Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Проточная ДНК-цитометрия в прогнозировании течения опухолевого процесса при некоторых злокачественных новообразованиях человека

Ня прлвях рукописи

НИКОЛАЕВА ТАМАРА ГРИГОРЬЕВНА

«ПРОТОЧНАЯ ДНК-ЦИТОМЕТРИЯ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ТЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА ПРИ НЕКОТОРЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ЧЕЛОВЕКА»

(14.00Л4 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ня соискание ученой степени доктора биологических наук

I

Москва - 2003

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им, Н.Н Блохи и а Российской академии медицинских наук (директор члеи-корр РАМН, профессор, доктор медицинских наук, Лауреат Государствеиной премии РФ, Заслуженный деятель науки РФ М.И.Давыдов)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Я.В.Добрьншн

Член-корреспондент РАМН Лауреат Государственной премии РФ, Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор М.И. Давыдов

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, прфессор Т. А, Богуш

доктор биологических наук, прфессор Л.Б.Горбачева

доктор медицинских наук, профессор В,М. Бухмян

Ведущее учреждение: Московский научно-исследовательский Онкологический институт им. П.А.Герцена

Зашита состоится £^3^2003 г. в /{а час на заседании Диссертационного Совета ( Д001. 17,ш) при Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478 Москва, Каширское шоссе ,24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического Научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «.'¡^« ¿Ие-С^пи')_гооз г.

Ученый секреиарь Диссертационного Совета Доктор медицинских наук

10. В. Шишкин

Общая характеристика работы Актуальность проблемы Современный метод проточной цитометрии позволяет с высокой точностью на статистически достоверном материале измерить количество исследуемых веществ в клетках и их ядрах. В основе определения - измерение естественной люминесценции или люминесценции специальных красителей, избирательно связывающихся с изучаемыми веществами.

Отдельное место среди методов проточной цитометрии занимает ДНК-цнтометрия. Своеобразие этого метода заключается в том, что содержание ДНК в нормальной жизнеспособной клетке не является постоянным, а зависит от фазы жизненного цикла клетки. При разных формах патологии количество ДНК в покоящейся (неделящейся) клетке не всегда бывает одинаковым (диплоидным), но может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения (гипоплоидия) или чаще - в сторону увеличения (ги перилоидия). Последнее (гиперднплоидия, триплоидия, тетраплондия и т.д) часто имеет место при злокачественном росте.

При анализе распределения нормальных клеток по содержанию ДНК учитывается как количество ДНК в покоящихся клетках (плоидность), так и изменения количества ДНК (вплоть до удвоения) в делящихся клетках. Поскольку при патологии высока вероятность одновременного присутствия в популяции нормальных (диплоидных) и патологически измененных (анеуплоидных) клеток, а также нормальных и измененных клеток, синтезирующих ДНК, очевидно, что анализ смеси таких субпопуляций является сложной математической задачей.

Разработаны математические подходы для анализа получаемых на проточном цитометре данных. Однако анализ разными математическими методами одной и той же кривой распределения клеток по содержанию ДНК не дает строго сопоставимых результатов, а соответствие таких-

^ г * 1 НАЦИОНАЛЬНАЯ

теоретических результатов реальным данным подвергается (ЙНИННШ:**

1С.гитерВург

рк _^^

Указанные несоответствия вынуждают исследователей разрабатывать новые методы и алгоритмы анализа ДНК-цнтометрнческнх кривых. В последние годы получил признание способ прогнозирования течения опухолевого процесса на основании определения плоидности клеток в опухолевом узле. Подвергались изучению различные новообразования человека, их ДНК-цитометрические характеристики сопоставлялись с клиническими данными. В результате такого сопоставления для разных видов опухолей выявлены некоторые общие закономерности: диплоидные опухоли имели более благоприятное течение, чем анеуплоидные. Для ряда опухолей также были отмечены некоторые специфические особенности. Сопоставление с клиническими факторами прогноза показало высокую информативность показателя плоидности ДНК опухолевых клеток и позволило рассматривать его как независимый прогностический признак.

Литература последних лет содержит сведения о высокой информативности ДНК-плоидности опухолевых клеток при различных новообразованиях человека [Абдылдаев 2002; Нечушкина 2002; Cosimelli и соавт. 1998; Hammer и соавт. 1999; Lanza и соавт. 1998; Pîetra и соавт 1998; Wang и соавт. 1997]. Приведенные работы подчас противоречивы, не всегда выполнены на достаточном количестве наблюдений, что не позволяет в полном объеме судить о прогностической значимости определения ДНК-плоидности для онкологической клиники.

В настоящее время, несмотря па большое число работ, окончательного мнения не сложилось о прогностической значимости ДНК-цитометрических данных при злокачественных опухолях молочной железы, головы и шеи, легких и толстой кишки. Между тем, заболеваемость перечисленными раками имеем стойкую тенденцию к росту. Для решения вопроса о степени допустимой органосохранности необходимого оперативного вмешательства хирургу требуются прогностические данные. Клинические прогностические критерии (локализация, стадия, форма роста, распространенность и др.) достаточно хорошо изучены и преимущественно

характеризуют состояние опухолевого процесса в настоящий момент. В то же время ДНК-цитометрические показатели, характеризующие биологические свойства опухолевых клеток, могут прогнозировать их поведение в будущем. Отсюда, актуальность темы определяется ' следующими соображениями.

Существующие способы (алгоритмы) математической обработки ДНК* цитометрических данных не всегда дают сопоставимые результаты.

Большинство их сложно и требует мощного компьютерного обеспечения. Внедрение метода ДНК-цитометрии в клинику требует создания относительно простого метода расчета ДНК-цитограмм, правильно интерпретирующего клеточную кинетику и выдающего стандартизованные результаты.

Накопленные материалы Д Н К-цнтометричееко го изучения новообразований человека в недостаточной степени описывают изучаемые нами злокачественные опухоли. Опухоли указанных локализаций являются достаточно распространенными, их прегрессирование рано приводит к генерализации процесса и гибели больных. Поэтому является актуальным и важным изучение их биологических особенностей и их прогностической значимости с целью поиска объективных прогностических критериев опухолевого процесса.

Цели исследования: разработать метод компьютерного анализа цитометрических данных; применить разработанный метод для изучения ДНК-цитометрических характеристик опухолей молочной железы, головы и шеи, легких и толстой кишки человека; выработать и обосновать ДНК-цитометрические критерии прогноза течения изучаемых злокачественных новообразований человека.

Задач» исследования. Для достижения намеченных целей необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать алгоритм математического анализа данных ДНК-гистограмм, полученных на проточном цитофлуориметре 1СР-22.

2. Сравнить результаты ДНК-цитометрического анализа, полученного на основе разработанного алгоритма, сланными обработки иными способами,

3. Изучить ДНК-цитометрические характеристики (плоидностъ) больных раками молочной железы, головы и шеи, легкого и толстой кишкн человека.

4. Сопоставить полученные показатели плоидности опухолей с клиническими (стадия заболевания, распространенность процесса, наличие местных и отдаленных метастазов, сроки послеоперационного рецидивирования и метастазировапия, сроки выживаемости и др.) и патоморфологическими {форма роста, степень дифференцнровкн и др.) данными.

5. Сопоставить данные ДНК-цнтометрии с клинической эффективностью примененного лечения (химиотерапия, лучевая или комбинированная терапия).

6. Провести многофакторный анализ н определить значимость ДНК плоидности в прогнозе изученных раков человека.

Научная новизна. Впервые в пределах РФ и СНГ разработаны новый алгоритм и программа анализа ДН К-цито метрических данных, позволяющие максимально близко к реальному вычислить в популяции долю ДНК синтезирующих клеток, выделить статистически значимо различающиеся субпопуляции, в едином стандарте охарактеризовать их плоидность.

Впервые с помощью разработанного алгоритма и программы были изучены ДНК-цитометрическне характеристики и классифицированы по плоидности новообразования молочной железы, головы и шеи, легкого и толстой кишкн (всего 654 случая).

Впервые путем сопоставления полученных на основе разработанного алгоритма ДН К-цитом етр и чес ки х данных с материалами историй болезни и многофакторного анализа полученных данных определена

клиническая значимости ДНК-плоидности в изученных опухолях. Показано, что ДНК-плоидность является одним из высокозначимых информативных прогностических признаков среди других клинических и морфологических критериев прогноза. Анеуплоидия опухоли является неблагоприятным показателем в прогнозе изученных нами новообразований.

Практическая значимость. Разработанный алгоритм и программа позволяет более точно классифицировать изучаемые новообразования по плоидности, что повышает уровень воспроизводимости прогноза. ДНК-плоидность является показателем биологических особенностей изученных нами раков человека.

Наши исследования показали, что анеуплоидные раки протекают в 2-3 раза более агрессивно, чем диплоидные. Плоидность ДНК 533 изученных нами новообразований является важным и независимым, статистически значимым прогностическим фактором. В практической деятельности необходимо учитывать значения ДНК-плоидности при выборе метода лечения и последующих наблюдениях за пациентами.

Практическое использование ДНК-плоидности способствует выделению групп, нуждающихся в более интенсивном лечении, а также поможет оценке эффективности различных вариантов адыовантного и неоадьювантного лечения больных различными опухолями.

Публикации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на Республиканских и международных конференциях. По итогам исследований в журналах, сборниках и материалах конференций опубликовано 5 0 работ.

Объем II структура диссертации Диссертация изложена на 268 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 39 рисунков и ] 8 диаграмм. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованной литературы. Указатель

литературы включает 43 работы отечественных и 385 иностранных авторов.

Содержание работы Методы исследований. В работе были исследованы 654 эпителиальные опухоли - молочной железы (280), слизистой оболочки гортани и ротовой полости (206), легких (96) и толстой кишки (72). Опухолевый материал брали во время операций у больных, проходящих курс стационарного лечения в хирургических отделениях НИИ онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина. Сроки наблюдения за больными были до 10 лет. ДНК-цитофлуориметрический анализ опухолевого материала проводили на проточном цитофлу ори метре ICP-22 (Германия). Для настройки цитофлуориметра и установления точной привязки пика диплоидных клеток к шкале прибора использовали внешний стандарт-лимфоциты крови здорового донора. Полученный во время операции материал опухолей человека помещали в среду 199 без сыворотки и исследовали в тот же день или хранили до обработки при -20й Ц. Материал опухолей освобождали от некротических участков, сосудов и помешали в часовое стекло в нескольких каплях сахарозного буфера. Разрезали ножницами на маленькие фрагменты. Кашицу помещали в ручной гомогенизатор, добавляли 5 мл 0,5N сахарозного буфера, тщательно растирали до получения гомогенной взвеси клеточных ядер. Гомогенат пропускали через нейлоновую сетку с отверстиями 100150 мкм. Взвесь разводили раствором сахарозы и центрифугировали 20 мин. при 1500 об/мин. Осадок ресуспендировали в буфере РМ-16 и трижды промывали по 1 мин. при 500 об/мин. Окраску образцов для ДН К-цито метрического анализа производили смесью этидиум-бромида и митрамицина (1:1). На основании произведенной классификации опухолей осуществлялась разбивка на группы сравнения историй болезней исследованных больных. Доступными для анализа оказалось

533 последних. В последних учитывали стадию заболевания, гистологическую форму и уровень морфологической диффсрепннровки опухолей, характер и эффективность проведенного лечения, послеоперационное течение заболевания, сроки наступления рениднаоп. местных и отдаленных метастазов, сроки выживания больных в послеоперационном периоде и т.д. Указанные клинические данные для каждой группы анализировали под углом зрения принадлежности опухолей к той или иной ДНК-цитометричсской форме (плоидности).На основании проведенных ретроспективных наблюдений оценивали прогностическую значимость ДМК-цитомепричсской классификации опухолей. В качестве основного критерия прогностической значимости рассматривали сроки наступления в послеоперационном периоде рецидивов и метастазов (возврат заболевания), а также сроки жизни леченых больных.

При сташстическон обработке данных использовали общепринятые методы вариационной статистики. Для значения средних величин (М) вычисляли разброс и статистические ошибки в виде квадра<ического отклонения (5), коэффициента вариации (v) или ошибки среднего арифметического (т). Вероятность различия средних величин определяли в соответствии с t- методом Стыодента. Принадлежность величии к одной совокупности, а также значимость различий средних значений оценивали в пределах 95 % доверительного интервала. Статистическую обработку и оценку полученных данных производили на ЭВМ АТ-286 но npoi рамме «VARX2PC», разработанной Басовым и соавт.,1989. При изучении выживаемости больных использовали интервальный метод построения таблиц дожития «life-table». Достоверность выявленных различий оценивалась с использованием статистического теста Май гсль-Хаичеля (Ml I) или критерия toy,rank. Достоверными считались различия с вероятностью не менее 95% ( р<0,05).

Результаты проведенных проведенных исследовании

Разработка метода компьютер ко го анализа ДНК-цнтометрнческих данных. В основу разработанного алгоритма анализа ДНК-цитометрических кривых, как н в иных существующих алгоритмах, был положен принцип нормального (гауссовского) распределения клеток в пиках (максимумах), соответствовавшим зонам 00/1 и С2/М клеток. Зона Э-фазных клеток рассчитывалась как промежуточная между указанными пиками. Участок поисков месторасположения пиков не лимитировался, что позволило вести свободный поиск таких максимумов по всей длине кривой. Такой свободный поиск позволял анализировать смесь 2 и более популяций клеток, различающихся по содержанию ДНК (плоидности) модальных классов клеток. При обработке поканальных данных применялся метод сглаживания по 7 точкам, что вместе с вычитанием 1% базового шума по всем каналам позволило избавиться от инструментальных шумов. Способом математического моделирования с наложением шумов было показано, что при указанном сглаживании уровень ошибок был наименьшим. Экспериментально установленным шагом поиска максимумов на кривой была длина равная 21 каналу. Каждый найденный на кривой пик принимался за центр локальной зоны шириной в 2 средних квадратических ошибки (2о) т.е. с вероятностью 95%. Полученные предварительные данные подвергались анализу на взаимное перекрытие.

