Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Противовирусные и иммуномодулирующие свойства глипролинов

( На правах рукописи

/

л \

иазОВТ254

УЧАКИНА Ольга Николаевна

ПРОТИВОВИРУСНЫЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГЛИПРОЛИНОВ

14.00.36.-Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

003067254

Работа выполнена в отделе интерферонов ГУ Научно-исследовательского Института Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамапеи РАМН.

Научный руководитель:

Академик РАМН, профессор, д.м.н. Ершов Ф.И.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Чекнев С.Б.

доктор биологических наук, профессор Галегов Г.А.

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

заседании диссертационного Совета Д 001.007.01 при ГУ Научно-исследовательского Института Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН по адресу: Москва, ул. Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского Института Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

РАМН

Защита диссертации состоится

февраля 2007г. в 11.00 часов на

Автореферат разослан_ [варя 2007г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Профессор, д.м.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы.

В патогенезе большинства известных инфекционных и неинфекционных заболеваний часто наблюдается дисбаланс в продукции и рецепции нейропептидов, гормонов и цитокинов. Данный факт напрямую указывает на тесное взаимодействие нервной, эндокринной и иммунной систем в регуляции гомеостатических реакций (Anishman Н., Baines М. et al., 1996; Симбирцев А.С., 2004; Kerr D., Krishnan С. Et al., 2005). Это обусловливает актуальность исследования взаимосвязей этих регуляторных и эффекторных медиаторов для разработки объективных методов коррекции их дисбаланса.

Больные, страдающие различными психо-неврологическими расстройствами, подвержены частым инфекционным заболеваниям, которые протекают, как правило, в тяжелой форме. Такие заболевания вирусной этиологии, как ОРВИ и герпесвирусные инфекции, широко распространены и недостаточно контролируются. Несмотря на многочисленные исследования, направленные на поиск и разработку новых противовирусных и иммуномодулирующих препаратов, эта проблема на сегодняшний день не потеряла своей актуальности.

В данной работе был использован новый подход для коррекции иммунодефицитных состояний у психоневрологических больных. Исследовались иммунотропные свойства новой группы отечественных нейротропных препаратов пептидной природы - глипролинов (Семакс, Селанк, PGP), синтезированных в Институте Молекулярной генетики РАН. Семакс, являясь эндогенным регулятором функций ЦНС, в очень низких дозах (3-30 мкг/кг) обладает выраженным ноотропным эффектом и в настоящее время широко используется в неврологической клинике (Гусев Е.И., Скворцова В.И. и др., 1997; Левитская Н.Г. и др., 2004). Селанк успешно прошел третью фазу клинических испытаний в качестве анксиолитика, PGP находится на стадии предклинических испытаний в качестве противоязвенного препарата. Уникальность свойств этой группы препаратов заключается в их психо-, нейро-и иммунотропной активности. Характерными чертами глипролинов являются высокая эффективность в малых дозах, быстрота наступления эффектов при отсутствии негативных побочных последствий (Ашмарин И.П. и др., 2003, 2005; Долотов О.В., Карпенко Е.А. и др., 2006). Изучение возможности использования глипролинов в качестве новой группы отечественных иммуномодуляторов, которые избирательно влияют на физиологический баланс Тип-1/Тип-2 цитокинов, и при этом обладают выраженными противовирусными свойствами является актуальной проблемой для современной медицины.

Цель работы: выявление изменений в цитокиновом профиле при экспериментальных вирусных инфекциях (грипп и инфекция, вызванная вирусом простого герпеса (ВПГИ) и ряда психо-неврологических патологий, а также обоснование возможности и тактики коррекции этих нарушений нейротропными препаратами из семейства глипролинов.

3

Для реализации указанной цели решались следующие задачи:

1. Изучить иммуномодулирующие и интерферон-индуцирующие свойства глипролинов в системах in vitro и in vivo.

2. Изучить противовирусную активность глипролинов в отношении вируса гриппа и Bill И в системах in vitro и in vivo.

3. Изучить цитокиновый Тип-1/Тип-2 баланс у людей с психоневрологическими заболеваниями (болезнь Паркинсона (БП), гепатолентикулярная дегенерация (ГДД), неврастения, генерализированное тревожное расстройство (ГТР).

4. Провести корреляцию экспериментальных лабораторных данных с результатами, полученными при клиническом испытании Селанка.

5. Оценить возможность использования глипролинов в качестве иммуномодуляторов и индукторов интерферона для профилактики и иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов.

Научная новизна работы.

1. Впервые была проведена комплексная оценка изменений в экспрессии генов и секреции цитокинов в клеточных культурах и в системе in vivo под воздействием иммуно- и нейротропных препаратов;

2. Впервые выявлено наличие иммуномодулирующих свойств у новых нейротропных препаратов пептидного происхождения, влияющих на продукцию ИФН и других цитокинов.

3. Впервые показан противовирусный эффект глипролинов на моделях экспериментальных вирусных инфекций (грипп, ВПГИ).

4. Впервые проведён корреляционный анализ психо-неврологического состояния и секреции цитокинов у больных с различными нейро- и психопатологическими нарушениями (БП, ГЛД, неврастения, ГТР).

Практическая ценность:

В работе показаны иммунорегуляторные свойства трёх новых отечественных глипролинов: Селанка, Семакса, и PGP. Обнаружены выраженные противовирусные свойства Селанка в отношении вируса гриппа А и вируса простого герпеса 1 и 2 типов.

