Автореферат и диссертация по медицине (14.01.15) на тему:Применение комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста в условиях металлостеосинтеза с использованием модифицированных пластин

На праварСрукописи

КАЛАШНИКОВ

Павел Иванович

ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА АУТОГЕННЫХ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ТРОМБОЦИТ АРНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА В УСЛОВИЯХ МЕТАЛЛОСТЕОСИНТЕЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЛАСТИН (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.15 - травматология и ортопедия

11 ИЮЛ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов-2015

005570897

005570897

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный медицинский университет имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Самодай Валерий Григорьевич Официальные оппоненты:

Маланин Дмитрий Александрович - доктор медицинских наук, профессор; ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России; кафедра травматологии, ортопедии и ВПХ с курсом травматологии и ортопедии; заведующий кафедрой.

Гришин Владимир Николаевич - доктор медицинских наук; МБУЗ «Городская больница №2» Старооскольского городского округа; отделение травматологии и ортопедии; заведующий отделением. Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный

исследовательский медицинский университет имени H.H. Пирогова» Министерства здравоохранения

Российской Федерации.

Защита состоится «23» d£-K. TJLc> рл^ 2015 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.094.01 при ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО « Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России и на сайте организации: www.sgmu.ru

Автореферат разослан « Д?» U- f-d> А А 2015 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Г.Н. Масля кова

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. С развитием техники и ростом урбанизации число скелетных травм, в том числе высокоэнергетических, из года в год увеличивается (Артамошина М.П., 2007). При этом, несмотря на определенные научные и практические достижения в травматологии и ортопедии, тенденции к снижению частоты осложнений в виде замедленной консолидации костных отломков нет (Голка Г.Г., Белостоцкий А.И., Фадеев О.Г., 2013).

Сроки иммобилизации и степень восстановления функции конечности обусловлены скоростью репаративных процессов (Еликов A.B., Караваев С.А., Цапок П.И., 2009, 2012; Струков В.И., Прохоров М.Д., Елистратов Д.Г., 2013). В 1965 году Marshall R. Urist из Калифорнийского университета впервые применил для стимуляции остеогенеза богатую тромбоцитами плазму (АутоБоТП). При этом он исходил из результатов, полученных предшественниками, в которых имелись указания как на выраженную ангиогенную, так и на остеогенную активность веществ, содержащихся в гранулах тромбоцитов.

Данные вещества - (тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста - pi (TGF-(31) и трансформирующий фактор роста - р2 (TGF-(32)) полипептидной природы относятся к группе факторов роста. Тромбоцитарный фактор роста участвует в регуляции процессов острого воспаления, заживления ран и образования рубца, присутствует в нейронах ЦНС, где, как предполагают, он играет важную роль в процессе выживания и регенерации клеток, в опосредованнии пролиферации и дифференцировки глиальных клеток (Bailas M.S., Chachoua А., 2011).

С целью активизации заживления ран и остеогенеза сотрудниками кафедры травматологии и ортопедии ВГМА им. H.H. Бурденко в 2012 было предположено использовать комплекс аутогенных лиофилизированных тромбоцитар-ных факторов роста (КАЛТФР), получаемых из аутоплазмы больного путём лиофилизации («Технология лиофилизации обогащенной тромбоцитами плаз-

\/

мы с сохранением жизнеспособности факторов ТвР РБОБ УЕСБ» (Самодай В.Г., Полесский М.Г.,2014).

Метод лиофилизации позволяет получать сухие ткани и препараты без потери их структурной целостности и биологической активности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 ° С). Лиофилизированые ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства (Гусаров Д.А., 2010).

Оптимальное решение проблемы местного воздействия лиофилизирован-ных тромбоцитарных факторов роста представляется возможным на основе модификации пластин для металлостеосинтеза с целью создания условий депонирования препаратов в зоне перелома.

Цель исследования: улучшить результаты хирургического лечения переломов костей различных сегментов в условиях металлостеосинтеза модифицированной пластиной с нанесенным на нее комплексом аутогенных лиофили-зированных тромбоцитарных факторов роста в эксперименте на кроликах.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести анализ результатов традиционного накостного остеосинтеза переломов диафиза бедренной кости в эксперименте на кроликах.

2. Разработать и применить в эксперименте способ накостного остеосинтеза с использованием модифицированной пластины с нанесенным на нее препаратом комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста.

3. Изучить динамику процесса консолидации переломов в экспериментальной и контрольной группах кроликов в разные сроки наблюдения методами лучевой диагностики.

4. Гистологически оценить темпы и качество формирования костной ткани при использовании комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста.

5. Провести сравнительную оценку процесса регенерации костной ткани контрольной и экспериментальной групп методом морфолого-статистического анализа.

