Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Полиморфизм онкогенов и микросателлитных последовательностей генома у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и первично-множественными злокачественными новообразованиями

РГ 6 од

1 з анв 1ЯЯ7

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 618.14-006-092.9

ГАСПАРЬЯН Александр Владимирович

ПОЛИМОРФИЗМ ОНКОГЕНОВ И МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА У ПАЦИЕНТОВ С НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ЛЕГКОГО И ПЕРВИЧНО-МНОЖЕСТВЕННЫМИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ.

(Специальность 14.00.14)

АВТОРЕФЕРАТ

диссетации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

МОСКВА 1997

Работа выполнена в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов (руководитель - доктор биологических наук А.Г.Татосян) •Онкологического научного центра РАМН (директор - академик РАМН Н.Н.Трапезников).

Научные руководители - доктор биологических наук А.Г.Татосян, доктор медицинских наук, профессор М.И.Давыдов. Официальные оппоненты: доктор биологических наук Б.П.Копнин,

доктор медицинских наук Е.А.Коган. Ведущее учреждение: Московский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена.

Защита диссертации состоится 997г.

в "_"часов на заседании Специализированого Ученого совета

(К. 001. 17. 01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина РАМН по адресу: г.Москва, 115478, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан эе^ода

Ученый секретарь

специализированного Ученого совета, доктор медицинских наук, профессор

В.С. Турусов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность проблемы.

Идентификация генетических факторов, ассоциированных с возникновением и развитием неоплазий, является одной из наиболее острых проблем современной молекулярной онкологии. Благодаря использованию молекулярно-биологических методов за последние 20 лет открыто несколько десятков генов, нарушения структуры и/или функции которых приводит к неопластической трансформации нормальных клеток и, таким образом, является причиной возникновения широкого спектра опухолей. Учитывая системный характер онкопатологий, в настоящее время при их исследовании возможен и наиболее целесообразен комплексный подход. Он подразумевает изучение наследственной предрасположенности и соматических нарушений генотипа, учет популяционно-генетических и эпидемиологических факторов, которые обусловливают формирование конкретной опухоли, характер ее прогрессии. Для развития злокачественной опухоли чаще всего необходимо накопление нескольких генетических нарушений (герминапьных и/или соматических) [Hunter Т. 1991]. У больных раком легкого часто выявляются соматические мутации онкогенов семейств ras и туе [Spandidos D.A. et al. 1994]. Названные онкогены входят в группу ключевых генов, участвующих в передаче молекулярного сигнала в клетке и задействованых в процессах клеточного роста и дифференцировки [Hesketh R. 1994]. В тоже время в некоторых популяциях показана ассоциация между наличием в генотипе индивида определенных наследуемых аллелей протоонкогенов с-Н a-ras-1, mycL1 и риском возникновения либо характером прогрессии рака легкого [Vineis Р., Caporaso N. 1991]. Таким образом одновременное исследование терминальных и соматических особенностей названных генов у больных раком легкого представляет значительный интерес.

В настоящей работе изучался наследственный полиморфизм генов

с-На-газ-1, тусИ, а также некоторые соматические нарушения в локусе последнего из названных генов у одних и тех же пациентов с немелкокпеточным раком легкого и первично-множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН). (В составе последней группы отдельно анализировались пациенты, одной из опухолей в анамнезе которых фигурировала карцинома легкого). Неуклонный рост заболеваемости раком легкого в промышленно-развитых странах, сложность его ранней диагностики требуют интенсивных исследований в области молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с возникновением и прогрессией этой неоплазии.

1.2. Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является молекулярно-биологический анализ различных аспектов полиморфизма локусов с-На-лаз-1 и тусИ, некоторых других молекулярно-генетических маркеров, которые могут иметь значение при возникновении или прогрессии немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) и первично-множественных злокачественных новообразований (ПМЗН) человека.

Для этого предполагалось решить следующие экспериментальные задачи.

1. Создание банка ДНК, выделенных из биопсийных материалов, клеток периферической крови больных немелкокпеточным раком легкого и первично-множественными злокачественными новообразованиями.

2. Сравнительный анализ препаратов ДНК путем рестриктного картирования с помощью специфических молекулярных зондов.

3. Идентификация полиморфных аллелей генов с-На-газ-1 и тус11 как молекулярных маркеров, ассоциированных с клиническими параметрами заболевания:

а) гистологическим типом опухоли;

б) степенью распространенности метастатического процесса.

4. Исследование нарушений в локусе гена тусИ, а также в теломерном участке короткого плеча 1 хромосомы в опухолях больных немелкоклеточным раком легкого с помощью метода полимеразной цепной реакции.

. 5. Сопоставление данных молекулярно-биологического анализа структуры исследованных генов с традиционными клиническими показателями.

1.3. Научная новизна.

В настоящее время имеются работы по изучению полиморфизма протоонкогенов с-На-гав-1 и гоусИ в связи с возникновением и прогрессией различных опухолей человека. Однако данные, полученные при обследовании пациентов различных этнических групп и популяций, не всегда совпадают. В частности это касается и немелкоклеточного рака легкого. В. настоящей работе впервые проведены комплексные исследования наследственного полиморфизма генов с-На-га5-1 и тусИ, а также некоторых соматических нарушений в локусе последнего гена у одних, и тех же больных немелкоклеточным раком легкого. При этом учитывались не только традиционные гистоморфологические и клинические характеристики опухолей, но и влияние канцерогенных факторов внешней среды, наследственная онкологическая отягощенность обследованных. Нами впервые показано, что наличие в геноме индивида "редкого" аллеля гена с-На-газ-1 может являться фактором риска возникновения аденокарцином легкого, а "общий" аллель а4 этого же гена ассоциируется с низкодифференцированными и высокометастазирующими опухолями, и таким образом является неблагоприятным прогностическим фактором НМРЛ человека.

Использованный метод тестирования микросателлитной нестабильности впервые введен в отечественную практику при изучении опухолей легкого. Его применение позволило показать, что наиболее

з

типичными соматическими нарушениями исследозанных микросателлитных маркеров короткого плеча 1 хромосомы при немелкоклеточном раке легкого является утрата гетерозиготности (30-40% информативных случаев). Однако, эти нарушения появляются относительно поздно в ходе прогрессии и могут свидетельствовать о длительном характере роста конкретной опухоли.