Результаты исследований продемонстрировали возможность и целесообразность использования глипролинов для предупреждения и лечения вирусных заболеваний у людей с психоневрологическими нарушениями. Обнаруженные иммуномодуляторные свойства этих пептидов позволяют классифицировать их в качестве адаптогенов и рекомендовать клиницистам для применения у лиц старшего возраста и людей, подверженных воздействию стресс-индуцирующих факторов окружающей среды.

Апробация диссертации.

Основные результаты работы были представлены на II Международном конгрессе по иммунопатологии и аллергологии (Москва, 2004г.), на

межлабораторном семинаре ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и Института молекулярной генетики РАН (Москва, 2004г.), на 14 съезде психиатров России (Москва, 2005г.), на Конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2005г.), на ежегодном конгрессе Международного общества Экспериментальной Биологии (Сан-Франциско, США, 2006г.) и на межлабораторной конференции ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и Научного Центра психического здоровья РАМН (Москва, 2006г.).

Апробация диссертации состоялась на заседании отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 21 марта 2006

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 113 страницах, включая 20 таблиц и 20 рисунков. Список цитированной литературы состоит из 17 отечественных и 128 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Изучались иммуномодулирующие и противовирусные свойства таких глипролинов как: Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) - синтетический пептидный препарат, являющийся аналогом фрагмента адренокортикотропного гормона (АКТГ4.10), полностью лишенный гормональной активности; Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) - синтетический пептид, содержащий фрагмент 289-292 эндогенного иммуноглобулина G; и PGP (Pro-Gly-Pro) - трипептид, стабилизирующий молекулы Семакса и Селанка.

В экспериментах in vitro для изучения иммуномодулирующих свойств глипролинов использовали клеточные линии фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), линии клеток моноцитарной лейкемии человека (J-96), невриномы Гассерова узла крысы (НГУК), а также иммуноциты периферической крови здоровых доноров и людей с депрессивными расстройствами. В качестве положительных контролей использовались препараты, цитокин-индуцирующее действие которых хорошо известно (индуктор интерферона - ридостин, неспецифический митоген - ФГА, и эталонный индуктор интерферонов - вирус болезни Ньюкасла -NDV).

Экспериментальная группа состояла из 8 человек, страдающих различными формами депрессивных расстройств (средний возраст 31,2±8.1). Больные проходили курс стационарного лечения в Специализированной клинической больнице №8 им. З.П.Соловьева (Клиника Неврозов) Департамента Здравоохранения г.Москвы.

Способность иммуноцитов секретировать цитокины в системе in vitro изучали в культуре клеток периферической крови по модифицированной методике, опубликованной ранее (P.Uchakin et.al., 2003). Клеточные линии и иммуноциты периферической крови культивировались в течение 24 часов в 5% атмосфере С02 при 37°С и 95% влажности. В культуральную среду вносили исследуемые глипролины в конечной концентрации 10" М. Контролем служила не активированная препаратами культура клеток. По окончании культивирования в надосадочной жидкости измеряли уровень секреции цитокинов: интерлейкина (HJI)-lß, -2, -4, -6 -10, -12, интерферона (ИФН)-а, -у, и фактора некроза опухоли (ФНО)-а методом иммуно-ферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов (R&D Systems, США) на ридере Organon Texnika (Microwell System, Boxtel, Голландия).

Тотальную клеточную РНК выделяли согласно методике, предложенной Chromczynsky Р. и Sacchi N. (1987).

Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили путем обратной транскрипции (ОТ) матричной РНК (мРНК) по стандартному протоколу (Maniatis Т. et.al., 1982). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием праймеров к участкам генов ИФН-а, -у, MJI-lß, -2, -4, -6 -10, -12, и ФНО-а на программируемом амплификаторе МС-2 (АО «ДНК-технология», Россия). В негативном контроле ПЦР проводили в отсутствии матрицы в реакционной среде. Количественным контролем служила ПЦР на тех же образцах кДНК с использованием праймеров к участку кДНК гена ß-актина. ПЦР-продукты анализировали электрофоретически в 1,5 % агарозном геле, для определил молекулярной массы ПЦР-продуктов использовали маркер 100 bp DNA-ladder (Gibco BRL, США). Количество ПЦР-продуктов анализировали, используя денситометрическую компьютерную программу ImageJ 1.36 (NIH., США).

Интерферон-индуцирующие свойства глипролинов изучали согласно методике, разработанной в отделе интерферонов НИИЭМ им. Н.ФГамалеи (Ершов Ф.И., 1996).

Противовирусная активность препарата Селанк изучалась в отношении вируса гриппа A/Aichi 2/68 (H3N2) и вируса простого герпеса первого (ВПГ-1) и второго (ВПГ-2) типов.

В системе in vitro активность препарата Селанк в отношении вируса гриппа А оценивалась по его способности контролировать репродукцию вируса в тест-культуре клеточной линии фибробластов почки собаки (MDCK). Селанк вводили по профилактической схеме (за 24 часа до заражения культуры вирусом), по лечебно-профилактической (одновременно с заражением) и по лечебной схеме (через 24 часа после заражения клеток вирусом гриппа) в конечных концентрациях - Ю^М, 10"7М и 10'8М. В качестве препарата сравнения применяли рекомбинантный ИФН-а в концентрации 104 МЕ/мл. Оценка противовирусной активности препаратов осуществлялась путем контроля репродукции вирусов в реакции гемагглютинации с вируссодержащей жидкостью по стандартной методике (Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я., 1943г.).