Научная новизна исследования:

1. Разработан способ аккумуляция биологически активных сухих веществ на металлоконструкциях для накостного остеосинтеза;

2. Применен способ накостного остеосинтеза с использованием модифицированной пластины и комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоци-тарных факторов роста для лечения переломов в эксперименте;

3. Установлена эффективность применения комплекса аутогенных лиофилизированных факторов роста для стимуляции консолидации переломов (заявка на изобретение № 2014154475 от 30.12.2014 «Способ накостного остеосинтеза с применением комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоци-тарных факторов роста»).

Практическая значимость. Разработан способ хирургического лечения переломов длинных трубчатых костей, основанный на применении модифицированных накостных металлоконструкций с использованием комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов .роста, позволяющий повысить эффективность и сократить сроки хирургического лечения переломов.

Основные положения, вынесенные на защиту:

1. Предложенная модифицированная пластина для накостного остеосинтеза способствует фиксации комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста, стимулирующих остеогенез, в зоне перелома.

2. Разработанный способ применения КАЛТФР позволяет улучшить результаты хирургического лечения переломов в эксперименте.

Методы исследования. Для решения поставленных задач в работе использовались экспериментальные методы моделирования переломов костей с последующим накостным остеосинтезом костных фрагментов, лучевые и гистологические методы исследования тканей в зоне перелома. Размеры образо-

вавшейся грануляционной ткани, хрящевой и костной мозолей оценивали с использованием системы анализа изображений Q550W (Германия) и программы «ImageJ». Для информационной интерпретации полученных результатов мор-фометрии проведен морфолого-статистический анализ на ПЭВМ, с помощью пакетов программ; Statistica 8.0, SSPS 13, с использованием параметрических критериев. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки средней (т). Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента, считая статистически достоверным значение р<0,05.

Достоверность и обоснованность результатов исследований обеспечены тщательностью проведенного эксперимента, качественным и количественным анализом данных применяемых исследований, системностью исследовательских процедур, применением современных методов статистической обработки информации.

Внедрение результатов исследования. Разработанный способ накостного остеосинтеза с использованием модифицированной пластины и КАЛТФР применен для лечения переломов в эксперименте, а так же включён в научно-педагогический процесс кафедры травматологии и ортопедии ГБОУ ВПО ВГМА им. H.H. Бурденко Минздрава РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно практических конференциях: «X Юбилейный всероссийский съезд травматологов-ортопедов» (Москва, 2014), «Вклад молодых учёных в развитие травматологии, ортопедии и нейрохирургии» (Саратов, 2014), «Современные принципы и технологии остеосинтеза костей конечностей, таза и позвоночника» (Санкт- Петербург, 2015 ), на заседании научно-практического общества травматологов и ортопедов Воронежской области (2014).

Личный вклад автора состоит в его участии на всех этапах процесса исследования: им изучены и систематизированы материалы по оценке проблемы травматизма и замедления консолидации костных отломков, разработан дизайн исследования и поставлен эксперимент на лабораторных животных (кроликах), разработана и использована в эксперименте модифицированная пластина для

остеосинтеза, осуществлен забор костного материала для гистологических исследований, проведена аналитическая и статистическая обработка полученных данных, подготовлены публикации.

Публикации. Основные положения и результаты диссертации опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 3 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 101 странице и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, двух глав описывающих ход экспериментального исследования и его результаты, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 205 источников, из которых 127 отечественных и 78 зарубежных.

Демонстрационный материал представлен 4 таблицами, 5 гистограммами, 39 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы. Работа выполнена в экспериментальной лаборатории НИИ ЭБМ ВГМА им. H.H. Бурденко на базе кафедры травматологии и ортопедии в 2013 — 2014 годах. В исследование включены 32 особи кроликов 4-6 месячного возраста.

В рамках проведённой экспериментальной работы были выполнены оперативные вмешательства у 2 групп кроликов:

1 группа - экспериментальная — оценка остеогенеза на 7-е сутки (4 кролика), на 14-е сутки (4 кролика), на 21-е сутки (4 кролика), на 28-е сутки (4 кролика); оперативное вмешательство проводили с использованием модифицированной реконструкционной пластины, аккумулирующей КАЛТФР.

2 группа - контрольная (16 кроликов), содержащая четыре подгруппы по четыре особи животных (соответственно аналогичным срокам экспериментальных подгрупп); оперативное вмешательство проводили с использованием обычной реконструкционной пластины и без использования КАЛТФР.

Способ изготовления лиофилизата аутогенных факторов роста с сохранением их жизнеспособности в проводимом исследовании описаны В.Г. Самодаем, М.Г. Полесским (Технология лиофилизации обогащенной тромбоцитами плазмы с сохранением жизнеспособности факторов ТвР РООБ УЕСБ). Основываясь на данных проведенной ими работы, мы считаем, что при производстве КАЛТФР не происходит потери свойств биологически активных веществ после их лиофилизации.

