Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Прионные болезни: клиника, диагностика и патологическая анатомия

На правах рукописи

РГБ ОД

2 О СЕН 19РЗ

Шитикова Ирина Евгеньевна

ПРИОННЫЕ БОЛЕЗНИ: КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА И ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ

14.00.13. - нервные болезни 14.00.15. - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1999

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте неврологии Российской Академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Завалишин И.А. доктор медицинских наук Гулевская Т.С.

Научный консультант -доктор медицинских наук Ройхель В.М.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Деконенко Е.П. доктор медицинских наук, профессор Орловская Д.Д.

Ведущая организация - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова.

Защита диссертации состоится 1999 г.

в //6 часов на заседании диссертационного совета Д 001.06.01. при Научно-исследовательском институте неврологии Российской Академии медицинских наук (123367, Москва, Волоколамское шоссе, 80).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ неврологии РАМН. Автореферат разослан мая 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук С.Н. Иллариошкин

р СI X 1 ~ / />

< ' 4 г -

1 ' /

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Прионные заболевания - группа очень редких нейродегенеративных болезней человека и животных, вызываемых инфекционными белковыми частицами, которые названы прионами [Prusiner S.В., 1982]. В настоящее время известно 4 болезни человека, этиологически связанных с прионами: болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (СГШШ), фатальная семейная инсомния (ФСИ) и куру. Эти болезни могут манифестировать в виде инфекционных (БКЯ, куру), спорадических (БКЯ) и наследственных форм (БКЯ, СГШШ, ФСИ).

В последние годы интерес к прионным болезням в мире резко усилился в связи с регистрацией нового варианта БКЯ, которая появилась в период эпидемии трансмиссивной спонгиоформной энцефалопатии (ТСЭП) коров в Англии, возбудителем которой является прион. В этот период в Англии зарегистрировано около 40 спорадических наблюдений нового варианта БКЯ, которая дебютировала в молодом возрасте, что нетипично для этого заболевания, причем в процессе патогистологического исследования мозга умерших больных были выявлены изменения, сходные с таковыми при спонгиоформной энцефалопатии коров [Will R.G. et al, 1996]. Последние исследования показали, что такая возможность существует, поскольку линии прионов, выделенные от людей, погибших от нового варианта БКЯ и коров с ТСЭП, оказались идентичными [Hill А. et al., 1997; Bruce М. et al., 1997]. В связи с этим эксперты ВОЗ не исключают возможность значительной эпидемии нового варианта БКЯ в ближайшие 1015 лет [Report WHO, 1998]. Эти данные перевели прионные болезни из категории экзотических заболеваний в важную научно-практическую проблему современной медицины. Изложенное свидетельствует об актуальности изучения прионных болезней на современном этапе.

Следует отметить, что наряду с уточнением механизмов синтеза прионного белка (РгР), путей его трансформации в патологическую

изоформу (PrPSc) и характера влияния последней на нейрон, важным является уточнение клинических и морфологических проявлений прионных болезней, а также разработка адекватных методов их ранней диагностики.

Необходимость дальнейшего изучения проблемы обусловлена чрезвычайным клиническим и патологоанатомическим полиморфизмом прионных болезней, что подтверждается все возрастающим числом описаний вариантов этих заболеваний [Collinge J. et al., 1990; Kirk A. et Ang L.C.,1994; Shabtai H et al., 1996; Carota A. et al., 1996; Campbell T. et al., 1996; Brown P. et al., 1998]. Именно поэтому эксперты ВОЗ рекомендуют публиковать все случаи этих заболеваний и прежде всего БКЯ, которая, возможно, в скором времени будет иметь эпидемическое значение.

Недостаточно разработан вопрос ранней диагностики прионных болезней. Так, достоверным диагноз БКЯ является только в случае обнаружения в мозговой ткани, полученной при секции или в результате прижизненной биопсии, PrPSc. В остальных случаях диагноз этого заболевания трактуется как возможный [Report of WHO, 1996,1997,1998].

В литературе последних лет наблюдается резкое увеличение публикаций по всем направлениям изучения прионных болезней, но реальных результатов по разработке прикладных аспектов этой проблемы пока не получено, что и определило цели и задачи настоящей работы.

Цель настоящего исследования заключалась в анализе клинической и патологоанатомической феноменологии прионных болезней в российской популяции больных, а также совершенствовании методов диагностики этих заболеваний.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клинических проявлений БКЯ и СГШШ в российской популяции больных.

2. Уточнить возможности электрофизиологических и нейровизуализационных методов в диагностике БКЯ.

3. Оценить диагностическую значимость метода исследования изменений в культуре клеток невриномы гассерова узла крысы под влиянием биологических материалов, полученных от больных БКЯ и СГШШ.

4. Изучить характер морфологических изменений в нервной системе в секционных случаях БКЯ, а также по материалам прижизненной биопсии головного мозга.

5. На основании полученных результатов уточнить патогенетические механизмы прионных болезней.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование БКЯ и СГШШ с использованием клинических, электрофизиологических, экспериментальных и морфологических методов. Получены данные, свидетельствующие о том, что БКЯ и СГШШ вызываются, возможно, различными изоформами прионов. Установлено, что в патогенезе прионных болезней имеет значение гематогенный путь. Впервые показано, что когнитивные вызванные потенциалы (Р300) могут быть использованы для объективизации деменции у больных БКЯ. Установлено, что на относительно ранних этапах БКЯ патологические изменения в головном мозге имеют очаговый и умеренно выраженный характер, в финале болезни - диффузный и резко выраженный.

Теоретическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют существующие представления о патогенетических механизмах прионных болезней, которые имеют как общие (путь распространения возбудителя), так и некоторые специфические черты; причем последние реализуются в основном, по-видимому, вследствие различных характеристик возбудителя при БКЯ и СГШШ.

Практическая значимость. 1. Определено диагностическое значение метода изучения изменений в культуре клеток невриномы гассерова узла крысы под влиянием биологических материалов больных БКЯ и СГШШ.