Изучение противогерпетической активности in vitro проводили в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO). Селанк вводили по

лечебно-профилактической и по лечебной схеме в конечных концентрациях -Ю^М, 10" М и 10"8М. В качестве препарата сравнения применяли известный индуктор интерферонов ридостин. Клетки заражали ВПГ-2 в дозе 0,1 ТЦД50/мл. Оценка противовирусной активности препаратов осуществлялась через 48-72 часа после заражения по цитопатогенному действию (ЦПД) вируса.

В экспериментах in vivo использовали 300 белых беспородных (б/п) мышей весом 14-16 г. Животных содержали в стандартных условиях при температуре 22°С, световом режиме 12:12 часов (свет с 8.00 до 20.00), питьевом и пищевом режиме ad libitum. Противовирусная активность препарата Селанк изучалась в двух сериях экспериментов с тест-инфекциями, вызванными вирусом гриппа A/Aichi 2/68 (H3N2) и ВПГ-1. Препарат Селанк вводили экспериментальным животным внутрибрюшинно в концентрациях 100мкг/кг и 200мкг/кг. Применялись три схемы введения препарата - профилактическая (за 24 часа до заражения животных тест-вирусом), лечебно-профилактическая (одновременно с заражением) и лечебная схема (через 24 часа после заражения животных вирусом). Противовирусная активность Селанка оценивалась по выживаемости животных. Кроме того, часть инфицированных животных забивалась на 3-е и 7-е сутки для определения титров вируса гриппа в тканях легкого, и на 7-е сутки для определения титров ВПГ-1 в тканях головного мозга. Каждое легкое (от 5 мышей) титровали по реакции геммаглютинации (РГА) с эритроцитами кур на клетках MDCK в разведении от 10'1 до 10'5 в 4-х повторах на каждое разведение легочной суспензии. Определение титров ВПГ-1 в тканях мозга опытных и контрольных мышей, проводили в 3 повторах на клетках VERO, обработанных 10-кратным разведением суспензии мозга. Наблюдение и учет ЦПД осуществляли на 3-4 день после контакта с инфекционным материалом.

Оценку активности препаратов проводили, учитывая:

1) среднюю гармоническую величину времени жизни для каждой группы мышей;

2) кратность защиты (КЗ);

3) индекс эффективности препарата (ИЭ).

Собранную гепаринизированную кровь использовали для определения интерферон-индуцирующей активности Селанка биологическим методом. Цитокин-индуцирующую активность препарата оценивали по уровню экспрессии генов цитокинов иммуноцитами методом ОТ-ПЦР.

Изучение in vivo цитокин-модулирующих свойств глипролина Селанк проводилось в группе больных тревожно-фобическими расстройствами. Обследовано 27 человек в возрасте 36.7±9.5 лет на фоне 14-дневного интраназального применения препарата Селанк. Исходя из клинического диагноза, все обследованные были разделены на группу с генерализированными тревожными расстройствами (ГТР, п=13) и неврастенией (Невраст. п=14). Классификацию тревожно-фобических расстройств проводили по DSM-4.

Уровень содержания цитокинов в системе in vivo определяли в сыворотке венозной крови, взятой натощак в стерильные пробирки в 8-9 часов утра. Концентрацию цитокинов (ИФН-у, ИЛ-4, -6-10,-12) измеряли методом ИФА с

использованием коммерческих наборов (R&D Systems, США) на ридерс Org а поп Texnika (Mícroweil System, Boxtel, Голландия).

Математическую обработку полученных результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами ковариационной статистики с применением статистической программы SigmaStat (SPSS Inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммуномодулирующие свойства глипролинов в системе in vitro.

Иммуннотропные свойства гли л роликов оценивались по их способности активировать экспрессию генов цитокинов и индуцировать их секрецию клетками как нервной (НГУК), так и иммунной систем (J-96).

В культуре клеточной линии J-96 при введении Семакса и Ссланка значительно (в 7,4 и 15 раз соответсвенно) повысилась секреция ЙФН-у (рис.1). При этом Селанк был единственным препаратом, индуцирующим экспрессию гена ИФН-7 в этой культуре. Все пгшпролины подавляли секрецию ИЛ-4 и И Л-6 в среднем в 2 раза, но только Семакс активировал секрецию растворимого рецептора ИЛ-4 (8.64пкг/мл) и ИЛ-12 (10.86пкг/мл) по сравнению с контролем ( 4 пкг/мл и 2.5 пкг/мл соответственно).

PGP

Селян*

А.!

и

га □

...........^............. ,., ^ т

«usu-msmitui

КОНТРОЛЬ

ИФНи ИФН-у

ил-г ил-4

ИЛ-4рсц.

0,1

10

100 100О 10000

ИЛ-1[)

ил-í ил-ю

ИЛ-12 ФИО-«

Рисунок I. Секреция лимфокинов (А) и монокинов (Б) клетками линии .1-96, стимулированных глипролинами. Результаты представлены как процентное

отношение к не активированной культуре принятой за 100% (КОНТРОЛЬ).

