Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Противовирусные и иммунотропные свойства новых производных аденина

У

На правах рукописи

0034Э Ю58

НЕСМИЯНОВ ПАВЕЛ ПАВЛОВИЧ

ПРОТИВОВИРУСНЫЕ И ИММУНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АДЕНИНА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 1 ЯНВ 2010

Волгоград-2010

003491058

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Петров Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Островский Олег Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Дубина Диляра Шагидуллаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится 17 февраля 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета (400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1)

Автореферат разослан «_»_20 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук,

профессор А. Р. Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема заболеваемости вирусными инфекциями приобретает в настоящее время все большую клиническую значимость. Показано, что в этиологии многих заболеваний лежат именно вирусные инфекции [Appel G., 2007; Merson M. H., 2006]. Среди них немаловажное место занимают вирусы семейства Herpesviridae и ретровирусные инфекции (ВИЧ-1,ВИЧ-2). Часто протекающие в латентной форме инфекции Herpesviridae становятся огромной проблемой у иммунокомпроменти-рованных пациентов, например, у пациентов трансплантологических отделений, подвергающихся иммуносупрессивной терапии[ВЫг С., 2008; Patel R., 1997; Hartmann А., 2006; Toyoda M., 2005; Boubenider S., 1999; Sageda S., 2002].

Клиническое течение ВИЧ-инфекции приводит к развитию иммунодефи-цитного состояния, последствиями которого является сопутствующая симптоматика, приводящая в итоге к летальному исходуЦТокровский В. В., 2002]. Известно несколько групп препаратов, целенаправленно воздействующих на различные этапы жизненного цикла вирусов [De Clercq Е., 2001, 2002]. Однако все препараты обладают рядом нежелательных эффектов, среди которых выработка у вируса лекарственной устойчивости. В связи с этим, особенное значение в современной фармакологии приобретает разработка новых противовирусных препаратов, по возможности обладающих иммуномодулирующим действием (в случае пациентов отделений трансплантологии это действие должно быть направлено на подавление иммунного ответа на трансплантаты; в случае ВИЧ-инфекции необходимо иммуностимулирующее действие для компенсации нарушенных функций иммунной системы). Хорошую репутацию в клинической практике заслужили противовирусные препараты на основе аналогов нуклеозидов, механизм действия которых основан на блокировании активности ферментов транскрипции и репликации вирусных нуклеиновых кислот [De Clercq Е., 2001, 2002]. Поэтому разработка противовирусных средств этой группы представляется перспективной.

Ряд новых соединений - производных аденина - синтезирован недавно в Волгоградском научном центре РАМН [Озерова Т. П., 2006; Петров В. И., 2003, Петров В. И., 2006]. Это структурные аналоги аденина: VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29. Предполагается, что данные соединения обладают способностью ингибировать репликацию и обратную транскрипцию вирусных нуклеиновых кислот, что делает их перспективными в качестве противовирусных агентов. Кроме того, представляется актуальной оценка аналогов нуклеозидов как иммунотропных средств, обладающие способностью регулировать функции компонентов иммунной системы в необходимом направлении - с целью подавления либо с целью активизации иммунного ответа в ряде патологических состояний.

Цель исследования

Теоретически обосновать возможность применения новых производных аденина в качестве противовирусных и иммуномодулирующих средств, предварительно изучив влияние их на процессы транскрипции, репликации, полимери-

зации ДНК и обратной транскрипции с РНК, а также оценив влияние соединений на функциональную активность клеток иммунной системы.

Основные задачи исследования

1. Оценить влияния веществ VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 на полимеризацию ДНК и обратную транскрипцию в стандартной системе для полимеразной цепной реакции.

2. Исследовать противовирусного действия соединений in vitro на модели человеческих лимфоцитов от зараженных ВИЧ пациентов.

3. Исследовать влияния соединений на экспрессию активационных маркеров Т-лимфоцитами и синтез цитокинов при поликлональной, антигеннеспецифи-ческой стимуляции, либо без таковой.

4. Изучить влияние веществ на формирование гуморального иммунитета

крыс.

5. На основе полученных характеристик выбрать соединения, имеющие оптимальный спектр активности для практического использования.

Научная новизна

В работе разработана модель для оценки влияния веществ VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 на полимеризацию ДНК и обратную транскрипцию в стандартной системе для полимеразной цепной реакции. Для этих веществ впервые определены их иммуномодулирующие свойства и противовирусная активность. Впервые проведена сравнительная оценка веществ и выбраны новые соединения, имеющие оптимальный спектр противовирусной и иммуномодулирующей активности для практического использования. Впервые предложена гипотетическая модель, объясняющая механизм иммуномодулирую-щего действия новых производных аденина.

Практическое значение и реализация результатов исследования

Полученные данные дают возможность яснее понять механизмы, лежащие в основе иммуномодулирующего действия аналогов аденина. Установлено, что исследованные соединения обладают иммуномодулирующей активностью. Результаты, полученные при выполнении данной работы, позволяют обосновать использование данных соединений для ряда патологических состояний: при аутоиммунной патологии, ТЬ2-опосредованной аллергической патологии, вирусных инфекциях, а также в профилактике посттрансплантационных осложнений. Полученные результаты могут стать основой дальнейших исследований с целью получения новых противовирусных соединений, обладающих иммуномодулирующим действием.

Результаты проведенного исследования внедрены в учебные планы и излагаются на лекциях и практических занятиях на кафедре иммунологии и аллергологии, кафедре клинической фармакологии и интенсивной терапии с курсом аллергологии и иммунологии ФУВ, кафедре инфекционных болезней ВолГМУ.

Положения, выносимые на защиту

1. Соединения VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 обладают дозозависимым противовирусным действием, связанным с ингиби-рованием обратной транскрипции РНК и полимеризации ДНК.

2. Соединения VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 обладают иммуномодулирующим эффектом, ингибируют активацию Т-лимфоцитов и стимулируют фагоцитарную и бактерицидную функцию нейтро-филов. Иммуномодулирующая активность соединений связана, в частности, с изменением спектра цитокинов, секретируемых Т-лимфоцитами и клетками фагоцитарной системы. Соединения VMA-03-01 и VMA-01-21 способны подавлять синтез антиген-специфических антител in vivo.

3. Наиболее перспективными соединениями для применения в качестве противовирусных средств, обладающих иммунотропными свойствами по результатам исследования являются VMA-03-01 и VMA-01-21. В возможный спектр клинического применения соединений входят аутоиммунная патология, ТЬ2-опосредованная аллергическая патология, посттрансплантациощше состояния, вирусные инфекции. Изученные соединения имеют хороший шанс пополнить арсенал оригинальных отечественных противовирусных и иммуномодулирующих средств

Апробация работы

По теме диссертационной работы опубликовано 3 печатные работы, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК. Основные результаты работы представлены на объединенном иммунологическом форуме -2008 (Санкт-Петербург, 30 июня - 5 июля 2008 г.), XII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 13-16 ноября 2007 г.), а также на ежегодных научных сессиях Волгоградского государственного медицинского университета (2007-2009 гг.).

Объем н структура диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, главы, посвященной результатам собственного исследования, обсуждения результатов и выводов. Работа проиллюстрирована 11 рисунками и 30 таблицами. Библиографический указатель включает 191 источник, в том числе 22 отечественных и 169 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Получение соединений. Производные аденина синтезированы в Волгоградском научном центре РАМН по оригинальной методике [Озерова Т. П., 2006; Петров В. И., 2003, Петров В. И., 2006].

Приготовление и характеристика образцов соединений. Полученные соединения разводились перед проведением экспериментов в диметилсульфоксиде в требуемых концентрациях.

Животные. Экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с Методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента» (1987), а также с соблюдением правил гуманного обращения с живот-

ными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001). Эксперименты проведены на беспородных крысах, полученных из питомника НИИ фармакологии РАМН. Использованы крысы-самцы массой 200-240 гр. в возрасте 4 мес. Животные содержались в неполной барьерной системе при световом режиме 12:12 на стандартной диете (гранулированный корм), получали кипячёную питьевую воду, подкисленную до рН 4-5. Опытная и контрольные группы животных были одного возраста, пола, массы, одного питомника и содержались в одинаковых условиях. Исследуемые вещества вводились внутрибрюшинно в'терапевтической дозе 100 мкг [Лебедева С. А., 2006; Хабриев Р. У., 2005] ежедневно в течение 3-х дней до иммунизации и 3 дней после введения эритроцитов животным.