2. Показано, что с целью объективизации деменции при БКЯ могут быть использованы когнитивные вызванные потенциалы (Р300).

3. Установлено, что повторные ЭЭГ-исследования у больных БКЯ способствуют выявлению типичных периодических комплексов, характерных для этой болезни. Динамические КТ- и МРТ-исследования позволяют выявить прогрессирующую атрофию головного мозга как при БКЯ, так и при СГШШ.

4. Выявление спорадического случая прионной болезни, фенотипически сходного с одной из наследственных форм, в частности, СГШШ, ставит вопрос о необходимости наблюдения за семьей пробанда с целью своевременной регистрации аналогичных случаев этого заболевания среди его близких родственников.

Внедрение результатов работы в практику.

Результаты настоящего исследования используются в практике НИИ неврологии РАМН и НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. В.М. Чумакова РАМН.

По заказу Минздрава России сданы в печать методические рекомендации «Клиника и диагностика прионных болезней человека», написанные при участии диссертанта.

Основные положения, выносимые на защиту.

Больные с быстро прогрессирующей деменцией, сочетающейся с нарастающим неврологическим дефицитом в виде пирамидных, экстрапирамидных, мозжечковых нарушений, нуждаются в наблюдении невролога для исключения прионного заболевания.

При подозрении на БКЯ необходимы повторные ЭЭГ-исследования для выявления характерных трехфазных комплексов; КТ- или МРТ-исследования в динамике, изучение когнитивных вызванных потенциалов (Р300).

Изучение изменений в культуре клеток невриномы гассерова узла крысы под влиянием биологических материалов больных БКЯ и СГШШ

является достаточно чувствительным методом диагностики этих заболеваний и, возможно, других болезней этой группы.

В отдельных случаях, главным образом для исключения БКЯ, с диагностической целью возможно проведение прижизненной биопсии головного мозга с исследованием биоптата световой и электронной микроскопией.

Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, III сосудистых, нейрогенетического, нейроинфекционного и реанимационного отделений, лабораторий экспериментальной патологии нервной системы, нейрохимии, нейрофизиологии, патологической анатомии, рентгенодиагностики : НИИ неврологии РАМН 27.04.1999 г. По материалам диссертации сделано 4 доклада на научных конференциях, в том числе: на конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1998; на международном симпозиуме «Нейроиммунология на пороге XXI века», С-Петербург, 1998; на Международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний нервной системы» Уфа, 1998; на Международном симпозиуме «Демиелинизация и прионные болезни» Донецк, 1998.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав и выводов. Иллюстрирована 3 таблицами, 9 рисунками и 28 фотографиями. Библиография содержит 20 работ отечественных и 165 - зарубежных авторов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Содержание работы

Общая характеристика больных и методы исследования

В настоящей работе представлен анализ случаев прионных болезней, которые наблюдались не только в НИИ неврологии РАМН, но и на кафедрах нервных болезней медицинских институтов Москвы и в ряде тех лечебных учреждений города, где этот диагноз ставился за последние 25 лет. Подобных больных оказалось 17, в том числе 15 с болезнью Крейтцфельдга-Якоба, и 2 -с синдромом Герстманна-Штреусслера-Шейнкера.

Однако в результате изучения медицинской документации в одном случае диагноз БКЯ был исключен, поскольку при КТ-исследовании у больного были выявлены признаки вентрикулита, а медицинские документы

3 больных были утеряны. Таким образом, последующему анализу было подвергнуто 13 наблюдений с прионными болезнями, из них 11 больных было с диагнозом БКЯ, причем в 7 случаях диагностика этого заболевания был подтверждена при патологоанатомическом исследовании; и 2 - с диагнозом СГШШ. Все наблюдения были спорадическими.

При изучении историй болезни на предмет адекватности диагностики БКЯ и СГШШ использовались критерии диагноза этих болезней, предложенные экспертами ВОЗ [Report of WHO, 1996,1998].

Среди подвергнутых нами анализу' 11 больных с БКЯ было 7 мужчин и

4 женщины, в основном старше 50 лет, но среди мужчин было 2 пациента в возрасте 39 и 40 лет. Шесть умерших в стационаре больных болели менее 1 года, двое - больше года (13 и 25 мес,), катамнез остальных 3 больных не известен.

Больные - мужчина и женщина с СГШШ - были в возрасте соответственно 48 и 49 лет, длительность болезни 2 и 3 года. Катамнез первого не известен, вторая умерла дома на 6 году болезни.

В 10 наблюдениях БКЯ проводилось ЭЭГ-исследование, в отдельных случаях исследовались соматосенсорные, слуховые, зрительные и когнитивные (Р300) вызванные потенциалы, в 10 - КТ- и/или МРТ-

исследования головного мозга, в 8 исследовалась цереброспинальная жидкость, в 2 проводилась биопсия мозговой ткани с последующим ее свето-и электронно-микроскопическим изучением. У 2 больных СГШШ проводилось ЭЭГ-исследование, а также КТ- и МРТ-исследования. Анализ результатов нейрофизиологических и нейровизуализационных исследований, в том числе выполненных в других лечебных учреждениях, проводился в лаборатории нейрофизиологии (руководитель - доктор биологических наук В.В. Гнездицкий) и отделе лучевой диагностики (руководитель - кандидат медицинских наук А.И. Кугоев) НИИ неврологии РАМН.