При анализе структуры популяции значения плоидности пиков на ДНК-ЦИ1 ограммах выражали индексом ДНК (ИДНК), который вычисляли как отношение номера канала анеуплоидного пика к номеру канала пика нормальных диплоидных ядер (стандарту). Коэффициент вариации (V) ИДНК рассчитывали из аппроксимации для гауссовского распределения. Его величина не превышала 9%. Если на ДНК-гистограмме присутствовал один ник, соответствующий диплоидному содержанию ДНК в ядрах (ИД11К=09СМ .10) образец считали диплоидным. Если ДНК-гистограмма имела второй и более пики, отличающиеся от диплоидного по

содержанию Д1 MC (ИД1 IK= 1,11-1,55) и содержащая более 50% клеток, то такой материал рассматривали как ансуплоидный (гпперднплоидный). При наличии в тетрашюидной области (ДНК=1,56-1,94) пика, содержащего 20% и более ядер, популяцию считали теграплоидпой. Наличие двух и более статистически раздельных пиков аисуплоилных ядер позволило говорить о миогоклоновой популяции. Поскольку расчеты производились с учетом 95% вероятное ги все пики ДНК-цитофаммы, содержащие менее 5% от числа просчитанных ядер считались незначимыми.

Работоспособность раэрабо)анных алгорлша и про) раммы была проверена в модельных опытах па опухолевых клегках линии CaOv путем сравнения полученных нами результатов с данными обработки ДПК-цитометрических кривых на основе иных программ (PH 1 и SOBK), Сравнение основных параметров кривых показало, 'мо ра шнцл полученных результатов между нашим агиоритмом и любой ш общепринятых программ (Р1;1 Г н S013R) была меньше, чем расхождения между ними (р>0.05). Было также проведено сравнение речультаюв определения в популяции доли нрол ифериру ющнх клеюк, выявляемым экспериментально и посредством математического расчет. Пролиферирующие клетки лнинн CaOv и в популяции лимфоцитов MCI или моноклональпыми антителами к ядерному ainnraty пролиферирующих клеток (И! Ю-38). Полученные в эксперименте и рассчитанные математически параметры нролиферирующих клеток различались на немногие проценты, а статистическое различие между ними было несущественным (р>0,05).

Таким образом, был разработан и апробирован новый ал(орпгм анализа кривых распределения клеток по содержанию Д1IK (фазам клеточпою цикла). Разработанные алгоритм н программа были применены для Д1 IK-цитометрнчсского амагппа клеточного соаава некоторых злокачественных опухолей с иелыо сопоставления

получаемых характеристик с особенностями течения опухолевого процесса у больных.

Л н ал из содержания ДНК в опухолевых клетках н сопоставление лабораторных данных с течением опухолевого процесса больных некоторыми новообразованиями. Опухоли молочной железы.

Среди 270 изученных аденокарцином молочной железы 30,8% были диплоидными и 69,2% анеуплоидными. Из числа последних в 33,6% случаев определялись гипердиплоидные опухоли, в 24,1% случаев -тетраплоидные опухоли, в 8,8% случаях в опухолях были представлены несколько субпопуляций клеток (многоклоновые). В образцах из нормальной молочной железы и 10 случаях фиброаденомы

популяции клеток были диплоидными. Полученные для 177 из 280 больных данные ДНК-цитограмм сопоставлены с клиническими показателями течения заболевания. Вне зависимости от стадии болезни возвраты (рецидивы и метастазы) заболевания среди больных анеуплоидными опухолями молочной железы был более частым, чем у больных диплоидными новообразованиями. По мере прогрессирования опухолевого процесса вероятность возвратов заболевания возрастала (Табл. 1). Таблица 1

Частота послеоперационных возвратов и рецидивов РМЖ а зависимости от структуры популяции и стадии заболевания

Структура популяции Стадий заболеваний

опухолевых клеток 1 + 11 1 II

Количество % Количество %

вольмьк рецидмвнооа больных рвцидивиров.

Циплодная (идккчо.вы.ю) МИ- 10 замо 30,3

Аиеуплоидияя-

гипердиппопдная (иднк-1,11.1,55) 21« 23,в 19\14 >2,3

татраппошиал (ипнк*1,и-1.м) 2016 25 30» зо

многиклоноаая 4\1 2$ Ш2 0 100

Итого па группам 7ЯИ 1в,7 10МЭ 51.»

Всего больных' 177 117

* 0 пиюмци "Коли**ес1§о больниц поселни больчих и чист мают« мбфлаввнкй ср«дн тк

Однако, если частота возврата диплоидных опухолей в III стадии заболевания составляла 30,3 %, то для ансуплоидпых (гипердиплоидных) опухолей этот показатель возрастал до 82,3 %. Прогностически наименее благоприятными были гипердиплондные и, особенно, многоклоиовые опухоли, вероятность возврата которых в III стадии заболевания достигала 100%. Проанализированы сроки возврата опухолей молочной железы в послеоперационном периоде в зависимости от структуры популяции и стадии заболевания. Средний срок возврата заболевания в III стадии был существенно короче (р<0.05), чем в I-II стадии. Вне зависимости от стадии заболевания более благопоиятным было течение диплоидных и тетраплондных новообразований. Сроки безрецидивного послеоперационного течения опухолевого процесса при диплоидных карциномах молочной железы в I -11 стадии были в 2,5 раза ( р<0.05), а в III стадии почти в 2 раза (р<0.05) продолжительнее, чем при гипердиплоидных опухолях. Особенности представляли данные о сроках возврата тетраплоидных опухолей молочной железы. При всех стадиях заболевания время наступления возврата для них существенно не отличалось от сроков возврата диплоидных карцином. Таким образом, наименее благоприятными с точки зрения сроков послеоперационного возврата опухолевого процесса были гипердиплоидные и многоклоиовые опухоли молочной железы.

Проанализированы сроки выживания больных III стадией заболевания в зависимости от структуры популяции опухолей молочной железы (рис. I). Выявлены существенные различия в сроках прогрессировать диплоидных и анеуплоидных новобразований молочной железы. Для больных анеуплоидными опухолями вероятность дожить до 5 лет составила 44,9 %, а диплоидными - около 73,3 % (р< 0.05) (рис. 2 ). К исходу 5 летнего срока наблюдения были живы 47 (74,6 % ) из 63 больных диплоидными опухолями и 56 (49,1 %) из 114 пациентов

Кумулятивная выживаемость больных раком молочной железы Ш стадии с метастазами в лимфоузлы (T1-4N1-3M0)

SEiZi

Рис, 1

->-Дяита«ни» о » 35

-•-Аизуппомдмы«

В 9 10

Годовые интерылы

Общая выживаемость больных раком молочной железы

Дипоедкыап'вэ Амупподньм А ■

10 11 12 Годмыа интармлм

Рие. 1

анеуплондными опухолями. Вероятность дожить до 10-летнего срока для диплоидных опухолей была 63,4 %, для анеуплоидных - 38,2 %. К конечному сроку наблюдения дожили 12 из 63 (19,0 %) больных диплоидными опухолями и 5 из 114 (4,4 %) пациентов с анеуплоиднымн опухолями.

Как указывалось, более благоприятным было течение опухолевого процесса у больных тетра- и гипертетраплоиднымн опухолями. Анализ 5-летней н более выживаемости указанных больных показал, что сроки их выживания существенно не отличались от длительности жизни больных диплоидными опухолями (р>0,05). Наиболее неблагоприятными в плане послеоперационного рециднвирования были гнпердиллондные н многоклоновые опухоли. Выживаемость таких больных была существенно хуже, чем средняя выживаемость для всех анеуплоидных опухолей. Так 5-летняя выживаемость больных гипердиплоидными опухолями составила 39,7 % (44,9 % для анеуплоидных), а 10-летняя -25,8 % (38,2 % для анеуплоидных) (рис.3 ). При многоклоновых опухолях выживаемость всех больных не превысила 4-летнего срока наблюдения (рис.4).

Анализ выживаемости послеоперационных больных раком молочной железы в зависимости от проведенного лечения показал следующее. После одного хирургического лечения 5 и 10 летняя выживаемость больных диплоидными и анеуплондными опухолями существенно не различалась (р> 0.05).(рис.5). Применение предоперационной

Выживаемость больных гипердиплоидным раком молочной железы

Годовьм интервалы

Рис. 3

% 120

химиотерапии и / или послеоперационной химно-лучевой терапнн существенно улучшало 5 и 10 летнюю выживаемость больных диплоидными опухолями. При этом выживаемость больных анеуплоиднымн опухолями при указанных разных схемах лечения была примерно в 2 раза хуже, чем больных диплоидными опухолями (рис.6 и

7).

Выживаемость больных л оликп ежовым раком молочной железы

~. Дилпоедны* п-ЗЭ ы» Пелмлоимы» л«24

(О 11 12 Годмы* мнгараапы

Рис. 4

Выживаемость послеоперационных больных раком молочной железы

% 120 100 ВО

во

40

-Дигъпоидныв п Мв ■»Анвуплондные п»29

в 10 11 12 Годом» интервалы

РИС, 5

Выживаемость больных раком молочной железы, подвергнутых операции с последующей химиотерапией (ОП + ХТ)

-ДмЛПСИАНкЧ Л * 4

7 е

Годов ыв интервалы

Рис. *

Кумулятивная выживаемость больных опухолями молочной железы, подвергнутых комбинированной терапии {ХТ + ОП + ХТ)

-Диплоидные П = 19

-Аиеуппонамые п'24

» 10 «1 Годовыф ИКТбрМпы

Рис, 7

Проведены анализ и сопоставление гистологической формы опухолей молочной железы, их популяционной структуры и вероятности наступления послеоперационного возврата опухолевого процесса. Отмечено преобладание анеуллондных опухолей среди протоковых (72,0 %) и дольковых (57,7 %) форм. Сопоставление с клиническими данными

выявило, что частота возрата заболевания в группе диплоидных протоковых опухолей составила 15,4 %, а в группе анеуплоидных - 46,3 %. Сходная картина наблюдалась в случаях дольковых карцином (18,8% и 40,0 % соответственно). 5 -летняя выживаемость 87 больных диплоидными и аиеуплоидными протоковыми РМЖ достоверно различалась. Для дольковых РМЖ различия в выживаемости не выявлены. Приведенные данные показали, что в прогнозировании послеоперационного течения опухолевого процесса при опухолях молочной железы более значимой является не гистологическая форма новообразования, а ее популяционная структура. На примере 145 новообразований молочной железы III стадии была сопоставлена популяционная структура РМЖ с наличием рецепторов стероидных гормонов - эстрогенов (Эр) и прогестерона (Пр). При средней частоте возвратов заболевания 47,6%

прогестеронположительные (Пр+) опухоли рецидивировали с той же средней частотой (50,0%), В то же время Эр+Пр- опухоли рецидивировали в 15,7% , а Эр-Пр- опухоли - в 84,5% случаев. При средней частоте возвратов анеуплоидных РМЖ 88,4% Эр-Пр- РМЖ рецидивировали в 100%. Во всех указанных случаях возвраты заболевания наступали в более короткие сроки и быстро приводили к гибели больных. 5 и 8 летняя выживаемость диплоидных рецепторположительных и анеуплоидных рецепторотрицательных РМЖ достоверно различалась вдвое (84,5% и 43,5%; 84,05% и 38,0%) (рис.8). Из наблюдения следует, что рецепторотрицательные РМЖ, как правило, анеуплоидные и в прогностическом отношении являются неблагоприятными.

Одновременное определение плоидности в первичной опухоли и в регионарном метастазе в лифоузел показало, что метастазы не всегда повторяют плоидность первичной опухали.

Выживаемость больных раком молочной железы в зависимости от плоидности и содержания рецепторов

С целью оценки методом ДНК-цитометрии эффективности предоперационной химиотерапии при опухолях молочной железы изучали изменения доли ДНК-синтезирующих (Э-фазных) клеток в процессе лечения. Больные получали 1 курс химиотерапии по схеме СМРАУ. Материал для исследования брали перед началом курса (биопсия) и во время операции по завершении курса лечения. Доля ДНК-сиитезирующнх клеток в 46 образцах нормальной ткани молочной железы составила 13,0+/- 0,85 %, в ткани 10 фиброаденом -22.6 +/-4.6 %. Среди 29 сольных диплоидными опухолями молочной железы не получавших предоперационной терапии, для которых было возможным определение зоны Б-фазных клеток, доля 8-фазных клеток в среднем составила 30,9+/- 3,2 %. После успешного по клиническим данным (уменьшение размеров опухоли более чем наполовину) курса лечения у 23 больныхдоля Б-фазных клеток в среднем снизилась до 19,7+/-2,7%. Продолжительность жизни больных в этой группе составила около 4 лет, а 4 больных дожили до 6-летнего срока наблюдения.Прн неэффективном лечении у 6 больных доля ДНК-синтезирующих клеток к исходу курса не только не снизилась, но во всех случаях возрастала. Возврат заболевания в указанной группе наступал через 8-18 мес, а

-»-Д(рвц. + >, пЧ7 -Ш-А (рец..), п = 23

2 3 4 5 б 7 в 9 10 1» И 13 \А

Годовь» иктервалы

Рис. в

продолжительность жизни не превысила 2 лет. Думается, что кинетика изменений доли ДНК-синтезирующих клеток в процессе лечения коррелирует со степенью эффективности проводимой противоопухолевой терапии.

Для выяснения значимости ДНК-плоидности в прогнозе РМЖ проведен многофакторный анализ этого фактора с клиническими показателями прогноза. В результате проведенного анализа показано, что пдоидность

по значимости занимает третье место (0,0938) после распространенности процесса (0,1037) и стадии заболевания (0,1034).