юооо

контр опь 10 100 1000

PGP

Семакс Селанк

•!, ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ В КОНТРОЛЬНО!-! КУЛЬТУР6

Двухкратное увеличение секреции ИЛ-2 было обнаружено н культуре клеток НГ'УК, стимул кропанной Сел ;ш ком (рис. 2). Введение Се макса в культуральную среду снизило в 5 раз секрецию ИЛ-4. В противоположность этому, добавление PGP в культуральнун} среду усилило секрецию этого "Гип-2 цитокина почти в 2 раза. Секрецию И Л-6 и ФНО-а стимулировали все тестированные препараты.

Рндостин NDV ФГА Даларгин PGP Семакс Селанк

1 •

Э ил-1и

t 'ч ш-г

d ил-4

в ип-i

б ФНО-ч

Il I I.—■

контроль ^

1 10 100 1000 X ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ В КОНТРОЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ

Рисунок 2. Секреция цитокинов клетками НГУК, стимул и рован кыми глипролинами. Результаты представлены как процентное отношение к не активированной культуре (КОНТРОЛЬ) принятой за 100%.

Важно отметить, что все три глипролина несколько отличались по спектру своей цитокин-стимулирующей активности. Суммируя эти данные, можно с уверенностью утверждать, что глнпролины не просто обладают цнтокин-стимулирующнми свойствами, они способны регулировать клеточно-опосредованный и гуморальный иммунный ответ, модулируя Тип-1/ Тип-2 иитокиновый баланс.

Изучение интерферон-индуцирующих свойств глипролинов проводилось биологическим методом в культуре Клеточных линий ФЛЭЧ и линии клеток .)-% (рис. 3).

Наиболее высокие титры ИФН (до 4000 Ед) были зарегистрированы в Культуре клеток линии ФЛЭЧ при введении Селанка и Семакса в среду культявированИй- В клетках линии .1-96, ИФН-индуцирую)нее действие всех глипролинов было значительно слабее, чем эффект радости на (12 К Ед), но, тем не менее, сравнимым, а в случае Семакса превышало действие циклоферона.

В дальнейшем наше исследование сфокусировалось на более детальном изучении свойств одного из глипролинов - Селанка.

Рисунок 3. Индукция интерферона глипролинами в сравнении с известными ИФН-индукторами. Данные представлены как титры содержания интерферона в среде культивирования.

Противовирусная активность глипролина Селанк при экспериментальной гриппозной инфекции.

В системе in vitro активность препарата Селанк в отношении вируса гриппа А штамм H3N2 оценивалась по его способности контролировать репродукцию вируса в тест-культуре клеточной линии MDCK (рис. 4),

Обнаружен выраженный Дозозависимый противовирусный эффект Селанка. При этом, при профилактической схеме введения, Селанк в концентрация 10""М показал наибольшую эффективность, полностью подавляя репродукцию вируса.

10'6М 10'ГМ 10'3М НФН-« Плацебо

Рисунок 4. Противовирусная активность препарата Селанк в культуре клеток МОСК, инфицированной тест-вирусом гриппа А штамм НЗМ2.

Селанк

{10 Е/мп)

Проведённые исследования в системе in vivo показали, что при гриппозной инфекции наибольшая выживаемость лабораторных животных наблюдались при использовании препарата по профилактической схеме - ИЭ 40%. Самые высокие титры ИФН (до 160 Ед) определялись при лечебно-профилактической схеме введения 200 мкг/кг Селанка на 3 сутки после инфицирования, и при профилактической схеме введения 100 мкг/кг Селанка на 6 сутки после заражения экспериментальных животных вирусом гриппа А.

Титр вируса гриппа в тканях легкого экспериментальных животных, по сравнению с контролем, снижался на 2,37-2,25 lg и 1,25-0,87 lg ТЦД50 при введении исследуемого препарата по профилактической и лечебно-профилактической схемам, соответственно. Введение Селанка индуцировало экспрессию гена ИФН-а во всех группах экспериментальных животных как на 3-е, так и на 6-е сутки после инфицирования. На 6-е сутки инфицирования животных, блокированная вирусом гриппа экспрессия гена ИФН-у, была восстановлена введением Селанка.

Противовирусная активность глнпролина Селанк при экспериментальной герпетической инфекции.

Активность препарата Селанк в отношении вируса простого герпеса 2 типа определялась в тест-культуре клеток VERO. Препарат вводили по лечебно-профилактической и лечебной схеме. Согласно полученным результатам, лечебная схема введения Селанка оказалась наиболее эффективной. При этой схеме применения, противовирусная эффективность препарата Селанк в концентрации Ю^М и 10"7М была сравнима с эффективностью применяемого в медицинской практике индуктора интерферона ридостина.

При экспериментальной герпетической инфекции у животных, Селанк в концентрации 200 мкг/кг оказывал преимущественно лечебное действие средней степени выраженности (ИЭ-50%). Титр вируса в тканях мозга, полученного от контрольных мышей, составил 4,0 lg. Применение Селанка по лечебной схеме снижало инфекционность ВПГ-1 в 2 раза по сравнению с контролем (р< 0,05).

Введение Селанка усилило экспрессию генов цитокинов, регулирующих развитие клеточно-опосредованных иммунных реакций, стимулирующих противовирусный иммунитет (ИФН-а и -у) (рис. 5).