1.4. Практическая значимость работы.

Полученные данные могут послужить основой дальнейших исследований для выработки комплекса независимых молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с возникновением либо с характером прогрессии немелкокпеточного рака легкого человека. Использованный метод изучения микросателлитной нестабильности с успехом применяется для поиска новых участков генома, утрата которых приводит к возникновению определенных новообразований. В конечном итоге, тестирование подобных маркеров может использоваться в целях ранней диагностики неоплазии или при составлении индивидуального прогноза течения заболевания. В частности, при невозможности дифференциальной диагностики вновь возникшей первичной опухоли от метастаза предыдущего новообразования (от чего кардинально зависит тактика дальнейшего лечения)^создание панели соматических нарушений ДНК, типичных для "ранних" этапов прогрессии определенного новообразования, может способствовать решению этой проблемы.

1.5. Апробация работы.

Диссертационная работа апробирована на совместной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, цитогенети«и, методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН 27 сентября 1996 года.

Материалы работы докладывались на 22 конференции 150ВМ (Гронинген 1994), 9 Международном симпозиуме по профилактике и диагностике рака (Бостон 1994), I Съезде онкологов СНГ (Москва 1996). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

11.1. Литературный обзор.

В литературном обзоре, включающем 12 разделов, описаны нарушения генома, специфично ассоциирующиеся с возникновением и/или прогрессией рака легкого и первично-множественных злокачественных новообразований человека.

11.2. Материалы и методы.

Образцы хирургически удаленных опухолей, морфологически-нормальной ткани, лимфоцитов периферической крови были получены из торакальной клиники ОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и Московского городского онкологического диспансера. Исследованы препараты клеточной ДНК от 229 больных немелкоклеточным раком легкого (плоскоклеточный рак - 66, аденокарцинома - 53, железистоплоскоклеточный рак - 10) и 47 больных первично-множественными злокачественными новообразованиями. В контрольную группу вошли 53 человека без онкопатологии. (Средний возраст обследованных был примерно равен во всех анализируемых группах).

Ткань легкого замораживалась в жидком азоте и разрушалась при помощи микродисмембратора (Microdismembrator U, B.Braun). Лимфоциты периферической крови осаждались центрифугированием на растворе фиколла, плотностью 1.77. Клеточная ДНК выделялась методом фенол-хлороформной экстракции. В работе также были использованы следующие

методы исследования: спектрофотометрическое определение концентрации ДНК, ее электрофорез и блот-гибридизация, получение радиоактивно-меченых зондов, полимеразная цепная реакция и др. [Sambrook J. et al. 1989]. Результаты молекулярно-биологических исследований сопоставлялись с традиционными клиническими характеристиками опухолей. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с использованием точного критерия Фишера при двусторонней альтернативе [Закс Л. 1976].

II.3. Результаты.

11.3.1. Наследственный полиморфизм локуса гена c-Ha-ras-1 у больных немелкоклеточным раком легкого и первично-множественными злокачественными новообразованиями.

Полиморфизм в локусе протоонкогена c-Ha-ras-1 обусловлен наличием вариабельного минисателлитного участка (Variable Number of Tandem Repeats - VNTR), расположенного примерно на на 1 тыс.п.н. "ниже" значащей части гена (рис. 1, стр. 7). Единицей повтора является фрагмент в 28 п.н. [Capon D.J. et al. 1983]. Известны 4 аллеля1, совместная частота встречаемости которых составляет примерно 95% от числа всех аллелей в популяции ("общие" аллели а1, а2, аЗ, а4), а также около 30 "редких" аллелей. Все они отличаются друг от друга по числу единиц повтора в минисателлите [Krontiris T.G. et al. 1985, 1986].

Целью этой части работы было исследование полиморфизма гена с-Ha-ras-1 у больных с различным метастатическим статусом и гисто-морфологическими типами HMPJ1, у пациентов с первично-множественными злокачественными новообразованиями, одним из которых является НМРЛ.

'Термин "аллель" в данном случае означает вариант размера минисателлитной ДНК.

ВатН1

1

рис. 1

Схема гена с-На-гаэ-1 человека

1У

Масштаб 500 н.п

вас! Мвр[/Нра1 Мзр1/Нра1 Ва1

■з§1б

4630

5620

6(

Черные прямоугольники, обозначенные римскими цифрами - экзоны гена. Стрелками показаны сайты рестрикции эндонукпеаз, а цифрами (в нуклеотидных парах) - их положение по отношению к левому на схеме сайту Ват Н1. Пунктиром показана область \ZNTR.

Обработка клеточной ДНК эндонуклеазами Мзр1/Нра11 с последующим анализом по Саузерну позволила выявить четыре "общих" аллеля: (а1 - а4, размеры 1.0, 1.5, 2.1 и 2.5 тыс.п.н. соответственно). Также были обнаружены 6 "редких" аллелей (0.8, 0.9, 1.1, 1.2, 2.3, 2.4 тыс.п.н.) (рис.2).

1

м

2 3 4 5 6

2.4 2.1

• <а4

* < аЗ

4

1.5 —

1.0

< а2

<а «• <а1

редк.

рис.2. Анализ полиморфизма гена с-На-га5-1 у больных НМРЛ с помощью смеси эндонукпеаз Мэр1 и Нра11.

М - маркер молекулярного веса ДНК Треки 1 - 7 - препараты клеточной ДНК больных НМРЛ.

В первую очередь нами было проанализировано распределение аллелей с-На-газ-1 в гистологически разнородных группах НМРЛ (табл1). Как видно из приведенных данных, распределение "общих" аллелей а1 - а4 в анализируемых группах различается незначительно, хотя обращает на себя внимание некоторое увеличение частоты а4 у больных по сравнению с контрольной группой. В группах пациентов с аденокарциномами и железисто-плоскоклеточным ("смешанным") раком легкого наблюдается достоверное повышение частоты встречаемости "редких" аллелей (10 из 100 и 3 из 20) по сравнению с здоровыми людьми (3 из 112, р=0.042, р=0.045 соответственно).