Иммунизация эритроцитами барана ОБ). Суспензию ЭБ предварительно трижды отмывали ФР, подсчитывали их количество и в объеме 0,2 мл внутрибрюшинно вводили по 5x10s клеток.

Взятие крови у животных. Забор крови у экспериментальных животных производили при ампутации кончика хвоста п од эфирным наркозом [ Hem А ., 1998].

Определение титра антител в сыворотке крови в реакции агглютинации. Для этого на 14-е сутки после иммунизации ЭБ у животных забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку титровали в 96-луночном планшете с шагом 'Л, добавляли ЭБ, инкубировали при 37°С 2 часа и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдалась агглютинация.

Взятие крови у людей. Кровь для исследования брали из вены в первой половине дня, натощак, до приема медикаментов и принятия лечебных процедур. В качестве антикоагулянта использовали гепарин, из расчета 35-45 ед. гепарина на 1 мл крови.

Выделение мононуклеаров из периферической крови человека. Жидкость для сепарации клеток (фиколл-урографин) с плотностью 1,077 помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали гепаринизированную кровь). После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо в растворе. Полученные клетки отмывали раствором Хенкса, ресуспенди-ровали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность.

Условия культивирования человеческих лимфоцитов. Клетки культивировали в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma») с добавлением 10% ауто-логичной сыворотки, 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глютамина («Sigma»). Культивирование проводили при 37°С в атмосфере с 7% С02 и абсолютной влажности 95% в присутствии соединений в диапазоне концентраций от 90 до 900 мкг/мл. В качестве контроля использовались как интактные клетки, так и ДМСО (контроль растворителя). Через 48 часов собирали супернатант и клеточный осадок.

Оценка влияния веществ на обратную транскрипцию РЖ и репликацию ДНК в системе in vitro. Противовирусные свойства соединений были исследованы в субгеномной репликационной системе на модели полимеразной цепной реакции. Для этой цели применялись коммерческие тест-системы производства «Ли-

тех» (Россия) для качественного определения Chlamydia trachomatis (детекция методом электрофореза), позволяющие оценить неспецифическое влияние соединений на процессы синтеза ДНК с участием Taq-полимеразы. Кроме того, использовали тест-системы «Амплисенс-ВИЧ-Монитор», позволившие произвести количественный анализ и оценить влияние веществ на этап обратной транскрипции РНК ВИЧ. Влияние веществ оценивали, внося их в смесь для амплификации положительного контрольного образца в конечных концентрациях 2, 5,10 мМ, соответствующих концентрациям нуклеогидов в ПЦР-смеси (в целях создания равных условий для конкуренции нуклеотидов за сайт связывания при транскрипции).

Оценка влияния соединений на продукцию вирусных белков и РНК in vitro в культуре лимфоцитов

Для исследования возможности применения культурального метода в оценке влияния соединений VMA-99-82, VMA 99-56, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 на продукцию вирусных белков и РНК использовались человеческие лимфоциты периферической крови. Отбор крови производился у ВИЧ-инфицированных пациентов, находящихся на диспансерном учете в ГУЗ ВО ЦПБ СПИД ИЗ. Для оценки нахождения вируса ВИЧ, как в супернатанте, так и внутри клеток, применяли метод твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) для определения антигена р24, с использованием коммерческой тест-системы "ДС-ИФА-ВИЧ-АГ-СКРИН" («Диагностические системы», Россия). Концентрацию вирусных РНК ВИЧ в супернатанте и внутри клеток определяли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческих тест-систем Real Time ПЦР HIV-1 (Abbot, США).

Определение количества IL-4. IL-10. IL-12. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммуно-ферментным методом при помощи тест-систем («Biosource», Invitrogen, США) согласно прилагаемым протоколам.

Влияние соединений на активацию лимфоцитов. Иммунотропное влияние веществ было оценено in vitro по количеству СОЗ+клеток, экспрессирующих маркеры ранней и поздней активации (CD69 и CD25 соответственно) после инкубации с веществами в присутствии митогена ФГА в культуре человеческих лимфоцитов, полученных от здоровых доноров. Для мечения клеток использовали мышиные антитела к CD3, CD25, CD69 человека, конъюгированные с флюорохро-мами FITC, РЕ («IOtest», Beckman Coulter, США) согласно прилагаемым методикам, после чего регистрировали результаты на проточном цитофлюориметре FC500 (Beckman Coulter, США).

Влияние соединений на функциональную активность нейтрофилов. Исследовали изменения показателей фагоцитарной функции (поглощение дрожжевых частиц) и микробицидных систем (тест с нитросиним тетразолием) в присутствии соединений в диапазоне концентраций от 90 до 900 мкг/мл. В качестве контроля использовались как интактные клетки, так и ДМСО (контроль растворителя).

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента, а для непараметрических выборок - U-критерия Манна-Уитни. Оценка нормальности распределения проводилась на основании W-теста Шапиро-Уилка в совокуп-

ности с визуальной оценкой гистограмм распределения. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка влияния веществ на обратную транскрипцию РНК и репликацию ДНК в системе in vitro.

При анализе электрофореграмм (рис.1) было выявлено, что все соединения, кроме VMA-99-82, обладают ингибирующим действием на процессы транскрипции ДНК, приводя к полной отмене синтеза специфических фрагментов ДНК. Максимальный эффект достигался при концентрации 10 мМ, т.е. наблюдался до-зозависимый характер подавления ДНК-полимеразной активности. По всей видимости, примерно в этой же концентрации соединения способны конкурировать с нуклеотидами, находящимися в реакционной смеси в высокой концентрации (до 40 мМ в совокупности).

1 - отр контроль

2 - отр.контроль

3 - контроль ДМСО

4 - VMA99-56 10 тМ

5 ~ VMA 99-50 5 тМ 6-VMA99-S6 2rnM

7 - VMA 03-01 10 тМ

8 - VMA 03-01 5 тМ в-VMA03-01 2тМ

10 -VMA 01-21 10 тМ

11 -VMA 01-21 5 тМ 12-VMA 01-21 2 тМ

13 - VMA 00-29 10 тМ

14 - VMA 00-29 5 тМ

15-VMA 00-29 2 тМ

16-VMA 99-82 10 тМ 17 - ■ VMA 99-82 5 тМ 18-VMA 99-82 2 тМ

Рисунок 1. Электрофореграмма фрагментов Д11К при действии соединений на этапе амплификации. Позиции 7, 10, 13 - подавление синтеза ДНК соединениями в концентрациях 10 мМ.

Аналогичный эффект наблюдался в тест-системах «Амплисенс-ВИЧ Монитор», причем у соединения УМА-99-82 проявился эффект на этапе обратной транскрипции, в отличие от этапа амплификации, что, вероятно, свидетельствует о несколько ином механизме его действия, нежели у остальных соединений (Таблица 1)

Таблица 1.

Влияние соединений на процессы обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот, Дапные показаны в единицах оптической плотности после проведения реакции гибридизации (М (ш))

Вещество Концентрация, мМ При внесении вещества на этапе обратной транскрипции При внесении вещества на этапе амплификации

Отрицательный контроль (К-) 0,77 (0,12) 0,77 (0,12)

Положительный контроль (К+) 1,56 (0,13) 1,56(0,13)

Контроль с ДМСО 1,77 (0,09) 1,63 (0,14)

VMA-99-5 6 10 мМ 0,60 (0,11)* 0,56 (0,09)*

5 мМ 1,46(0,16) 1,52 (0,15)

2 мМ 1,51 (0,17) 1,48(0,15)

VMA-03-01 10 мМ 0,79 (0,12)* 0,82 (0,09)*

5 мМ 1,18(0,11) 1,31 (0,13)

2 мМ 1,42(0,15) 1,45(0,11)

VMA-01-21 10 мМ 0,29 (0,13)* 0,45(0,11)*

5 мМ 1,16(0,12) 1,22 (0,09)

2 мМ 1,45(0,11) 1,51 (0,20)

VMA-00-29 10 мМ 0,70 (0,12)* 0,49 (0,12)*

5 мМ 1,43 (0,19) 1,45(0,13)

2 мМ 1,47(0,15) 1,50 (0,19)

VMA-99-82 10 мМ 0,29 (0,08)* 1,31 (0,11)

5 мМ 1,42(0,13) 1,38(0,15)

2 мМ 1,46 (0,14) 1,37(0,15)

Примечание: * - отличия от положительного контроля с ДМСО, р<0,05.