Выраженный супрессивный эффект на Тип-2 цитокины (ИЛ-4, ИЛ-6), лишний раз подтверждают его иммунокоррегирующие свойства, проявляющиеся через модуляцию Тип-1/Тип-2 цитокинового баланса.

Рисунок 5, Полукояичественный анализ экспрессии генов цитокинов лейкоцитами крови мышей инфицированных ВГ1Г-1, на фоне внутри-брюшинной инъекции препарата Селанк по п ро фи л акти чес кой (-24ч),

лечебно-профилактической (Оч), и лечебной схемам

И<РН-а

-0.6 -0,4 -0.2 0.0 0.2

1ННЦЭ tío о\A.ett,,;-.' ' -.•.■ .i-V.V.Í4CJ

Таким образом, данные серии экспериментов, проведенных в моделях in vitro и in vivo, выявили наличие противовирусной активности у препарата Селанк и позволяют предполагать прямое направленное действие этого глипролина на и vi му по компетентные клетки при развитии иммунного ответа.

Влияние Селанка на продукцию цитокинов иммуноцнтамн периферической крови людей.

Поскольку гаипролины в первую очередь являются нейротропными препаратами, то следующим этапом стало изучение влияния Селанка на продукцию in vitro цитокинов и м му ноКОм п етентн ым и клетками людей, страдающих различными формами депрессивных расстройств. Введение Селанка в концентрации 10* M в культуральную среду полностью (р=0.005; Х5=18,675; dtH) подавило экспрессию гена ИЛ-6 в культуре иммуноцитов периферической крови пациентов с депрессивными расстройствами, но не повлияло на экспрессию этого гена клетками крови здоровых доноров. В то же время, введение Селанка в культуральную среду достоверно увеличило (р<0.05) секрецию ИЛ-6 иммуноцнтамн по сравнению с контрольными образцами {рис. 6).

Рисунок 6. Уровень содержания ИЛ-6 в кондиционной среде крови больных, стимулированной Селанком в концентрации 10'7М и в контрольной (не активированной) культуре иммуноцитов. На логарифмической оси ординат представлены

индивидуальные (о и •) и средние (столбцы) значения. * - статистическая достоверность

(р<00.5).

Контроль Селанк

Полученные результаты позволяют предположить, что Селанк запускает сигнальный каскад, действующий по принципу обратной связи, выводя белок из клетки в межклеточное пространство (кондиционная среда в системе in vitro), и одновременно блокируя экспрессию гена этого белка.

Иммуномодулирующне свойства Селянка в системе in vivo.

Заключительной стадией нашей работы явилось изучение иммунотролных свойств глипролина Селанка у людей, страдающих тре во жн о- ф об и ч ее кими расстройствами (13 человек) и неврастенией - 14 человек. Все обследованные проходили амбулаторное лечение в рамках 3-ей стадии клинических испытаний Селанка в качестве анксиолитика. Вирусных заболеваний у обследованных за время приема Селанка зарегистрировано не было. Иммуно-модуляторные свойства Селанка оценивались по уровню секреции Тип-1 и Тип-2 цитокинов в сыворотке крови больных. ИФН-v и ИЛ-12 использовались как маркеры клеточно-опосредованных иммунных реакций, а ИЛ-4, -6, и -10, как маркеры гуморального иммунитета.

В нашем исследовании мы обнаружили статистически достоверное (р<0.05) снижение в секреции ИФН-у. Несмотря на кажущееся иммуносупрессируюшее действие Селанка, необходимо учитывать, что ИФН-у обладает выраженными провоспалительными свойствами и подавляет продукцию фактора роста нейронов. В данной ситуации, активация этого цитокина может имен,, деструктивное действие. В тоже время, содержание ИЛ-6 (повышающего выживаемость холинэргических нейронов в культуре) достоверно увеличилось. Эти результаты в определённой мере коррелируют с данными, полученными нами в системе in vitro (рис, 6) на клетках крови людей с депрессивными расстройствами.

Как уже отмечалось, адекватность иммунного ответа определяется балансом клеточно-опосредованных и гуморальных реакций. Мы провели

оценку влияния Селанка на Тип-1/Тип-2 иммунный баланс, проанализировав Т1/Т2 индекс (рис. 7).

ИФН-у / ИЛ-4

ИЛ-12 / ИЛ-10

1.6 -

1.6 ■

*

1.1 -

1.1 •

*

0.6 •

-О-ГТР

*

0.6 ■

-О-ГТР

а- Невраст.

-и-Невраст.

0.1

0.1

II

II

Рисунок 7. Соотношения содержания цитокинов, регулирующих Тип-1 и Тип-2 иммунные реакции в сыворотке периферической крови больных до (I) и после ( II ) приёма препарата. Результаты представлены как Mean± SEM, !og|0 абсолютного содержания, п=27. * - статистическая достоверность (Р<0.05).

Полученное таким образом соотношение ИФН-у/ИЛ-4 представляло лимфоцитарный Тип-1/Тип-2 баланс (Т-клеточный ответ), в то время как соотношение ИЛ-12/ИЛ-10 отражало состояние моноцитарно-макрофагального ответа. Проведённый анализ показал достоверное снижение ИФН-у/ИЛ-4 соотношения и увеличение ИЛ-12/ИЛ-10. Динамика этих изменений имела достоверную обратную корреляционную зависимость

(г=-0.61; р<0.001). Такая динамика, очевидно, описывает развитие серии защитных реакций, направленных на предотвращение негативного воздействия ИФН на нервные ткани, и при этом сохраняет активными клеточно-опосредованные иммунные реакции.