Таблица 1. Частота встречаемости аллелей протоонкогена с-На-гаву больных РП и индивидов без онколатопогии (норм контроль)._

"Общие" ПКРЛ АКЛ Смешан. НМРЛ Здоровые

аллели рак (всего) индивиды

с-На-ras п=132 п =100 п=20 п=258 п=112

а1 78 55 10 148 71

% 59.1 55.0 57.5 63.4

а2 20 15 3 39 22

% 15.2 15.0 15.1 19.6

аЗ 17 10 1 28 12

% 12.8 10.0 10.9 10.7

а 4 12 10 3 25 4

% 9.1 10.0 9.7 3.57

"Редкие" 5 10* 3* 18 3

аллели,% 3.8 10.0 7.0 2.7

л- количество аллелей в группе (кол,- во индивидов х 2, т.к. у каждого на гомологичных хромосомах имеется по одному аллелю гена).

*Статистически значимое различие по частоте встречаемости редких аллелей между нормальным контролем и группой АКЛ (р=0.042), а также нормальным контролем и пациентами с "смешанным" раком (р-0.046)

Данные, полученные ранее в отношении полиморфизма описываемого гена у больных раком легкого в различных популяциях, достаточно противоречивы. Если в английской популяции [Не1дЬчуау и. е1 а1.

1986] не было показано повышения частоты "редких" аллелелей у больных раком легкого по сравнению с здоровыми людьми, норвежскими ¡КуЬегд О. е1 а1. 1990] и американскими [Эидтоига Н. е1 а1. 1990] исследователями такая закономерность была продемонстрирована. Помимо проблемы генетической адекватности различных популяций, противоречивые результаты могут быть объяснены тем, что авторами не всегда учитывалось содержание отдельных гистологических типов в анализируемой группе новообразований. Наши данные согласуются с этим предположением: в последней из цитируемых работ фактически 2/3 анализируемых случаев рака легкого составляли аденокарциномы.

Таблица 2. Частота встречаемости аллелей гена с-На-га$-1 у курящих и некурящих больных с железистыми опухолями легкого и у индивидов без _ онкопатологии (контрольная группа)._

Экспозиция канцерогенами табачного дыма ал л е ли редкие а1 а2 аЗ а4 аллели АКЛ

-, п=66 +, п=34 38 (57.6%) 11 (16.7%) 3 (4.5%) 4 (6.1%) 10* (15.2%)

17 4 7 6** 0

п=8 +, п=12 Смешан, рак лег к.

3 1 1 0 3*

7 2 0 з** 0

- - некурящие пациенты + - курящие пациенты

п-количество аллелей в анализируемых группах

* значительное различие по частоте встречаемости редких аллелей как между некурящими и курящими пациентами с АКЛ (р-0.015), так и между некурящими больными в обеих группах и нормальным контролем (р=0.0030, р=0.0036).

** По сравнению с нормой, среди курящих больных выше частота аллеля а4 (р=0.011-для АКЛ, р=0.0197 - для "смешанного" рака легкого).

Основной причиной рака легкого, как известно, является курение табака. Однако, если возникновение плоскоклеточного рака, как правило,

ассоциируется с этой привычкой, этиологическое значение канцерогенов табачного дыма при возникновении аденокарцином легкого менее очевидно. В связи с этим нами было проведено сравнительное исследование распределения аллелей с-На-газ-1 у курящих и некурящих больных железистым раком легкого (табл.2).

В результате установлено, что в группе некурящих больных АКЛ частота встречаемости "редких" аллелей составляет 15.2%, что не только выше показания данного параметра у здоровых людей (2.7%, р=0.0030) но и у некурящих больных АКЛ (р=0.015). Хотя нами обследовались лишь 10 больных железисто-плоскоклеточным раком, сходная тенденция прослеживается и в этой группе: у 3 из 8 некурящих больных обнаружены "редкие" аллели, что достоверно выше аналогичного показателя в контрольной группе (р=0.0036). Оказалось, что в исследованной выборке носителями "редких" аллелей у больных АКЛ и "смешанным" раком являются только некурящие индивиды. Фактически, каждый третий пациент из этих групп обладал "редким" аллелем, в то время как среди нормальных доноров такие фрагменты встречаются лишь у 5% индивидов.

Нами также было проведено медико-генетическое обследование больных аденокарциномами, которые не подвергались экспозиции табачными или другими известными канцерогенами в процессе профессиональной деятельности. У 3 из 6 пациентов, имевших ближайших родственников с онкологическими заболеваниями в анамнезе, в геноме есть "редкие" аллели с-На-гзз-1.

Полученные данные свидетельствуют об ассоциации "редких" аллелей гена с-На-газ-1 с повышенным риском возникновения железистых опухолей легкого у человека. Вряд ли можно утверждать, однако, что конститутивная ослабленность системы репарации ДНК (индикатором которой могут являться наследуемые "редкие" формы минисателлита) не вносит свой вклад как фактор генетического риска возникновения например плоскоклеточного рака легкого. Скорее всего, группа некурящих больных АКЛ представляет собой более "чистую" систему, в которой не проявляется

ю

доминирующее влияние канцерогенов внешней среды и поэтому имеется возможность зафиксировать факторы наследственной

предрасположенности к возникновению заболевания.

Среди курящих больных железистыми опухолями отмечается увеличение частоты встречаемости аллеля а4 (6 из 34 - АКЛ, 3 из 12 -"смешан", рак легкого) по сравнению с группой индивидов без онкопатологии (4 из 112, р=0.011, р=0.0197 соответственно) (табл. 2). Обсуждение этого факта будет дано после результатов анализа распределения аллелей с-На-газ-1 в группах больных с различными клинико-морфологическими параметрами заболевания: метастатическим статусом и уровнем клеточной дифференцировки опухоли. В табл. 3 представлены данные о распределении аллелей с-На-газИ в группах больных с наличием либо отсутствием метастазов на момент хирургического вмешательства.

