего эффекта гестагена дюфастон, что позволило разработать принципиально новый подход к профилактике гестоза в группах высокого риска, имеющий важное значение для предотвращения репродуктивных потерь.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Овуляторный период и физиологическое течение беременности ассоциировано с супрессорной реорганизацией иммунной системы, которая формируется к моменту овуляции яйцеклетки, максимально выражена в 1-ом триместре и снижается к исходу гестации.

2. Формирование иммуносупрессии обусловлено действием гуморальных факторов, в том числе ТЬ2-цитокинов, и регуляторных клеток, включая CD4+CD25+T-ioieTKH и 1Ь-10+моноциты. При этом долевое участие и выраженность клеточных и гуморальных механизмов иммуносупрессии меняется в ходе течения репродуктивного процесса.

3. Дефект иммунносупрессорной реорганизации ассоциирован с развитием дисфункций в репродуктивной сфере и проявляется снижением продукции блокирующих факторов и повышением доли активированных НК-клеток при бесплодии; уменьшением супрессорной активности сыворотки крови, повышением соотношения Thl/Th2-цитокинов и уменьшением количества CD4 CD25 / СВ4+СВ25н'еЬрегуляторных Т-клеток при угрозе выкидыша; снижением супрессорной активности сыворотки крови на фоне существенного усиления продукции Thl-цитокинов и уменьшением содержания CD4+CD25+/CD4+CD25hish Т-клеток при гестозе.

4. Коррекция дефекта иммуносупрессии при патологии репродуктивной функции позволяет добиться положительного клинического эффекта. В частности, восстановление продукции блокирующих факторов на фоне аллоиммунизации лимфоцитами партнера приводит к повышению фертильности, а коррекция цитокинового баланса на фоне пролонгированного приема гестагена (дюфастон) — снижению частоты развития гестоза.

ВЫВОДЫ

1. Состояние физиологической иммуносупрессии, формирующееся в овуляторный период, обусловлено действием регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток и гуморальных супрессорных факторов, активность которых прямо коррелирует с биохимическим показателем ранней беременности — уровнем хорионического гонадотропина человека, что свидетельствует о важном значении иммуносупрессорной перестройки в наступлении беременности.

2. Супрессорная реорганизация иммунной системы наиболее выражена в I-ом триместре физиологической беременности, проявляется усилением супрессорной активности сыворотки крови и снижением митоген-индуцированного пролиферативного ответа Т-клеток и обусловлена смещением цитокинового баланса в сторону ТЬ2/иммуносупрессорных факторов и увеличением содержания регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток.

3. К Ш-ему триместру физиологической беременности выраженность иммуносупрессии ослабевает. Это проявляется усилением пролиферативной активности Т-клеток и увеличением доли активированных CD56+CD16+NK-клеток и ассоциировано со снижением содержания регуляторных CD4+CD25hlgh Т-клеток и уменьшением степени поляризации цитокинового баланса в сторону ТЬ2-медиаторов.

4. Иммунные дисфункции при бесплодии неясного генеза сопряжены с дефицитом в сыворотке крови блокирующих факторов, подавляющих ответ на аллоантигены, и повышением содержания различных субпопуляций киллерных клеток, в том числе активированных CD56+CD16+HK.

5. Беременность у женщин с угрозой самопроизвольных выкидышей ассоциирована с нарушением формирования гестационной иммуносупрессии, о чем свидетельствует снижение супрессорной активности сыворотки крови, усиление пролиферации Т-клеток и повышение доли активированных CD56+CD16+ НЕС. Выявленные изменения связаны с усилением продукции Thl-цитокинов и снижением количества регуляторных CD4+CD25+/CD4+CD25high Т-клеток.

6. Осложненная гестозом беременность характеризуется дефектом механизмов гестационной иммуносупрессии, что проявляется снижением супрессорной активности сыворотки крови и увеличением доли активированных НК-клеток и обусловлено снижением содержания регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+/CD4+CD25hlgh), усилением продукции Th 1 /ТЬ2-цитокинов и количества TNFa/p+ и IL-10+ секретирующих моноцитов. Усиление продукции Th2 цитокинов и 1Ь-10+-секретирующих моноцитов при геетозе является проявлением механизмов feed-back регуляции в ответ на запуск провоспалительных цитокинов, поскольку развитие наиболее тяжелого проявления гестоза - преэклампсии сопровождается резким снижением продукции IL-10.