Таким образом, основываясь на детально изученных регуляторных свойствах Селанка в системах in vitro и in vivo, мы показали наличие иммунотропных и противовирусных свойств у этого пептида. Это, в свою, очередь, указывает на возможность и целесообразность использования Селанка, а возможно, и всей группы глипролинов, для предупреждения и лечения вирусных заболеваний.

Наличие у глипролинов именно иммуномодулирующих, а не иммуностимулирующих свойств, позволяет использовать их у людей с психоневрологическими нарушениями, которых можно отнести в группу повышенного риска инфекционных заболеваний. Также представляется важным учитывать адаптогенные свойства этих пептидов для их применения у лиц старшего возраста и людей, подверженных воздействию стресс-индуцирующих факторов окружающей среды для профилактики инфекционных заболеваний.

выводы

1. Показано цитокин-стимулирующее и интерферон-индуцирующее действие новых отечественных препаратов глипролинов - Семакса и Селанка, синтезированных в Институте молекулярной генетики РАН, в культурах клеток невриномы (НГУК), моноцитарной лейкемии (J-96) и фибробластов лёгкого эмбриона человека (ФЛЭЧ).

2. Селанк обладает выраженным дозозависимым ингибиторным эффектом в отношении вируса гриппа A/Aichi 1/68 (штамм H3N2) в моделях in vitro и in vivo. Применение препарата по профилактической и лечебно-профилактической схемам превышало эффективность ИФН-а.

3. Антивирусная активность препарата Селанк в отношении вируса простого герпеса, используемого по лечебной схеме в моделях in vitro и in vivo, была сравнима с известным индуктором интерферона ридостином.

4. Мониторинг цитокинового статуса больных с различными видами психоневрологических нарушений, выявил отклонения в сывороточном содержании цитокинов, регулирующих баланс Тил-1/Гип-2.

5. В культурах иммунокомпетентных клеток больных с депрессивной симптоматикой Селанк модулирует продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-6, блокируя экспрессию его гена, что может объяснить один из возможных механизмов его нейротропных свойств.

6. Использование Селанка в качестве анксиолитика при лечении тревожных расстройств сопровождается иммуномодулирующим эффектом на Тип-1/Тип-2 цитокиновый баланс. Зарегистрировано достоверное снижение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 и достоверное увеличение соотношения ИЛ-12/ИЛ-10.

7. Обнаужение цитокин-модулирующих, интерферон-индуцирующих и противовирусных свойств глипролинов - Семакса и Селанка, позволяет рассматривать их как новый класс иммуномодуляторов, перспективных для предупреждения и лечения инфекционных и неинфекционных заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Суркина И.Д., Готовцева Е.П., Ватагина О.Н., Зозуля А.А., Кост Н.В., Ильинский О.Б. Влияние стимуляции иммуно-интерфероногенеза на процессы адаптации к физической нагрузке. Участие опиоидной системы. Сообщение 1. // Ж.: Вестник спортивной медицины России. М., 1993, №1, с. 14-19.

2,, Surkina I., Vatagina О., Gotovtseva Е., Uchakin P., Shurin M., Zozulya A., Ilyinsky O. Optimization of adaptive processes by immunomodulation. // 2nd International Congress ISNIM. Paestum (Salermo), Italy - Sept. 12-17, 1993. Abstracts.

3. Gotovtseva E., Uchakin P., Vatagina O., Surkina I., Shurin M., Zozulya A., Ilyinsky O. Lymphokine production under chronic stress in athletes. // 2nd International Congress ISNIM. Paestum (Salermo), Italy - Sept. 12-17, 1993. Abstracts.

4. Зозуля А.А., Кост H.B., Макаренкова В.П., Ватагина O.H., Мешавкин B.K. Взаимосвязь характеристик опиоидных рецепторов дельта-типа стриатума и обонятельных луковиц с поведенческим проявлением тревожности крыс.// Тезисы конференции «Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга», М., 1999, с.ЗЗ

5. Зозуля А.А., Кост Н.В., Мешавкин В.К., Макаренкова В.П., Соколов О.Ю, Габаева М.В., Торопов А.В., Ватагина О.Н., Алфимова М.В., Степура О.Б., Пак Л.С., Акатова Е.В., Иванов С.В., Смулевич А.В. Опиоиды в нейрохимических механизмах тревоги.// Нейрохимия, 2000, т.17, с.157-159.

6. Подчерняева Р.Я., Данлыбаева Г.А., Мельниченко Е.И., Ватагина О.Н., Павлов В.И., Мезенцева М.В. Продукция мРНК цитокинов в культуре клеток и крови людей под влиянием КВЧ-облучения.//Ветеринарная патология, 2003, №1, с.35-27.

7. Mezentzeva M.V., Narovlyansky A.N., Semernina V.V., Sanin A.V., Vatagina O.N., Lamygo E.V., Tchulkova S.V., Yershov F.I. Cytokines synthesis characteristics in gastric cancer parients.// International Cytokine Society Annual Meeting, Sept.2003, V.14, P.128. Abstract.