В двух наблюдениях (БКЯ и СГШШ) был использован метод диагностики прионных болезней, заключающийся в анализе изменений в культуре ткани невриномы гассерова узла крысы под влиянием сыворотки и сгустка крови, а также суспензии биоптата мозговой ткани больной БКЯ, предложенный доктором медицинских наук В.М. Ройхелем и соавт. (1987) в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН имени В.М. Чумакова,, где и осуществлен нами этот раздел работы. Для этого использовали перевиваемые культуры клеток невриномы гассерова узла крысы [Авцын А.П. с соавт., 1989]. Подобный подход был обоснован тем, что ранее были показаны изменения в этих клетках при инфицировании их агентом скрепи -прототипическим для всей группы прионных болезней [Ройхель ВМ. и соавт., 1987]. Однослойные культуры клеток невриномы гассерова узла крысы заражали 10% суспензией сгустка крови больной и разведенной в 10 раз сывороткой крови. Использовали две модификации заражения - на монослой выращенных клеток и в суспензию клеток. В первом случае после контакта клеток с инокулируемым материалом монослой многократно отмывали. В контрольных группах на клетки невриномы гассерова узла крысы воздействовали сывороткой крови и суспензией сгустка крови здорового человека. После заражения проводили 3 последовательных пассажа на 3-4-й день роста клеток. Материал 3-го пассажа был использован для проведения морфологических и электронно-микроскопических исследований (НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН имени

В,М, Чумакова, км.н. С.Г. Соболев). Для проведения морфологических исследований клетки выращивали на покровных стеклах, выращенные клетки фиксировали в динамике роста на 1 - 4-е сутки в жидкости Карнуа, окрашивали гематоксилином Коуля и эозином. Митотический индекс рассчитывали по методу И.А. Алова и соавт.[1973]. Кроме того, определяли уровень и характер патологических митозов. Препараты для электронной микроскопии готовили по стандартной методике. Монослой клеток снимали механическим путем, центрифугировали при 3000 об/мин, осадок фиксировали в 2% глутаральдегиде на какодилатном буфере, обезвоживали в восходящей серии спиртов и в окиси пропилена и заключали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на микротомах LKB-4800 и Reichert ОМ-3. Срезы контрастировали цитратом свинца и насыщенным раствором спиртового уранилацетата и просматривали в электронном микроскопе JEM - 100Х при ускоряющем напряжении 80 кВ.

В 7 секционных случаях был исследован головной мозг, в 3 из них спинной мозг и периферические нервы. Следует отметить, что в 2 наблюдениях БКЯ была произведена прижизненная стереотаксическая биопсия мозговой ткани из правой лобной доли с последующим ее свето- и электронно-микроскопическим исследованием.

Головной мозг в трех наблюдениях исследовался по единой методике, принятой в лаборатории патологической анатомии НИИ неврологии РАМН (руководитель - доктор медицинских наук Т.С. Гулевская). Исследовалась кора всех долей (по нескольку участков из каждой доли, практически из каждой извилины), базальные ядра, таламус, гипоталамус, мозолистое тело, средний мозг, варолиев мост на разных уровнях, продолговатый мозг, мозжечок, а также спинной мозг (шейный, грудной, поясничный отделы). В остальных 4 случаях исследовались отдельные участки головного мозга, полученные из других лечебных учреждений.

Для микроскопического исследования головного мозга были применены следующие гистологические и нейрогистологические методы окраски и импрегнации срезов: гематоксилином и эозином, по ван Гизону,

фукселином по методу Вейгерта (на эластические волокна), импрегнация по Снесареву (на аргирофильные волокна). Для изучения состояния нейронов и нейроглии срезы окрашивались крезилвиолеттом по Нисслю, лаксолевым прочным голубым (на миелиновые волокна и нейроны), импрегнировались по Кахалю (на протоплазматические астроциты), по Мийагава-Александровской (на микроглиоциты и олигодендроглиоциты), по Гросс-Бильшовскому (на нейрофибриллы), по Кампосу (на осевые цилиндры). Замороженные срезы окрашивались на липиды шарлахом-красным и на миелин по Шпильмейеру. Препараты из биоптатов мозговой ткани окрашивались гематоксилином и эозином, Конго-рот, по ван Гизону, Нисслю, Билыповскому. Для электронно-микроскопического исследования проводили стандартную глутар-осмиевую фиксацию ткани мозга с последующей проводкой и заливкой в смолы. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим, а ультратонкие - уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали в электронном микроскопе 1ЕМ-100В (Япония).

Результаты исследований

Болезнь Крейтцфельдта-Якоба

В наших исследованиях БКЯ составила 11 наблюдений. Основным клиническим проявлением болезни была быстро прогрессирующая деменция, как правило, с двигательными нарушениями. Следует отметить, что во всех случаях имело место постепенное развитие заболевания.

В результате ретроспективного анализа установлено, что у половины больных регистрировались продромальные симптомы за 1-6 месяцев до появления первых признаков болезни. При этом в разных сочетаниях отмечались астения, адинамия, общая слабость, головокружение, головные боли, нарушения сна, боли в ногах, снижение аппетита, потеря массы тела, изменения в поведении, нарушения внимания и памяти.

Первыми симптомами болезни чаще были диплопия, нарушения зрения, шаткая походка, дизартрия, нарастающие психические нарушения, реже - скованность в ногах, дрожание в руках. У всех больных имело место

прогрессирующее течение заболевания без эпизодов стабилизации патологического процесса.

В развернутой стадии болезни у всех 11 больных наблюдались разной степени выраженности и в разных сочетаниях деменция, пирамидные и зкстралирамидные симптомы; у 7 больных - мозжечковые нарушения; у 6 -миоклонус; у 5 - головокружение, зрительные и глазодвигательные нарушения; у 4 - псевдобульбарные нарушения, вегетативные расстройства и амиотрофии.

В финальной стадии болезни (7 больных) наблюдали распад личности вплоть до тотальной деменции и мутизма, разной глубины расстройства сознания, децеребрационную ригидность, миоклонии, гипертермию, сопутствующую соматическую патологию, нарушения дыхания центрального типа.

Из лабораторных методов диагностики БКЯ наибольшее значение имела ЭЭГ, что соответствует данным литературы [Schlenska GK., Walter GF., 1989]. При этом у всех 10 исследованных больных отмечалось общее снижение уровня электрической активности мозга, доминировала медленноволновая активность тета- и дельта- диапазона (рис. 1). Обращает на себя внимание, что только у 5 больных, которые находились на более поздних этапах патологического процесса, регистрировались трехфазные острые волны тета-диапазона. Следует отметить, что указанные изменения электрической активности головного мозга у 2 пациентов удалось выявить лишь в процессе повторных исследований. Последнее обстоятельство позволяет сделать вывод о необходимости динамических ЭЭГ- исследований при подозрении на БКЯ.