Для изготовления КАЛТФР применяется собственная кровь животных, что полностью исключает иммунную реакцию организма, несмотря на белковую природу используемого вещества. Как известно, состав крови - это форменные элементы и плазма крови с растворенными в ней минеральными веществами, витаминами, белками, продуктами метаболизма и др. При изготовлении КАЛТФР сырьем служит тромбоцитарная масса крови, получаемая путем двойного центрифугирования.

После замораживания тромбоцитарная масса подвергается лиофилизации в лиофильной сушилке ЛС-500. После этого полученный КАЛТФР закрывают в герметичный контейнер, а перед применением стерилизуют в озоновой камере "Орион" с экспозицией не менее 120 минут.

После подбора металлоконструкций для настоящей экспериментальной работы все пластины были подвергнуты модификации, необходимой для использования КАЛТФР.

На рабочей контактирующей с костью поверхности пластины, планируемой для выполнения остеосинтеза перелома, инструментально производится нанесение цилиндрических углублений диаметром 0,5-1,0 мм и глубиной 0,3 -0,5 мм, в количестве 10-15 наем 2. Примерный суммарный объем полученных полостей можно рассчитать по формуле объема цилиндра (Виноградов И.М., 1977): Ух=(71 (с1/2)2 Ь) п I-¡А^ (3,14(1,0/2)20,5)15

где V2- - суммарный объем, (1 - диаметр, Ь - высота, п - количество углублений.

По результатам вычислений получаем примерный объем углублений на см2 пластины 5,8875 мкл.

Мы знаем, что концентрация тромбоцитов крови у кроликов, использованных в эксперименте, составляет от 200 тыс/мкл до 400 тыс/мкл, при норме 130 -900 тыс/мкл (Риган В., Сандерс Т., Деникола Д., 2000). Для изготовления лио-филизата из тромбоцитарной массы использовали 3-5 мл (1 мл = 103 мкл) цельной крови, соответственно количество тромбоцитов в аутоБоТП составляет примерно от 6 до 20* 108 /мкл. Соответственно, это же количество сухого вещества из тромбоцитов сохраняется в КАЛТФР. Зная, что в каждом тромбоците около 1200 молекул PDGF массой 26 - 30 кДа, получаем массу PDGF цельной крови в пределах от 18,72*1012 кДа до 72* 1012 кДа. Сухой остаток плазмы крови составляет 8 - 10 %, это означает, что при изготовлении лиофилизата из тромбоцитарной массы мы получаем сухое вещество объемом 240 - 500 мкл, при сохранении того же количества сухого вещества из тромбоцитов, с сохранением массы PDGF. Известно, что кДа примерно равен 1,66043 ± 0,00031*10" 12 нг, полученная нами концентрация PDGF составляет 31,08 - 119,55 нг/мкл. Для стимуляции направленного действия достаточным содержанием PDGF является 0,1-0,2 нг/мкл (Siegbahn A. and Clin J., 1990). Объем полости, созданной на пластине, способен аккумулировать достаточное количество факторов роста для стимуляции остеогенеза (рис. 1).

Рисунок 1. Модификация реконструкционной пластины для накостного остеосинтсза.

А - обычная реконструкционная пластина; Б - модифицированная.

Размеры использованных реконструкционных пластин: толщина - 3,0 мм, ширина -10,0 мм, длина - 49 - 73 мм (per. номер 29/12010198/4892-01).

Незначительные размеры сделанных слепых отверстий не уменьшают прочность конструкции, но способны механически аккумулировать достаточный объем биологически активного вещества — КАЛТФР.

Полученная нами модификация обеспечивает прицельность воздействия тромбоцитарных факторов роста непосредственно в зоне перелома. При накостном прилежании пластины благодаря имеющимся улублениям полностью исключена миграция лиофилизата тромбоцитарной массы из места её размещения, что уменьшает потери действующего вещества. На этот способ накостого остеосинтеза модифицированой платиной с использование КАЛТФР нами оформлена заявка на патент № 2014154475 от30.12.2014года.

При выполнении оперативного вмешательства нами применялся препарат «Золетил 100», широко известный и активно применяемый в ветеринарной практике. Наркозный эффект достигается через 6-7 минут после однократного внутримышечного введения препарата в дозе до 15-30 мг/кг. Длительность хирургической стадии наркоза (при условии отсутствия выраженных внешних раздражителей) составляет до 2-3 часов. В нашем случае, предполагая непродолжительное оперативное вмешательство, мы использовали дозировку 15 мг/кг, достигая тем самым длительность стадии хирургического наркоза около 1 часа. Осложнений общей анестезии не было.

Оперативное вмешательство, выполненное у экспериментальной группы животных на этапах укладки и хирургического доступа, практически не отличалось от техники классического накостного остеосинтеза, выполненного у животных контрольной группы.