Таблица 3. Частота встречаемости аллелей протоонкогена с-На-газ-1 у больных РЛ с различным метастатическим статусом.

Общие П К Р Л А К Л

аллели

с-На-гаэ М+ М- М+ м-

п=68 п=64 П=52 п=30

а1 42 36 29 15

% 61.8 56.3 54.0 50.0

а2 7 13 7 4

% 10.3 20.3 14.0 13.3

аЗ 8 9 5 5

% 11.8 14.1 10.0 16.7

а4 9* 3 8* 2

% 13.2 4.7 16.0 6.7

"Редкие" 2 3 3 3

аллели,% 2.9 3.1 6 10.0

п — количество аллелей в группе М+ - наличие метастазов, М- - остутствие метастазов *статистически значимое различие по частоте встречаемости а4 между пациентами с метастазами и индивидами без онкопатологии (р=0.033-для ПКРЛ, р=0.0107 - для АКЛ)

и

Как у больных ПКРЛ, так и у пациентов с АКЛ, имеющих метастатические поражения, отмечается статистически достоверное увеличение частоты встречаемости аллеля а4 по сравнению с группой индивидов без онкопатологии (13.2%, 16.0%; р=0.033, р=0.011 соответственно). В тоже время, исследование данного параметра у больных без видимых метастатических поражений (4.7% - для ПКРЛ, 6.7% -для АКЛ) практически не отличается от его показателя в группе здоровых индивидов (3.6%).

При анализе распределения аллелей у больных с различным уровнем клеточной дифференцировки опухоли было установлено, что частота встречаемости а4 в группа ПКРЛ с низкой дифференцировкой составляет 19.2% (5 из 26 аллелей), что выше значения данного показателя в группе высоко и умеренно дифференцированных плоскоклеточных опухолей (6.6%, 7 из 106 аллелей) и достоверно превышает его значение в контрольной группе (3.6%, р=0.012). У больных с низкодифференцированными АКЛ отмечена сходная тенденция (3 из 16, 18.3%, р=0.042).

Из приведенных данных можно сделать вывод, что наличие у больного немелкоклеточным раком легкого "общего" аллеля а4 гена с-На-гаэ-1 ассоциируется с способностью опухоли к быстрой диссеминации и низким уровнем клеточной дифференцировки. Таким образом, присутствие в генотипе пациента а4 может оцениваться как неблагоприятный прогностический показатель течения данного заболевания.

В анамнезе 13 обследованных нами пациентов с НМРЛ фигурируют злокачественные новообразования другой локализации. Наследственная предрасположенность к возникновению первично-множественных злокачественных новообразований (ПМЗН) в некоторых случаях представляется достаточно очевидной. Однако, молекулярно-генетические маркеры, ассоциирующиеся с этим феноменом, еще недостаточно изучены. Мы сравнили распределение различных аллелей гена с-На-гзз-1 в группах

ПМЗН - пациентов, последней опухолью в анамнезе которых был рак легкого с больными ПМЗН других локализаций и здоровыми людьми.

Полученные нами данные приведены в табл. 4. В группе индивидов с метахронными опухолями, последняя из которых была раком легкого, показано статистически достоверное возрастание частоты а4 (5 из 26, 19.2%) по сравнению с контрольной группой (4 из 112, 3.6%, р=0.012). Кроме того, в обеих группах ПМЗН-больных отмечается несколько повышенное содержание "общего" аллеля аЗ, однако, статистическая достоверность этого заключения находится на уровне значимости его ошибки (р=0.0500).

Частота встречаемости "редких" аллелей в описываемых группах больных несколько превышала показания этого параметра у индивидов без онкопатологии, однако, эти различия были недостоверными.

Таблица 4. Распределение аллелей с-На-газ-1 у пациентов с ПМЗН.

"Общие" ПМЗН ПМЗН ПМЗН Нормальный

сРЛ, без РЛ, (всего), контроль,

аллели п=26 п=68 п=94 п=112

а1 10 35 45 71

% 38.5 51.5 47.9 63.4

а2 3 11 14 22

% 11.5 16.2 14.9 19.6

аЗ 6 13 19 12

% 23.1 19.1 20.2 10.7

а4 5* 4 9 4

% 19.2 5.9 9.6 3.6

"редкие" 2 5 7 3

аллели, % 7.7 7.4 7.4 2.7

* повышение частоты а4 по сравнению с нормальным контролем (р=0.0121).

Полученные данные также свидетельствуют о роли минисателлитного участка в дистальной части протоонкогена с-На-газ-1 в патогенезе НМРЛ у человека.

Точная функция области VNTR до конца не выяснена. Возможность того, что аЗ или а4 аллели напрямую задействованы в процессе возникновения или прогрессии исследованных онкопатологий, представляется маловероятной. Скорее всего, в зависимости от размера, минисателлит оказывает различное модулирующее действие на факторы, непосредственно ассоциированные с процессом канцерогенеза, например, на экспрессию протоонкогена c-Ha-ras-1 или близлежащие гены. Во всяком случае известно, что этот минисателлит может взаимодействовать с некоторыми транскрипционными факторами, а от его величины зависит уровень экспрессии регулируемого гена [Green М., Krontiris T.G. 1993]. Наши данные о том, что наибольший по размеру "общий" аллель а4 чаще встречается у пациентов с более агрессивными случаями HMPJ1, согласуются с приведенной выше гипотезой. Интересен также тот факт, что а4 чаще встречается у курящих больных железистым раком легкого. Канцерогены табачного дыма являются причиной соматических мутаций в клетках легкого, фенотипическое проявление таких генетических нарушений может зависеть от действия регуляторных элементов генома, к которым относится описываемый участок.

II.3.2. Наследственный полиморфизм гена туеL1 у больных НМРЛ и

ПМЗН.

Полиморфизм гена mycL1 регистрируется благодаря наличию сайта рестрикции для эндонуклеазы EcoRI, локализованного во втором интроне [Nau М.М. et al. 1985] (рис. 3, стр. 15 ). При рестрикции клеточной ДНК этот сайт обеспечивает образование фрагмента в 6 тыс.п.н. (S-аллель), а его отсутствие - фрагмента в 10 тыс.п.н.(L-аплель).