8. Балашева E.B., Турьянов M.X., Ватагина O.H., Семернина В.В., Павлов В.И., Мезенцева М.В. Особенности синтеза цитокинов при хроническом вирусном гепатите С.//Тезисы VI Российский съезд врачей инфекционистов, С.-Петербург, -29-31 октября 2003., с.22.

9. Ватагина О.Н., Мезенцева М.В., Учакин П.Н., Щербенко В.Э., Карабанов А.В., Иванова-Смоленская И.А., Ершов Ф.И. Цитокиновый дисбаланс при неврологических заболеваниях.// Ж.: Аллергология и иммунопатология, 2004, Т.5, №1, С.210.

Ю.Ватагина О.Н., Мезенцева М.В., Учакин П.Н., Мясоедов Н.Ф., Ершов Ф.И. Модуляция цитокинового баланса in vitro пептидным препаратом селанк.// Тезисы 14 съезда психиатров России, М., 15-18 ноября 2005 г., С. 134

11.Мясоедов Н.Ф., Ершов Ф.И., Учакина О.Н., Учакин П.Н., Мезенцева М.В., Сургучева И.М., Зозуля А.А., Соколов О.Ю. Изучение цитокинмодулирующих и антивирусных свойств биологически активных пептидов - глипролинов.// Тезисы Конференции «Фундаментальные науки - медицине», М., 14-16 декабря 2005 г., С.

12.Uchakina O.N., Uchakin P.N., Mezentseva M.V., Scherbenko V.E., Karabanov A.V., Ivanova-Smolenskaya I.A., Ershov F.I. Immunocorrection of altered cytokine production in neurological patients. // The FASEB Journal, Vol.20, No.5,-2006, A1128.

13.Uchakin P.N., Tobin B.W., Smith S.M., Uchakina O.N. Alterations in aminoacids metabolisms in human immunocytes subjected to microgravity analog. // The FASEB Journal, Vol.20, No.5, -2006, A1055.).

14.Учакин П.Н., Учакина O.H., Моруков Б.В., Ларина И.М., Богданова Н.Б., Мезенцева М.В., Тобин Б.В., Ершов Ф.И. Эндокринная регуляция цитокинового баланса у человека в условиях моделированного космического полета.// Вестник РАМН, М., Медицина, 2006, №7, С. 15-20.

Принято к исполнению 25/12/2006 Исполнено 26/12/2006

Заказ № 1079 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 \vvwv аиК)гсй:га1 гц

В патогенезе большинства инфекционных и неинфекционных заболеваний часто наблюдается дисбаланс в продукции и рецепции нейропептидов, гормонов и цитокинов [23]. Данный факт напрямую указывает на тесное взаимодействие нервной, эндокринной и иммунной систем в регуляции го-меостатических реакций, что обуславливает актуальность исследования взаимосвязей этих регуляторных и эффекторных медиаторов для разработки объективных методов коррекции их дисбаланса

Нарушение нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы служит патогенетическим звеном многих заболеваний Обнаружено, что различные медиаторы нейроэндокринной системы могут селективно модулировать иммунную систему, влияя на пролиферацию иммунекомпетентных клеток и продукцию ими цитокинов [84]. В то же время, выявлены и механизмы обратной связи иммунной и нейроэндокринной систем, реализуемые посредством растворимых медиаторов иммунной системы, в первую очередь - цитокинов [35, 61] Многочисленные исследования показали, что регуляторные пептиды продуцируются клетками иммунной системы в концентрациях, достаточных для нейроэндокринной регуляции и способных оказывать влияние на психическое состояние человека [21]. С другой стороны, нарушения в функционировании нейро-эндокринной системы являются факторами предрасположенности к развитию вторичных иммунодефицитов, приводящих к опасности развития аутоиммунных, онкологических заболеваний, к утяжелению протекания инфекционных заболеваний, и тд [80] Больные, страдающие различными психоневрологическими расстройствами, подвержены частым инфекционным заболеваниям, которые протекают, как правило, в более тяжелой форме

Заболевания вирусной этиологии, гакие как грипп и герпес, являются наиболее широко распространенными и плохо контролируемыми инфекциями Несмотря на многочисленные исследования, направленные на поиск и разработку новых противовирусных и иммуномодулирующих препаратов, эта проблема на сегодняшний день не потеряла своей актуальности В связи с этим, представляется важным детальное изучение продукции цитокинов, играющих ведущую роль в развитии противовирусных и противораковых иммунных реакций у больных с нейродегенеративными заболеваниями для оценки нового подхода иммунокоррекции с использованием нейротропных препаратов, идентичных или близких по природе к эндогенным пептидам