У всех животных контрольной группы мы применяли фиксацию отломков при помощи пластин для накостного остеосинтеза (реконструкционных) с использованием фиксации 4-6 кортикальными винтами.

Оперативный доступ осуществляли по переднебоковой поверхности бедра, выполняли тупое расслоение мышц с выделением средней трети диафиза бедра. Моделирование поперечного перелома выполняли во всех исследуемых группах при помощи фрезы диаметром 1 мм, после чего производили

репозицию полученных отломков. Осуществляли обнажение бедренной кости в объеме, минимально требуемом для размещения металлоконструкции. После предварительного моделирования по форме бедра, пластину укладывали на кость, удерживали костодержателем и фиксировали 4-6 винтами диаметром 2,5 и 3,5 мм. Затем, сняв костодержатели и убедившись в стабильности удержания отломков, мы ушивали рану послойно кетгутом. Во время оперативного вмешательства на всем протяжении выполнялся тщательный контроль гемостаза. Кожные покровы ушивали капроном, при необходимости рану дренировали перчаточным выпускником. На рану укладывали стерильную салфетку, смоченную спиртовым раствором хлоргексидина, и наклеивали асептическую повязку «Круподерм». При необходимости дополнительно применяли бинтование.

Продолжительность оперативного вмешательства в среднем составляла 30-40 минут. Использование дополнительных средств иммобилизации было весьма затруднительно, поскольку, приходя в сознание, животное всячески пыталось скинуть с себя ограничивающие повязки, вызывая тем самым высокий риск миграции металлоконструкции. Наблюдая за послеоперационным животным без иммобилизации, мы заметили, что оно ведет себя более спокойно, щадя конечность и не нагружая её, и пришли к выводу о нецелесообразности применения в нашем случае дополнительных средств наружной фиксации оперированного сегмента.

Создав перелом бедренной кости, требуемый для нашего исследования у экспериментальной группы кроликов, мы приступали к основной части экспериментального хирургического вмешательства - выполнению разработанного способа накостного остеосинтеза с использованием модифицированных рекон-струкционных пластин, способных аккумулировать КАЛТФР.

Модернизированные нами пластины имеют на своей поверхности, контактирующей с костью, множество мини-углублений, специально созданных и используемых для аккумуляции КАЛТФР. При нанесении лиофилизата на пластину мы использовали исключительно аутогенный

материал особи, каждый из которых имел свое числовое обозначение. Биоматериалы хранили в специальных условиях и перед применением стерилизовали. Сухое вещество в асептических условиях извлекали из пробирки и выкладывали на стерильную марлевую салфетку, откуда сухим и чистым инструментарием распределяли по поверхности пластины. Очень важно, чтобы при этом все используемые предметы были абсолютно сухими, так как при малейшем контакте с жидкой средой лиофилизат превращается в гелеобразное вещество, что конечно не лишает его свойств, но сильно затрудняет нанесение на металлоконструкцию.

После нанесения сухого вещества на поверхность конструкции необходимо выполнить его опрессовку для удержания мельчайших частиц лиофилизата в полостях углублений пластины. Фиксация частиц КАЛТФР достигается путем простого нажатия металлическим шпателем на поверхность пластины с помещенным на неё веществом.

После завершения максимального наполнения всех полостей пластины, мы могли приступить к непосредственному использованию металлоконструкции для накостного остеосинтеза.

Следующий этап операции - открытая репозиция бедра. Отломки тщательно сопоставляли, исключая ротацию и поперечное смещение. Особенностью выполняемого нами остеосинтеза является сохранение диастаза около 1 мм (расстояние равное диаметру фрезы, которой моделировали перелом). На наш взгляд, имеющийся дефект костной ткани не должен отразиться существенным образом на интенсивности репаративного остеогенеза, но сможет послужить качественным гистологическим материалом для сравнительной оценки состава вновь образованной костной ткани. После репозиции отломков на кость укладывали подготовленную модифицированную пластину с нанесённым на неё КАЛТФР и предварительно закрепляли ее костодержателем. Затем выполняли бикортикальную фиксацию пластины 4-6 винтами. Сняв косто держатель, выполняли контроль прочности закрепления отломков.