Таким образом, из наших исследований следует, что ДНК-аиеуплоидия клеток опухолей молочной железы и, особенно, гипердиплондия и многоклоновый характер популяции опухолевых клеток ухудшает прогноз опухолей молочной железы в отношении частоты и сроков возврата опухолевого процесса и времени выживания радикально оперированных больных.

Опухоли слизистой оболочки полости рта и гортани. Методом проточной цитометрии изучены ДНК-цитограммы 206 опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани, представлявшие собой плоскоклеточные раки слизистой оболочки. По содержанию ДНк опухоли слизистой оболочки гортани и ротовой полости распределились следующим образом: 60,6% опухолей были диплоидными и 39,4 % -анеуплоидными (Табл. 2). Среди последних гипердиплоидных было 45 (55,5%), тетраллоидных - 30 (37,0 %), гнпертетраплондпых - 2 (2,9 %) н полнклоновых 1 (1,5%). Полученные для 206 больных ДНК-цитометрнческие данные были сопоставлены с материалами историй болезнен. Во всех стадиях заболевания преобладали больные диплоидными опухолями, а в 1У стадии больные анеуплоидными опухолями. В табл.3 представлены сводные данные о связи плоидностн, стадии и частоты возвратов заболевания опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани.

Таблица *

Гистологическая классификация, клиническая стадия и плоидность опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани

Классификация и стадия Копич-во Плоидность ДНК

больных Диплоидные Анеуппоидные

Все больные 206 125 (60,6) 81 (39,4)

38 29 9

ТгМнМо 23 17 6

ТЛмМо 85 50 35

Т<Ио-зМо 60 29 31

Раки гортани Т^оМо 38 29 9

ТгМмМо 20 14 6

ТаЬЬиМо 56 34 22

Т'Ыо-гМо 24 12 12

Всего.,, 13В 89 49

Раки полости рта

ТЧИоМо - - -

ЪМмМо 3 3 -

ЪМмМв 29 16 13

ТяМо-гМо 36 17 19

Всего.» 6в 36 32

Пловдиве« ДНК. сплин мСмемнпя я частот» pemmitaea н региона рны! мстастазм при мокачмтмпцщ

lieeogSpaioMHHHi слизистой (бол очки полости рта и гарт« и и

Плочиноста ДНК

Стадии эабшкмняа чнак бОЛЫЦМ FCUHW11U Дкплондкие Аиеупдеядиис

N регистарике метасгам (%) Число болишх Рсццдиаи н регионарные мспсташ (%) Число бопьиих Рсцндовы н регионарные unctuu (%)

1 3!/7* 11,4 гт I0J 5/4 44.4

И 23/10 41,6 по 17,6 Ш 100.0

III ij/j? 46.0 jo/u 16,0 35/26 74,0

IV «опг 53,0 29/7 24,1 31/25 SL.0

в« го... I06/íí 43.0 111/16 21,0 6 ¡/61 75,0

* В x'Uonxai 'Число ботш w-t ' пожажно числе бо/ivwx u ■ruceo ptцидилол и рлгионарпш ¿temacmaioe среди них

Средняя частота возникновения возвратов составила 43,0 %. У больных анеуплоиднымн новообразованиями возвраты возникали чаще, чем у больных диплоидными опухолями (75,01 % к 21,0 %). С развитием заболевания (стадии) преимущественно нарастало количество возвратов среди больных анеуплоидными опухолями слизистой оболочки полости рта и гортани. В 1 — II стадии возвраты у больных анеуплоидными опухолями составили 44,49 %, а в III - IY стадиях - 74,5% и 81,0 %. При диплоидных новообразованиях частота возвратов в аналогичных стадиях составила 10,3%,И,6%, 26,0 % и 24,1 %. 5 и 10 летняя выживаемость больных диплоидным и анеуплоидным опухолями слизистой оболочки полости рта и гортани статистически значимо (р<0.05) различалась и составила 92,9 % и 24,0 %; 74,7% и 8,0 % (рис. 9). Приведенные данные характеризуют суммарную картину течения опухолевого процесса изученных опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани. Однако при анализе материала обращает внимание, что среди изученных раков слизистой оболочки ротовой полости отсутствовали больные с ранними (I - II) стадиями заболевания. Поэтому было сочтено необходимым сопоставить плоидность и течение заболевания раздельно для больных опухолями слизистой оболочки гортани и опухолями слизистой оболочки полости рта.

Выживаемость больных раками слизистой оболочки полости рта и

гортани

Годовые икггервдпы

Все изученные опухоли слизистой оболочки гортани были в 64,4 % случаев диплоидными (89) и в 35,5% -анеуплоидными (49). Среди анеуплоидных опухолей большая часть 53,1% была гипердиплоидной (26 из 49) и в 47,0 % тетраплоидной (23 из 49). Во всех стадиях заболевания С преобладали диплоидные опухоли . Общая частота возвратов опухолей I слизистой оболочки гортани составила 36,9 %. У больных анеуплоидными I опухолями возвраты возникали в 4 раз чаще, чем у больных диплоидными ( 17,9 % и 71,4 %) (таблица 4), С развитием заболевания увеличивалось количество возвратов среди больных анеуплоидными опухолями. Возвраты заболевания чаще обнаруживались среди тетраллоидных опухолей и их частота нарастала по мере развития заболевания. Сроки возникновения возвратов для анеуплоидных опухолей всех стадий составляли 5-6 мес, для диплоидных - более 24 мес.

Рассмотрены взаимосвязь гистологической формы роста опухолей слизистой оболочки гортани и плоидности ДНК (Табл.5). У 55 больных инфильтративной формой роста большая часть опухолей слизистой оболочки гортани была диплоидной. Частота вовратов среди анеуплоидных опухолей была выше (70 %), чем у больных диплоидными новообразованиями гортани (14,3%). При смешанной форме роста частота возвратов среди анеуплоидных опухолей была статистически выше, чем у больных диплоидными опухолями (66,6% и 14,8%; 87,5% и 21,0 %). ( Взаимосвязь плоидности ДНК и морфологической степени

дифференцировки проанализирована на примере 120 опухолей слизистой оболочки гортани (Табл.6). Частота возвратов заболевания у больных анеуплоидными опухолями с ороговением была в 4 раз выше, чем среди больных диплоидными опухолями. Для анеуплоидных неороговевающих опухолей слизистой оболочки гортани частота возникновения возвратов была также выше (в 2 раза), чем для диплоидных новообразований гортани.

Кроме морфологической оценки степень дифференцировки опухолей слизистой оболочки гортани анализировали на основании классификации

Тлблиць 4

Плои дно сть ДНК, стадия заболевания и частота рецидивов и регионарных метастазов раков гортани

Стадия заболевания КвличеС! ее больны* % речидиеое и №1«»« ЛлОИДНОСТк ДНК

Диплоидные Анеуппоидные

количество больмьа % реи. и нет Количество бОЛЬНЫК S р«ц н мет

1 (TiNoMo) saw* 1В,4 29\Э 10,3 914 44,4

N fTlNo-iMo} 20\9 45 14(3 21,4 616 100

111 (TJNmMO) 56122 39,2 3416 17,в 22116 72,7

IV CTJNWMO) 24МЗ 54,1 1214 33,3 1219 75

Всего... 138151 36,9 8911$ 17,9 49135 71,4

* в ногкжч* "Колкчегтее Сольный" ло«»зяио числе больны« м число роддоеое ирегиомврны* н*т*ета»е среди ни»

Гвблиш $

Плоидность ДНК, формы роста и частота рецидивов и регионарных метастазов рака гортани

Форма роста Количестве больных % речидиеое и ыетветаэов Плоидность ДНК

Диплоидные Анеуплондные

Количество больиик % peu. и«*ет Количестве больны* % рец. и мет

Эюофитная 27*11* 40,7 1В14 21 817 87,5

Смешанная 48118 37,5 2714 14,В 21114 66,6

Инфипьтрати!- 55119 34,5 351S 14,3 20114 70

ная

Всего... 130148 37 81113 16 49V35 71,4

* В плм» "Количеспо болты*" гиамно чиаи вомни и число рецидим! и репюиврнм Miter»** среди мм

Таблиц* С

Плоидность ДНК и частота появления рецидивов и регионарных метастазов при разных формах ппоскоклеточного рака гортани

Ппосишететочный Р« Количест* о больиыя % реиндиео» и цетветвюв Плоид иоеть

Диплом Анеуплоидные

Количестьо больным Ч р«ц нмт количество больным % реи и мет

Без орогзденид С ороговением 3311V 07138 33,3 43. е 2416 471$ 25 17,2 91S 40130 55.$ 75

Всего... 120149 40,6 71VI4 19,7 4913S 71,4

* 9 полой«* Количество болтни" лоомн» чист бог»ны« и чмспо щцндкм* » ретоиврньи ыетвсгвюе среди ин>

степени злокачественности по балльной системе у 69 больного. Высокодифференцированных опухолей (I степень дифференцировкн) было 12. Среди них обнаружено 16,6% возвратов заболевания. Умерешюдифференцированных опухолей (11 степень ) было 48. Среди них преобладали диплоидные новообразования. Возвраты среди анеуплоидных опухолей в этой группе встречались в 6 раз чаще, чем среди диплоидных (р< 0.05). В группе и из ко дифференцированных (Ш степень) преобладали анеуплоидные (7 из 9) опухоли слизистой оболочки гортани. Возвраты среди последних встречались в 85,7 %.

Проанализирована выживаемость больных опухолями слизистой оболочки гортани (рис.10). Выживаемость больных диплоидными и анеуплондными опухолями статистически значимо различалась на протяжении 10 лет наблюдения и составила для диплоидных опухолей 76,8 %, а для анеуплоидных - 12,0 %. % 5 летняя выживаемость больных диплоидными и анеуплондными опухолями I стадии не различалась. Различия увеличивались по мере прогрессирования заболевания (III-1Y стадии). Выживаемость больных опухолями слизистой оболочки полости гортани Ш стадии к 10 годам наблюдения при диплоидных опухолях составила 67,6 %, при анеуплоидных - 37,0 % (р<0.05). За 10 лет наблюдений умерли 4 (11,7%) из 34 больных диплоидными опухолями и II (50,0 %) из 22 больных анеуплондными опухолями. Таким образом, фактическая смертельность больных анеуплондными опухолями слизистой оболочки гортани была в 3,5 раза выше, чем больных диплоидными (р<0.05) ( рис 11).

Проанализирована выживаемость больных диплоидными опухолями слизистой оболочки гортани в сравнении с гипердиплоидными и тетраплоидными опухолями. Вероятность дожить до 6 лет больных диплоидными опухолями в сравнении с больными гипердиплоидньгми и тетраплоидными опухолями была выше в 2,1 и 4 раза соответственно (р<0,05) (рис. 12-13).

Выживаемость больных раками гортани

% 120 т-

1 2 3 4 5 6 7

9 10 11 Годовые интервалы

Рис. 19

Выживаемость больных раками гортани III стадии заболевания

% 120

Диплоидкм п*М ч Анауллодт* п »Я

1 I 3 4 5 в 7 «

Рие. Н

в 10 11 Годе«« интервалы

Выживаемость больных диплоидными и гипердиплоидными раками

гортани

100

* 120 100 во во 40

-Диплоидные п ■ 69 - Гнлердиплоцднь« п>2в

ььы.

9 10 11 Годовые интервалы

Рис. 12

Выживаемость больных диплоидными и тетрапл видными раками

гортани

[_т 1-Й-1 1—1 1 -1 1

Г.....г......

-Диппонцные п = В9 Тетралпоедчые л»23

э ю и Гедовьге интервалы

Рис. »

Также была исследована связь плоидности, применяемого лечения и возникновения возвратов заболевания. Одному оперативному вмешательству чаще подвергались больные опухолями слизистой оболочки

гортани, чем опухолями слизистой оболочки полости рта. В I -II стадиях опухолей слизистой оболочки гортани произведено 57 операций (43 больных диплоидными и 14 - анеуплоидными опухолями), а в Ш - 1Y стадии - 32 операций (22 больных диплоидными и 10-анеуплоидными опухолями). Среди оперированных больных возвраты отмечались у б (9,2 %) из 65 больных диплоидными опухолями и у 10 (41,6%) из 24 больных анеуплоидными опухолями. Все анеуплоидные опухоли слизистой оболочки гортани, независимо от стадии заболевания, при одном хирургическом лечении характеризовались более частыми возвратами. 5 летняя выживаемость после одного хирургического лечения для больных диплоидными опухолями была 90,6 %, для больных анеуплоидными -50,0% (р<0.05). Среди первых погибли к 5-летнему сроку наблюдения 1 (1,5 %) из 65 , среди вторых - 8 (33,3 %) из 24, 10 летняя выживаемость для больных диплоидными и анеуплоидными опухолями составила 90,6% и 25,1 % (рис. 14).Послеоперационная лучевая терапия, преимущественно применяемая в JII-IY стадии заболевания, проведена у 36(11 больных диплоидными и 25 анеуплоидными) опухолями слизистой оболочки гортани. Среди больных диплоидными опухолями к 6-летнему сроку наблюдения не отмечено гибели больных, а среди больных анеуплоидными умерли в эти сроки 15 (60,0%) из 25. Выживаемость на этот срок ( рис. 15) больных диплоидными опухолями составила 100,8%, а анеуплоидными - 11,8 % (р<0,05). Вероятно, лучевая терапия была более эффективной при диплоидных опухолях слизистой оболочки гортани, чем при анеуплоидных.