По активности угнетения обратной транскрипции вещества распределилсь следующим образом: УМА-01-21 =УМ А-99-82>УМА-99-56> УМА-00-29>УМА-03-01. Значимые отличия наблюдались между веществами УМА-01-21, УМА-99-82 и остальными соединениями. При снижении концентрации до 5 мМ и ниже все вещества в одинаковой мере прекращали проявлять свое действие в отношении подавления обратной транскрипции. На этапе амплификации все соединения, кроме УМА-99-82, ингибировали амплификацию в концентрации 10 мМ, значимых отличий в силе ингибирования между различными соединениями выявлено не было.

Оценка чувствительности ВИЧ к соединениям

Отмечается увеличение вирусной нагрузки в клеточном лизате в присутствии ДМСО по сравнению с контрольными пробами. При стимуляции ФГА, вирусная нагрузка в контроле ДМСО снижается, что можно объяснить способно-

стью ДМСО снижать способность лимфоцитов к бласттрансформации. Одновременно, как известно, ФГА блокирует прикрепление белок gpl20 ВИЧ к рецептору CD4 [Wimer В., 2000], что и отражается в итоговом снижении вирусной нагрузки. Заметно, что в присутствии исследуемых соединений продукция вируса снижается еще более выражено, наиболее ярко данный эффект проявляется в присутствии VMA-03-01 без стимуляции ФГА, и в присутствии VMA-00-29 при стимуляции ФГА (выделены в таблице жирным шрифтом). Высокая вирусная нагрузка, но малое количество CD4-KJiexoK, вероятно, способствовали нарушению жизнеспособности лимфоцитов, которое привело к их апоптозу. Подтвердить данный вывод считается возможным на основании наблюдения увеличения количества антигена р24 в супернатанте. Увеличение концентрации р24 при одновременном снижении вирусной нагрузки свидетельствует о выходе р24 при гибели клеток, и не связано с увеличением продукции вируса. В пользу данного факта говорит и сохранение концентрации р24 в отсутствие стимуляции фитогемагглютинином. Исключение составили пробы в присутствии VMA-00-29, в которых и без стимуляции ФГА уровень р24 в супернатанте был достоверно выше, чем в контроле ДМСО, и составил в среднем 0,152 нг/мл.

Таблица 2.

Влияние соединений в концентрации 180 мкг/мл на продукцию вирусной РНК и бел-

ка р24 ВИЧ в культуре лимфоцитов человека (М (т))

Вещество Стимулятор Вирусная нагрузка, копий/мл Количество р24, у.е.

Контроль 975 0,117

Контроль ФГА 1675,5 0,086

Контроль+ДМСО 3358,5f 0,126

Контроль+ДМСО ФГА 2398,5* 0,083

VMA-03-01 1236,0" 0,122

VMA-03-01 ФГА 1519,5** 0,109**

VMA-01-21 1830,5" 0,123

VMA-01-21 ФГА 1684,0** 0,114**

VMA-00-29 1769,5" 0,152"

VMA-00-29 ФГА , 963,0*,** 0,118**

VMA-99-56 1999,5" 0,120

VMA-99-56 ФГА 1035,0*,** 0,108**

VMA-99-82. 1454,5" 0,123

VMA-99-82 ФГА . . .1203,5*,**: ? одоб** ;

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле с ФГА; ** - значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО и с ФГА (р<0,05).f - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле без ФГА; * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле с ДМСО без ФГА

Оценка влияния веществ на активацию лимфоцитов in vitro В концентрации 90 мкг/мл в реакционной смеси соединения VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-99-56 способствовали снижению количества клеток, экспрес-сирующих CD69 по сравнению с контрольными образцами (Таблица 3). Соединения VMA-00-29 и VMA-99-82 в концентрации 90 мкг/мл не повлияли значимо на

экспрессию CD69 в сравнении с ДМСО. В отношении экспрессии CD25 исследуемые соединения проявили свое действие несколько иначе. VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29, VMA-99-56 почти вдвое снижали экспрессию CD25 на Т-лимфоцитах, в то время, как в присутствии VMA-99-82 по сравнению с контролем (ДМСО) экспрессия CD25 возросла почти в 2 раза, и составила в среднем 21,05% клеток.

При увеличении концентрации исследуемых веществ до 180 мкг/мл наблюдались следующие эффекты. В присутствии соединений VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-99-56 не было выявлено значимых различий по сравнению со значениями в контроле с ДМСО, соединение VMA-00-29 ингибировало экспрессию CD69 по сравнению с чистым ДМСО. В присутствии соединения VMA-99-82 наблюдалось значительное увеличение экспрессии CD69 по сравнению как с ДМСО, так и с «интактными» клетками, стимулированными ФГА (Таблица 4).

Таблица 3.

Влияние соединений в концентрации 90 мкг/мл на экспрессию CD25 a CD69 Т-

лимс юцитамп здоровых доноров, % клеток (М (m))

Вещество Стимулятор % CD25+ клеток <М(т)) % CD69+ клеток <М(т»

Контроль 2,9 (0,02) 3,0 (0,25)

Контроль ФГА 25,1 (2,23) 14,8(2,14)

Коитроль+ДМСО 2,8(0,18) 3,2 (0,35)

Контроль+ДМСО : - ■ ФГА: 12,5 (0.2)* 7,65(1,1)*

VMA-03-01 1,7 (0,13) 5,45 (1,16)

VMA-03-01 ФГА : 7,5(1,15)*,** 2,0(0.34)*,**

VMA-01-21 0,15 (0,03) 4,1 (1,10)

VMA-01-21 • ФГА 6,3(1,11)*,** ' 1,05(0,42)*,**

VMA-00-29 3,15 (0,12) 5,25(1,03)

VMA-00-29 ■■•".'■: • ФГА 7,15(0,18)*,** -: 6,05 (0,20)*

VMA-99-56 2,05(0,18) 2,8(0,11)

VMA-99-56: ФГА 8.52(2.16)* : 3,35 (2,14)*,**

VMA-99-82 2,8(0,11) 3,4 (0,25)

VMA-99-82 ФГА 21.05 (3,23)* . 5,3(0,14)*

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле с ФГА; ** - значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО и с ФГА (р<0,05).

На экспрессию С025 соединения повлияли следующим образом. Все вещества, кроме УМА-99-82, в значительной степени снижали количество клеток, на поверхности которых содержался маркер СБ25, по сравнению с контролем (ДМСО). В присутствии соединения УМА-99-82 экспрессия СБ25 увеличивалась по сравнению с контролем более чем в 2 раза (33,95% по сравнению с 14,8% в контроле). Увеличение концентрации исследуемых веществ до 800 мкг/мл повлекло за собой появление следующих эффектов. В присутствии соединений УМА-03-01, УМА-01-21, УМА-00-29, значимо снижалось по сравнению с контролем (ДМСО) количество клеток, экспрессирующих как СБ69, так и СБ25. В присутствии соединения УМА-99-82 количество клеток, экспрессирующих маркеры активации СБ69 и СБ25 не отличалось от контроля. Заметно, что с увеличением концентрации УМА-99-56 возрастает количество клеток, экспрессирующих СВ69. В концентрации 800 мкг/мл оно перестало отличаться от контроля.

В этом случае, видимо, следует говорить о возможном токсическом действии соединений на лимфоциты; кроме того, в соответствии с увеличением концентрации соединений увеличивалось и количество вносимого в кулыуральную среду ДМСО, который обладает эффектом ингибирования в отношении бласт-трансформации лимфоцитов.

Таблица 4.