С целью объективизации дегенеративного процесса в нервной системе у двух больных исследовали когнитивные вызванные потенциалы (Р300). В обоих случаях выявлены изменения этого показателя, причем в обоих наблюдениях патологический потенциал Р300 отражал наличие деменции (рис.2).

Рисунок 1. ЭЭГ в динамике у больной Е., 55 лет с диагнозом БКЯ.

А - обследование 04.03.95 г. (видно преобладание в - активности, а -ритм дезорганизован, единичные вспышки острых волн);

Б - обследование 10.03,95 г. (отчетливое появление трехфазных острых волн, носящих периодический характер; периодов изолиний не определяется).

Отведения - монополярные референциалъные относительно ипсилатерального ушного электрода.

В процессе КТ- и/или МРТ- исследований, проведенных у 10 больных, выявлены признаки атрофии головного мозга в виде увеличения желудочков и цистерн мозга, расширения борозд и атрофии мозжечка. Указанные изменения были выражены в большей степени у 3 пациентов с более длительным течением заболевания. Следует отметить, что у наших больных при МРТ-исследовании в Т2-режиме не выявлялись гиперденсивные сигналы в проекции базальных ганглиев и зрительных бугров, о чем имеются сообщения в литературе [Yoon S. et al, 1995; Almond J. et al, 1996].

Рисунок 2. Результаты обследования когнитивных ВП (Р300) у больной Е., 55лет с диагнозом БКЯ, 04.03.95 г..

Слева представлены ВП на незначимый (частый) стимул; справа - на значимый (редкий) стимул в условиях его опознания (больная ошибалась при их подсчете).

На незначимый стимул - отчетливо выраженный сенсорный ответ в виде У-волн (компоненты М-Р), параметры которого в пределах нормы.

На значимый стимул - отчетливая волна с латентностью 420 мс. (Р3(300)=420 мс), в норме для данного возраста - Р3(300)= 360 мс.

Комплекс Ш-РЗ-Ю(РЗОО) - когнитивная и Ы1-Р2 - сенсорная части ответа при усреднении на значимый стимул,.

Рутинные исследования крови и цереброспинальной жидкости не выявили воспалительных и каких-либо других изменений в этих биологических материалах.

В двух случаях БКЯ с диагностической целью была произведена стереотаксическая биопсия головного мозга. При световом и электронно-микроскопическом исследовании биоптата коры лобной доли обнаружены

морфологические изменения ткани мозга, считающиеся характерными для спорадических форм БКЯ: утрата нейронов и тяжелые изменения оставшихся нервных клеток, пролиферация астроцитарной глии и спонгиоз. Электронно-микроскопическое исследование показало наличие типичных для БКЯ множественных вакуолей в нейропиле, развивающихся преимущественно в отростках нейронов (аксонах и дендритах), а также глиоцитов с деструкцией их органелл и накоплением обрывков измененных мембран; значительно реже вакуоли обнаруживались в перикарионе глиоцитов и нейронов (рис. 3).

Рисунок 3. Результаты исследования биопсийного материала больной £., 55 лет с БКЯ. Электронная микроскопия (а-в) и световая микроскопия (г-е).

а. Множество полостей, ограниченных мембраной, в нейротте в некоторых - дополнительные более мелкие полости, часть которых окаймлена двухконтурной мембраной. Ув. х 20000.

б. Многокамерная полость с "вторичными", ограниченными мембраной, вакуолями, в них на территории аксона миелинизированные нервные волокна; очаговое расщепление миелиновой оболочки. Ув. х 30000.

в. Формирование множества вакуолей вблизи нейрона, в цитоплазме которого определяется большое число липид-липофусциновых комплексов, набухание митохондрий и скопление большого числа поперечно срезанных и плотно расположенных филаментов. Ув. х 30000.

г. Выпадение нейронов, пролиферация астроглии, единичные микровакуоли в коре. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 240.

д. Изменения нейронов III слоя коры (гиперхроматоз ядер, хроматолиз цитоплазмы) и увеличение числа астроцитов с гипертрофированными ядрами. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х400.

е. Извитость миелиновых волокон в подкорковом белом веществе с расширением аксонов. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим. Ув. х 1000.

С целью совершенствования прижизненной диагностики БКЯ мы заразили перевиваемую культуру клеток невриномы гассерова узла крысы 10% раствором сыворотки крови больной БКЯ, 10% суспензией сгустка крови и 10% суспензией биопсийного материала головного мозга больной БКЯ. После инокулирования проводили 5 последовательных пассажей через 4-5 дней роста клеток и материал 5 пассажа использовали для проведения морфологических и электронно-микроскопических исследований.

Показано, что в клетках, инфицированных всеми видами исследуемых материалов (суспензия головного мозга, сыворотка крови и смесь сыворотки с суспензией сгустка крови), имело место повышение митотического индекса по сравнению с интактным контролем; в первые сутки культивирования митотический индекс увеличивался в 1,6-1,7 раза. При дальнейшем культивировании в пределах 4 суток значение митотического индекса снижалось. Повышение митотического индекса не сопровождалось увеличением числа патологических митозов и гигантских клеток.

При электронно-микроскопическом изучении препаратов зараженных клеток показано, что заражение клеток сгустком крови и смесью сыворотки и сгустка крови приводило к появлению более чем в 50% клеток многослойных

мембран, в меньшей степени (более чем в 20% клеток) они присутствовали в клетках, инокулированных биопсийным материалом головного мозга. Следует отметить, что появление многослойных мембран имеет место и в головном мозге экспериментальных животных, а также в культуре клеток, зараженных агентом скрепи, причем их количество у животных возрастало в динамике инфекции пропорционально накоплению агента скрепи [Beck Е. et al., 1982; Roykhel V.M. et al., 1990]. Таким образом, появление и накопление многослойных мембран в значительном количестве может рассматриваться как свидетельство наличия и накопления в клетках агента трансмиссивных спонгиоформных энцефалопатий.