Из 68 больных опухолями слизистой оболочки полости рта диплоидные опухоли отмечались у 36 (52,9 %), анеуплоидные —у 32 (47,1 %) (Табл.7). Частота возвратов у больных диплоидными опухолями III - IY стадии составила 43,7% н 41,4 %, у больных анеуплоидными опухолями

соответственно- 69,2 % и 94,7 %. У 32 больных анеуплоидными опухолями преобладал гипердиплоидный рак - 68,7 % (22 из 32). Возвраты для больных диплоидными опухолями возникали в сроки после 12 мес, у больных анеуплоидными - раньше.

Выживаемость больных раком гортани после хирургического лечения

во

40

20

......I......I......I......[

ДИПП0ИДИЫ9 Л «65 В Анеупгюиднь* п=2*

1 2 3 4 56 7 8 910 1112

Годовые интервалы

Рнс. Ы

Выживаемость больных раками гортани с послеоперационной лучевой терапией

- Диплоидны* п* 11 . Лиауппоидны*

Рис. 15

Таблиц* 7

Плоидкость ДНК, стадия заболевания и частота рецидивов и регионарных метастазов при раках слизистой оболочки полости рта

Стадия »болмания Капнч*спо ботмык % редои»« и иет>стазо> Пло^у*>с1Ъ ДНК

Днлпвчдн** Аивуплоийиие

Количестн больныч % р*ц. и иФГ Хо/нгчетм больных Ч рщ н нит

II (Тг№мМо) 3« 3\0

111 (ТаЫиМо) 29« 6* 55,2 Ш7 43,7 13\9 69,2

IV (Т^о-гМо) 36\25 69,4 17*7 41,4 1вЛ1в 94.7

Всего 68\41 60,3 Э6И4 38.9 32\27 54.3

* в полоны* Количктю боглиы*" поемно числа больных я число рецкдиао* и регионарных метастмо* среди ник

Связь плоидности ДНК с гистологическими формами роста опухолей слизистой оболочки полости рта проанализирована у 68 больных. Частота возвратов у больных анеуплоидными опухолями в группе с инфнльтративным ростом была вдвое больше, чем диплоидными (80,0 % и 43,0 %). При смешанной форме роста частота возвратов у больных анеуплоидными опухолями составила 84,2 %, диплоидными -34,7 %, при экзофитном росте - у 20,0 % больных диплоидными и у 100% анеуплоидными раками. Независимо от формы роста общая частота возвратов была выше у больных анеуплоидными опухолями, чем диплоидными (85,7 % и 33,3 %) (р <0,05) ( Табл. 8).

Те&шце а

Плоидность ДНК, форма роста и частота рецидивов и регионарных метастазов при раках слизистой оболочки полости рта

Форма роста Количестве болычпг Чрецндиао» и н#чстцо* Плоидиостъ ДНК

Диплом [ные Анеуплоидные

Количество % ИМ4Г * реи «*«т

Эюофитная 11\7* 54,5 511 20 6» 100

Смешанна» 42\24 57,1 23\0 34,7 19*16 84,2

Инфильтратнвмая 16\10 66,6 е\2 40 10\8 80

Всего„ 6в\41 50,3 33\11 31.3 35130 В5,7

* 8 «лоикак "КйАечлм СольныиГ пбкиано СМТ14Ш*НН4 обинго ЧИСЛЯ бопым и числе ринит и рогноннжми ыетксг*м*

Проанализирована связь между плоидностью и степенью злокачественности 23 диплоидных и 20 анеуплоидных опухолей слизистой оболочки полости рта. Среди 5 высокодифференцированных опухолей обнаружено по 1 возврату. Среди 20 умеренно дифференцированных новообразований - возвраты обнаружены У 83,3 % больных анеуплонднымн опухолями слизистой оболочки полости рта. В группе малоднфференцированных опухолей у больных анеуплонднымн опухолями возвраты отмечались в 100,0 % случаев. Таким образом возвраты заболевания чаще наблюдались у больных анеуплонднымн опухолями с умеренной н низкой степенью дифференцнровки, чем у больных диплоидными опухолями аналогичной степени дифференцнровки.

Проанализирована 7 летняя выживаемость больных опухолями слизистой оболочки полости рта. Обнаружено статистически достоверное различие в выживаемости больных диплоидными н анеуплонднымн опухолями. Выживаемость больных диплоидными опухолями к 7-летнему сроку наблюдения составила 77,6 %, анеуплонднымн - 27,3 % ( р< 0.05). Фактическая смертельность среди больных анеуплонднымн опухолями также была в 2,8 раза выше. За 7 лет среди больных анеуплонднымн опухолями погибли 26 из 32 (81,3%), а среди больных диплоидными-6 из 36(16,6%).

Рассмотренана связь плондностн ДНК, частоты возвратов заболевания и примененного лечения. Больные опухолями слизистой оболочки полости рта сначала подвергались сохранной операции, затем лучевой терапии (24 случаев) либо химиотерапии с последующей операцией (25 случая) (рис 16 и 17). Кумулятивная выживаемость больных диплоидными опухолями при первом варианте лечения к 4-летнему сроку наблюдения составила 92,3 %, больных анеуплонднымн новообразованиями-9,1 %(р<0,05). Вероятность выжить для больных диплоидными опухолями была выше,

Выживаемость больных раками слизистой оболочки полости рта, перенесших послеоперационную лучевую терапию

1..........1..........1..........1...........1"

4=1

—Дипломами* п ■ 13 Лнеуппоидми» п»11

Рис, М

« 120

Выживаемость больных раками слизистой оболочки полости рта после предоперационной химиотерапии

—♦-Диплоидные п »13 -•-Аиеуллондикв п»12

в 10 11 Годоаы* интервалы

2 3 4 5 в 7 в

РИС. 17

чем для оольных анеуплоиднымн опухолями. Применение второй схемы лечения показало снижение выживаемости больных анеуплоиднымн опухолями (29,7 %) по сравнению с больными диплоидными (66,7 %) (р< 0,05). Вероятно, лучевая терапия как и предоперационная химиотерапия

при комбинированном лечении опухолей слизистой оболочки полости рта была более эффективной для диплоидных опухолей.

Таким образом, по результатам многофакторного анализа ДНК-плоидности и клинических показателей течения опухолевого процесса при опухолях слизистой оболочки полости рта и гортани отмечена первостепенная диагностическая значимость ДНК-плоидности (0,104), а также важность сроков возникновения рецидивов (0,095),вида лечения ( 0,0б7),степени злокачественности (0,056), стадии заболевания (0,030) и локализации опухоли (0,014). При этом ДНК-диллоидия опухолей явилась наиболее весомым благоприятным показателем прогноза заболевания. ДНК-анеуплоцдия в такой же степени указывала на неблагоприятный 5-н летний прогноз опухолевого процесса. Раздельный анализ клинических показателей течения заболевания диплоидными и анеуплоидными опухолями показал, что для прогноза первых наиболее важным было позднее появление рецидивов, для вторых - более ранняя стадия развития процесса.

В итоге можно отметить, что среди опухолей слизистой оболочки полости рта диплоидные новообразования преобладали над анеуплоидными. Независимо от стадии заболевания частота послеоперационных возвратов опухолевого процесса для анеуплоидных опухолей была в 1,5 -3 раза выше. При всех изученных клинически неблагоприятных гистологических формах роста опухоли (инфильтративная, смешанная) преобладали анеуплоидные опухоли. Частота возвратов заболевания в пределах изученных гистологических форм была связана, главным образом, с анеуплоидией. При плоскоклеточных (неороговевающих и ороговевающих) опухолях слизистой оболочки гортани частота возвратов заболевания также была выше для анеуплоидных опухолей, чем для диплоидных, и а большей степени зависела от анеуплоидии, чем от степени дифференцировки. Возникновение возвратов заболевания и длительность безрецндивного периода также в большей степени были связаны со значением ДНК-плоидности, чем со степенью дифференцировки опухолей. Поэтому

аиеуллоидию ДНК опухолевых клеток, по-видимому, следует рассматривать как высокоинформативный независимый неблагоприятный фактор прогноза рака слизистой оболочки полости рта и гортани.

Рак легкого.

Изучены ДНК-цнтограммы 96 больных аденокарцнномами (24) и плоскоклеточными раками легкого. По содержанию ДНК опухоли легкого распределялись следующим образом: диплоидные 19,6 %, анеуплоидные 80,4 %. (Табл 9). В разработку вошли материалы историй болезней 88 пациентов. Примерно одинаковое соотношение числа диплоидных и анеуплоидных опухолей легкого для 64 случаев разных по морфологическим характеристикам плоскоклеточных опухолей (с ороговением, без ороговения, малодифференцированные) различалось только для

Таблица »

Гистологическая классификация, клиническая стадия заболевания и плоидность рака лёгкого

Стадия Количество Плоидность ДНК

заболевания больных Диплоидные Анеуп/юидныв

Пгоскоклвточм^ж рая

п-здамо 27 6(22.2)" 21(77.9)

Т2Н1М0 э 0 3

Т1-ЭМ2М0 34 «33.5) 26(76.5)

Веаго... «4 14(21,() 50(78,2)

Ддвмонацинома

Т1М0М0 9 2 7

тгтмо 4 1 3

Т1-ЗМ2М0 11 1 10

Всато... и 4(11.6) 20(43,4)

Итоге:

Пномо 36 в га

Т2М1М0 т 1 в

п-зкгмо 45 9 за

Карцнипу! 2 0 2

Гаманпюцитома » 0 1

Малкоклеточный 1 0 1

Крутоклагточный 1 0 1

Саатписпатачмый 2 0 г

Венганмпаточный 1 1 0

Вс«го„. > 1 т

Вс* Больны* «в 1419,6) тли*

■ в »об™ указано прочаипю» еоотнимни»

малоднфференцированных плоскоклеточных опухолей: среди них преобладали (66,6%) анеуплондные формы. Среди 24 аденокарцином легкого доля анеуплоидных опухолей была 83,4 %. Частота возвратов заболевания в обеих группах больных возрастала по мере развития заболевания, особенно в стадии Т1-3 N2 МО (табл. 10). В 1 стадии

Таблица 10

Прогрессировать плоскоклеточного и аденогенного раков лёгкого в зависимости от плоидности и состояния лимфоузлов

Ллоеттоклеточный рак

Стад«* Количество % Диплом цны» Анеуплоидные

иболмгмия вольных «омрвто» Количество вольных % нярате* Количество больных * *о»р>ТО|

Tt.iNiMo 27VT 22.2 6Ю 0 2в,5

TuNi-iMt 37124 64,9 ev3 37,5 29(21 72,4

Всего... 64130 46,0 14(3 21,4 50(27 54

АЙеногарчинока

TiNeMa 9\5 55,5 2(0 0 7\5 71,4

T14N1.1M« 1SV12 во 2V1 50 1Э\11 04,6

Всего 24(17 70,8 4\1 25 20\1в во

* Из ии* с возвратами

заболевания диплоидные плоскоклеточные опухоли не рецидивировали, а в III стадии рецкднвирование отмечено в 37,5 %. Среди больных анеуплондными плоскоклеточными раками этот показатель возрастал с 28,5 % в I стадии до 72,4% в III стадии заболевания. Анеуплоидные аденокарциномы рецидивировали в 71,4% случаев в начальной стадии заболевания Т1 и Т2. Диплоидные аденокарциномы в аналогичных ранних стадиях заболевания не рецидивировали. Среди анеуплоидных плоскоклеточных опухолей легкого гипердиплоидные опухоли рецидивировали чаще (72,7 %) других. За ними шли пол и клоповые и гипертетраплоидные (57,1 % и 66,1 %) Реже других рецидивировали тетраплоидные опухоли (23,5 %).

Была изучена связь плоидности и частоты рецидивирования у больных первичными плоскоклеточными опухолями легкого с интактными лимфоузлами и у таких же больных с метастазами в лимфоузлы. У первых

плоскоклеточные анеуплоидные опухоли поражали лимфоузлы в 2 раза чаще, чем диплоидные опухоли, а анеуплоидные аденокарциномы метастазировали в лимфоузлы еще чаще ( 84,6 %) Аналогичная тенденция сохранялась в случаях уже пораженных лимфоузлов. У таких больных анеуплоидные опухоли рецидивировали во всех изученных случаях, что в 2,5 раза превысило частоту поражения интактных лимфоузлов диплоидными опухолями.

Сроки возникновения рецидивов у больных диплоидными плоскоклеточными опухолями легкого составили 21,2 +А6.7 мес, а анеуплоидными опухолями - 10,4+/-1,27 мес (р=0,05. К 5-летнему сроку наблюдения выживали 70,5 % больных диплоидными опухолями и 45,6% больных анеуплоидными опухолями (р=0,001). В группе больных плоскоклеточными раками с ороговением при анеуплоидных новообразованиях больные выживают в 43,2% случаев, а при диплоидных опухолях - в 100% (р<0,05) (рис. 18).

Выживаемость больных диплоидными и анеуплоидными аденокарциномами достоверно различалась. К 4-му году наблюдения среди больных диплоидными аденокарциномами выживали 71,4 %. Среди больных анеуплоидными аденокарциномами - 28,9 % (р=0,05) (рис. 19).

Проанализирована выживаемость больных опухолями легкого, перенесших лишь одно оперативное лечение, и больных после комбинированного лечения (у -облучение 20 Гр, затем операция). Показано достоверное различие между выживаемостью к 4 годам наблюдения оперированных больных диплоидными и анеуплоидными опухолями (75,0 % и 33,0 %), Среди 20 больных, получивших предоперационную лучевую терапию, к 4 годам больше выживало больных диплоидными раками легкого,чем анеуплоидными (81,8 % и 58,7%), Выживаемость больных анеуплоидными опухолями легкого, получивших комбинированное лечение, была выше, чем среди только оперированных больных (58,7 % и 33,0 %).