Ранее японскими исследователями было показано, что генотип SS часто ассоциируется с появлением регионарных и отдаленных метастазов. Кроме того, уровень смертности у пациентов с S-аллелем был значительно выше [Kawashima К. et al. 1988, 1992].

рис. 3.

Схема гена MYC L1 человека

EcoRI

Smal

-3000 о

EcoRI-полиморфный JL сайт I"

Масштаб 500 н.п

Е

1157

3106

Черные прямоугольники, обозначенные римскими цифрами - экзоны. Стрелками указаны сайты рестрикции эндонуклеаз, цифрами - их расположение (в нуклеот. парах) от точки старта транскрипции (0).

Французские авторы констатировали ассоциацию между генотипом SS и появлением у больных раком молочной железы метастатических поражений легкого [Chámpeme М.-Н. et al. 1992.]. В некоторых других популяциях связь между S-аллелем и характером течения рака легкого не установлена [Tefre Т. et al. 1990, Tamai S. et al. 1990].

В этой части работы мы анализировали ассоциацию аллелей гена mycL1 с клинико-морфологическими параметрами НМРЛ: уровнем метастазирования опухоли и степенью ее клеточной дифференцировки. Анализу подверглись также пациенты с ПМЗН, последней опухолью в анамнезе которых был рак легкого.

Были проанализированы образцы ДНК от 87 пациентов, которые ранее прошли тестирование в отношении полиморфизма c-Ha-ras-1. Их рестрикция эндонуклеазой EcoRI и последующий анализ по Саузерну позволили выявить 2 фрагмента: L и S аллели. Соответственно, в треках присутствовали 1 либо 2 характеристические полосы, в зависимости от гомозиготности или гетерозиготности по данному локусу конкретного больного (рис 4).

Одновременно полиморфизм данного гена изучался в группе из 53 здоровых доноров (контрольная группа).

По сравнению с статистически достоверными закономерностями, установленными в отношении распределения аллелей c-Ha-ras-1 у обследованных онкологических больных, ассоциация между определенным

генотипом либо аллелем ту&Л и клиническим течением заболевания прослеживается менее явно.

м

10.06.0 ■

рис.4. Рестрищионный полиморфизм гена тус!-1 у больных НМР/1. М - маркер молекулярного веса ДНК. Треки 1 - 7 - препараты клеточной ДНК больных НМРЛ.

Распределение аллелей I. и Э среди больных с различными гистологическими типами НМРЛ фактически идентично таковому в контрольной группе.

Исследование полиморфизма гена тусИ у пациентов с НМРЛ различной степени опухолевой диссеминации позволило выявить следующие особенности. Частота встречаемости 1_-аллеля у больных ПКРЛ с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов составляет 39.3%, Э-аллель в той же группе встречается чаще: 60.7% (табл. 5, стр. 16).

Таблица 5. Частота встречаемости аллелей тусИ у больных

ПКРЛ АКЛ ЖПКРЛ Всего НМРЛ

Аллель м- М+ М- М+ м- М+ М- М+

п=58 п=56 п=14 п=34 п=6 п=6 п=73 п=96

Ь 33 22 9 17 2 1 44 40

% 56.9 39.3 64.3 50.0 56.4 41.7

Б 25 34 5 17 4 5 34 56

% 43.1 60.7 35.7 50.0 43.6 58.3

М+ - наличие, М- - отсутствие метастазов

Введем относительную величину (К), характеризующую отношение частот встречаемости 1_ к Б. В описываемой группе она составляет 0.64. В тоже время у больных ПКРЛ без метастазов К=1.33. Что превышает данную величину в группе индивидов без онкопатологии (1.1).

В фуппе пациентов с АКЛ без метастазов содержание 1_-аплеля также выше (64.1%), а К=1.8. АКЛ-больные с метастазами имеют равную частоту полиморфных фрагментов (К=1). В целом, у больных НМРЛ с метастазами соотношение встречаемости аллелей тус1_1 по сравнению с контрольной группой примерно на 10% "сдвинуто" в сторону уменьшения содержания Ьаллеля.

Распределение генотипов в рассматриваемых группах носит сходный характер. . '

Гомозиготы по Б-аллелю встречаются на 16% чаще у больных ПКРЛ с метастазами (10 из 28 - 35.7%). Одновременно с этим эквивалентно уменьшается доля 1_1_ генотипов. Последних фактически в 2 раза больше среди ПКРЛ-пациентов без метастатических поражений (10 из 29 по сравнению с 4 из 28 у больных с метастазами).

Примечательно, что все пациенты с метастатическим поражением отдаленных органов являлись носителями 3-аплеля, причем более половины из них - гомозиготны по данному фрагменту (4/7). Таким образом, во всех исследованных группах нами не зафиксировано ни одного случая И-генотипа у больного с отдаленными метастазами на момент хирургического вмешательства.

Исследование генотипов пациентов с различным уровнем клеточной дифференцировки показывает почти двукратный рост встречаемости генотипа ЭЭ среди пациентов с низкодифференцированными опухолями по сравнению с группой индивидов с высоко и умереннодифференцированными опухолями (46.2% против 22.7% - для ПКРЛ, 42.8% против 23.5% - для АКЛ) (табл. 6, стр. 12 ).

Таблица 6. Распределение аллелей и генотипов тусИ у больных

НМРЛ с различным уровнем дифференцировки опухолевых клеток.

Аллель ПКРЛ АКЛ

гена в/д и у/д н/д в/д и у/д н/д

mycL1 п=88 п=26 п=34 п=14

L 45 10 22 4

% 51.1 38.5 64.7 28.6

S 43 16 12 10*

% 48.9 61.5 35.3 71.4

Генотип П=44 п=13 п=17 п=7

UL 11 3 9

% 25.0 23.1 52.9 -

L/S 23 4 4 4

% 52.3 30.8 23.5 57.1

S/S 10 6 4 3

% 22.7 46.2 23.5 42.8

в/д у/д - высокая и умеренная, н/д - низкая дифференцировка *различие по частоте встречаемости Э-аллеля между группой высоко и умеренно-дифференцированных аденокарцином легкого и группой низкодифференцированных АКЛ.