Влияние соединений в концентрации 180 мкг/мл иа экспрессию CD2S и CD69 Т-

лимфоцитамн здоровых доноров, % клеток (М (т))

Вешество Стимулятор % CD25+ клеток (М(т)) % CD69+ клеток (М(ю))

Контроль 3,40 (0,11) 3,50(1,13)

Контроль ФГА 23,3 (2,18) 23,35 (2,89)

Контроль+ДМСО 10,15(1,10) 6,15(1,20)

Контроль+ДМСО ФГА 14,8 (3,45)* 8,72(1,41)*

VMA-03-01 7,05 (0,59) 2,95 (0,43)

VMA-03-01 ФГА 7,55 (0,68)*,** 8,25 (1,12)*

VMA-01-21 2,90 (0,33) 2,85 (0,12)

VMA-01-21 ФГА 7,30(1,1)*,** 7,21 (0,68)*

VMA-00-29 3,90(0,15) 3,53 (0,54)

VMA-00-29 ФГА 4,35 (0,98)*,** 3,65 (0,23)*,**

VMA-99-56 3,15 (0,76) 3,62 (0,67)

VMA-99-56 ФГА 3,40 (0,76)*,** 8,51 (0,78)*

VMA-99-82 1,71 (0,42) 5,25 (0,23)

VMA-99-82 ФГА 33,95 (5,56)*,** 31,65*,** (6,12)

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле с ФГА;

** - значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО и с ФГА (р<0,05).

Таблица 5.

Влияние соединений в концентрации 800 мкг/мл на экспрессию С1)25 и С069 Т_лимфоцитами здоровых доноров, % клеток (М (т))__

Вещество Стимулятор % CD25+ клеток (М(ш)) % CD69+ клеток <М(ш»

Контроль 8,75(1,22) 4,8 (0,35)

Контроль ФГА 21,8(2,12) 21,2(3,20)

Контроль+ДМСО 4,2 (0,53) 0,8 (0,12)

Контроль+ДМСО ФГА 6,2(1,42)* . 13,0(2,11)*

VMA-03-01 6,6(1,79) 7,3 (2,35)

VMA-03-01 ФГА 2,9 (0,25)*,** ■ 6,25(0,98)*,**

VMA-01-21 0,12(0,11) 3,4 (0,24)

VMA-01-21 : ФГА 0,21(0,18)*,** 0,14(0,16)*,**

VMA-00-29 0,19 (0,22) 3,75 (0,67)

VMA-00-29 ФГА 4,2(0,58)*,** 0,6(0,35)*,**

VMA-99-56 1,2 (0,98) 3,3 (0,49)

VMA-99-56 ФГА 4,5(0,14)*,** ..... 10,25(1,11)*,**

VMA-99-82 2,8 (0,23) 9,05 (0,85)

VMA-99-82 : ФГА 9,55(1,19)* 9,9(1,84)*

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле с ФГА; ** - значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО и с ФГА (р<0,05).

Оценка влияния веществ на продукцию цитокинов лимфоцитами in vitro

При анализе содержания цитокинов после культивирования лимфоцитов с соединениями в присутствии 90 мкг/мл исследуемых соединений, значимых отличий от контроля (ДМСО) не наблюдалось.

При увеличении в культуральной среде концентрации соединений до 180 мкг/мл наблюдались эффекты, представленные в таблице 6.

Во всех случаях заметно значимое снижение концентрации IL-10 в суперна-танте. Поскольку в присутствии растворителя ДМСО также наблюдаются подобные результаты, можно связать угнетение секреции IL-10 именно с присутствием ДМСО. Только в присутствии VMA-01-21 уровень IL-10 значимо отличался от контроля с ДМСО, составив в среднем 0,41 пг/мл. Эффекты соединений на синтез IL-12 проявились следующим образом. В присутствии ДМСО ФГА-индуцированный синтез IL-12 снизился по сравнению с контролем более чем в 10 раз (104,28 пг/мл). В присутствии исследуемых соединений во всех случаях, кроме VMA-01-21, наблюдалась тенденция к еще более выраженному снижение концентрации IL-12 в супернатанте, однако статистически достоверной разница была только в присутствии VMA-99-56 и VMA-99-82. В присутствии VMA-01-21 концентрация IL-12 была несколько выше по сравнению с контролем ДМСО (143,96 в сравнении с 104,28). На концентрацию IL-4 в супернатанте заметное влияние оказало лишь присутствие VMA-00-29, VMA-99-56, VMA-99-82. В присутствии этих веществ концентрация IL-4 по сравнению с контролем ДМСО значимо снижалась.

Таблица 6.

Влияние соединений в концентрации 180 мкг/мл на снлтез цитокинов Т-лимфоцитами здо-

ровых доноров, пг/мл (Me IQ1-Q3))

Вещество Стимулятор IL-10 IL-12 IL-4

Контроль 52,10 [37,10-411,22] 724,5 [449,12-1023,23] 9,09 [1,31-27,59]

Контроль ФГА 122,32 [74,64-585,24] 1215,00 [92,34-1375,12] 14,12 [1,01-18,38]

Контроль+ДМСО 25,22 [3,55-29,77] 8,77 [0,11-397,13] 11,56 [1,82-35,67]

Котроль+ДМСО . ФГА 15,15 [1,22-17,84]» 104,28 [25,23-1000,01]» 16,11 [1,13-28,18]»

VMA-03-01 0,00 [0,00] 53,06 [4,69-86,73] 11,84 [1,14-37,11]

VMA-03-01 ФГА 0,00 [0,00]» 55,58 [6,57-191,72]* 11,41 [2,59-16,83]»

VMA-01-21 0,00 [0,00] 21,12 [2,57-53,78] 12,71 [2,14-40,37)

VMA-01-21 ФГА 0,41 [0,12-57,94]»,** 143,96 [11,23-293,56]* 12,85 [3,31-22,45]

VMA-00-29 0,21 [0,20-4,04] 4,08 [0,66-191,72] 9,36(1,29-11,37]

VMA-00-29 ФГА 0,00 [0,00]» 51,42 [9,82-979,25]* 9,24 [0,55-29,52]»,»*

VMA-99-56 0,00 [0,00] 3,72 [1,01-19,92] 10,24 [1,22-23,71]

VMA-99-56 ФГА 0,00 [0,00]* 5,67 [0,41-13,72]»,»» 9,31 [1,97-18,11]»,»»

VMA-99-82 0,00 [0,00] 0,00 [0,00] 15,95 [2,13-56,11]

VMA-99-82 ФГА 0,00 [0,00]» 21,00 [12,00-307,22]»,»» 6,97 [1,11-8,87]»,»»

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле с ФГА; ** -значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО и с ФГА (р<0,05).

В концентрации 800 мкг/мл исследуемые соединения более выражено проявили эффекты, описанные с концентрацией 180 мкг/мл. Наблюдалось ингибиро-вание синтеза IL-10 всеми соединениями, исключая VMA-01-21, в присутствии которого уровень IL-10 значительно увеличился в сравнении с контролем ДМСО. В присутствии VMA-01-21 в концентрации 800 мкг/мл значительно увеличивалось содержание IL-10 в супернатанте. Также в концентрации 800 мкг/мкл исследуемые соединения в значительной степени способствовали усилению синтеза IL-12, кроме VMA-99-82 - в его присутствии содержание IL-12 не определяется. Продукция IL-4 также снижена в присутствии всех исследуемых соединений. VMA-99-82 обладает наиболее выраженным супрессивным эффектом в отношении синтеза IL-4 (Таблица 7).

Таблица 7.

Влияние соединений в концентрации 800 мкг/мл на синтез цитокинов Т-лимфоцнтами здоро-

вых доноров, пг/мл (Me |Q1-Q3|)

Вещество Стимулятор IL-10 IL-12 IL-4

Контроль 52,10 [37,10-411,22] 724,5 [449,12-1023,23] 9,09 [1,31-27,59]

Контроль ФГА 122,32 [74,64585,241 1215,00 Г92,34-1375,12] 14,12 [1,01-18,38]

Контроль+ДМСО 25,22 [3,55-29,77] 8,77 [0,11-397,13] 11,56 [1,82-35,67]

Контроль+ДМСО ФГА 15,15 [1,22-17,84]» 104,28 [25,231000,011* 16,11 [1,13-28,18]*

VMA-03-01 0,82 [0,21-1,01] 86,73 [71,32-95,43] 8,29 [1,18-9,92]

VMA-03-01 ФГА 2,67 [0,10-3,01]*,** 561,77 [445,52601,041*,** 7,12 [5,67-9,19]**

VMA-01-21 18,98 [2,31-24,67] 293,56 [233,57-321,21] 5,36 [0,54-6,11]

VMA-01-21 ФГА 57,94 [6,55-■ 62,831*,** 307,22 [301,77324,271*,** 10,88 [9,19-14,39]*,**

VMA-00-29 0,00 [0,00] 1000 [889,99-1203,35] 5,00 [3,58-5,97]

VMA-00-29 ФГА 0,00 [0,00]*,** 191,72 [112,33202,28]** 6,89 [4,33-8,93]**

VMA-99-56 0,00 [0,00] 13,72 [11,46-18,22] 6,31 [5,89-9,70]

VMA-99-56 ФГА 0,00 [0,00]*,** 149,92 [111,20186,721*,** 7,07 [6,59-7,49]**

VMA-99-82 0,00 [0,00] 0,00 [0,00] 11,73 [8,12-13,55]

VMA-99-82 ФГА 0 [0,00]*,** ■ 0,00 [0,00]*,** 5,94 [0,99-6,85]**

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле с ФГА; ** - зна-

чимые отличия по отношению к контролю с ДМСО и с ФГА (р<0,05).