Выживаемость больных с пло стоклеточный и карциномами лЯгкого (ПКЛ)

в» пкл

1 г * 1 I Годы

—<—д пищ 11 !»• И

А- 11

п-ат

I г > * » I Годы

Рис. 18

ПКЛ 6*] орого**ннл

1 2 ] ' » Годы

Выживаемость больных аден о карциномам и лёгкого

-Диплоидные II14 —Анеуплонднь1* п« ¿0

1 1 • » 1 Рис. 1$

Полученные результаты говорят о том, что немелкоклеточные раки легкого, неоднородные по своей клинической картине, в прогностическом плане должны рассматриваться индивидуально в зависимости от содержания в опухолевых клетках ДНК. Измерение содержания ДНК перспективно для оценки клинического течения болезии и прогноза при нем ел коклеточ пых опухолях легкого.

Рак толстого кишечника.

Изучены ДНК-цнтограммы 72 больных раком толстого кишечника ( сигмовидной н ободочной кишки). Все больные подвергались операциям различного объема. У 42 больных (58,3 %) выявлены диплоидные раки толстого кишечника, у 30 - анеуплоидные (41,7 %). Среди последних было 4 (13,4%)гиперднплоидных, 15 (50,0%)тетраплоидных и по 4(13,4%)

гипертетраплоидных и 7 (23,3%) многоклоновых. В возрастной группе моложе 60 лет количество анеуплоидных опухолей статистически значимо превышало количество аналогичных опухолей в группе больных старше 60 лет (56,5 % и 38,7 %).

В табл. 11 представлены данные о распределении 62 прослеженых в течение ряда лет опухолей толстого кишечннка по стадиям, плоидности и частоте возвратов заболевания. Показано, что частота возникновения возвратов заболевания у больных диплоидными опухолями составила 8 из 35 (22,9 %),, а у больных анеуплоидными опухолями она была вдвое выше 13 из 27 (48,1 %) (р < 0.05) при общей частоте 33,9 %. По нашим данным анеуплоидные опухоли в 2 раза чаще сопровождались отдаленными метастазами. Общая частота возвратов у больных Ша стадии составила 20,0 %, а среди больных Шб стадии втрое больше -60,0 %. Раздельно у больных днплонднымн н анеуплоидными опухолями 1116 стадии частота вовратов составила-40,0 % и 70,0% (р<0,05). В1Y стадии эти показатели соответственно составили 50,0 % и 66,7 %.

Частота возврата заболевания у больных гипердиплондными и гипертетраплоидным опухолями была одинаковой и составила 25,0 %. При многоклоновых опухолях кишечника у всех 4 больных были отмечены местные рецидивы или отдаленные метастазы. У пациентов с тетраплондными опухолями прогрессирование заболевания было отмечено у 46,7 % случаев (р<0,05). Таким образом, многоклоновые опухоли толстого кишечника характеризовались наиболее агрессивным течением с высокой

вероятностью местного рецидирования и раннего отдаленного метастазиро вак ия.

Сравнительный анализ степени морфологической дифференциров-ки, частоты возвратов и плоидности опухолей толстого кишечника показал, что клинические показатели были хуже при апеуплоидных опухолях с высокой, умеренной и низкой степенью дифференцнровкн (30,0%, 50,0%, 80,0%), чем при диплоидиых соответственно — 6,7%, 28,6% и 50,0%. Тем не

Таблица №11

Связь плоидности ДНК, стадии и частоты возврата заболевания

ДИПЛОИДНЫЕ АНЕУПЛОИДНЫЕ

СТАДИЯ ВСЕГО %% % % Л 3 | % «0 г о 2 1

£ Е ! < г Е 1

На 4/0* 25 4/0 — — / — — — —

№ 1/1* 100 — — - — 1/1* 100 1 -

Ша 35/7* 20 22/4* 18,2 2 2 13/3* 23,1 — —

Шб ¡5/9* 60 5/2* 40 - 1 10,7* 70 - -

1Уа 7/4* 57,1 4/2* 50 1 1 3/2* 66,7 2 —

ВСЕГО 62/2/* 33,9 35 27

* — абсолютное число пациентов с выявленным прогрессирован нем болезни.

менее, статистически значимые различия кумулятивной выживаемости были выявлены только у больных диплоидными и анеуллоидными новообразованиями при низкой степени дифференцировкн (86,0% и 35,0 %) (р< 0.05).

Анализ выживаемости больных опухолями толстого кишечника в зависимости от плоидности показал следующее. 5 летняя выживаемость больных диплоидными и анеуплоидными опухолями составила 70,0 % и 53,0 % (р<0,05). 10- летняя выживаемость больных была 59,0 % и 28,0% ( р= 0,035). 5 летняя выживаемость больных анеуплоидными опухолями была хуже, чем у больных диплоидными опухолями при всех стадиях заболевания. Выживаемость больных анеуплоидными опухолями в стадиях 11+Ша, Шб и ГУ составила 67%, 33%, 20%, для больных диплоидными опухолями 79%, 79%, 33%.

Проанализирована частота прогрессирования заболевания в зависимости от плоидности опухолей толстого кишечника и проведенных лечебных мероприятий. 48 больных подверглись хирургическому лечению (30 диплоидными и 18- анеуплоидными опухолями). Возвраты заболевания составили 26,7 % и 55,6 % для диплоидных и анеуплоидных опухолей. 14 больным (5 диплоидных и 9 анеуплоидных опухолей) проведена предоперационная лучевая терапия (4-5 Гр) с последующей операцией. Частота возвратов в этой группе составила для диплоидных и анеуплоидных опухолей соответственно 0% и 33,3 % ( р>0.05). При этом общая частота возвратов заболевания у больных при выполнении одного хирургического вмешательства была выше (37,5 %), чем при проведении комбинированного лечения (21,4%)

5 летняя выживаемость только оперированных больных диплоидными опухолями составила 68,0 %, а анеуплоидными - 42,0 % (р<0,05). 10 летняя выживаемость составила соответственно 55,0 % и 28,0% (р=0,008). 5 летняя выживаемость в группе комбинированного лечения составила для больных

диплоидными опухолями 80,0%, а для аиеуплоидных опухолей 75,0 %. 10-летпяя выживаемость составила соответственно 80,0% и 56,0 %, (р>0,05).

Многофакторный анализ ДНК-ллоидности и клинических факторов прогноза заболевания опухолей толстого кишечника показал первостепенную прогностическую значимость ДНК-плоидности и стадии заболевания в ряду других клинических показателей прогноза.

Заключение

Проведенные нами исследования раков молочной железы, головы и шеи, легкого, толстого кишечника, также как и литературные данные, свидетельствуют о высокой информативной значимости для прогноза послеоперационного течения опухолевого процесса определения ДНК-плоидности опухолевых клеток в новообразованиях. По нашим и данным других авторов показатель ДНК-плоидности занимает доминирующее положение среди иных клинических лабораторных факторов прогноза течения опухолевого процесса. Показано, что анеуплоидия опухолей с высокой степенью вероятности сопровождается более ранними и более частыми послеоперационными возвратами опухолевого процесса (метастазы и рецидивы), что влечет за собой существенное сокращение жизни оперированных больных по сравнению с обладателями диплоидных опухолей. Наиболее прогностически неблагоприятными формами анеуплоидии являются многоклоновые опухоли. ДНК-цитометрическое прогнозирование дает основание для формирования среди оперированных больных групп повышенного риска возврата заболевания с целью интенсивной специфической противоречиливной терапии. Таким образом, ДНК-анеуплоидия является доминирующим неблагоприятным прогностическим фактором для изучененных новообразований человека.

ВЫВОДЫ

1. Проточная ДНК-цитометрия позволяет исследовать такую биологическую характеристику, как плоидность опухолевых клеток, то есть содержание ДНК в преобладающем классе клеток. Классификация опухолей по плондности разделяет их на диплоидные и анеуплоидные. Изучена ДНК плоидность 654 опухолей - 280 раков молочной железы, 206 опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани, 96 раков легкого и 72 колоректальных рака. При раках молочной железы и легкого анеуплоидные опухоли встречались чаще (60,0 % и 80,0 %), чем диплоидные. Среди изученных опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани и при колоректальных раках диплоидные варианты встречались чаще (60,6 % и 58,3 %), чем анеуплоидные.

2. ДНК-плоидность не только не противоречила принятым морфологическим факторам прогноза, но была однозначна с ними и часто превосходила их по частоте совпадений и достоверности при прогнозе рецидивов регионарных метастазов и продолжительности жизни при раках изученных локализаций.

3. ДНК-плоидность (анеуплоидия) коррелировала с отсутствием эстрогеновых рецепторов при раке молочной железы. Анеуплоидные рецепторотрицательные РМЖ имели худшую выживаемость по сравнению с диплоидными рецепторположительными новооборазованиями.

4. Анеуплоидные опухоли являются неблагоприятным фактором прогноза при раках молочной железы, слизистой оболочки полости рта и гортани, легких и колоректальных раках. Частота рецидивов и метастазов изученных анеуплоидных опухолей в 2-4 раза выше, чем при диплоидных опухолях, а сроки их появления в 2 раза меньше. Сроки и вероятность

появления рецидивов и местных метастазов, как и выживаемость больных находилась в прямой связи с ДНК-плоидностью опухолевых клеток, имеющей свойства независимого прогностического признака.

5. 5- летняя выживаемость при анеуплондных новообразованиях молочной железы, слизистой оболочки полости рта и гортани, легких и при кол о ректальных раках составила 44,2 %; 24,0 %; 45,6 % и 53,0 %, при диплоидных - 73,2 %; 92,9 %; 74,5 % и 70,0 %. Ю- летняя выживаемость анеуплондных новообразований (кроме раков легкого) была 38,2 %; 8,0 % и 28,0 %, диплоидных - 63,4 %; 74,7 % и 59,0 %. Продолжительность жизни больных анеуплоидными опухолями была в 1,5 — 4 раза короче, чем у больных диплоидными карциномами.

6. В результате проведенного многофакторного анализа клинических и лабораторных данных выявлена первостепенная прогностическая значимость и независимость ДНК - ллоидности при раке слизистой оболочки полости рта и гортани и при колоре(стальных раках. При раках молочной железы прогностическая значимость ДНК-плоидности следовала на втором месте за стадией заболевания,

7. При планировании лечения больных изученных новообразовании необходимо учитывать данные ДНК-цитометрии. При анеуплондных карциномах, учитывая неблагоприятный прогноз, целесообразна дополнительная терапия, направленная на предупреждение возникновения рецидивов и метастазов.

8. ДНК-цитометрнческое прогнозирование течения опухолевого процесса позволит формировать группы повышенного риска раннего рецидивнрования и метастазирования среди больных анеуплоидными карциномами.

Список опубликованных работ

1. Анализ распределения клеток одной и смеси популяций// ГОСФАП N 50890001111 от 29, 09.89 (соавт. Басов Б.Н., Добрынин Я.В.)

2. Проточная цитофлуориметрня в прогнозировании рецидивов опухолей молочной железы у оперированных больных//Автоматизация цитометрических исследований, Киев., 1990, с.117-119 (соавт. Добрынин Я.В., Чнквашвили Б.Ш., Финько В.Б.)

3. Проблема анализа данных проточной ДНК-цитометрии и разработка программы расчета параметров клеточного цикла с помощью ЭВМ. // Автоматизация цитометрических исследований, Киев.,1990, с. 66-70 (соавт. Добрынин Я.В., Басов Б.Н., Мирнаношвнли М.Л.)

4. ДНК цктометрия в прогнозировании течения некоторыми видами новообразований человека //Терапия, диагностика н профи лактнка опухолей в эксперименте Москва, 1990, с. 66-70 (соавт. Добрынин Я.В.,Финько В.Е., Голованов М.В.)

5 . Биологические и клинические аспекты изучения циклического гуакозин-3-5-

монофосфата при раке молочной железы //Антибиотики и химиотерапия 1990, N 12, с.

29-30 (соавт. Летягнп В.П.,Воротников И,К., Чнквашвили Б.Ш.,

Кушпинский И.Е., Пискунова Т.В., Вайраддн А.С., Золотухина Е,Б,, Воронцова А.В.)

6, Проточная антометрия в прогнозировании течения рака молочной железы //Вестник ОНЦ АМН, 1994,1, с. 30-37 (соавт. Добрынин Я. В.,Чнквашвили Б. Ш., Воротников И. К., Летлгин В, П.)

7. Биологические особенности плоскоклеточного рака гортани // Conferetita IX а oncologilorder) Moldova consacrata ybileului de 35 am al Institumlui, Chisinau, 1995, c. 147-IS (соавт. Alferov V.S.. Ахундов A,A.)

8- ДНК-цитометрия опухолевых клеток и прогноз нри раке гортани // Конференция онкологов России Ростов на Дону ,1995, с.220-223 (соавт. Алферов B.C., Ахундов А.А., Худнрат С,,Добрынии Я.В,, Матякнн Б.Г.)

9. Морфологические и биологические особенности плоскоклеточного рака гортани // Вестник Отолярингологиии, 1995, N 3, с, 27-31 (соавт. Алферов B.C., Ахундов А.А., Павловская А.И., Азизян Р.И,, Ротобелъская Л.Е)

10 Плоидность ДНК опухолевых клеток и прогноз при раке гортани //Вестник ОНЦ РАМН,1995, Кг 1, с. 17-25 (соавт. Добрынин Я.В.,Алферов B.C., Матякнн Е.Г., Павловская А.И., Кондратьева Т.Т.).

11 .Плоидность ДНК опухолевых клеток в прогнозировании течения злокачественных новообразований//Вестник РАМН 1995,№4,с,49-50(соавт. Добрынин Я. В., Летяги к В.П., Алферов B.C., Пророков В.В.)