Соответственно, если в высоко и умереннодифференцированных ПКРЛ распределение аллелей тусИ фактически идентично таковому в контрольной группе, низкодифференцированные плоскоклеточные опухоли демонстрируют изменение баланса в сторону увеличения содержания Б и уменьшения встречаемости 1_-аллеля. В сходных группах АКЛ различие частот встречаемости I. к Э статистически достоверно (р=0.0294).

Распределение аллелей гена тус1_1 у пациентов с ПМЗН представлено в таблице 7 (стр. 19).

Из приведенных данных видно, что содержание Э-аллеля у пациентов с метахронными новообразованиями, последним из которых был рак легкого, частота встречаемости Э-аллеля почти в 2 раза больше, чем у пациентов с множественными опухолями других локализаций и у нормальных доноров. Небольшое количество обследованных в этой группе не позволяет, однако, сделать такое заключение с оптимальной

достоверностью (р<0.05). Генотип БЭ встречался у половины ПМЗН - РЛ больных, в то время как все другие обследованные группы в соответствии с примерно равной частотой встречаемости аллелей I. и Э в нормальной популяции, демонстрировали соотношение генотипов И : (.Э : ЭЭ как 1 : 2 :1.

Таблица 7. Полиморфизм тус11 у пациентов с ПМЗН.

Аллель ПМЗН, ПМЗН ПМЗН Норм.

гена РЛ без РЛ (всего) контр.

туе 1.1 п=20 п=64 п=84 п=86

Ь 7 30 37 45

% 35.0 46.9 44.0 52.3

э 13 34 47 41

% 55.0 53.1 56.0 47.8

Генотип п=10 п=32 п=42 п=43

П. 2 6 8 10

% 20.0 18.8 19.0 23.3

ьэ 3 18 21 25

% 30.0 56.3 50.0 58.1

ээ 5 8 13 8

% 50.0 25.0 31.0 18.6

Подводя итог этой части работы следует отметить, что в нашей популяции прослеживается явная тенденция к повышенной частоте Э-аллеля протоонкогена тус1Л у пациентов с высокометастазирующим НМРЛ и в группе больных с низкодифференцированными АКЛ. У больных ПМЗН с ЗЭ-генотипом выше вероятность того, что последней опухолью является рак легкого. Таким образом, наличие у пациента Э аллеля может расцениваться как неблагоприятный прогностический фактор течения НМРЛ.

11.3.3. Исследование некоторых соматических нарушений короткого плеча 1 хромосомы в опухолях легкого человека.

За последние годы многие исследователи обратили внимание на высокую частоту делеций некоторых участков короткого плеча первой

хромосомы в опухолевых клетках пациентоз с нейробластомой [Fong С. et al. 1989, Maris J.M. et al. 1995, Martinsson Т. et al. 1995, Casciano I. et al. 1996]. Французскими авторами выявлены соматические нарушения 1р в клетках рака молочной железы [Bieche I. et al. 1993]. Приведенные данные дают основание предположить наличие нескольких онкосупрессорных генов на коротком плече 1 хромосомы.

Характерные соматические нарушения 1р выявляются при мелкоклеточном рака легкого. Внутрихромосомная транслокация приводит к образованию гибридного гена mycL1-RFL (1р32) [Makela Т. et al. 1992.], обладающего трансформирующей активностью [MacLean-Hunter S. et al. 1994].

Исследование соматических нарушений участка 1p32-pter короткого плеча 1 хромосомы в клетках опухоли, которые могут быть связаны с возникновением и/или прогрессией немелкоклеточного рака легкого у человека, явилось предметом рассмотрения в данной части работы.

Нами были использованы 5 микросателлитных ДНК-маркеров: D1S417, D1S162, MYCL1, D1S247, D1S143. Их взаиморасположение на хромосоме показано на рис. 5, а общая характеристика приведена в табл. 8

(стр. 21). msifi?

DIS417 I MYCL1 DIS247 D1S243

I / 1 X vv_v_v_

центромера Гр32 - 1р34 1Р36 теломера

рис. 5. Взаиморасположение маркеров, использованных при исследовании соматических нарушений на коротком плече хромосомы 1.

Препараты ДНК от 58 индивидов с различными гистологическими типами НМРЛ анализировались на предмет полиморфизма вышеуказанных локусов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Исследование продуктов реакции осуществлялось согласно протоколу, разработанному в лаборатории онкогенетики (руководитель - д-р. R.Lidereau) центра Rene Huguenine (Париж, Франция).

Таблица 8. Основные характеристики микросателлитных маркеров, _использованных при анализе ДНК из опухолей легкого._

Маркер Тип сателлита Размеры аллелей Количество аллелей Гетерози-готностьв популяции

D1S417 СА-повтор 189-195н.п. 4 0.59

D1S162 СА-повтор 127-160н.п. 12 0.91

MYCL1 AAAG-повтор 140-209н.п. 12 0.95

D1S247 СА-повтор 243-263н.п. 11 0.87

D1S243 СА-повтор 142-170н.п. 11 0.86

Их разделение по молекулярному весу производилось в высокоразрешающем денатурирующем ПААГ с последующим "сухим" капиллярным переносом на заряженную мембрану и гибридизацией с радиоактивно-меченым поу-32Р олигонуклеотидом (СА)12. (В случае MYCL1 специфической пробой служила одна из олигонуклеотидных затравок, использовавшаяся для амплификации фрагмента в ходе ПЦР).

На рис.6 (стр. 22) представлены результаты анализа некоторых из вышеназванных маркеров в ДНК из клеток НМРЛ.

В зависимости от гомо либо гетерозиготности по данному локусу конкретного больного, в каждом треке присутствовали 1 или 2 основных фрагмента. Высокая полиморфность использованных маркеров обусловила преобладание гетерозиготных форм (см. табл.8). Иными словами, подавляющее большинство случаев были "информативными":только при наличии 2 аллелей можно зафиксировать делецию одного из них в ДНК из опухолевых клеток по сравнению с ДНК-препаратом из клеток периферической крови того же больного.