Итак, использованный нами метод диагностики БКЯ показал свою эффективность в анализируемом случае этой болезни. Следует лишь отметить, что метод не является прямым, поскольку о наличии прионной инфекции мы судим по косвенным признакам. Тем не менее, результат этого исследования подтвердил диагноз БКЯ при жизни больной.

Таким образом, диагностика БКЯ в наших наблюдениях была как основана на характерных для этого заболевания клинических данных (деменции, пирамидных и экстрапирамидных и мозжечковых симптомах, миоклонусе), так и результатах комплекса лабораторных исследований. К последним относятся KT- и МРТ-исследования, нейрофизиологические методы (ЭЭГ, когнитивные вызванные потенциалы (Р300), а также изучение изменений в культуре ткани невриномы гассерова узла крысы под влиянием биологических материалов больных. В отдельных случаях с диагностической целью может проводиться биопсия головного мозга.

Результаты посмертного морфологического исследования нервной системы во всех семи случаях подтвердили диагноз спорадической формы БКЯ на основании выявления триады характерных классических морфологических признаков этого заболевания: гибели нейронов, преимущественно в коре полушарий большого мозга, астроглиоза и спонгиоформной дегенерации серого вещества.

Указанные деструктивные процессы в коре больших полушарий головного мозга, очевидно, являются морфологическим субстратом деменции, которая была четко выражена в наших наблюдениях, нарастая по мере прогрессирования заболевания. Эти обстоятельства могут определять и динамику изменений на ЭЭГ.

Однако патологические изменения выявлялись не только в коре, но и в той или иной степени выраженности распространялись на базальные ядра, таламус, мозжечок, белое вещество головного мозга, что находило свое выражение в развитии топически локальных по клиническим данным проявлений БКЯ (расстройства координации, спастические парезы, супрануклеарные симптомы, гиперкинезы и т.д.).

В исследованных случаях не было обнаружено амилоидных куру-бляшек, однако это не противоречит диагнозу БКЯ, так как, по данным литературы, в спорадических случаях заболевания эти бляшки обнаруживаются только в 5-10% случаев [Ironside J.В., 1996; DeArmond S. et al., 1996].

При сопоставлении результатов морфологического исследования биоптатов мозговой ткани и данных секции в одних и тех же наблюдениях нам впервые удалось установить, что на более ранних этапах БКЯ патологический процесс имеет очаговый и умеренно выраженный характер, в отличие от более диффузных и резко выраженных выпадений нейронов и их дегенеративных изменений, а также спонгиоза и пролиферации астроцитов в финале болезни. Результаты клинико-морфологических сопоставлений показали, что клинический полиморфизм БКЯ обусловлен особенностями локализации патологического процесса. В свою очередь, локализация процесса, в соответствии с современными представлениями, очевидно, связана с полиморфизмом 129 кодона PRNP и типом PrPres [Gambetti P., 1997].

Итак, в спорадических случаях вероятный диагноз БКЯ может быть поставлен при наличии характерной клинической симптоматики (прогрессирующая деменция, симптомы поражения пирамидных,

экстрапирамидных и мозжечковых систем, миоклонические судороги, типичные изменения на ЭЭГ и др.) не только при аутопсии, но и с помощью биопсии мозга. Так, при свето- и электронно-микроскопическом исследовании биоптатов коры мозга, проведенной за несколько месяцев до летального исхода, в двух случаях были выявлены морфологические признаки, типичные для БКЯ, однако, в отличие от секционных данных, все эти изменения носили умеренно выраженный и ограниченный характер. При этом наиболее умеренно был выражен такой, считающийся основополагающим морфологический признак, как спонгиоформная дегенерация серого вещества, что создавало определенные трудности при прижизненной светооптической диагностике БКЯ, а также свидетельствовало о том, что на данной стадии заболевания спонгиоз не носит распространенного характера. Более информативными оказались данные электронной микроскопии, выявившие в обоих случаях ультраструктурные изменения, типичные для спонгиоформных энцефалопатии.

Вместе с тем, необходимо отметить, что достоверным морфологическим методом диагностики этого и других прионных заболеваний в настоящее время является иммуноцитохимический метод выявления отложений PrPSc в ткани мозга. Инфекционная изоформа прионного белка откладывается в синапсах коры мозга и мозжечка, а также в амилоидных бляшках. По данным литературы, иммуноцитохимическим методом был подтвержден диагноз в 179 спорадических случаях БКЯ [Geneva, 1996]. При этом исследование иммуноцитохимическим методом биоптатов мозга свидетельствует о том, что отложение прионного белка является наиболее ранним этапом в развитии БКЯ и определяется еще до развития структурных изменений в ткани мозга [Castellani R. et al., 1996].

Однако, несмотря на высокую диагностическую значимость биопсии головного мозга на современном этапе ее целесообразно проводить лишь в отдельных случаях скорее для исключения БКЯ, чем для подтверждения диагноза этого заболевания. Это обусловлено не только отсутствием методов лечения БКЯ, но и опасностью появления ятрогенных случаев болезни

[Geneva, 1998] в связи с высокой контагиозностью ткани головного мозга больных БКЯ.

Синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера.

СГШШ мы наблюдали у двух больных (мужчины и женщины), соответственно 48 и 49 лет. Главным клинически проявлением болезни были мозжечковые нарушения (динамическая и статическая атаксия), разной степени выраженности пирамидные симптомы, легкие когнитивные нарушения. При ЭЭГ- исследовании выявлены неспецифические изменения. При КТ- и МРТ-исследовании - признаки атрофии головного мозга. В обоих наблюдениях заболевание развивалось исподволь и имело прогрессирующее течение. Больные находились на лечении в НИИ неврологии РАМН однократно. Одна больная умерла дома на шестом году болезни, катамнез другого не известен. Дифференциальный диагноз проводился с наследственными болезнями нервной системы, рассеянным склерозом, лейкодистрофией и другими. Биопсия головного мозга не проводилась. Оба наши наблюдения были спорадическими, хотя большинство описанных наблюдений являются семейными, что не противоречит данным литературы. Мутации PRNP не исследовались.