12-Зиачимость определения ДНК-плоидностн опухолевых клеток в прогнозировании течения рака легкого // Вестник ОНЦ РАМН, 1995, № 3, с. 40-46 (соавт.Полошенй Б.Е., Басов Б.Н., Добрынин Я.В., Давыдов М.И

13.FCM analysis content DNA in large intestine cancer cells and it relation wilh prognosis//Sixth international congress on anticancer treatment 1996, p. 210 (соавт.Dobrynin Ya.V,,Basov B.N,. Prorokov V.V.)

14.FCM analysis of the breast cancer population structure after presurgery chemotherapy// Ibid , 14 p. 164 (соавт. Dobrynin Ya.V., Shishkin Yu. V.)

15. FCM analysis DNA in oral carcinoma cells and it relation with results of combined therapy efficacy// Ibid , p,210 (соавт. Uvarov A.,Basov B.N.,Khudirat S., Achundov A., Dobrynin Ya.)

16 Influence DNA contents into the squamous cell carcinoma of the oral cavity on prognosis// J. of Cranio Maxillofacial surgery 1996, v 24, suppl 1, p. 159 (соавт. Uvarov A.A., Achundov A.)

17.Плоидность плоскоклеточного рака гортани и орофарингеалъной области //I съезд онкологов стран СНГ 1996, с. 9) (соавт. Ахундов А.А.,Уваров А.А., Алферов B.C.)

18.Плоидность ДНК при раке толстого кишечника и ее значимость в прогнозе заболевания //Там же, с.95(соавт. Добрынин Я.В.,Пророков В.В,, Басов Б.Н., ХудиратС., Глазкова Т.)

19.FCM analysis orthc breast canccr population structureaftcr presurgery chemotherapy// XYlll congress orthe ISAC, Rimini 1996, Cytometry 1996, suppl 8,p.66 (соагт. Shislikm Yu.V„ Dobrynin Ya.V.)

20. Ploidy in prognosis of lung cancer//Tirst international meeting on advances in theknolidge of cancer management 1997, Vienna Austria p.35 (Pol osky В., Dobrynin Ya.)

21.Laryngeal canccr DNA ploidy and prognosis //7|Ь1СЛСТ 1997, p. 219 (соапт. Khudirot.S, Dasov B.N., Alferov V, C., Dobrynin Ya V.

* 22,FCM analysis ofthe adenocarcinoma breast population structure (SPF and ploidy) after

presurgery chemothcrapy/ZIbid.,p. 130 (соавт. Dobrynin Ya.V.)

, 23.FCM analysis content DNA (ploidy) in squamous cclls oropharyngeal canccr and the role of ploidy in disease prognosis 9,h Congress ofthe European Society of Surgical Oncology

* Lausanne, Switzerland. 3-6 June, 1998 (соавт. Achundov A, A., Nudirat S.A..Alferov V.S , Uvarov A.A., Dobrynin Ya.V.)

24. DNA plotdy in prognosis of lung canccr course //S"11CACT 1998, p 206 (coanr Polotsky В., Dobrynin Ya.)

25. Presurgery chemotherapy and DNA ploidy of adenocarcinoma breast cclls //Г' European breast canccr conference, Florence, 29-3 Oct, 1998 (соавт. Dobrynin Ya.V.)

26. DNA content (ploidy) in squamous cell ofthe head and neck canccr//17IK International Cancer Congress Rio de Janeiro, 1998,23-28 Aug. p.99 (соавт. lludirat S.A., Achundov A , Alferov V.,Uvarov A„ Dobrynin Ya.)

27. Presurgery chemotherapy and DNA ploidy ofthe adenocarcinoma breast// Ibid, p 99 ( coanr Dobrynin Ya.V.)

28 Presurgery chemotherapy and DNA ploidy ofthe adenocarcinoma cells //гЗ^ЕЗМО Congress, Greece, 6-10 Nov. ,1998 (соавт. Dobrynin Ya.V.)

29. Content DNA (ploidy) and prognosis in squamous cell of lite head and neck cancer//J, Craniom ax i No facial Surgery, 1998, v. 26, suppl, p. 131 < соавт. Nudirat S, Achundov A, Alferov V., Uvarov A„ Dobrynin Ya,)

30. FCM-analysis DNA content in squamous cell oropharyngeal canccr and the meaning ofploidy in disease prognosis // Menagemenl Meeting # The Team Approach lo Canccr Managements 1999, April, Belgium ( соавт,Hudirat S., Alferov V,, Uvarov A,, Dobrynin Ya )

31. Цитометрическое определение содержания ДНК в клетках опухолей головы и шеи и его роль в прогнозе заболевания // Вестник РОПЦ РАМП, 2000, № 1, с. 11-20 ( соавт, Худнрат С., Ахундов А.А., Басов Б.Н., Алферов B.C., Уваров Л.Л.)

32. Плондность ДНК колоректальимх карцином - абсолютный или вероятии ft фактор прогноза^/2-ой съезд оикопогос стран СНГ с участием ученых Европы, Америки и Азии, Киев, Украина, 2000, Эксперим. Онкологи я,2000 v.22, suppl.. N 154 (соаот.

* КрутнВ С.В., Пророков В.В., Добрынин Я П.)

33. ДНК плондность клеток карцином орофарнпгсалыгоП области и пропил заболевания// Там же, N 405 (соавт. Ахундов А.А., Алферов B.C., Добрынин Я.В.)

Ч 34. Analysis DNA content in squamous cell oropharyngeal cancer and meaning of ploidy in disease prognosis.// XY Congress ofthe European association forCrantoMaxillofactal

* Surgery, Edinburgh, 2000, p. 264 (соавт. Alferov V.S,, Achundov A,, Dobrynin Ya)

* 35. FCM ploidy analysis ofthe head and neck squamous cell canccr and its meaning in disease

prognosis //Abstracts of 7* International Congress on Oral Cancer. 1 lie 1 laguc, The Netherlands, April 2001, р.85(еоавт. Achundov A., Khudirat S. A., Alferov V., Dobrynin Ya)

36. DNA content in squamous cell oropharyngeal cancer and the ploidy meaning in disease prognosis/ZAbslract of 11ЛICACT Paris, France, Fcbr. 2001, p. 195 (coatrr. Achundov A , Alferov V., Dobrynin Ya.)

37. FCM ploidy analysis of head and neck squamous cell canccr and its meaning in disease prognosis //Abstract of 9A International Congress on cleft palate and Craniofacial Anomalies. //Goleborg, Sweden, June 2001, p. 315 (соавт AchundovA, Khudirat S , Alferov V ,

Dobrymn Ya.)

38. DNA ploidy as the significant prognostic factor of colorectal cancer// I l,h ICACT, Paris. Franco, Febr. 2001, p.194 (соавт. Krutii C.)

39. Клиническое значение ДНК- плондносш при плоскоклеточных раках слизистой оболочки полости рта и гортани// 2-ой Конгресс онкологов Закавказских государств. Азербайджан, Баку, май 2001, с. 117 (соавт, Ахундов А..Алферов В., Добрынин Л.)

40. Значение ДНК-плоидностн при колоректальных карциномах //Там же с. 137 (соавт. Крутий С., Пророков В.Добрынин Я.)

41. The method of flow DNA cytometry Tor the disease prognosis of some human malignant tumors// 18th Int. J. Cancer 2002, suppl. 13, p.150 (соавт. Dobrynin Ya.)

42. Опыт применения проточной цитометрии для прогнозирования лечения злокачественных новообразований //Вопросы онкологии 2001 т. 47, N 6, с. 684-689 (соавт. Добрынин Я.В., Летягнн В.П., Ахундов А.А., Пророков В.В., Давыдов М.И.)

43. Метод проточной цитометрии в прогнозировании течения опухолевого процесса при некоторых опухолях человека //Вссросс. Практич. Коиф. «Отечествениые противоопухолевые препараты», Москва, 2002, е.] 18(соавт. Добрынин Я.В.)

44. Плоидиость ДНК н прогноз рака толстой кишки // Сборн. Научи, трудов Подольской б-цы, 2001, с.65-69 (соавт.КрутнЙ С.В., Пророков В.В., Ушакова Т.В., Добрынин Я.В.)

45. Значение плоидности ДНК при колоректальном раке // Y Вссросс. Конф. с междунзр. участием «Актуальные проблемы колопроктологин» Ростов на Дону, 2001, с. 161-162 (соавт.Пророков В.В., Крутий С.В., Ушакова Т.В.)

46. Метод проточной цитометрии в прогнозировании клинического течения рака слизистой оболочки полости рта и гортани//Современная Онкология, 2002, t,4,N 3, с. 118-120 (соавт. Ахундов А.А., Подвязников С.О., Добрынин Я.В.)

47. DNA Content in squamous cell oropharyngeal cancer and the ploidy meaning in disease// J. CraníomaxiIlofacial surgery 2002, v.30, suppl 1, p. 188 (соавт. Achundov A.A.)

48. Prognostic significance in disease prognosis in oropharyngeal cancer (HP* World congress of the international federation of head and neck oncologic societies, Rio de Janeiro, Brasil, 2002, societies, Rio dc Janeiro, Brasil, 2002, № 83 (соавт .Achundov A.A.)

49. DNA content and overall survival time in squamous cell oropharyngeal cancer//13 ICACT, 2003, p. 252 (соавт. Achundov A.A.)

50. Метод проточной ДНК-цитометрии в прогнозировании течения опухолевого процесса при новообразованиях человека //«Современная онкология на рубеже веков» Москва 2003, с. 470-497 (соавт. Добрынин Я.В.)

»

Í *

I *

Заказ ПО Тираж 100 экз.

Участок множительной техники POHU им. H.H. Блохи на РАМН

9

Г

I

РЫБ Русский фонд

2006-4 37457

11 i 4

1 9 -.ел ; Д}

Актуальность проблемы. Современный метод проточной цитомет-рии позволяет с высокой точностью на статистически достоверном материале измерить количество исследуемых веществ в клетках и их ядрах. В основе определения - измерение естественной люминесценции или люминесценции специальных красителей, избирательно связывающихся с изучаемыми веществами.

Отдельное место среди методов проточной цитометрии занимает ДНК-цитометрия. Своеобразие этого заключается в том, что содержание ДНК в нормальной жизнеспособной клетке не является постоянным, а зависит от фазы жизненного цикла клетки. При разных формах патологии количество ДНК в покоящейся (неделящейся) клетке не всегда бывает одинаковым (диплоидным), но может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения (гипоплоидия) или чаще - в сторону увеличения (гиперплоидия). Последнее (гипердиплоидия, трип-лоидия, тетраплоидия и т.д) часто имеет место при злокачественном росте.

При анализе распределения нормальных клеток по содержанию ДНК учитывается как количество ДНК в покоящихся клетках (плоидность), так и изменения количества ДНК (вплоть до удвоения) в делящихся клетках. Поскольку при патологии высока вероятность одновременного присутствия в популяции нормальных (диплоидных) и патологически измененных (анеуплоидных) клеток, а также нормальных и измененных клеток, синтезирующих ДНК, очевидно, что анализ смеси таких субпопуляций является сложной математической задачей, осуществляемой с помощью специально разработанных программ.

ДНК цитометрические характеристики опухолевых клеток являются предметом самостоятельного изучения. Исследованиями указанным методом было показано, что далеко не все злокачественные опухоли характеризовались измененным кариотипом [Зубрихина, 1990]. Многие из них обладали диплоидным хромосомным набором, ДНК-цитометр.ически не отличавшимся от нормального. Разрешающая способность применяемого метода ДНК-цитометрии не позволяла отличить нормальный диплоидный ка-риотип от псевдодиплоидного. В последнем, несмотря на стандартное диплоидное количество ДНК, вероятны структурные перестройки хромосом. Кроме того, было показано, что перестройки в хромосомах могут также происходить на уровне отдельных генов, что, понятно, не может быть зарегистрировано путем суммарного определения ДНК в геноме клеток.

В последние годы получил признание способ прогнозирования течения опухолевого процесса на основании определения плоидности клеток в опухолевом узле. Подвергались изучению различные новообразования человека, их ДНК-цитометрические характеристики сопоставлялись с клиническими данными. В результате такого сопоставления для разных видов опухолей выявлены некоторые общие закономерности: диплоидные опухоли имели более благоприятное течение, чем анеуплоидные. Для ряда опухолей также были отмечены некоторые специфические особенности. Сопоставление с клиническими факторами прогноза показало высокую информативность показателя плоидности ДНК опухолевых клеток и позволило рассматривать его как независимый прогностический признак.

Литература последних лет содержит сведения о высокой информативности ДНК-плоидности опухолевых клеток при различных новообразованиях человека. Приведенные работы подчас противоречивы, не всегда выполнены на достаточном количестве наблюдений, что не позволяет в полном объеме судить о прогностической значимости определения ДНК-плоидности для онкологической клиники.

В настоящее время, несмотря на большое число работ, окончательного мнения не сложилось о прогностической значимости ДНК-цитометрических данных при злокачественных опухолях молочной железы, головы и шеи, легких и толстой кишки. Между тем, заболеваемость перечисленными раками имеем стойкую тенденцию к росту. Для решения вопроса о степени допустимой органосохранности необходимого оперативного вмешательства хирургу требуются прогностические данные. Клинические прогностические критерии (локализация, стадия, форма роста, распространенность и др.) достаточно хорошо изучены и преимущественно характеризуют состояние опухолевого процесса в настоящий момент. В то же время ДНК-цитометрические показатели, характеризующие биологические свойства опухолевых клеток, могут прогнозировать их поведение в будущем. Отсюда, актуальность темы определяется следующими соображениями.

Существующие способы (алгоритмы) математической обработки ДНК-цитометрических данных не всегда дают сопоставимые результаты. Большинство их сложно и требует мощного компьютерного обеспечения. Внедрение метода ДНК-цитометрии в клинику требует создания относительно простого метода расчета ДНК-цитограмм, правильно интерпретирующего клеточную кинетику и выдающего стандартизованные результаты.