На завершающем этапе операции выполняли туалет раны водным раствором хлоргексидина биглюконата, затем рану ушивали послойно атравматической иглой с кетгутом 2,0 при соблюдении анатомии тканей бедра. Обязательным являлось тщательное укрытие металлоконструкции мышцами. При наложении швов не допускали натяжения краев раны, чтобы не вызвать ишемию тканей. Кожные покровы ушивали одиночными швами атравматической иглой, в качестве шовного материала использовали капрон 3,0. В завершении операции на рану накладывали стерильную салфетку, смоченную спиртовым раствором хлоргексидина, и наклеивали стерильную повязку «Круподерм». В условиях тщательного гемостаза необходимости в дренировании раны не возникало. Средняя продолжительность оперативного вмешательства составляла около 40 минут. На протяжении всех манипуляций кролики не испытывали никаких болевых ощущений, находясь в хирургической фазе наркоза. Благодаря точно рассчитанной дозировке анестезиологических препаратов кролики начинали выходить из наркоза только спустя 5-10 минут после окончания операции, уже находясь в клетке, то есть в привычных для себя условиях. Через пару часов они охотно начинали есть и пить. Перевязки производили 2-3 раза в неделю, преимущественно по мере промокания повязки геморрагическим отделяемым между швов, которое прекращалось уже на 5 - 6 сутки. С учетом строгих соблюдений правил асептики и антисептики, а так же контроля за состоянием послеоперационных ран нам удалось исключить необходимость применения антибактериальных препаратов. На 7 - 8 сутки после операции раны благополучно заживали первичным натяжением.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ультразвуковое исследование (УЗИ) проводили с использованием аппарата «RASCAN ЭТС-Д-05» и микроконвексного датчика «ДУ-2/5,0С15 2,5-5,0 МГц» с частотой 3,7 МГц.

При УЗИ прооперированных кроликов проводили эхосканирование области перелома на разных этапах репаративного процесса, что позволило выявить УЗ-картины на различных сроках (7, 14, 21,28 суток).

Таким образом, при сравнении полученных результатов, уже на 7-е сутки по данным УЗИ отмечаются существенные различия эхо-структуры тканей зоны перелома. К 5 - 7 дню с момента операции завершается лизис гематомы и поврежденных тканей и начинается появление фиброзной ткани или так называемой мягкой мозоли. При сравнительном анализе полученных сведений отмечается отставание в репарации контрольной группы по сравнению с экспериментальной.

По результатам, отраженным в таблице 1 видно, что начало активизации процесса оссификации косной мозоли приходится на 7-14 сутки, когда завершается формирование хрящевой ткани и появляется молодая костная ткань. Согласно УЗ- признакам заключительный этап формирования костной мозоли у особей, прооперированных без использования КАЛТФР, приходится примерно на 28 дней. При этом у животных, для лечения которых применялись стимуляторы остеогенеза (тромбоцитарные факторы роста), аналогичные признаки формирования зрелой костной ткани начинали проявляться уже на 21 день.

Таблица 1

Сроки выявления УЗ - признаков консолидации у исследуемых кроликов (дней)

~^~№чщдгру п п ы УЗИ-признаки 1.1 1.2 1.3 1.4 2.1 2.2 2.3 2.4

Ншобновлемис кровообращения 7 7 7 7 - 14 14 14

Наличия хрящевой мозоли - 14 14 14 - 14 14 14

Начало формирования костной мозоли - - 14 14 - - 21 21

Формирование окончательной костной мозоли - - - 21 - - - 28

Проведенное исследование свидетельствует о более интенсивном процессе репаративного остеогенеза в экспериментальной группе. Применяемый нами способ накостного остеосинтеза с использованием КАЛТФР, оказывает стимулирующий остеогенез эффект с первых же дней его использования.

Рентгенологическое исследование оперированных конечностей животных выполняли с использованием стационарной ветеринарной рентгенологической системы HF-525plus Vet в режиме 44 шА 0.1 кВ с экспозицией в 1 секунду. Проводили сравнительный анализ рентгенографических данных на 7, 14, 21, 28-е сутки после металлостеосинтеза.

При рентгенографическом исследовании через 7 дней наблюдается примерно схожая картина у всех исследуемых групп. Линия перелома четко прослеживается, края отломков заострены, кортикальный слой бедренной кости виден отчетливо как в зоне перелома, так и в пределах здоровых тканей. Признаков пе-риостальной реакции, проявляющейся в утолщении надкостницы, нет.

Можно сделать вывод, что в эти сроки с момента выполнения накостного остеосинтеза на рентгенограмме правого бедра экспериментальной подгруппы 1.1 видимых признаков начала процесса консолидации перелома нет, так же как на снимках контрольной подгруппы 2.1.

На рентгенограммах, выполненных на 14 день, у животных экспериментальной подгруппы 1.2 определяется появление выраженной периостальной реакции. Контуры кортикального слоя неровные, что говорит о гипертрофии надкостницы. Линия перелома едва прослеживается, края отломков сглажены, межотломковую щель перекрывают глыбчатые тени разной интенсивности. Выражены тени эндоостальной реакции, периостальные наслоения не объединяются. Начинают появляться признаки формирования костной мозоли в зоне перелома.

При изучении снимка кролика контрольной подгруппы 2.2 через 14 дней в первую очередь отмечается более отчетливо видимая линия перелома. Межотломковую щель перекрывают легкие вуалевидные тени. Контуры концов отломков и осколков менее четкие. Тени эндоостального регенерата не определяются. На отломках выявлены слабо выраженные периостальные напластования толщиной до 1,0 мм. Кортикальная пластинка слабо различима с интрамедиар-ным слоем костной мозоли. Имеются признаки локальной остеопении, что может говорить о некотором замедлении формирования костной мозоли.