В данной работе, был использован новый подход для коррекции имму-нодефицитных состояний у психоневрологических больных Исследовались иммунотропные свойства новой группы отечественных нейротропных препаратов пептидной природы - глипролинов (Семакс, Селанк, PGP), синтезированных в Институте Молекулярной генетики РАН. Глипролины включают ряд простейших пролинсодержащих ди- и трипептидов и входят в состав олигопептидов, которые легли в основу таких лекарственных препаратов, как Семакс и Селанк Семакс - синтетический аналог фрагмента адренокортико-тропного гормона (АКТГ4 10), полностью лишенный гормональной активности Являясь регулятором функций центральной нервной системы (ЦНС), Семакс в очень низких дозах (3-30 мкг/кг) обладает выраженным ноотроп-ным эффектом и в настоящее время широко используется в неврологической клинике [8, 13] Молекула Селанка может быть рассмотрена как содержащая фрагмент 289-292 иммуноглобулинов (Ig) класса G Ранее проведенные исследования и результаты клинических испытаний подтвердили наличие психотропной активности Селанка, проявляющейся в виде сочетания анксиоли-тического и стимулирующего действия [12, 14] PGP - трипептид, стабилизирующий молекулы Семакса и Селанка, находится на стадии предклинических испытаний в качестве противоязвенного препарата Уникальность свойств этой группы препаратов заключается в их психо-, нейро- и иммуно-тропной активности. Характерными чертами этих пептидов являются высокая эффективность в малых дозах, быстрота наступления эффектов при отсутствии негативных последствий [4, 26]

Целью наших исследований являлось выявление изменений в цито-киновом профиле при экспериментальных вирусных инфекциях (грипп и инфекция, вызванная вирусом простого герпеса (ВПГИ) и ряда психоневрологических патологий, а также обоснование возможности и тактики иммунокоррекции этих нарушений нейротропными препаратами из семейства глипролинов

Для реализации указанной цели решались следующие задачи:

1 Изучить иммуномодулирующие и интерферон-индуцирующие свойства глипролинов в системах in vitro и in vivo.

2 Изучить противовирусную активность глипролинов в отношении вируса гриппа и ВПГИ в системах in vitro и in vivo.

3 Изучить цитокиновый Тип-1/Тип-2 баланс у людей с психоневрологическими заболеваниями (болезнь Паркинсона (БП), гепато-лентикулярная дегенерация (ГЛД), неврастения, генерализированное тревожное расстройство (ГТР))

4 Провести корреляцию экспериментальных лабораторных данных с результатами, полученными при клиническом испытании Селанка

5 Оценить возможность использования глипролинов в качестве иммуно-модуляторов и индукторов интерферона для профилактики и иммунокоррекции вторичных иммунодеффицитов.

В работе использован широкий спектр культуральных, вирусологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов, в том числе им-муно-ферментный анализ (ИФА) и метод полуколичественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Новизна исследования:

1 Впервые была проведена комплексная оценка изменений в экспрессии генов и секреции цитокинов в клеточных культурах и в системе in vivo под воздействием иммуно- и нейротропных препаратов;

2. Впервые выявлено наличие иммуномодулирующих свойств у новых нейротропных препаратов пептидного происхождения, влияющих на продукцию интерферона (ИФН) и других цитокинов

3 Впервые показан противовирусный эффект глипролинов на моделях экспериментальных вирусных инфекций (грипп, ВГ1ГИ)

4 Впервые проведен корреляционный анализ психоневрологического состояния и секреции цитокинов у больных с различными нейро- и психопатологическими нарушениями (БП, ГЛД, неврастения, ГТР)

Практическая ценность:

В работе показаны иммунорегуляторные свойства трех новых отечественных глипролинов: Селанка, Семакса, и PGP. Обнаружены выраженные противовирусные свойства Селанка в отношении вируса гриппа А и вируса простого герпеса I и 2 типов Результаты исследований продемонстрировали возможность и целесообразность использования глипролинов для предупреждения и лечения вирусных заболеваний у людей с психоневрологическими нарушениями Обнаруженные иммуномодуляторные свойства этих пептидов, позволяют классифицировать их в качестве адаптогенов и рекомендовать их клиницистам для применения у лиц старшего возраста и людей, подверженных воздействию стресс-индуцирующих факторов окружающей среды

ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1 Показано цитокин-стимулирующее и интерферон-индуцирующее действие новых отечественных препаратов глипролинов - Семакса и Селанка, синтезированных в Институте молекулярной генетики РАН, в культурах клеток невриномы (НГУК), моноцитарной лейкемии (J-96) и фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ)

2. Селанк обладает выраженным дозозависимым ингибиторным эффектом в отношении вируса гриппа A/Aichi 1/68 (штамм H3N2) в моделях in vitro и in vivo. Применение препарата по профилактической и лечебно-профилактической схемам превышало эффективность ИФН-а.

3. Антивирусная активность препарата Селанк в отношении вируса простого герпеса, используемого по лечебной схеме в моделях in vitro и in vivo, была сравнима с известным индуктором интерферона ридостином

4 Мониторинг цитокинового статуса больных с различными видами психоневрологических нарушений, выявил отклонения в сывороточном содержании цитокинов, регулирующих баланс Тип-1 /Тип-2.

5 В культурах иммунокомптентных клеток больных с депрессивной симптоматикой Селанк модулирует продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-6, блокируя экспрессию его гена, что может объяснить один из возможных механизмов его нейротропных свойств

6 Использование Селанка в качестве анксиолитика при лечении тревожных расстройств сопровождается иммуномодулирующим эффектом на Тип-1/Тип-2 цитокиновый баланс. Зарегистрировано достоверное снижение соотношения ИФН-у/ИЛ-4 и достоверное увеличение соотношения ИЛ-12/ИЛ-10

7 Обнаружение цитокин-модулирующих, интерферон-индуцирующих и противовирусных свойств глипролинов - Семакса и Селанка, позволяет рассматривать их как новый класс иммуномодуляторов, перспективных для предупреждения и лечения инфекционных и неинфекционных заболеваний