Влияние веществ на фагоцитарную активность нейтрофилов При исследовании влияния веществ УМА-99-82, УМА 99-56, УМА-03-01, УМА-01-21, УМА-00-29, было выявлено, что они достоверно увеличивают фагоцитарную активность нейтрофилов, влияя как на количество фагоцитирующих клеток в положительную сторону, так и качественно увеличивая их способность поглощать чужеродные элементы. В большей мере этот эффект выражен для

VMA 03-01. Для соединений VMA-99-82, VMA-00-29 повышение количества поглощающих клеток не приводит к увеличению фагоцитарного показателя, что может свидетельствовать о снижении порога активации отдельных нейтрофилов, но не увеличивает их поглотительной способности. При этом следует принимать во внимание, что ДМСО по литературным данным и на основании наших наблюдений обладает ингибирующим действием на функции нейтрофилов [Repine J. Е., 1979; Czuprynski С. J., 1984].

Таблица 9.

Влияние соединсншТв концентрации 800 мкг/мл на фагоцитарную активность ней__трофилов (М (ш))___

Исследуемый параметр VMA-03-01 VMA-01-21 VMA-00-29 VMA-99-56 VMA-99-82

Фагоцитарный показатель, % Контроль(«бланк») Контроль растворителя (ДМСО) Опыт 44(2,48) 28(1,25)* 41(1,72)*,** 44(2,48) 28(1,25)* 41(0,68)*,** 37,00(1,59) 28,00(1,00)* 39,00(1,95)** 35,80(1.59) 28,00(1,00)* 36,20(1,20)** 35,80(1,59) 28,00(1,00)* 33,40(1,03)**

Количество поглощенных дрожжей, шт Контроль («бланк») Контроль растворителя (ДМСО) Опыт 103(3,06) 79(4,66)* 101(3,84)*,** 103(3,06) 79(4,66)* 104(3,52)*,** 56,00(6,26) 25,00(3,71)* 25,00(9,05) 46,00(6,26) 22,30(3,71)* 46,60(6,44)** 46,00(6,26) 22,30(3,71)* 33,50(12,68)

Фагоцитарное число Контроль («бланк») Контроль растворителя (ДМСО) Опыт 2,45(0,21) 2,72(0,24)* 2,50(0,07)* 2,45(0,21) 2,72(0,24)* 2,54(0,09)* 1,51(0,16) 0,97(0,13) 0,76(0,28) 1,28(0,16) 0,80(0,13) 1,29(0,18)** 1,28(0,16) 0,80(0,13) 1,00(0,17)

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле; ** -

значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО (р<0,05).

Влияние веществ на активность нейтрофилов в НСТ-тесте Наиболее выраженное влияние на микробицидную активность нейтрофилов оказывают соединения VMA-03-01 и VMA-01-21, их действие начинает проявляться в концентрации 180 мкг/мл (Таблица 10). Спонтанная и стимулированная пирогеналом активность нейтрофилов в присутствии данных соединений в концентрации 180 и 800 мкг/мл даже превышает исходную активность, характерную для контрольных проб.

Таблица 10.

Влияние соединений в концентрации 180 мкг/мл на активность нейтрофилов в

НСТ-тесте (М (ш))

Исследуемый параметр VMA-03-01 VMA-01-21

Спонтанная активность. %

Контроль(«бланк») 33(1,19) 33(1,19)

Контроль растворителя (ДМСО) 24(0,50)* 24(0,50)*

Опыт 33(1,51)** 30(1,82)*,**

Стимулированная активность, % 36,5(1,14) 36,5(1,14)

Контроль(«бланк») 29(1,08)* 29(1,08)*

Контроль растворителя (ДМСО) 38,5(1,29)** 35(1,96)**

Опыт

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле; ** -значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО (р<0,05).

Соединения УМА-00-29, УМА-99-56, УМА-99-82 показали значимые отличия от контроля лишь в концентрации 800 мкг/мл (Таблица 11).

Таблица 11.

Влияние соединений в концентрации 800 мкг/мл на активность нейтрофилов в __НСТ-тесте (М (ш))___

Исследуемый параметр УМА-03-01 УМА-01-21 УМА-00-29 УМА-99-56 УМА-99-82

Спонтанная активность. % Контроль(«бланк») Контроль растворителя Опыт 30,5(0,87) 26(0,79)* 37,5(1,14)*,** 30,5(0,87) 26(0,79)* 34,5(0,56)*,** 38(1,24) 31(1,21)* 34(1,28) 38(1,24) 31(1,21)* 39(0,86)** 38(1,24) 31(1,21)* 39(0,73)**

Стимулированная активность, % Контроль («бланк») Контроль растворителя Опыт 33(1,25) 27,5(0,84)* 39,5(1,73)*, ** 33(1,25) 27,5(0,84)* 37,5(1,37)*,** 39(1,21) 34(0,71)* 37(0,66)** 39(1,21) 34(0,71)* 41(1,44)** 39(1,21) 34(0,71)* 42(1,18)**

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле; ** -значимые отличия по отношению к контролю с ДМСО (р<0,05).

Оценка влияния соединений на показатели иммунитета крыс На основании исследования свойств новых производных аденина для дальнейшего исследования выбраны соединения УМА-03-01 и УМА-01-21. Для этих веществ продемонстрировано их влияние на развитие гуморального и клеточного иммунного ответа в ходе сенсибилизации крыс эритроцитами барана.

В качестве одного из показателей иммунного ответа при введении антигена (эритроцитов барана), мы использовали состав лейкоцитов периферической крови животных. Кровь при этом исследовали до иммунизации (Таблица 12), а также на 7 и 14 день после иммунизации.

Таблица 12.

Лейкоцитарный состав периферической крови крыс контрольной и опытных _групп перед иммунизацией (М (т)) _

Параметры Контроль УМА-03-01 УМА-01-21

Лейкоциты, кл/мкл 15860(2061) 12020(1826)* 12780(2137)*

Лимфоциты, % 60,6(4,66) 63,6(4,37) 54,4(4,76)

Моноциты, % 4,4(2,42) 3,4(1,29) 9,4(1,36)

Сегментоядерные нейтро-филы, % 33,2(5,83) 30,6(4,13) 31,6(3,60)

Эозинофилы, % 1,8(0,37) 2,4(0,93) 4,6(0,40)

Базофилы, % 0 0 0

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле

На 7 день после иммунизации во всех группах животных отмечается увеличение количества лейкоцитов, что представляется закономерной реакцией на введение антигена. Обращает на себя внимание, что количество лейкоцитов увеличивается за счет лимфоидного ростка. Относительное количество лимфоцитов в период иммунизации увеличивается, в то время, как количество сегментоядерных нейтрофилов снижается (Таблица 13).

Таблица 13.

Лейкоцитарный состав периферической крови крыс контрольной и опытных групп на 7 день после иммунизации (М (ш))_

Параметры Контроль УМА-03-01 УМА-01-21

Лейкоциты, кл/мкл 18800(1855) 15360(1566)* 15860(2201)*

Лимфоциты, % 79,3(2,56) 65,5(4,51)* 65,8(11,88)*

Моноциты, % 3,25(0,48) 3,5(1,57) 6,6(1,19)

Сегментоядерные нейтро-филы, % 16,5(2,25) 14,5(3,50) 25,8(3,40)*

Эозинофилы, % 1(0,71) 1,25(0,48) 0,8(0,20)

Базофилы, % 0 0 0

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле

На 14 день после иммунизации количество лейкоцитов резко снижается во всех исследованных группах животных (таблица 14, рис. 1). При этом относительное количество популяций лейкоцитов также изменяется в присутствии соединения УМА-01-21 (рис. 2). Обращает на себя внимание увеличение относительного количества эозинофилов периферической крови.