Проведенные исследования показали, что наиболее типичными изменениями названных маркеров в опухолевых клетках больных НМРЛ является утрата гетерозиготности (делеция одного из аллельных фрагментов, loss of geterozygosity - LOH, рис.бА).

пациент 25ПК

Маркеры_D1S162 D1S417 MYCL1

Н. 0.

рис 6. Исследование нарушений микросатеплитных маркеров у пациентов с НМРЛ.

О - препарат амллифицированной ДНК из клеток опухоли, Н - препарат амплифицированной пимфоцитарной ДНК. Стрелками показаны мутации в опухоли.

A. Депеции (LOH+) в различных локусах у одного и того же пациента.

Б. Пример фенотипа RER+ по маркеру D1S162 (пациент 12АК).

B. Пример алпельного дисбаланса по маркеру D1S243.

Г. Нормальная амплификация аллелей (маркер D1S243, пациент

45ПК).

В нескольких случаях отмечаются также ошибки репликации (replication error - RER+, рис.бБ) и эффект алпельного дисбаланса (реципрокная интенсивность амплификации аллелей в опухоли по сравнению с нормой, рис. 6В). Данные по частоте встречаемости различных нарушений у обследованных больных приведены в табл. 9 (стр.23).

В целом исследованные локусы мало отличались друг от друга по частоте утраты гетерозиготности. Однако, по мере продвижения от центромерной к теломерной области, прослеживается тенденция к некоторому росту числа делеций. Наибольшее значение LOH демонстрирует маркер D1S243 (41.9% от числа информативных или

гетерозиготных случаев), который фактически расположен в теломерной области (1р36).

Таблица 9. Частота генетических нарушений 5 микросателпитных

Маркер Количество гетерозигот Делеция адлеля (LOH+) Ошибка репликации (RER+) Аллель-ный дисбаланс Нет нарушений

D1S162 46 15(32.2%) 3 (6.5%) 3 (6.5%) 25 (54.3%)

D1S417 27 8 (29.6%) — 2 (3.9%) 19 (70.4%)

MYCL1 51 19(37.3%) — — 30 (58.8%)

D1S247 31 12(38.7%) — — 18 (58.1%)

D1S243 43 18 (41.9%) 1 (2.3%) 1 (2.3%) 23 (53.5%)

Результаты анализа частоты микросателлитной нестабильности (фенотип RER+), и случаев аллельного дисбаланса в клетках НМРЛ дают основания предположить нетипичность данного явления в исследованном хромосомном локусе.

Генетические нарушения во всех исследованных локусах не проявляли гистологической специфичности и наблюдались с равной частотой у больных ПКРЛ и АКЛ.

При оценке степени LOH локуса 1p32-pter нами были использованы следующие принципы. В случае обнаружения делеций для всех информативных маркеров (5 из 5, 4 из 4, 3 из 3 и т.д.) констатировали 100% уровень данного нарушения. Если имелись делеции в 4 из 5, 3 из 4, 2/3, 3/5, 2/4 и 1/2 информативных случаев, мы оценивали их как 50 - 80% уровень LOH. В третью группу вошли пациенты с частотой делеций от 20 до 40% (2/5, 1/3, 1/4, 1/5). Наконец, в образцах опухолей от 17 пациентов не было выявлено ни одного LOH+ случая по какому-либо из исследованных маркеров (уровень.-делеций - 0%). С учетом изложенных критериев, при анализе LOH в группах опухолей с различной скоростью роста, размером и

метастатическим потенциалом были выявлены некоторые особенности (табл. 10).

Таблица 10. Частота утраты гетврозиготности в группах пациентов с _различными клиническими параметрами заболевания_

Клинический параметр ДЕЛЕ Ц ИИ 100% 50-80% 20-40% 0% п=11 п=18 п=12 п=17

Небольшой размер опухоли (Т1-Т2) 5 (45.5%) 10(55.6%) 6 (50.0%) 14 (82.4%)

Отсутствие регионарных метастазов (N0) 1* (9.4%) 8 (44.4%) 10(83.3%) 10 (58.8%)

Стадия заболевания: 1-П Ш-Л/ — 4 (22.2%) 6 (50.0%) 7(41.2%)

11 (100%) 14 (77.8%) 6 (50.0%) 10 (58.8%)

Низкая клеточ. дифференцир. 4 (36.4%) 2 (11.1%) 3 (25.0%) 1 (5.9%)

*статистически значимое различие по числу опухолей с поражением регионарных п/у между группами с 100% LOH и LOH до 50% (р=0.0006); ** значимое различие по числу опухолей 3-4 стадии развития между группой с 100% LOH и индивидами с делециями до 50% (р=0.023), а также группой с фенотипом LOH - (р=0.014)

Нами не было выявлено каких-либо закономерностей в отношении LOH в зависимости от степени клеточной дифференцировки опухоли.

У пациентов с полным отсутствием делеций в исследованных локусах большинство опухолей (14 из 17, 82.4%) имеют небольшой размер (Т1-Т2), в тоже время как у больных с фенотипом LOH+ наблюдается фактически равное соотношение пациентов с показателями Т1-Т2 и ТЗ-Т4.

Лишь в 1 из 11 случаев опухолей (9.4%), характеризующихся отсутствием метастазов в регионарные лимфатические узлы (на момент операции), делеции обнаружены в 100% информативных случаев исследованных маркеров.

Наиболее типичными для фенотипа LOH+ являются,, случаи длительно растущих опухолей с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов как первого, так и второго порядка. Примером такого новообразования может служить 1 из 2 случаев, в которых делеции были выявлены в 5 из 5 исследованных маркеров. Опухоль была классифицирована какТ4Ы2М0 и имела размеры 10x12x10 см (М23ПК).

Однако, следует отметить, что при рассмотрении групп плоскоклеточных опухолей с метастатическим поражением отдаленных органов, у 3 из 4 пациентов наблюдалось полное отсутствие делеций. В этих случаях наблюдалась быстрая генерализация процесса: т.е. наличие "отдаленных" метастазов сочеталось с небольшим размером первичной опухоли (T2NxM1).

