Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Полиморфизм генов HLA II класса и комбинация основных серологических маркеров в ассоциации с ревматоидным артритом в русской популяции Челябинской области

003461175

На правах рукуписи

ХРОМОВА Елена Борисовна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ Ш_,А П КЛАССА И КОМБИНАЦИЯ ОСНОВНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В АССОЦИАЦИИ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 г фев

Челябинск - 2009

003461175

Работа выполнена на кафедре микробиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Бурмистрова Александра Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Сибиряк Сергей Владимирович

доктор биологических наук,

профессор Цейликман Вадим Эдуардович

Ведущая организация:

Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук, г.Екатеринбург

Защита диссертации состоится « 25 » февраля 2009 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г.Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ревматоидный артрит (РА) является одной из актуальных медико-социальных проблем. Это обусловлено отсутствием четких представлений об этиологии и патогенезе РА, комплексного мультифакторного заболевания, для которого характерны гетерогенная клиническая картина, преимущественное поражение лиц трудоспособного возраста, ранняя инвалидизация, снижение качества и продолжительности жизни больных. Все сказанное создает трудности в ранней досимптоматической и дифференциальной диагностике РА, подборе эффективных методов лечения.

Анализ результатов молекулярно-генетических исследований показал, что в развитии РА значительная доля всей генетической составляющей (3040%) принадлежит генам HLA П класса главного комплекса гистосовмесгимости человека. Об этом свидетельствуют результаты экспериментальных работ и клинических исследований: наличие в фенотипе определенных генов HLA II класса локусов DRB1, DQA1 и DQB, а также определенных гаплотипических сочетаний, ассоциировано с высоким или же минимальным риском развития данной аутоиммунной патологии во многих европейских популяциях. Такие ассоциации являются предметом изучения направления «HLA и болезни». [Хаитов P.M., Алексеев Л.П., 1991]. На сегодняшний день наименее изученной в этом плане является территория Российской Федерации, что связано с ее большой протяженностью, различиями географических и экологических районов проживания населения и его многонациональностью. В последние годы получены результаты о предрасполагающей роли гена DRB1*04 в популяции русских Московской области [Мякоткин В.А, 2003J и в популяции башкир Челябинской области [Девальд И.В., 2005].

К сожалению, несмотря на объяснение множества существенных патогенетических деталей, механизмы инициации и персистенции заболевания полностью не раскрыты, что иллюстрируется недостаточной диагностической эффективностью используемых критериев, предложенных в 1987 году Американской коллегией ревматологов (ACR) на ранних этапах развития РА. Поэтому, наряду со всесторонним изучением иммуногенетических аспектов интенсивно исследуются иммунологические показатели РА, аутоиммунного нарушения, сопровождающегося продукцией специфических для РА аутоантител различных типов. С 2008 года, помимо ревматоидного фактора, одного из «старейших» лабораторных показателей РА, в критерии ACR внесен еще один, более специфический - наличие антител к цитруллинированным пептидам, как дополнительный критерий иммунологического варианта РА [Насовов Е.Л., 2008].

В то же время, несмотря на то, что ассоциативная связь РА с генами HLA П была обнаружена 30 лет назад, а высокоспецифичные для РА антицитруллинированные антитела были открыты более 40 лет назад, только в

начале XXI века были выполнены работы, показывающие связь этих показателей, в частности ассоциацию аллелей генов НЬА П класса с продукцией специфических аутоантител, играющих важную роль в проявлении клинических симптомов заболевания.

Цель работы

Анализ ассоциации полиморфизмов генов НЬА П, определяющих чувствительность / устойчивость к ревматоидному артриту, с наличием аутоантител различных типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса 1ёМ) с целью выделения комплексного информативного лабораторного маркера риска развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.

Задачи

1. Изучить особенности распределения аллелей и генов локусов ОЯВ1, 00 А1, ОС)В1 НЬА П класса и их гаплопгипических сочетаний в русской популяции больных ревматоидным артритом.

2. Установить аллели, гены и гаплотипы НЬА II класса, определяющие предрасположенность или устойчивость к ревматоидному артриту в популяции русских Челябинской области.

3. Определить распространенность аутоантител различных типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса 1§М) и их комбинаций у больных ревматоидным артритом.

4. Оценить чувствительность и специфичность аутоантител различных типов у больных ревматоидным артритом.

5. Оценить диагностическую эффективность и информативность определения комплекса иммуногенетического и серологических показателей в лабораторной диагностике ревматоидного артрита.

Научная новизна

Определены особенности распределения аллелей и генов локусов ОЫВ1, 0<ЗА1, ОС>В1 НЬА П класса у больных ревматоидным артритом и здоровых лиц в популяции русских Челябинской области.

Впервые представлены данные об аллелях, генах и гаплотипах локусов Б1Ш1 и Б(ЗА1, Б(ЗВ1 НЬА П класса, определяющих предрасположенность и устойчивость к развитию ревматоидного артрита в популяции русских Челябинской области:

• предрасположенность к РА определяют: ген НЬА Б1Ш1*04, аллели В1Ш1*0401, БРА1*0301, БдВ1*0302, генотипы ОЯВ1*01/04, ОЛВ 1*03/04 и гаплотипы БС^З, ОЯВ1 *04-ОдА1 *0301-БдВ1 *301 и Б1Ш1*04-0<ЗА1 *0301-0(ЗВ 1*0302.