Таблица 14.

Лейкоцитарный состав периферической крови крыс контрольной и опытных групп на 14 день после иммунизации (М (т))_

Параметры Контроль \'МА-03-01 УМА-01-21

Лейкоциты, кл/мкл 7220(1527) 6440(1074) 7480(508)

Лимфоциты, % 70(4,07) 66,2(3,12) 47(5,38)*

Моноциты, % 7,6(0,93) 7,0(1,48) 6,8(1,93)

Сегментоядерные нейтрофилы, % 19,6(2,99) 23,2(2,56) 40,8(6,10)*

Эозинофилы, % 2,6(0,51) 3,6(1,40)* 5.4(1,36)*

Базофилы, % 0 0 0

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле

Оценка влияния веществ УМА-03-01 и УМА-01-21 на состояние гуморального иммунитета крыс

Исследование уровня антител к эритроцитам барана в периферической крови крыс показало, что до иммунизации и на 7 день после антител не обнаруживается, и только к 14 дню исследования в сыворотке появлялись антитела. Оба соединения проявили ингибирующее действие в отношении синтеза антител у животных (табл. 5).

* +

15350

* +

15550

контроль ' '/МА-01-21 ; контроль ; ША-05-01

1 ' '

Передиммушие^ей ?дгнь

йвжнй - ... '.'МА-01-21 ■

контроль ! \"МА-ОЗ-01 УМА-01-21

Рис. 1. Динамика изменения количества лейкоцитов при иммунизации крыс эритроцитами барана

Данные приведены в виде М (т)

* - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле *г - значимые отличия от предыдущего уровня по критерию Манна-Уитня

Перед иммунизацией 7 день

и Лимфоциты, % *!Момоциты,& ^Сен«ьито«Д1риыемейтрйфмяы,%

ггроль УМА-03-01 ; УМА-01-21

14 день Эозинофилы. %

Рис. 2. Динамика изменения состава лейкоцитов периферической крови крыс при иммунизации эритроцитами барана. Данные приведены в виде М (т)

* - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле + - значимые отличия от предыдущего уровня по критерию Манна-Уитни

Таблица 15.

Титры антител к эритроцитам барана в контрольной и опытных группах

животных (Me 01-031)

Контроль VMA-03-01 VMA-01-21

До иммунизации 0 0 0

7 день исследования 0 0 0

14 день исследования 1:87 fl:64-l:106] 1:53,4 [1:36-1:64]* 1:59,8 [1:38-1:67]*

Примечание: * - значимые отличия (р<0,05) по отношению к значению в контроле.

Таким образом, влияние соединений на гуморальный иммунитет выражается в их способности снижать синтез антиген-специфических антител in vivo.

Исследуемые производные аденина обладают достаточно широким спектром иммуномодулирующей активности. Влияние на неспецифический иммунный ответ проявляется стимуляцией как поглотительной, так и бактерицидной функции нейтрофилов. Кроме того, соединения затрагивают регуляторные функции клеток иммунной системы, влияя на процессы активации Т-лимфоцитов, причем выраженность действия веществ в значительной мере зависит от их концентрации. Исследуемые производные аденина ингибируют появление активаци-онных маркеров на Т-клетках, что согласуется со многими литературными данными о влиянии производных аденина на Т-лимфоциты [Laugel В., 2008]. Влияние соединений на гуморальный иммунитет выражается в их способности снижать синтез антиген-специфических антител in vivo.

В качестве контроля растворителя использовался диметилсульфоксид (ДМСО). Из литературных источников достоверно известно, что ДМСО, находясь в культивационной среде ингибирует бласт-трансформацию лимфоцитов в концентрациях от 0,15% [Van Rensburg C.E.J., 1982, Novogrodsky А., 1982]. Кроме того, ДМСО стимулирует синтез IL-2 Т-лимфоцитами и фагоцитирующими клетками, и способен увеличивать экспрессию рецепторов к IL-2 (CD25). Мы наблюдали сходные результаты, за тем исключением, что экспрессия CD25 индуцировалась ДМСО только в отсутствие митогена (ФГА). В присутствии ФГА ДМСО в некоторой степени ингибировал экспрессию CD25. Известно, что некоторые вещества были исследованы на предмет подавления указанной активности ДМСО. Результаты известных работ свидетельствуют о том, что ингибиторы действия ДМСО обладают иммуносупрессорными свойствами в отношении Т-лимфоцитов. Авторами работ допускаются выводы о том, что такие соединения представляется возможным применять в качестве фармакологически активных средств при аутоиммунной патологии, а также в трансплантологии для предотвращения отторжения трансплантата [Sang В. Н., 2001].

Сделана попытка раскрыть механизмы, при помощи которых исследуемые соединения проявляют описанные эффекты. Известно, что ДМСО увеличивает способность иммунокомпетентных клеток синтезировать такие цитокины, как IL-4, IL-13, IFN-y, в то же время ингибируя синтез IL-10 и IL-5. Кроме того, ДМСО

способствует увеличению относительного и абсолютного количества эозинофи-лов и лимфоцитов в периферической крови [Novogrodsky А., 1982]. Было обнаружено, что ДМСО незначительно подавляет фагоцитарную и бактерицидную активность нейтрофилов, а исследуемые соединения в значительной мере способствуют восстановлению этой активности. Восстановление активности фагоцитирующих клеток связано с увеличением продукции IL-12 в присутствии соединений. В эксперименте in vivo, тем не менее, показано, что в присутствии соединений VMA-03-01 и VMA-01-21 количество эозинофилов увеличивается по сравнению с контролем (ДМСО). Объяснить это можно тем, что исследуемые соединения, несмотря на ингибирование продукции ТЬ2-цитокинов, могут не оказывать влияния на синтез лимфоцитами других факторов, таких как фактор хемотаксиса эозинофилов (ФХЭ-А) или даже усиливать миграционную способность эозинофилов за счет усиления синтеза фагоцитами TNF-a и GM-CSF.

Исходя из полученных данных, можно сделать заключение, что практически все исследуемые вещества индуцируют синтез IL-12 и подавляют синтез IL-4 иммунокомпетентными клетками. Исключение составляет лишь VMA-99-82, в присутствии которого синтез IL-12 снижается. Однако это же соединение обладает наиболее значительным ингибирующим эффектом в отношении синтеза IL-4. В присутствии всех указанных соединений снижается продукция IL-10, кроме вещества VMA-01-21, которое, наоборот, способствует синтезу IL-10. Предполагается, что наблюдаемые эффекты связаны со способностью исследуемых производных аденина «переключать» иммунный ответ з сторону ТЫ пути, одновременно ин-гибируя активность ТЬ2-клеток и Treg (с этим, вероятно, связано снижение синтеза IL-10 [Lohr J., 2009]). Данные выводы подтверждаются литературными данными о том, что производные аденина могут способствовать перенаправлению иммунного ответа с Th2 в сторону Thl-пути [Vultaggio А., 2009; Fili L., 2006] и служить иммунотерапевтическими агентами в лечении аллергических заболеваний [Brugnolo F., 2003]. Можно также предположить, что описанное иммуномодули-рующее действие связано с ингибированием Notch-рецепторов [Palaga Т., 2008; Rutz S., 2008], экспрессия и активность которых может снижаться под действием возрастающей продукции IFN-y. Источником этого IFN-y, в свою очередь, могут являться нейтрофилы, которые достаточно эффективно активируются в присутствии исследуемых соединений. Поскольку при активации нейтрофилов увеличивается синтез IFN-y, и в то же время мы наблюдали снижение экспрессии рецепторов для IL-2 на стимулированных лимфоцитов, становится возможным предположение о том, что исследуемые соединения способны подавлять иммунное воспаление, происходящее, при участии активированных Т-лимфоцитов, в том числе и аутоиммунных реакций [Grajewski R. S., 2008; Kelchtermans Н., 2007; Xiaodong Wu, 2006; Fili L., 2006]. Перечисленные механизмы суммированы на рис.3.