Наконец, анализ распределения больных в указанных выше группах в зависимости от стадии заболевания показал, что все пациенты с 100% LOH в зоне 1р32 - pter имеют 3-4 стадию заболевания, в то время как среди пациентов с низким уровнем делеций, такие индивиды встречаются лишь в половине случаев.

Таким образом, наиболее вероятно предположение, согласно которому нарушения исследованных локусов отражают общую генетическую нестабильность длительно растущего НМРЛ, проявляются на более поздних стадиях опухолевой прогрессии и не являются типичными для быстро развивающихся неоплазий. Поскольку размер опухоли не всегда отражает время ее развития, интенсивность соматических нарушений ДНК в описываемых локусах мог бы служить критерием времени

роста неоплазии на момент проведения исследования.

* * *

Как следует из всех результатов данной работы, исследование генетических маркеров как детерминированных в геноме индивидума (полиморфизм протоонкогенов c-Ha-ras-1 и mycL1), так и изменяющихся в ходе прогрессии опухоли (микросателлитные ДНК) может служить важным инструментом как при формировании групп риска возникновения различных

форм немелкоклеточного рака легкого, так и для оценки степени интенсивности и риска быстрой прогрессии опухоли у таких больных. На этой модели возможно создание панели различных молекулярных маркеров, позволяющей с большой достоверностью предугадать характер течения заболевания у каждого конкретного пациента, что несомненно имеет очень важное значение в практике клинической онкологии [гЬогоуэкауа е1 а1. 1996].

111. Выводы.

1. Частота встречаемости а4 и "редких" аллелей гена c-Ha-ras-1, S-аллеля гена mycL1 повышена у больных с различными гистологическими типами НМРЛ и у пациентов с ПМЗН.

2. В группе некурящих пациентов с аденокарциномами легкого обнаружено значительное повышение частоты встречаемости "редких" аллелей c-Ha-ras-1, что свидетельствует о выраженной наследственной детерминированности развития данного гистологического типа НМРЛ.

3. Аллель а4 протоонкогена c-Ha-ras-1 является неблагоприятным прогностическим маркером при немелкокпеточном раке легкого у человека. Возрастание частоты данного аллеля наблюдается у больных немелкоклеточным раком легкого с регионарными и отдаленными метастазами, а также низкой дифференцировкой опухолевой ткани.

4. Аллель аЗ c-Ha-ras-1 чаще встречается у пациентов с ПМЗН и не ассоциируется с неблагоприятными клиническими критериями при раке легкого.

5.Наличие в генотипе пациентов НМРЛ S-аллеля протоонкогена /77/cL1 ассоциировано с более высоким метастатическим потенциалом опухолей по сравнению с таковыми у больных, не имеющими этого аллеля.

6.Соматические мутации в коротком плеча 1 хромосомы (локус гена туеL1, и соседние с ним участки) выявляются в медленно растущих опухолях легкого, как правило на 3-4 стадии заболевания и не имеют гистологической специфичности. Феномен утраты гетерозиготности данного локуса не является причинным фактором трансформации, а является показателем длительной прогрессии основого процесса.

IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Yakubovskaya М., Zborovskaya I., Gasparian A.. Polotsky В., Machaladze Z., Belitsky G.. Analysis of K-ras mutation in lung tissues and metastases of Russian patients with lung tumors. Environmental and Molecular Carcinogenesis, 1994, V.23s, p.75.

2. Zborovskaya I., Polotsky В., Kitaeva M., Gasparian A., Gerasimov S., Shtutman M., Kadagidze Z. Tatosyan A.. Polymorphic alleles of oncogenes and expression of cell surface molecules in non-small cell lung carcinomas with different metastatic potential. XXIII Meeting ISOMB.1994, P.7.3

3. Zborovskaya I., Gasparian A.. Polotsky В., Kitaeva M., Shtutman M., Kadagidze Z. Tatosyan A.. Prognostic polymorphic alleles of c-Ha-ras and L-myc in lung tumors of different histological types. Cancer detection and prevention, 1995, V.19, N 1, p.80

4. Marina G. Yakubovskaya, Vladimir Spiegelman, Feng C. Luo, Serge Malaev, Alexander Salnev, Irina Zborovskaya. Alexander Gasparian. Boris Polotsky, Zurab Machaladze, Alexander C. Trachtenberg, Gennady Belitsky and Zeev Ronai. High frequency of K-ras mutations in normal appearing lung tissues and sputum of patients with lung cancer. Int. J. Cancer, 1995, V.63, pp.810-814.

5. Zborovskaya I., Gasparian A.. Kitaeva M., Polotsky В., Tupitzin N., Gerasimov S., Machaladze Z., Yakubovskaya M„ Shtutman M., Davidov M., Tatosyan ASimultaneous detection of genetic and immunological markers in NSCLC: prediction of metastatic potential of tumor. Clin. Exp. Metastasis, 1996, V.14.

6. Гасларьян А.В.. Сельчук В.Ю., Якубовская М.Г., Зборовская И.Б., Татосян А.Г. Рестрикционный полиморфизм протоонкогена c-Ha-ras-1 у пациентов с первично-множественными злокачественными новообразованиями и немелкоклеточным раком легких. Генетика, 1997, Т.ЗЗ, N 1, сс. 96-100.

7. Гаспарьян А.В.. Зборовская И.Б., Лактионов К.К., Мукерия А. Ф., Татосян А.Г., Заридзе Д.Г. Полиморфизм протоонкогена c-Ha-ras-1 у больных железистыми опухолями легкого - в сб. научн. трудов "Новое в онкологии" под ред. И.В.Поддубной. М., 1997, N 2 (принято в печать).

8. Зборовская И.Б., Гаспарьян А.В.. Полоцкий Б.Е., Лактионов К.К., Герасимов С.А., Китаева М.А, Пахомов В.Ю., Мукерия А.Ф., Заридзе Д.Г., ТатосянА.Г. Факторы генетической нестабильности при немелкоклеточном раке легкого. Материалы I Съезда онкологов СНГ, 1996, ч. Л с.185~.