Указанные признаки свидетельствуют о более интенсивном костеобразова-нии у экспериментальной группы по сравнению с контрольной.

При сравнении рентгенограмм, выполненных на 21 день у экспериментальной группы исследуемых отмечается наличие признаков сформированной костной мозоли. На рентгенограмме контрольной подгруппы 2.3 продолжает прослеживаться линия перелома, отмечается выраженная периостальная реакция, появляются признаки слабо выраженной эндостальной реакции. Надкостница утолщена, края отломков размыты. Отмечается разрежённость костной ткани в зоне перелома, признаки остеопении сохраняются. Описанная картина практически полностью соответствует той, что мы наблюдали у экспериментальной подгруппы 1.2 на 14 сутки. Таким образом, можно говорить об отставании ре-паративного процесса остеогенеза примерно на 5-7 дней у особей, для лечения которых не использовался КАЛТФР.

На заключительных снимках, выполненных на 28 сутки, в экспериментальной подгруппе 1.4 мы видим полное сращение перелома правого бедра. Линия пере лома едва различима, края отломков не видны, явные признаки сформированной интермедиарной и периостапьной мозоли с четкими контурами, пери-оссальной реакции надкостницы нет.

На рентгенограмме контрольной подгруппы 2.4 сделанной на 28 день после операции наблюдается картина продолжающегося формирования костной мозоли. Линия перелома визуализируется, выраженная пери- и эндооссапьная реакции с признаками оссификации. Контуры образующейся костной мозоли размыты. Подобная рентгенологическая картина свидетельствует о незавершённом процессе остеогенеза и для его полного окончания требуется еще какое-то время.

По результатам сравнения всех выполненных рентгенологических исследований мы получаем картину значительного опережения репарации костной ткани в экспериментальной группе. Тот факт, что уже через 21 день в экспериментальной группе мы наблюдали практически полное сращение переломов, ука-

зывает на положительное влияние КАЛТФР на продолжительность образования костной мозоли.

Выведение животных из эксперимента и забор материала осуществляли следующим образом: подгруппы 1.1 и 2.1 на 7-е, подгруппы 1.2 и 2.2 на 14-е, подгруппы 1.3 и 2.3 на 21-е, подгруппы 1.4 и 2.4 на 28-е сутки наблюдения с момента остеосинтеза. На аутопсии оценивали состояние окружающих мягких тканей, надкостницы, кортикального слоя и костномозгового канала. Забор материала для гистологического исследования проводили путем тщательного сепарирования мышц от костей, выделения сегментов костей длиной 1,5 - 2 см с областью костного регенерата.

Из полученного материала выпиливали по три фрагмента костной мозоли толщиной 4-5мм. Эти фрагменты фиксировали в 10% -ном забуференном растворе цинк-формалина в течение трех суток, затем декальцинировали в растворе «Трилон-В» в течение трех недель, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин. Изготавливали парафиновые срезы толщиной 4,0 мкм и окрашивали несколькими методиками: гематоксилином-эозином; по Массону - анилиновым синим; альциановым синим - pH 2.5. Микроскопическое исследование проводили на светооптическом микроскопе Leica DMR (Германия) с использованием видеоискателя Leica DFC295, при увеличении 50;100;200;400. Изображения получены с использованием лицензионного программного обеспечения Leica Application Suite Version 4.4.0 производства Leica Microsystems (Switzerland) Limited и Leica Microsystems CMS GmbH. Морфометрию исследуемых критериев (размеры образовавшейся грануляционной ткани, хрящевой и костной мозолей) оценивали с использованием системы анализа изображений Q550W (Германия) и программы «ImageJ».

В контрольной подгруппе 2.1 на 7-е сутки отмечалась выраженная пара-оссальная реакция с активным вовлечением надкостницы с прорастанием из нее сосудов для развития репаративного остеогенеза, констатированы признаки воспалительного процесса на фоне рубцовой соединительной ткани.

Микроскопическая характеристика зоны перелома первой экспериментальной группы исследуемых кроликов с применением КАЛТФР констатировала наличие клеток хондробластического ряда и фрагменты молодого хряща, а также зрелого, представленного изогенными группами. Присутствовали клетки моноцитарного ряда и остатки рубцовой соединительной ткани с окружающими сосудами. Таким образом, спустя семь суток зона перелома у кроликов экспериментальной подгруппы 1.2, которые испытывали воздействие КАЛТФР, в сравнении с контрольной подгруппой 2.1 отличалась ускоренным репаратив-ным процессом с признаками хондрогенеза — началом образования хрящевой мозоли.