Накопленные материалы ДНК-цитометрического изучения новообразований человека в недостаточной степени описывают изучаемые нами злокачественные опухоли. Опухоли указанных локализаций являются достаточно распространенными, их прогрессирование рано приводит к генерализации процесса и гибели больных. Поэтому является актуальным и важным изучение их биологических особенностей и их прогностической значимости с целью поиска объективных прогностических критериев опухолевого процесса.

Цели исследования: разработать метод компьютерного анализа ци-тометрических данных; применить разработанный метод для изучения ДНК-цитометрических характеристик опухолей молочной железы, головы и шеи, легких и толстой кишки человека; выработать и обосновать ДНК-цитометрические критерии прогноза течения изучаемых злокачественных новообразований человека.

Задачи исследования. Для достижения намеченных целей необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать алгоритм математического анализа данных ДНК-гистограмм, полученных на проточном цитофлуориметре 1СР-22.

2. Сравнить результаты ДНК-цитометрического анализа, полученного на основе разработанного алгоритма, с данными обработки иными способами.

3. Изучить ДНК-цитометрические характеристики (плоидность) больных раками молочной железы, головы и шеи, легкого и толстой кишки человека.

4. Сопоставить полученные показатели плоидности опухолей с клиническими (стадия заболевания, распространенность процесса, наличие местных и отдаленных метастазов, сроки послеоперационного рецидивирования и метастазирования, сроки выживаемости и др.) и патоморфологическими (форма роста, степень дифференцировки и др.) данными.

5. Сопоставить данные ДНК-цитометрии с клинической эффективностью примененного лечения (химиотерапия, лучевая или комбинированная терапия).

6. Провести многофакторный анализ и определить значимость ДНК плоидности в прогнозе изученных раков человека.

Научная новизна. Впервые в пределах РФ и СНГ разработаны новый алгоритм и программа анализа ДНК-цитометрических данных, позволяющие максимально близко к реальному вычислить в популяции долю ДНК синтезирующих клеток, выделить статистически значимо различающиеся субпопуляции, в едином стандарте охарактеризовать их плоидность.

Впервые с помощью разработанного алгоритма и программы были изучены ДНК-цитометрические характеристики и классифицированы по плоидности новообразования молочной железы, головы и шеи, легкого и толстой кишки.

Впервые путем сопоставления полученных на основе разработанного алгоритма ДНК-цитометрических данных с материалами историй болезни и многофакторного анализа полученных данных определена клиническая значимости ДНК-плоидности в изученных опухолях. Показано, что ДНК-плоидность является одним из высокозначимых информативных прогностических признаков среди других клинических и морфологических критериев прогноза. Анеуплоидия опухоли является неблагоприятным показателем в прогнозе изученных нами новообразований.

Практическая значимость. Разработанный алгоритм и программа озволяет более точно классифицировать изучаемые новообразования по плоидности, что повышает уровень воспроизводимости прогноза. ДНК-плоидность является показателем биологических особенностей изученных нами раков человека.

Наши исследования показали, что анеуплоидные раки протекают в 2-3 раза более агрессивно, чем диплоидные. Плоидность ДНК изученных нами новообразований является важным и независимым, статистически значимым прогностическим фактором. В практической деятельности необходимо учитывать значения ДНК-плоидности при выборе метода лечения и последующих наблюдениях за пациентами.

Практическое использование ДНК-плоидности способствует выделению групп, нуждающихся в более интенсивном лечении, а также поможет оценке эффективности различных вариантов адьювантного и неадью-вантного лечения больных различными опухолями.

Публикации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на Республиканских и международных конференциях. По итогам исследований в журналах, сборниках и материалах конференций опубликовано 50 работ.

выводы

1. Проточная ДНК-цитометрия позволяет исследовать такую биологическую характеристику, как плоидность опухолевых клеток, то есть содержание ДНК в преобладающем классе клеток. Классификация опухолей по плоидности разделяет их на диплоидные и анеуплоидные. Изучена ДНК плоидность 654 опухолей - 280 раков молочной железы, 206 опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани, 96 раков легкого и 72 колоректальных рака. При раках молочной железы и легкого анеуплоидные опухоли встречались чаще (60,0% и 80,0%), чем диплоидные. Среди изученных опухолей слизистой оболочки полости рта и гортани и при колоректальных раках диплоидные варианты встречались чаще (60,6% и 58,3%), чем анеуплоидные.

2. ДНК-плоидность не только не противоречила принятым морфологическим факторам прогноза, но была однозначна с ними и часто превосходила их по частоте совпадений и достоверности при прогнозе рецидивов регионарных метастазов и продолжительности жизни при раках изученных локализаций.

3. ДНК-плоидность (анеуплоидия) коррелировала с отсутствием эстро-геновых рецепторов при раке молочной железы. Анеуплоидные ре-цепторотрицательные РМЖ имели худшую выживаемость по сравнению с диплоидными рецепторположительными новооборазованиями.

4. Анеуплоидные опухоли являются неблагоприятным фактором прогноза при раках молочной железы, слизистой оболочки полости рта и гортани, легких и колоректальных раках. Частота рецидивов и метастазов изученных анеуплоидных опухолей в 2-4 раза выше, чем при диплоидных опухолях, а сроки их появления в 2 раза меньше. Сроки и вероятность появления рецидивов и местных метастазов, как и выживаемость больных находилась в прямой связи с ДНК-плоидностью опухолевых клеток, имеющей свойства независимого прогностического признака.

5-летняя выживаемость при анеуплоидных новообразованиях молочной железы, слизистой оболочки полости рта и гортани, легких и при колоректальных раках составила 44,2%; 24,0%; 45,6% и 53,0%, при диплоидных - 73,2%; 92,9%; 74,5% и 70,0%. 10-летняя выживаемость анеуплоидных новообразований (кроме раков легкого) была 38,2%; 8,0% и 28,0%, диплоидных - 63,4%; 74,7% и 59,0%. Продолжительность жизни больных анеуплоидными опухолями была в 1,5-4 раза короче, чем у больных диплоидными карциномами. В результате проведенного многофакторного анализа клинических и лабораторных данных выявлена первостепенная прогностическая значимость и независимость ДНК-плоидности при раке слизистой оболочки полости рта и гортани и при колоректальных раках. При раках молочной железы прогностическая значимость ДНК-плоидности следовала на втором месте за стадией заболевания.

При планировании лечения больных изученных новообразований необходимо учитывать данные ДНК-цитометрии. При анеуплоидных карциномах, учитывая неблагоприятный прогноз, целесообразна дополнительная терапия, направленная на предупреждение возникновения рецидивов и метастазов.

ДНК-цитометрическое прогнозирование течения опухолевого процесса позволит формировать группы повышенного риска раннего рецидивирования и метастазирования среди больных анеуплоидными карциномами.

и III стадией (84 больных) заболевания, наблюдавшихся 4 года, установили, что пациенты диплоидными опухолями показали лучшую безрецидивную выживаемость (р=0,013) и общую выживаемость (р=0,021) по сравнению с больными анеуплоидными опухолями. Авторы отметили, что для пациентов диплоидными опухолями II стадии 5-летняя выживаемость составила 97%. В то же самое время в ряде работ приводятся данные о том, что ДНК плоидность не оказывает влияния ни на продолжительность жизни, ни на длительность безрецидивного периода [Ando и соавт., 1994, Tang и соавт., 1995, Tonouchi и соавт., 1998; Salud и соавт., 2000]. Так, Enker и соавт., (1991), изучая содержание ДНК и пролиферативную активность в 176 колоректальных карциномах (срок наблюдения 5,6 лет) не обнаружили корреляции между содержанием ДНК и продолжительностью жизни больных. Такие же выводы сделали Deans и соавт., (1993). При изучении плоидности ДНК у 312 больных не было выявлено корреляции плоидности с прогнозом ни при одновариантном (р=0,06), ни при многовариантном анализе. На основании анализа полученных результатов авторы сделали заключение о том, что только гистологические показатели являются определяющими в прогнозировании течения злокачественных опухолей толстой и прямой кишок. К аналогичным выводам пришли Bianchi и соавт., (1993) при изучении прогностической значимости ДНК-плоидности. Было показано, что ни плоидность ДНК, ни индекс ДНК, ни доля клеток в S-фазе клеточного цикла не имеют прогностического значения при колоректальных раках. Bottger и соавт., (1993) при изучении плоидности ДНК методом имидж-цитометрии у 137 пациентов, не выявили корреляции данного параметра с длительностью безрецидивного периода. Yamazoe и соавт., (1994) провели изучение плоидности ДНК у 330 пациентов первичными колоректальными аденокарциномами и сравнили полученные данные с известными клинико-патологическими характеристиками. При проведении многофакторного анализа по Коксу 10 клинических прогностических факторов ДНК-плоидность по информативности занимала четвертое место, после таких факторов как степень поражения лимфоузлов, уровеня клеточной дифференцировки и степени инвазивного роста. Проведенный анализ показал, что плоидность ДНК является одним из 5 значимых прогностических факторов определяющих течение опухолевого процесса при данной локализации опухоли. Изучение выживаемости по Mantel-Haenszel не выявило статистически достоверной разницы между продолжительностью жизни пациентов диплоидными и анеуплоидными опухолями. В итоге было сделано заключение о том, ДНК плоидность не является существенным прогностическим фактором и его не стоит принимать во внимание с основными гистопатоло-гическими данными для лучшего прогнозирования исхода заболевания.

Yamamoto и соавт., (1998) при исследовании 230 образцов опухолевых тканей больных колоректальными карциномами не выявили существенного различия в выживаемости пациентов диплоидными или анеуплоидными опухолями (р=0,322). Однако отметили, что у пациентов с высоким индексом ДНК выживаемость была меньше.

4.4.1.6. Индекс ДНК и прогноз при раке толстой кишки

Многие исследователи, занимающиеся изучением клеточно-кинетических параметров в опухолях считают индекс ДНК (ИДНК), более информативным признаком по сравнению с разделением опухолей на диплоидные и анеуплоидные [Harlow и соавт., 1991; Tomita и соавт., 1993; Tomoda и соавт., 1993; Grigolato и соавт., 1994; Yamamoto и соавт., 1998].

Harlow и соавт., (1991) исследуя ИДНК в образцах парафиновых срезов аденокарциномы кишечника в стадии С по Дюксу показали, что ИДНК менее 1,2 является благоприятным прогностическим признаком. Tomoda и соавт., (1993), анализируя значение ИДНК в прогнозировании течения рака прямой и ободочной кишок, показали, что больные, имеющие ИДНК более 1,6, характеризуются более коротким периодом выживания по сравнению с больными, имеющими ИДНК менее 1,6. На основании этого ими было сделано заключение, что ИДНК представляет более важную прогностическую информацию по сравнению с плоидностью ДНК у больных после удаления злокачественной опухоли. Tomita Masao и соавт., (1993) исследовали плоидность ДНК в опухолевых клетках 226 больных колоректальным раком и отметили снижение доли диплоидных раков по мере прогрессии опухолей. Увеличение индекса ДНК более 1,5 указывало на неблагоприятный прогноз раков указанной локализации.

По наблюдениям Pandrea и соавт., (1995) ИДНК коррелировал со стадией, но не был связан с локализацией и гистологической формой опухоли. Kimura и соавт., (1996) пришли к заключению, что ИДНК следует считать важным прогностическим фактором у 412 больных данной патологией. Особенно низкая выживаемость и частое рецидивирование было отмечено в анеуплоидных опухолях с ИДНК более 1,5.

Yamamoto и соавт., (1998) отметили, что ИДНК с учетом стадии процесса может служить прогностическим показателем выживаемости 230 больных колоректальными карциномами. Выживаемость была достоверно ниже у пациентов с высоким ИДНК (>1,5), чем у больных с низким ИДНК (<1,5) (р=0,004). Tomoda и соавт., (1998) провели сравнительное изучение плоидности ДНК, ИДНК и их влияния на выживаемость 201 пациента колоректальными раками. Средний ИДНК составил 1,42. Рецидив был диагностирован у 30 пациентов (14,9%). Проведенный многофакторный анализ установил, что ИДНК, в отличие от плоидности опухоли, является более значимым прогностическим критерием длительности безрецидивного периода. Пациенты с ИДНК больше, чем 1,4 имели более короткий безрецидивный период, чем с ИДНК меньше чем 1,4 (р<0,001), особенно в стадии С по классификации Дюкса (р=0,0033).

К прямо противоположным выводам пришли Bianchi и соавт., (1993). При изучении прогностической значимости ИДНК у 34 больных колоректальными раками был сделан вывод о том, что ни плоидность ДНК, ни индекс ДНК, ни доля клеток в S-фазе клеточного цикла не имеют прогностического значения при опухолях данной локализации.

4.4.1.7. Пролиферативная активность и прогноз колоректального рака

Многие исследователи, изучающие клеточно-кинетические изменения в колоректальных карциномах, рассматривают долю клеток в фазе S клеточного цикла или сочетание этого параметра с плоидностью или индексом ДНК как более значимые прогностические факторы при раках данной локализации. Все предложенные к настоящему моменту математические модели обработки получаемых гистограмм в конечном итоге сводятся к вычленению из общего числа клеток обследованной популяции количества клеток находящихся в G 0\1 и G2+M фазах клеточного цикла. Современные проточные системы, как правило, уже выпускаются со встроенными программами обработки ДНК гистограмм. В виду того, что разными исследователями применяются различные алгоритмы обработки ДНК-гистограмм, данные расчета доли S-фазных клеток могут значительно отличаться друг от друга. Расхождения при определении величины клеточных фракций при этом могут составлять от 10% до 20% и более. В отдельных измерениях величина ошибки для фракции GO/1 может составлять более 40%. Показателем точности единичного измерения является низкое значение коэффициента вариации фракции клеток в GO/1 фазе клеточного цикла (максимальный пик).