В одном наблюдении СГШШ были проведены дополнительные исследования, направленные на индикацию изменений в перевиваемых клетках невриномы гассерова узла крысы, вызываемых возбудителями прионных болезней.

Показано, что инокуляция клеточной культуры сывороткой и сгустком крови больной вызывали вначале угнетение размножения клеток невриномы Гассерова узла крысы, а затем усиление их пролиферации. Так, митотический индекс клеток после заражения сывороткой крови и сгустком крови больной на первые сутки роста был ниже контрольных значений в 2,2 и 3 раза соответственно. На 2 сутки роста митотический индекс в клетках инфицированной культуры был в 2,6 раза выше, чем в контроле. Наиболее существенное повышение митотического индекса наблюдалось на 3 и 4 сутки

роста при заражении клеток суспензией сгустка крови. В указанные сроки роста значения миготического индекса в 4,5 и 7,5 раза, соответственно, превышали контрольный уровень.

Инфицирование клеток сывороткой и сгустком крови больной также приводили к увеличению процента патологических митозов. При заражении клеток сывороткой больной количество патологических митозов возрастало, в среднем, в 1,4 раза, а при инокуляции сгустком крови - в 2,5 раза. Наиболее частой формой патологии деления было рассеивание хромосом.

При электронно-микроскопическом исследовании клеток невриномы Гассерова узла крысы, инокулированных на монослой или в суспензию клеток, показано, что заражение материалом от больной приводило к выраженному увеличению количества многослойных мембран, в отличие от результатов инокуляции клеток контрольными материалами (рис. 4). Следует отметить, что уровень образования многослойных мембран при заражении сывороткой крови и сгустком крови больной СГШШ был такой же, как при экспериментальной инокуляции клеток агентом скрепи и в головном мозге зараженных экспериментальных животных [ЯоукЬе1 У.М.й а1.,1990], а также у описанной выше больной БКЯ.

Результаты гистологического и электронно-микроскопического исследования клеточных глиальных культур, зараженных материалами от больной СГШШ, являются еще одним дополнительным доказательством того, что это заболевание относится к группе прионных болезней.

Рисунок 4. Ультраструктурные изменения клеток невриномы гассероеа узла крысы-2 после инокуляции биологическими материалами от больной К, 48 лет с СГШШ.

а. Клетки невриномы гассероеа узла крысы-2 после инокуляции агента скрепи в суспензию. Скрученные мембраны в вакуолях. Ув.х20000

б. Клетки невриномы гассероеа узла крысы-2 после инокуляции сыворотки больной СГШШ в суспензию. Многослойные мембраны и вакуоль - «мыльный пузырь», расположенный межклеточно. Ув.х 53000

е. Клетки невриномы гассероеа узла крысы-2 после инокуляции сыворотки больной СГШШ в суспензию. Формирование «дочерней вакуоли» в вакуоли цитоплазмы. Ув.х53000

г. Клетки невриномы гассероеа узла крысы-2 после инокуляции сгустка крови больной СГШШ на монослой. Многослойные мембраны, расположенные межклеточно. Ув.хЗЗООО

Таким образом, диагностика СГШШ в наших наблюдениях основывалась на особенностях клинической картины (мозжечковые и негрубые когнитивные нарушения), МРТ и/или KT данных (атрофия головного мозга), а также на результатах изучения изменений в культуре клеток невриномы гассерова узла крысы под влиянием сыворотки и сгустка крови больной.

Молекулярно-генетические исследования на предмет выявления мутации PRNP мы не проводили, но клинически приведенное наблюдение ближе к генотипу PrP Prol02Leu-129Met, для которого также характерны главным образом мозжечковые и нерезко выраженные когнитивные нарушения. Поскольку случаи СГШШ в данных семьях единственные, необходимо наблюдение за всеми кровными родственниками больных для выявления повторного случая этой болезни.

Обсуждение результатов экспериментальных исследований

Изменения в культуре клеток невриномы гассерова узла крысы под влиянием биологических материалов больных БКЯ и СГШШ позволяют обсуждать не только вопросы диагностики этих заболеваний, но и проблемы этиологии и патогенеза. Так, показано, что в обоих случаях в этих клетках появляются многослойные мембраны. Эти мембраны аналогичны подобным структурам в головном мозге мышей, зараженных агентом скрепи, причем их количество возрастало в динамике инфекции пропорционально накоплению агента скрепи [Roykhel V.M. et al., 1990]. В литературе также имеются указания на выявление многослойных мембран в головном мозге обезьян, зараженных агентом куру [BeckE. et al., 1982].

Итак, появление и накопление многослойных мембран в значительном количестве может рассматриваться как свидетельство наличия и накопления в клетках агента трансмиссивных спонгиоформных энцефалопатии Способность этих агентов персистировать в различных клеточных культурах, вызывая в них определенные изменения, отмечалась и другими авторами. Так, при инфицировании клеток мышиной нейробластомы агентом

скрепи в них накапливается иммунореактивный белок приона скрепи, резистентный к перевариванию протеазой К, агент скрепи был способен длительно персистировать и в гибридных соматических клетках [Ройхель В.М. и др., 1997; McKinley М.Р. et al., 1978;NearyK. etal., 1991].

Таким образом, использованный нами метод диагностики БКЯ и СГ1ПШ показал свою эффективность в анализируемых случаях этих болезней. Следует лишь отметить, что метод не является прямым, поскольку о наличии прионной инфекции мы судим по косвенным признакам. Тем не менее, результат этого исследования подтвердил диагноз БКЯ при жизни больной.