7. Наличие обратной корреляционной зависимости тяжести гестоза с супрессорной активностью сыворотки крови и относительным содержанием CD4+CD25+/CD4+CD25high Т-клеток свидетельствует о важности нарушений механизмов гестационной иммуносупрессии в развитии поздних осложнений беременности.

8. Повышение уровня блокирующих факторов в сыворотке крови и снижение содержания активированных CD56+CD16+ НК-клеток на фоне аллоиммунизации лимфоцитами партнера ассоциировано с наступлением беременности, что свидетельствуют о необходимости индукции иммуносупрессии для повышения фертильности у женщин с бесплодием неясного генеза.

9. Пролонгированный прием гестагена (дюфастон) в 1-ой половине гестации приводит к коррекции цитокинового баланса у женщин с риском развития гестоза и позволяет снизить частоту развития осложнений во П-ой половине беременности, что свидетельствует о патогенетической роли иммунных дисфункций в развитии гестоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итогом данной работы явились новые данные о значимости и механизмах формирования иммуносупрессии на различных этапах репродуктивного процесса. Проведенные исследования позволили охарактеризовать цитокин-опосредованные и клеточные механизмы и их долевое участие в супрессорной реаранжировке и выявить общие закономерности формирования иммуносупрессии на пике овуляции и при беременности.

Полученные данные о снижении выраженности супрессии при бесплодии и гестационных осложнениях свидетельствуют о том, что нарушение супрессорной реорганизации сопряжено с развитием патологии. Поскольку при бесплодии неясного генеза у подавляющего большинства женщин выявляется дефектность супрессорных механизмов, коррекция которых приводит к восстановлению фертильности, можно рассматривать данную форму бесплодия как иммунологическую. Развитие ранних (УСВ) и поздних (гестоз) гестационных осложнений сопряжено с нарушением цитокинового баланса, характерного для физиологической беременности, и снижением относительного количества естественных регуляторных Т-клеток. Наличие обратной взаимосвязи между содержанием регуляторных Т-клеток и супрессорной активностью сыворотки крови со степенью тяжести гестоза подтверждает значимость выявленных механизмов нарушения иммуносупрессии в развитии гестационных осложнений. Следствием реципрокных взаимоотношений между регуляторными Т-клетками и естественными цитотоксическими лимфоцитами является повышение доли активированных НК-клеток при осложненном течении беременности. Несмотря на ряд общих закономерностей развития гестационных осложнений при УСВ и гестозе имеются существенные различия. УСВ характеризуется возрастанием пролиферативной активности Т-клеток, сопряженной с увеличением в циркуляции провоспалительных цитокинов. Напротив, при гестозе уровень пролиферации снижен, что обусловлено делецией отвечающей популяции лимфоцитов. При гестозе регистрируется одновременное усиление продукции про- и противовоспалительных цитокинов, продуцируемых как Т-хелперными клетками, так и моноцитами, что можно рассматривать как ответную реакцию на повышение содержания провоспалительных факторов. Срыв регуляции цитокинов приводит к прогрессированию заболевания и развитию ПЭ.

С учетом полученных данных была проведена апробация 2-х методов иммунотерапии, целью которых являлась коррекция иммунных нарушений при патологии репродукции. Индукция состояния иммуносупрессии у женщин с иммунологическим бесплодием методом АИЛ позволила повысить фертильность, что сопровождалось наступлением беременности. Пролонгированный прием гестагена (дюфастон) в 1-ой половине беременности с целью коррекции цитокинового баланса сопровождался достоверным снижением частоты развития гестоза в группах высокого риска. В результате был разработан принципиально новый подход к профилактике гестоза, имеющий важное значение для предотвращения репродуктивных потерь.

Таким образом, изучение механизмов иммуносупрессии в норме и при патологии репродуктивного процесса, а также патогенетическое обоснование использования новых подходов к коррекции иммунных нарушений при патологии репродукции является новым научным направлением исследований в клинической иммунологии, разработка которого в рамках настоящей работы позволяет с новых позиций оценить иммунопатогенез репродуктивных нарушений и разработать принципиально новые подходы к иммунокоррекции при данной патологии. Дальнейшие исследования в этой области могут быть плодотворными для повышения фертильности у женщин с иммунологическим бесплодием и снижения частоты гестационных осложнений.