На основе описанных механизмов действия, возможно обрисовать потенциальный спектр клинического применения производных аденина. Это терапия вирусных инфекцией, сочетающихся с аутоиммунными заболеваниями, а также ТЬ2-опосредованной аллергической патологией (по дтверждением тому служит, что IL-10, синтез которого ингибируется исследуемыми соединениями, способен поляризовать иммунный ответ по ТЬ2-пути [Laouini D., 2003; Wynn Т. А., 2004]).

Кроме того, с учетом показанной антицитомегаловирусной активности [Петров В. И., 2004] соединений становится крайне привлекательной идея о том, что исследуемые соединения найдут свое применение в терапии пациентов транс-плантологических отделений. Как известно, риск цитомегаловирусной инфекции у пациентов после трансплантации значительно повышается в связи с иммуносу-прессией, а исследуемые соединения могут выступать одновременно в роли противовирусных и иммуносупрессорных агентов.

Противовирусные и иммуномодулирующие свойства всех исследованных соединений представлены в виде сводной таблицы (Таблица 1 б).

Наиболее перспективными соединениями для применения в качестве противовирусных средств, обладающих иммунотропными свойствами по результатам исследования являются УМА-ОЗ-О! и УМА-01-21.

\\

РНК

л /А*

и

Стимуляция синтеза 11.-12

Ингибирование

обратной транскрипции

ДНК

о

л\ л\ ч\

Ингибирование репликации ДНК

ДНК

Ингибирование продукции РНК ВИЧ

РНК

Рис. 3. Схема, иллюстрирующая мишени воздействия новых аналогов аденина и гипотетические механизмы их иммуномодулирующего действия. Вещества ингибируют репликацию нуклеиновых кислот, в т.ч. РНК ВИЧ. Под действием соединений происходит стимуляция синтеза 1Ь-12 нейтрофилами и Т-хелперами, что ведет к преимущественной днфференцировке Т-хелперов по ТЫ-пути. При этом угнетается синтез 1Ь-10 и 1Ь-4, что объясняется ингибировани-ем ТИ2 и Тгеё, и отражается в снижении синтеза антител В-лимфоцитами. ТЫ-, ТЬ2 -Т-хелперы 1 и 2 типа; В - В-лимфоцит, Treg - Т-ретуляторный лимфоцит.

Ингибирование синтеза антител

Таблица 16.

Противовирусные и иммунотропные свойства новых производных аденина - сводная таблица результатов

Вещества Ингнбнро-вание репликация ДНК Ингибирование обратной транскрипции РНК Влияние на продукцию вирусной РНК ВИЧ Влияние на экспрессию маркеров активации лимфоцитов и сиптез ци- токипов Влияние па фагоцитарную активность ней-трофнлов Влияпие на бактерицидную активность фагоцитов Влияние на продукцию антител in vivo Влияние на состав периферической крови крыс

VMA-01-21 + ++ 1 CD25, сЬб9| IL-4I IL-10T IL-12ÎÎ т ÎÎ 1 ++

VMA-03-01 + + и CD25, CD69J, IL-4| IL-10| IL-12TÎ ÎÎ ÎÎ 1 +

VMA-99-S6 + + 1 CD25, CD69I IL-4| IL-10i IL-12T Î Г

VMA-99-82 + ++ 1 CD25, CD69Î IL-4U IL-10i IL-12J. Î î

VMA-00-29 + + ц CD25, CD69J, IL-4J, IL-10| IL-12T Î î

Примечание: «+» - наличие эффекта, «-» - отсутствие эффекта, «|» - усиление, <ф> - ингибирование.

ВЫВОДЫ

1. Новые производные аденина: соединения VMA-99-56, УМА 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 обладают ингибирующим действием в отношении полимеризации ДНК и обратной транскрипции в стандартных системах для проведения полимеразной цепной реакции. Наиболее эффективными ингибиторами полимеризации нуклеиновых кислот являются соединения VMA-01-21, VMA-99-82.

2. Соединения ингибируют синтез РНК ВИЧ in vitro в культуре человеческих лимфоцитов, полученных от ВИЧ-инфицированных больных, наиболее активно ингибирование синтеза вирусной РНК происходит в присутствии веществ VMA-01-21, VMA-03-01. Наименее активно соединение VMA-00-29.

3. Новые производные аденина ингибируют экспрессию активационных маркеров Т-лимфоцитами при поликлональной, антигеннеспецифической стимуляции in vitro. Единственное исключение представляет собой вещество VMA-99-82, в присутствии которого увеличивается экспрессия маркеров CD25, CD69 на Т-клетках. Все соединения ингибируют синтез лимфоцитами IL-4. В присутствии всех соединений, кроме VMA-99-82, увеличивается синтез IL-12. В присутствии всех соединений, кроме VMA-01-21, снижается секреция IL-10.

4. Соединения VMA-03-01 и VMA-01-21 ингибируют синтез антиген-специфических антител in vivo у крыс при сенсибилизации эритроцитами барана.

5. Наиболее перспективными соединениями для применения в качестве противовирусных средств, обладающих иммунотропными свойствами по результатам исследования являются VMA-03-01 и VMA-01-21. В возможный спектр клинического применения соединений входят вирусные инфекции, сочетающиеся с аутоиммунной патологией, ТЬ2-опосредованной аллергической патологией, посттрансплантационными состояниями.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать соединения VMA-03-01 и VMA-01-21 для дальнейшего доклинического и токсикологического изучения с целью внедрения их в клиническую практику в качестве эффективных противовирусных и иммуномо-дулирующих препаратов.

2. Считать доказанным, что новые производные аденина обладают противовирусной активностью, связанной как с ингибированием обратной транскрипции так и репликации вирусных нуклеиновых кислот.

3. Считать доказанным, что соединения VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-99-56, VMA-99-82, VMA-00-29 обладают иммуномодулирующей активностью, отражающейся в ингибировании активации Т-лимфоцитов (кроме VMA-99-82) и увеличении продукции IL-12 при одновременном подавлении продукции IL-10, IL4, и как следствие ингибируют синтез антигенспецифических антител in vivo.

4. Считать целесообразным включение результатов данной работы в научно-практические и методические рекомендации для студентов, научных работников и преподавателей соответствующих дисциплин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммунотропные свойства новых производных аденина // Российский иммунологический журнал. - 2008. -т. 2 (11). -№2-3 (соавторы А. В. Стры-гин, А. А. Озеров).

2. Исследование in vitro противовирусных механизмов новых синтетических препаратов из группы аналогов аденина // Материалы XII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области: Тезисы докладов. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2008. - 220с.

3. Иммунотропные свойства новых производных аденина // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2009. - N 3 . - С. 34-38.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ Вирус иммунодефицита человека

ВПГ Вирус простого герпеса

ДМСО Диметилсульфоксид

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК Рибонуклеиновая кислота

спид Синдром приобретенного иммунодефицита

ФГА Фитогемагглютинин

ФР Физиологический раствор

цмв Цитомегаловирус

ЭБ Эритроциты барана

GM-CSF Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий

фактор

IL Интерлейкин

IFN Интерферон

TNF Фактор некроза опухоли

НЕСМИЯНОВ ПАВЕЛ ПАВЛОВИЧ

ПРОТИВОВИРУСНЫЕ И ИММУНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АДЕНИНА

Автореферат

Подписано к печати 28.12.09 г. Формат 60x84/16. Печать офс.Бум. офс. Уч.изд.л.1,5.Тираж 100 экз. Заказ 198.