В модельных опытах по инфицированию клеток невриномы гассерова узла крысы агентом скрепи длительное (двухлетнее) их культивирование сопровождалось повышением митотического индекса; в инфицированных клетках по сравнению с контролем это повышение было 1,7 -кратным на 32 пассаже, 2,8-кратным - на 51 пассаже и 4,8-кратным - на 99 пассаже [Roykhel V.M. et al., 1987]. Таким образом, выявленное в настоящей работе под влиянием биологических материалов больных БКЯ и СПИШ повышение митотического индекса в 1,6-1,8 раза, определяемое на уровне 5 пассажа, соответствовало этим данным. В то же время динамика изменений митотического индекса, определяемая при инфицировании клеток невриномы гассерова узла крысы агентами СПИН! и БКЯ, была различной. В обоих случаях имело место повышение уровня митотического индекса, но при инфицировании агентом СГШШ начальное падение его на 1 сутки роста культуры сменялось повышением с максимумом к 3-4 суткам роста, а при инфицировании клеток агентом БКЯ подъем митотического индекса имел место уже в первые сутки роста культуры и сменялся его падением к 3-4 суткам. Можно полагать, что отмеченные различия в динамике изменения митотического индекса и отсутствие индукции патологических митозов в случае инфицирования клеток агентом БКЯ могут быть связаны с особенностями реакции клеток невриномы гассерова узла крысы на инфицирование этими возможно в чем-то различными двумя агентами.

Заслуживает внимания и то обстоятельство, что реакция клеток невриномы гассерова узла крысы была практически одинакова при инфицировании их как сывороткой и сгустком крови больной, так и суспензией биопсийного материала головного мозга. Это позволяет использовать для диагностики такие доступные биологические материалы, как сгусток крови и сыворотка крови. Использование крови как субстрата для проведения диагностики прионных болезней хорошо соответствует данным литературы о прионемии, выявленной при экспериментальной инфекции животных агентами БКЯ и скрепи, и возможности воспроизведения инфекции при инокуляции сгустком крови и признания значимости гематогенного пути в патогенезе инфекции (ТОпщег Н., 1984; Кигос1а Y е! а1., 1983; МапиеМв Е.Е. е1 а1., 1978].

Полученные нами в ходе экспериментальной работы результаты дают основание для ряда выводов прикладного и теоретического характера. В практическом плане оригинальный метод изучения изменений в культуре невриномы гассерова узла крысы под влиянием биологических материалов больных БКЯ и СГШШ позволяет говорить о возможности более широкого применения его для прижизненной диагностики различных клинических форм прионных болезней. Исследование когнитивных вызванных потенциалов (Р300) может быть использовано в качестве дополнительного прижизненного диагностического теста БКЯ с целью объективизации психических нарушений. В теоретическом плане имеют значение результаты наших исследований, свидетельствующие о возможности существования различных линий прионов, а также о вероятной роли гематогенного пути в патогенезе этой группы заболеваний.

Выводы

1. В результате анализа 13 случаев прионных болезней (11 - БКЯ и 2 -СГШЩ) установлено, что наряду с типичными клиническими проявлениями (быстро прогрессирующей демечцией, пирамидных, мозжечковых и экстрапирамидных симптомов) во всех наблюдениях БКЯ, у 3 из них в различных сочетаниях выявлены некоторые особенности феноменологии этого заболевания, такие как расстройства сна, зрительные и слуховые галлюцинации в начале болезни, тазовые и вегетативные нарушения, вовлечение в процесс периферической нервной системы; в двух наблюдениях СГШШ, помимо мозжечковых нарушений, выявлены негрубые когнитивные нарушения.

2. У всех обследованных больных в процессе ЭЭГ-исследования отмечено снижение уровня биоэлектрической активности мозга, доминирование медленноволновой активности тета- и дельта- диапазона; у половины пациентов БКЯ регистрировались трехфазные острые волны, в двух наблюдениях они выявлены при повторном исследовании. У 2 больных БКЯ имели место изменения когнитивных ВП (Р300), что отражало наличие деменции. В процессе КТ- и/или МРТ- исследований у всех больных БКЯ и СГШШ выявлены признаки прогрессирующей атрофии головного мозга.

3. Установлено диагностическое значение оригинального метода исследования морфологических изменений в культуре ткани невриномы гассерова узла крысы при использовании сыворотки и сгустка крови больных БКЯ и СГШЩ в виде повышения митотического индекса и образования многослойных мембран для установления их прионной этиологии.

4. При выявлении случая спорадического прионного заболевания, фенотипически сходного с одной из наследственных его форм, необходимо динамическое наблюдение за родственниками пробанда с целью своевременной регистрации повторного случая этой болезни в семье.

5. В результате патологоанатомичеекого исследования нервной системы в 7 случаях БКЯ выявлена триада характерных для этого заболевания признаков: дегенерация и гибель нейронов, преимущественно в коре полушарий большого мозга, астроглиоз и спонгиоформная дегенерация серого вещества. Эти изменения в той или иной степени распространялись и на базальные ядра, таламус, мозжечок, белое вещество головного мозга. Ни в одном случае не были выявлены куру-бляшки.

6. Результаты светооптического изучения биоптатов мозговой ткани при БКЯ показали, что в отличие от секционных данных, характерные для этого заболевания дегенеративные изменения в нервной системе носили умеренно выраженный и очаговый характер. При этом менее значительно были выражены спонгиоформная дегенерация серого вещества, а также утрата нейронов и пролиферация астроцитов, что может свидетельствовать о достаточно ранней стадии болезни, когда все эти изменения, и в первую очередь спонгиоз, еще не носят диффузного характера. Более информативными оказались данные электронной микроскопии, выявившие в обоих случаях распад клеточных мембран, характерный для спонгиоформных энцефалопатий.

7. Итоги проведенного исследования расширяют существующие представления о патогенезе прионных болезней, поскольку свидетельствуют о роли гематогенного пути в механизмах развития патологического процесса при БКЯ и СГШШ. Кроме того, результаты проведенной работы позволяют сделать вывод, что эти два заболевания вызываются по-видимому разными изоформами РгР5с.

Практические рекомендации

1. Пациенты с быстро прогрессирующей деменцией, сочетающейся с нарастающими пирамидными, экстрапирамидными и мозжечковыми нарушениями, а также миоклониями, нуждаются в наблюдении невролога для исключения прионного заболевания.