В зоне перелома у кроликов контрольной подгруппы 2.2 спустя 14 суток заметны формирующиеся пластины и трабекулы хрящевой ткани. У кроликов экспериментальной группы 1.2 в условиях воздействия КАЛТФР спустя 14 суток отмечался процесс оссификации хряща, с признаками формирования первичной костной мозоли.

На 21-е сутки у кроликов контрольной подгруппы 2.3 в зоне перелома при микроскопировании на фоне провизорного хряща было обнаружено незначительное количество гипертрофированных хондроцитов, свидетельствующих об изменении их синтетической активности и о существенном изменении транскрипционного профиля, индуцирующего переключение экспрессии основного коллагена хрящевой ткани на его экспрессию для костной и формирование костной мозоли.

В экспериментальной группе кроликов 1.3 через 21 сутки обнаруживались фрагменты перихондральной манжетки и компактного вещества костной ткани кортикального слоя кости, на фоне восстановленной гемапоэтической паренхимы красного костного мозга. Таким образом, через 21 сутки у контрольной подгруппы 2.3 в области перелома наблюдалось завершение формирования костной грубоволокнистой мозоли, а в экспериментальной подгруппе 1.3 были обнаружены пластинки компактной костной ткани.

Через 28 суток у кроликов контрольной подгруппы 2.4 в центральной части трабекул видны участки молодого костного коллагена, а по периферии - остеокласты, функция которых направлена на создание условий для формирования костных пластинок.

У экспериментальной подгруппы кроликов 1.4 в зоне перелома спустя 28 суток при микроскопировании видны трабекулы губчатой кости, имеющие пластинчатое строение. Восстановлена сосудистая система. Отмечаются некоторые очаги резорбции костной ткани как избыточной. Можно отметить завершающийся процесс перестройки регенерата в костную мозоль с формирующимися остеонами.

Такая гистологическая картина подтверждается данными морфолого-статистического анализа. Площадь первичной хрящевой мозоли, образованной хондробластами и фибробластами в экспериментальной группе достоверно больше относительно контрольной группы на 7-е сутки эксперимента, а затем снижается в хронодинамике наблюдения до минимальных значений к 28-м суткам, оставаясь достоверно ниже соответствующих значений в контроле (рис. 2.).

7 (VI к и

14 сутки 21 сутки 28 сутки контроль ■ опыт

Рисунок 2. Площадь первичной хрящевой мозоли в хронодинамике эксперимента. Примечание: # - р < 0,05 по отношению к контрольной группе, *- р < 0,05 по отношению к предыдущему сроку наблюдения

Таким образом, скорость образования хрящевой мозоли, состоящей из зрелых хондроцитов, наиболее выражена в первые сроки наблюдения в экспериментальной группе в сравнении с контролем (р<0,05).

Общая площадь гиалинового хряща в зоне сращения достоверно повышалась спустя 14 суток и была максимальной, постепенно уменьшаясь в объеме к концу эксперимента, оставаясь только в виде небольших островков. Показатели контрольной группы имели сходную динамику, но с отставанием приблизительно на семь дней (р<0,05) (рис. 3).

Процесс формирования губчатой кости на месте первичной костной мозоли у животных экспериментальных групп начинался на 14 сутки наблюдения, имея небольшую площадь в виде островков в толще гиалинового хряща, тогда как в контрольной группе этот процесс был практически не заметен (р<0,05).

7 сутки 14 сутки 21 сутки 28 сутки

контроль ■ опыт

Рисунок 3. Площадь гиалиновой хрящевой ткани области сращения перелома в хро-нодинамике эксперимента.

Примечание: # - р < 0,05 по отношению к контрольной группе, *- р < 0,05 по отношению к предыдущему сроку наблюдения

Через 21 сутки площадь костной ткани экспериментальной группы достоверно и резко увеличивалась в сравнении с контрольными показателями, не снижая таковой динамики до конца эксперимента (рис. 4.)

усл-ед.

900000

800000

700000

600000 -

500000 -

400000 ^ ШШШ

300000 -

200000 р§ 1 1 р 1

100000 * МК1

0 ^ к-,-,-,- -^

7 сутки 14 сутки 21 сутки 28 сутки

^контроль ■ опыт

Рисунок 4. Формирование костной ткани в области сращения перелома в хроноди-намике эксперимента.

Примечание: #- р < 0,05 по отношению к контрольной группе, *- р < 0,05 по отношению к контрольной группе

Процессы преобразования и деструкции гиалинового хряща в ходе остеоге-неза частично отражены на рис. 5.