Пролиферативную активность клеток опухоли, оцененную по доле клеток в S фазе клеточного цикла, рассматривают как высокоинформативный признак, характеризующий агрессивное поведение злокачественной опухоли. Однако большинство авторов не считают его независимым прогностическим фактором, а связывают его с анеуплоидией ДНК. Установлено, что доля клеток в периоде S значимо выше в анеуплоидных опухолях [Hiddemann, 1989; Agnano и соавт., 1993; Cascinu и соавт., 1998]. По данным разных авторов пропорция S-клеток в диплоидных и анеуплоидных раках сильно различается.

Так по данным Giaretti и соавт., (1989) средняя доля клеток в периоде S для анеуплоидных опухолей составляет 13,6% , в то время как для диплоидных опухолей этот показатель равен 1,2%. По наблюдениям Salud и соавт., (1999); Flati и соавт., (1990) доля клеток в фазе S клеточного цикла для анеуплоидных раков составляла 20%> - 33%>, а при диплоидных раках эта доля не превышала 9-17%>. По наблюдениям Sampedro и соавт. (1999) доля S фазных клеток для диплоидных и анеуплоидных колоректальных раков составила 12% и 16,9%.

Общепринято мнение о том, что анеуплоидные опухоли с высоким содержанием клеток в S фазе характеризуются быстрой прогрессией, ранним метастазированием, большей частотой возвратов заболевания [Зубрихина, 1990; Demirer, 1995]. По данным Harlow и соавт., (1991) больные опухолями с низкой пролиферативной активности имели большую продолжительность жизни, чем больные опухолями с умеренной или высокой пролиферативной активностью. По выводам, сделанным в работе Grigolato и соавт., (1994), изучившими пролиферативную активность в 30 образцах аденокарцином толстой кишки, диплоидные опухоли с высоким содержанием клеток в S-фазе могут предсказать группу риска с возможной генерализацией процесса. По данным Чистяковой и Зубрихи-ной, (1998) на основании изучения плоидности у 67 больных раком прямой и ободочной кишок 5-летняя выживаемость была четко связана с типом ДНК-гистограммы. Наилучшие показатели были отмечены в случае диплоидной опухоли с низкой пролиферативной активностью. Авторы пришли к заключению, что выживаемость больных зависит в большей степени от уровня пролиферативной активности, чем от плоидности опухоли. К такому же выводу пришли Venkatesh и соавт.,(1994), анализируя данные 248 пациентов колоректальным раком.

По их наблюдениям сочетание анеуплоидности с высоким содержанием клеток в S фазе более 20% указывало на неблагоприятный прогноз, чем исследование только плоидности (р=0,00003). Выживаемость больных анеуплоидными опухолями с высокой долей клеток в фазе S клеточного цикла (более 20%) была в 3,7 раз ниже, чем при анеуплоидных опухолях с низкой пролиферативной активностью. Работа Sumpedro и соавт., (1999) подтверждает полученные предыдущими авторами данные на 88 больных колоректальными раками. Больные анеуплоидными опухолями рецидивировали достоверно чаще, чем больные диплоидными новообразованиями (36,9% и 26,1%). При рассмотрении безрецидивного периода было замечено, что диплоидные опухоли с высокой долей S-клеток вели себя как анеуплоидные. На основе полученных результатов выявлено два профиля гистограмм. Прогностически благоприятным профилем признано сочетание диплоидной опухоли и низкой доли S-клеток. Прогностически неблагоприятным было сочетание диплоидной опухоли с высоким содержанием S-клеток и все анеуплоидные опухоли. Последние позволяли различать больных с высоким риском рецидива. Pinto и соавт., (1997) проведя изучение ДНК плоидности и фракции клеток в S-фазе на замороженных образцах, полученных от 61 пациентов колоректальным раком, обнаружили корреляцию между значениями доли клеток в S-фазе и гистологической формой (р<0,0016), поражением лимфоузлов (р<0,0007), наличием отдаленных метастазов (р<0,0001), стадией опухоли (р<0,0001), венозной инвазией (р<0,0002), и инвазией лимфатических сосудов (р<0,01). Не было обнаружено связи с периневральным ростом и инфильтрацией новообразования через стенку кишки. На основании полученных результатов авторы пришли к выводу, что проточноцитометрический анализ плоидности ДНК и определение доли клеток в S-фазе клеточного цикла являются полезными параметрами для биопатологической оценки колоректальных опухолей. Анеуплоидия и высокая пролиферативиая активность, коррелированная с гистопатологиче-скими особенностями, определяя агрессивный характер поведения опухоли и высокую потенцию к рецидиву заболевания. Cosimelli и соавт., (1998) при изучении доли клеток в S-фазе у 120 больных выявили, что при содержании клеток в S-фазе более 17,3% результаты 5-летней безрецидивной выживаемости были хуже, чем при значениях S-фазы ниже 17,3% (44,5% против 85,2%о соответственно; р=0,03). В работе Buglioni и соавт., (1999) проведен многофакторный анализ корреляции между биопатологическими маркерами р53 и Вс1-2, характеризующими агрессивность опухоли, и ДНК-плоидности на материале 171 колоректального рака. Выявлено 2 клинико-биологичес-ких профиля. Первый характеризовался отсутствием накопления р53, экспрессией Вс1-2,диплоидией, низким процентом S-фазных клеток, А-В стадией по Дюксу, высокодифференцированными опухолями и отсутствием рецидивов. Второй соединял следующие показатели - накопление р53, отсутствием экспрессии Вс1-2, анеуплоидией, высоким процентом S-фазных клеток, C-D стадией по Дюксу, плохо дифференцированными опухолями и рецидивами. Общая и безрецидивная выживаемость были лучше в первом варианте. Авторы пришли к заключению, что добавление биологических маркеров р53 и Вс1-2 в сочетании с определением ДНК плоидности может быть полезным для выявления больных с высоким риском рецидивирова-ния, особенно на ранних стадиях для проведения адьювантной терапии.

Работ, в которых бы отрицалась прогностическая значимость определения доли клеток в S-фазе клеточного цикла немного. В исследовании Bianchi и соавт., (1993) при ретроспективном анализе 34 пациентов коло-ректальными опухолями был сделан вывод, отрицающий прогностическую значимость ДНК-плоидности, индекса ДНК, доли клеток в S-фазе клеточного цикла в течении опухолей данной локализации.

Подводя итог обзору литературы, следует отметить, что, несмотря на достаточно обширный накопленный экспериментальный и клинический материал, до сих пор не существует единого мнения о прогностической значимости изучения ДНК плоидности и пролиферативной активности в злокачественных опухолях данной локализации, не определена роль этих факторов в выработке плана лечебных мероприятий.

4.4.2. Анализ и сопоставление ДНК-цитометрических данных с клиническими факторами прогноза при раке ободочной и прямой кишки (результаты собственных исследований)

4.4.2.1 Контингент обследованных

Анализируемую группу составили 72 больных злокачественными опухолями прямой и ободочной кишки, находившимися на лечении в Отделении проктологии Института клинической онкологии Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина РАМН с 1983 по 1986 гг.

Соотношение женщин и мужчин в группе обследованных больных было примерно одинаковым и составило соответственно 52,8% и 41,2%. Большинство обследованных больных было в возрасте от 50 до 69 лет - 54 человека (75%). Лиц моложе 49 лет было 12 человек (16,7%), больных в возрасте старше 70 лет - 6 человек (8,3%).

Все 72 пациента были подвергнуты хирургическому или комбинированному лечению. Объем оперативного вмешательства соответствовал локализации патологического очага. Окончательное определение стадии распространенности опухолевого процесса проводилось на основании данных полученных во время оперативного вмешательства и сопоставления их с результатами морфологического исследования удаленного операционного материала. При определении стадии заболевания пользовались общепринятой в нашей стране классификации колоректальных карцином согласно методическим указаниям Ученого совета Министерства здравоохранения (1956).

Распределение больных в соответствии со стадией опухолевого процесса представлено в диаграмме 3.

Диаграмма 3

Распределение больных в зависимости от стадии опухолевого процесса

Па

38

18

11

116

Ша

Шб

IV

Основная масса больных, 56 человека (77,8%), была оперирована в Ша и Шб стадиях заболевания. Из них количество больных в стадии Ша, т.е. без наличия метастазов в регионарных лимфоузлах, было в 2 раза больше, чем число больных с их поражением (стадия III6) и составило 52, 8% и 25,0% соответственно (38 и 18 человек). С IV стадией заболевания было 11 человек (15,3%о). Больные в стадии Па и 116 были представлены группой состоящей из 5 человек, что составило 6,9 % от общего количества пациентов.

Определение принадлежности опухоли к той или иной гистологической форме проводилось в соответствии с современной Международной гистологической классификацией опухолей тонкой и толстой кишки (ВОЗ,

1976 г.). Подавляющее число опухолей носило строение аденокарциномы 66 больных (89,2%). Перстневидно-клеточный рак был отмечен лишь в одном наблюдении (1,4%). Муцинозная аденокарцинома была выявлена у 5 больных, что составило 6,8%.

Высоко дифференцированные опухоли были выявлены у 31 (43,0%) больного, среднедифференцированные у 29 (40,3%), низкодифференциро-ванные у 12 (16,7%) больных (диаграмма 4).

Диаграмма 4

Распределение колоректальных опухолей в зависимости от уровня дифференцировки

50,0%

40,0%

30,0%

20,0%

10,0%

0,0%

40,3% г

1 Ь,/7о

L т

43,0% низкодиф. среднедиф. высокодиф.

Уровни дифференцировки

Как видно из диаграммы, частота опухолей с высокой и средней степенью дифференцировки была примерно одинаковой и составила соответственно 43,0%о и 40,3%. Низкодифференцированный рак был выявлен у 16,7 % больных.

Наиболее частой локализацией опухоли была сигмовидная кишка -32 наблюдения. Второй по частоте встречаемости были опухоли правой половины ободочной кишки - 25 случаев (рак восходящей ободочной кишки - 10, рак слепой кишки - 9, рак печеночного угла ободочной кишки - 6). По поводу новообразований прямой кишки было оперировано 3 больных. В 5 случаях был выявлен рак поперечно-ободочной кишки. Распределение больных в зависимости от локализации патологического очага представлено в диаграмме 5.

Диаграмма 5

Распределение больных колоректальным раком в зависимости от локализации опухоли рак сигмовидной кишки 44% рак прямой кишки 4% рак поперечно-ободочной кишки

Т/о рак низходящеи ободочной кишки 10% рак слепой кишки 13% рак восходящей ободочной кишки 22%

В правой половине ободочной кишки опухоли локализовались в 25 случаях, в левой - в 39 случаях. Полученные нами результаты анализа по локализации патологического очага подтверждают установленный факт о более частом повреждении опухолевым процессом левых отделов ободочной кишки.

Все 72 пациента были подвергнуты различным видам оперативного лечения, объем которого определялся локализацией и степенью распространения опухолевого процесса. Данные о характере проведенного лечения проведенного лечения представлены на диаграмме 6.

Распределение больных колоректальным раком в зависимости от характера лечебных мероприятий

56 лт+оп ОП

В комплексе лечебных мероприятий 16 пациентам в предоперационном периоде была проведена дистанционная гамма-терапия (СОД 20-25 Гр.) в режиме «укрупненного фракционирования» при разовой очаговой дозе в 5 Гр с захватом в поля облучения не только зоны расположения опухоли, но и зон регионарного метастазирования. Оперативное вмешательство, во избежание развития ранних лучевых реакций, выполнялось не позднее 1-3 суток после окончания облучения.

Сроки наблюдения за больными в послеоперационном периоде составили 10 лет и более.

Исследование ДНК плоидности проведено у 72 больных колоректальным раком. Диплоидные опухоли были выявлены у 42 больных (58,3%), ане-уплоидия ДНК была обнаружена у 30 больных (41,7%) (диаграмма 7).

Среди анеуплоидных опухолей гипердиплоидные опухоли были у 4 (13,4%) больных, тетраплоидные - у 15 (50%), гипертетраплоидные опухоли наблюдались у 4 (13,4%) пациентов и поликлоновые у 7 (23,3%) больных.

4.4.2.2. ДНК плоидность, пол, стадия заболевания и локализация опухоли

Распределение больных колоректальным раком в зависимости от плоидности анеуплоидные 42% диплоидные 58%

Диплоидные карциномы у мужчин были отмечены в 21 (61,8%), анеуплоидные - в 13 (38,2%>) случаев. У женщин диплоидные опухоли и анеуплоидные опухоли отмечались в 57,3%о и 42,3% случаев. На основании этого нами было сделано заключение об отсутствии связи ДНК-плоидности с полом больных.

При исследовании связи плоидности со стадией заболевания (таблица 18) обнаружено преобладание диплоидных опухолей над анеуплоид идными у больных в стадии Ilia - 25 (65,8%) против 13 (34,2%). Однако, по мере прогрессии заболевания, в стадии Шб, т. е. при наличии поражения регионарных лимфоузлов было выявлено нарастание частоты анеуп лоидных опухолей по сравнению с больными в предыдущей группе. Анеуплоидные опухоли в Шб стадии были отмечены в 61,1% случаев, диплоидные опухоли отмечены у 38,9% больных. У больных IVa стадией заболевания диплоидные опухоли отмечены у 57,1%, анеуплоидные - у 42,9% больных.

Анализ распределения содержания ДНК в зависимости от локализации опухоли показало, что для правой половины толстого кишечника характерны диплоидные опухоли. Диплоидные новообразования при данной локализации были обнаружены в 60-66,7%>%о, в то время как анеуплоидные в 32,3%>-40,0% случаев. Опухоли левой половины толстой кишки по плоидности распределялись примерно одинаково. Диплоидные опухоли были диагностированы у 50,0-57,1 %% больных, анеуплоидные - у 42,9-50,0%о%