2. При подозрении на БКЯ необходимы повторные ЭЭГ-исследования, КТ-и/или МРТ-исследования в динамике, изучение когнитивных ВП (РЗОО), анализ изменений в культуре клеток невриномы гассерова узла крысы под влиянием биологических материалов больных, в отдельных случаях для исключения БКЯ может проводиться биопсия головного мозга.

3. В случае выявления пациента со спорадическим прионным заболеванием, фенотипически сходным с одной из наследственных его форм, необходимо наблюдение за семьей пробанда для своевременной регистрации повторного случая аналогичной болезни среди его родственников.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Завалишин И.А., Верещагин Н.В., Ройхель В.М., Жученко Т.Д., Шитикова И.Е. Прионовые болезни.// Вестник РАМН - 1997,- № 9, С. 48-55.

2. Ройхель В.М., Фокина Г.И., Кондакова Л.И., Соболев С.Г., Погодина В.В., Джибладзе Д.Н., Гнездицкий В.В., Кашина Е.М., Переседов В.В., Сунгуров Е.Б., Кугоев А.И., Чайковская Р.П., Коновалова Е.В., Шишкова И.Е., Завалишин И.А. Прижизненная диагностика прионовых губкообразных трансмиссивных энцефалопатий.// Вопр. вирусологии.-1997,- № 5, С. 259-265.

3. Шитикова И.Е., Завалишин И.А., Гнездицкий В.В., Федин П.А. Клинико-нейрофизиологический анализ верифицированного случая болезни Крейтцфельдта-Якоба. //В сб. Международной конференции «Современное состояние методов неинвазивной диагностики в медицине» "НЕЙРО-97"- Украина, Ялта-Гурзуф,- 1997.-С.32-34.

4. Завалишин И.А., Ройхель В.М., Жученко Т.Д., Шитикова И.Е. Прионовые болезни человека.//Журн. невропатол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. -1998.-№ 1, С.61-66.

5. Верещагин Н.В., Завалишин И.А., Ройхель В.М., Жученко Т.Д., Шитикова И.Е. Прионы и нейродегенеративные заболевания человека. //Клиническая медицина,-1998.-№ 5, С.4 -7.

6. Завалишин И.А., Шитикова И.Е., Попова Л.М., Джибладзе Д.Н., Пирадов М.А., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д., Адарчева Л.С, Иллариошкин С.Н., Бородулина В.А., Спиридонов Ю.М., Емелин Е.В. Клинические проявления прионных болезней человека./'/V Российский конгресс «Человек и лекарство» . Тез. докл. - Москва, 21-25 апреля 1998. С. 426

7. Завалишин И.А., Ройхель В.М., Гнездицкий В.В., Шитикова И.Е, Джибладзе Д.Н., Кугоев А.И., Фокина Г.И., Кондакова Л.М., Соболев С.Г., Погодина В.В., Чайковская Р.П., Кашина Е.М., Сунгуров Е.Б.. Болезнь Крейтцфельдта-Якоба: новые возможности прижизненной диагностики.//Международный медицинский журнал.-1998.-N1, С.50-55.

8. Гулевская Т.С., Ложникова С.М., Чайковская Р.П., Соболев С.Г., Джибладзе Д.Н., Попова Л.М., Пирадов М.А., Шитикова И.Е., Завалишин И.А. Значение биопсии головного мозга для диагностики болезни Крейтцфельдта-Якоба.// Материалы конференции «Восточная и западная медицина - реальная помощь». Лики России, С-Птб..1998.-С.48-49.

9. Шитикова И.Е., Завалишин И.А. Болезнь Крейтцфельдта-Якоба в Московском регионе. //Международный медицинский журнал.-1998.- N 910, С. 856-858.

10.И.А. Завалишин., И.Е. Шитикова, В.М. Ройхель, Т.С. Гулевская, В.В. Гнездицкий, И.А. Иванова-Смоленская, Л.М. Попова, Д.Н. Джибладзе, М.А. Пирадов, А.И. Кугоев., С.Н. Иллариошкин, Л.С. Адарчева, Р.П. Чайковская, С.М. Ложникова, С.Г. Соболев, A.B. Никольский. Диагностика прионных заболеваний человека. //В сб. "Актуальные

вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики". Мат. конф. -Уфа.- 1998, С.88-89.

П.Завалишин И.А., Ройхель В.М., Гулевская Т.С., Гнездицкий В.В., Шитикова И.Е., Джибладзе Д.Н., Кугоев А.И., Фокина Г.И., Кондакова JI.M., Соболев С.Г., Погодина В.В., Чайковская Р.П., Ложникова С.М., Сахарова A.B., Кашина Е.М., Сунгуров Е.Б. Прижизненная диагностика болезни Крейтцфельдта-Якоба.// Журн. невропатол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. - 1998. - № 5, С. 20-25.

12.3авалишин И.А, Шитикова И.Е., Ройхель В.М., Гулевская Т.С., Гнездицкий В.В., Иванова-Смоленская И.А., Попова JI.M., Джибладзе Д.Н., Пирадов М.А., Кугоев А.И., Иллариошкин С.Н., Адарчева Чайковская Р.П., Ложникова С.М., Соболев С.Г., Никольский A.B., Туманов Л.Б. Прионные болезни человека в России //В сб. научных трудов, посвященных 50-летию КБ № 6 ФУ «Медбиоэкстрем». Москва. -1998 - С.113-117.

Условные сокращения

БКЯ - болезнь Крейтцфельдта-Якоба ВП - вызванные потенциалы

СГШШ - синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера

ТСЭП - трансмиссивная спонгиоформная энцефалопатия

ФСИ - фатальная семейная инсомния

ИЮТ - ген прионного протеина человека

РгР или РгР° - нормальный прионный протеин человека

РгРг" - патологическая изоформа прионного белка, резистентная к

расщеплению протеазами. РгР5с - патологическая изоформа прионного белка.

Типография ООО «Телер» 125299, Москва, ул. Космонавта Волкова, 12

Подписано в печать 17.05.1999 г. Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. Бумага ZOOM. 2,0 печатных листа. Заказ 101.