7 сутки 14 сутки 21 сутки 28 сутки

контроль ■ опыт

Рисунок 5. Динамика изменения числа зрелых хондроцитов

Через 7 суток с момента оперативного вмешательства в экспериментальной группе кроликов ткань гиалинового хряща содержала единичные хондроциты, тогда как спустя 14 суток их количество достоверно возрастало и достигало максимума, превышая показатели контроля (р<0,05). Начиная с 21-х суток число хондроцитов в поле зрения достоверно снижалось. Динамика изменения числа хондроцитов у кроликов контрольной группы полностью повторяла опыт с незначительным отставанием. Проведенная статистическая обработка резуль-

татов исследований, позволяет считать эффективность использования КАЛТФР на пластине при накостном остеосинтезе доказанной. Морфолого-статистический анализ результатов лечения переломов в эксперименте выявил эффективность использования КАЛТФР на пластине при накостном остеосинтезе, способствующего стимуляции процессов репаративного остеогенеза и сокращающего сроки консолидации на 5-7 дней.

ВЫВОДЫ

1. Проведенный анализ результатов традиционного накостного остеосин-теза перелома бедра у кроликов контрольной группы показал, что минимальный срок для завершения процесса консолидации составляет 28 дней.

2. Разработанный способ накостного остеосинтеза с использованием модифицированной пластины с нанесенным на нее комплексом аутогенных лио-филизированных тромбоцитарных факторов роста позволяет сократить сроки лечения переломов.

3. Лучевые методы исследования свидетельствуют о сокращении сроков консолидации перелома бедра у кроликов экспериментальной группы в условиях металлостеосинтеза модифицированной пластиной с фиксированным на ней комплексом аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста.

4. Гистологическое исследование костной мозоли в различные сроки проведенного эксперимента подтвердило ускорение репаративного остеогенеза с опережением процесса консолидации переломов на фоне применения комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста, нанесенных на модифицированную пластину для остеосинтеза.

5. Морфолого-статистический анализ клеточной структуры в зоне перелома на различных сроках доказывает ускорение процесса репаративного остеогенеза в экспериментальной группе на 5-7 дней по сравнению с контрольной.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Для изготовления комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитар-ных факторов крови используется тромбоцитарная масса, полученная из ауто-плазмы. Объем забора венозной крови определяется исходя из контактирующей с поверхностью кости площади модифицированной пластины, подобранной для отдельного случая. Достаточным является количество из расчета 1 мл крови на 1 см2 контактной площади пластины.

Модификация пластины заключается в придании ей способности аккумулировать КАЛТФР на своей поверхности и достигается путем нанесения мини-углублений диаметром 0,5-1,0 мм и глубиной 0,3-0,5 мм, в количестве 15-20 на см2.

При выполнении оперативного вмешательства требуется полное соблюдение техники накостного остеосинтеза согласно рекомендациям AO/ASIF, обеспечивающей стабильность фиксации. Помимо этого рекомендуется максимальное сохранения надкостницы костных отломков.

Материалы выполненного экспериментального исследования рекомендованы для внедрения в учебный процесс студентов, интернов и ординаторов в рамках цикла травматологии и ортопедии на базе Воронежского государственного медицинского университета им. H.H. Бурденко.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Применение комплекса лиофилизированных аутогенных факторов роста в условиях накостного металлостеосинтеза / П.И. Калашников, А.Б. Курбанов // Материалы X Юбилейного всероссийского съезда травматологов-ортопедов. -М., 2014.-С. 456.

2. Использование тромбоцитарных факторов роста при накостном остеосин-тезе в эксперименте / П.И. Калашников, В.Г. Самодай // Молодой учёный. -2014.-№ 17.-С. 158-161.

3. Использование комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста при накостном остеосинтезе в эксперименте / П.И. Калашников // Врач аспирант. - 2014. - №6.2(67). - С. 265-271.

4. Современные методы накостного остеосинтеза (обзор литературы) / П.И. Калашников // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2014. - Т. VI,- №4. - С. 438-444.

5. Использование лиофилизата тромбоцитарных факторов роста при накостном остеосинтезе в эксперименте / П.И. Калашников, А.Б. Курбанов // Вклад молодых учёных в развитие травматологии, ортопедии и нейрохирургии. -Саратов, 2014.-С. 50.

6. Использование комплекса аутогенных лиофилизированных тромбоцитарных факторов роста при накостном остеосинтезе в эксперименте/ П.И. Калашников, В.Г. Самодай // Современные принципы и технологии остеосинтеза костей конечностей, таза и позвоночника. — СПб., 2015. — С. 48.

7. Гистологические результаты использования аутогенных факторов роста в эксперименте / П.И. Калашников // Врач аспирант. - 2015. -№1.2(68). - С. 259-266.

КАЛАШНИКОВ ПАВЕЛ ИВАНОВИЧ

«Применение комплекса аутогенных лиофилнзированных тромбоцитарных факторов роста в условиях металлостеосинтеза с использованием модифицированных пластин (экспериментальное исследование)»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 30.06.2015 г. Гарнитура Times New Roman. Формат 60x84/16. Бумага для множительной техники. Усл.-печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 3999. «Издательство ВГМУ им. H.H. Бурденко» 394036, г. Воронеж, ул. Студенческая, 10