Отпечатано с готового оригинал-макета В типографии издательства «Перемена» 400131, Волго град, пр.им.В.И. Ленина, 27

Проблема заболеваемости вирусными инфекциями приобретает в настоящее время все большую клиническую значимость. Показано, что в патогенетической и этиологической основе многих нозологических форм лежат именно вирусные инфекции [3, 112]. Среди них немаловажное место занимают представители семейств Негре8уМс1ае и Яе&оутс1ае (ВИЧ-1,ВИЧ-2). Часто протекающие в латентной форме инфекции Негре$уМс1ае становятся огромной проблемой у иммунокомпроментированных пациентов, например, у пациентов трансплантологических отделений, подвергающихся иммуносупрессивной терапии [14, 124, 67, 147, 18, 135]. Клиническое течение ВИЧ-инфекции приводит к развитию иммунодефицитного состояния, последствиями которого являются осложнения, в том числе, инфекционные, приводящие в итоге к летальному исходу [187]. Продолжительность и качество жизни больных СПИДом напрямую связаны с возможностями этиотропной терапии заболевания. Известно несколько групп препаратов, целенаправленно воздействующих на различные этапы жизненного цикла вирусов [36, 37], при этом для некоторых из них описано иммунотропное действие. Однако все препараты обладают рядом нежелательных эффектов, среди которых и выработка у вируса лекарственной устойчивости. Иммуномодулирующее действие должно учитываться, в первую очередь, у реципиентов трансплантатов, получающих иммуносупрессивную терапию, при лечении инфекций иммунной системы и т.д. В последнем случае это необходимо, так как существует возможность не только суммации получаемого противовирусного эффекта (или даже синергического эффекта), но и взаимного ослабления. В этой связи представляют интерес производные аденина, для которых описана возможность не только противовирусного, но и иммуномодулирующего эффекта. Особенное значение в современной фармакологии приобретает разработка новых противовирусных препаратов, по возможности обладающих иммуномодулирующим действием (в случае пациентов отделений трансплантологии это действие должно быть направлено на подавление иммунного ответа на трансплантаты; в случае ВИЧ-инфекции необходимо иммуностимулирующее действие для компенсации нарушенных функций иммунной системы). Хорошую репутацию в клинической практике заслужили противовирусные препараты на основе аналогов нуклеозидов, механизм действия которых основан на блокировании активности ферментов транскрипции и репликации вирусных нуклеиновых кислот [36, 37], поэтому дальнейшая разработка противовирусных средств этой группы представляется перспективной.

Ряд новых соединений - производных аденина — синтезирован недавно в Волгоградском научном центре РАМН [173]. Это структурные аналоги аденина: УМА-99-56, УМА 99-82, УМА-03-01, УМА-01-21, УМА-00-29. Предполагается, что данные соединения обладают способностью ингибировать репликацию и обратную транскрипцию вирусных нуклеиновых кислот. Вместе с тем, учитывая серьезные нарушения в иммунной системе при ВИЧ-инфекции, представляется актуальной оценка аналогов нуклеозидов и как иммунотропных средств, обладающих способностью изменять функции иммунной системы и влиять на эффективность проводимой терапии.

Цель исследования

Цель исследования - теоретическое обоснование возможности применения новых производных аденина в качестве противовирусных и иммномодулирующих средств, предварительно изучив влияние их на процессы транскрипции, репликации, полимеризации ДНК и обратной транскрипции с РНК, а также оценив влияние соединений на функциональную активность клеток иммунной системы.

Основные задачи исследования:

1. Оценка влияния веществ VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 на полимеризацию ДНК и обратную транскрипцию в стандартной системе для полимеразной цепной реакции.

2. Исследование противовирусного действия соединений in vitro на модели человеческих лимфоцитов от зараженных ВИЧ пациентов.

3. Исследование влияния соединений на экспрессию активационных маркеров Т-лимфоцитами и синтез цитокинов при поликлональной, антигеннеспецифической стимуляции, либо без таковой.

4. Исследование влияния веществ на формирование гуморального иммунитета крыс.

5. На основе полученных характеристик выбрать препараты, имеющие оптимальный спектр активности для практического использования.

Научная новизна

1. Впервые разработана модель для оценки влияния веществ VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 на полимеризацию ДНК и обратную транскрипцию в стандартной системе для полимеразной цепной реакции.

2. Для этих веществ впервые определены их иммунотропные свойства и противовирусная активность.

3. Впервые проведена сравнительная оценка веществ и выбраны новые соединения, имеющие оптимальный спектр противовирусной и иммуномодулирующей активности для практического использования.

4. Впервые предложена гипотетическая модель, объясняющая механизм иммуномодулирующего действия новых производных аденина.

Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования

1. Представлены практические рекомендации по спектру возможного клинического применения новых производных аденина: при аутоиммунной патологии, ТЪ2-опосредованной аллергической патологии, вирусных инфекциях, а также в профилактике посттрансплантационных осложнений.

2. Полученные данные о противовирусном и иммунотропном действии соединений используются в лекционных и практических курсах на кафедрах иммунологии и аллергологии, кафедре клинической фармакологии и интенсивной терапии с курсом аллергологии и иммунологии ФУВ, кафедре инфекционных болезней ВолГМУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Соединения VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 обладают дозозависимым противовирусным действием, связанным с ингибированием обратной транскрипции РНК и полимеризации ДНК.

2. Соединения VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 обладают иммуномодулирующим эффектом, ингибируют активацию Т-лимфоцитов и стимулируют фагоцитарную и бактерицидную функцию нейтрофилов. Иммуномодулирующая активность соединений связана, в частности, с изменением спектра цитокинов, секретируемых Т-лимфоцитами и клетками фагоцитарной системы. Соединения VMA-03-01 и VMA-01-21 способны подавлять синтез антиген-специфических антител in vivo.

3. Наиболее перспективными соединениями для применения в качестве противовирусных средств, обладающих иммунотропными свойствами по результатам исследования являются VMA-03-01 и VMA-01-21. В возможный спектр клинического применения соединений входят вирусные инфекции, аутоиммунная патология, ТЬ2-опосредованная аллергическая патология, посттрансплантационные состояния, сопровождающиеся инфекционным синдромом с активацией соответствующей инфекции. Изученные соединения имеют хороший шанс пополнить арсенал оригинальных отечественных противовирусных и иммуномодулирующих средств

Апробация работы

Материалы работы представлены на объединенном иммунологическом форуме -2008 (Санкт-Петербург, 2008), XII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 13-16 ноября 2007 г.)

По материалам работы опубликовано 3 печатные работы, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, одной главы, посвященной результатам собственного исследования, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами, 11 рисунками.

выводы

1. Новые производные аденина: соединения VMA-99-56, VMA 99-82, VMA-03-01, VMA-01-21, VMA-00-29 обладают ингибирующим действием в отношении полимеризации ДНК и обратной транскрипции в стандартных системах для проведения полимеразной цепной реакции. Наиболее эффективными ингибиторами полимеризации нуклеиновых кислот являются соединения VMA-01-21, VMA-99-82.

2. Соединения ингибируют синтез РНК ВИЧ in vitro в культуре человеческих лимфоцитов, полученных от ВИЧ-инфицированных больных, наиболее активно ингибирование синтеза вирусной РНК происходит в присутствии веществ VMA-01-21, VMA-03-01. Наименее активно соединение VMA-00-29.

3. Новые производные аденина ингибируют экспрессию активационных маркеров Т-лимфоцитами при поликлональной, антигеннеспецифической стимуляции in vitro. Единственное исключение представляет собой вещество VMA-99-82, в присутствии которого увеличивается экспрессия маркеров CD25, CD69 на Т-клетках. Все соединения ингибируют синтез лимфоцитами IL-4. В присутствии всех соединений, кроме VMA-99-82, увеличивается синтез IL-12. В присутствии всех соединений, кроме VMA-01-21, снижается секреция IL-10.

4. Соединения VMA-03-01 и VMA-01-21 ингибируют синтез антиген-специфических антител in vivo у крыс при сенсибилизации эритроцитами барана.

5. Наиболее перспективными соединениями для применения в качестве противовирусных средств, обладающих иммунотропными свойствами по результатам исследования являются VMA-03-01 и VMA-01-21. В возможный спектр клинического применения соединений входят вирусные инфекции, сочетающиеся с аутоиммунной патологией, ТЬ2-опосредованной аллергической патологией, посттрансплантационными состояниями.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать соединения VMA-03-01 и VMA-01-21 для дальнейшего доклинического и токсикологического изучения с целью внедрения их в клиническую практику в качестве эффективных противовирусных и иммуномодулирующих препаратов.

2. Считать доказанным, что новые производные аденина обладают противовирусной активностью, связанной как с ингибированием обратной транскрипции так и репликации вирусных нуклеиновых кислот.

3. Считать доказанным, что соединения УМА-03-01, VMA-01-21, VMA-99-56, VMA-99-82, УМА-00-29 обладают иммуномодулирующей активностью, отражающейся в ингибировании активации Т-лимфоцитов (кроме УМА-99-82) и увеличении продукции IL-12 при одновременном подавлении продукции IL-10, IL4, и как следствие ингибируют синтез антигенспецифических антител in vivo.

4. Считать целесообразным включение результатов данной работы в научно-практические и методические рекомендации для студентов, научных работников и преподавателей соответствующих дисциплин.