• устойчивость к РА определяют: гены В11В1*11, 1ЖВ1 * 13, ОЯВ1*15, аллели 0<ЗА1*102, БС>А1*103, БОВ 1*0602-8, гаплотипы Б11В1*07-

ОС)А1*0201-ОС>В1*0201, ШВ1 * 13-БС)А1 * 103-БОВ1 *0602-8, ОЯВ1*15-БОА1 * 102-БОВ1 »0602-8.

Новыми являются данные о частоте встречаемости, чувствительности и специфичности основных серологических показателей у больных ревматоидным артритом: антител к модифицированному цитруллинированному виментину (анти-МСУ), суммарного ревматоидного фактора (РФсум) и ревматоидного фактора класса ^М (РФггм) и их комбинаций. Показано, что наиболее специфичным тестом для диагностики РА является определение анти-МСУ антител. Максимальные значения специфичности достигаются при определении комбинации МСУ+/РФсум+, МСУ+/РФ[8м+ и одновременном обнаружении трех типов аутоантител, что позволяет проводить дифференциальную диагностику РА от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.

Показана высокая информативная значимость определения комбинации иммуногенетического маркера и серологического показателя анти-МСУ в лабораторной диагностике ревматоидного артрита. Для комбинации 011В1*04+анти-МСУ характерна максимальная чувствительность (1,0) и высокая специфичность (0,75). Эти данные позволяют заключить, что позитивность по двум показателям: ВЛВ1*04 и анти-МСУ, является высоко чувствительным и специфическим лабораторным маркером при выделении группы риска среди родственников больных РА.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Носительство определенных аллелей, генов и гаплотипов НЬА II класса определяет риск развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.

2. Высоко специфичным для диагностики ревматоидного артрита является определение антител к модифицированному цитруллинированному виментину. Максимальная специфичность достигается при определении комбинации антител трех типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса ^М), что позволяет дифференцировать ревматоидный артрит от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.

3. Определение комбинации иммуногенетического (носительство гена БКВ1*04) и серологических (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса ГйМ) показателей может служить высоко чувствительным и специфическим лабораторным маркером риска развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.

Практическая значимость

Данные о распределении полиморфизмов генов локусов БЯ и БО НЬА П класса в группе больных РА и контроле могут использоваться в качестве

группы сравнения при проведении иммуногенетических исследований в таких разделах научных направлений как «Генетическое разнообразие человека» и «НЬА и болезни».

Новый подход к оценке генетической предрасположенности/ устойчивости к развитию РА на основании ассоциации аллелей, генов, генотипов и гаплотипических сочетаний НЬА П класса можно использовать для молекулярной диагностики РА и генетического прогнозирования в семьях больных РА русской популяции Челябинской области.

Одновременное выявление у больных РА трех серологических показателей (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса позволит проводить дифференциальную диагностику группы

больных РА от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов..

Определение ассоциации аутоантител различных типов, их комбинации между собой и с иммуногенетическим показателем (носительство гена БИВ! *04) может служить лабораторным маркером риска развития РА среди родственников больных русских Челябинской области и позволит выработать наиболее эффективную тактику профилактики и лечения РА.

Полученные результаты могут быть использованы в лабораторной практике в рамках технологий молекулярной медицины в качестве вспомогательных факторов, способных дополнить классические факторы риска развития ревматоидного артрита при формировании группы риска.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику зональной лаборатории иммунологического типированния ткани ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови», ревматологических отделений МУЗ Городская клиническая больница №6 и НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Челябинск ОАО РЖД» г. Челябинска. Основные положения работы используются в научно-педагогической деятельности кафедры микробиологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет» в лекционном курсе «НЬА и болезни».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на конференции, посвященной 25-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории Челябинской государственной медицинской академии — «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Челябинск, 2006); на всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (г. Пермь, декабрь 2006 г.); на международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (г. Киров, июнь 2007 г.); на конференции «Фундаментальное и прикладное значение оценки гена иммунного ответа» (г. Челябинск, январь 2008 г.).

Публикации

По теме работы опубликовано 15 научных работ.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из 4 глав, включающих в себя введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и заключения. Список литературы включает в себя 180 работ: 27 отечественных и 153 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 2 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа проводилась на базе зональной лаборатории иммуногенетического типирования Челябинской областной станции переливания крови (совместный Научно-учебный центр молекулярной иммуногенетики УРО РАН / ГОУ ВПО Челябинский Государственный университет и ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови»).

Дизайн проведенной работы относится к типу ретроспективных исследований «случай-контроль» [Реброва О.Ю., 2002]. Работа строилась в два этапа. Первый этап включал иммуногенетические исследования больных и контрольной группы методами молекулярного типирования специфичностей системы НЬА, второй этап включал серологические исследования.

Иммуногенетические исследования

Для иммуногенетического анализа нами было обследовано 100 человек русской национальности, больных РА, находившихся на лечении в ревматологических отделениях МУЗ Городская клиническая больница № 6 и НУЗ «ДКБ на ст. Челябинск ОАО РЖД» в период с 2004-2007 гг. Набор больных проводился специалистами отделений вне зависимости от стадии, клинического варианта течения заболевания и возраста пациентов. В качестве критериев диагностики заболевания были приняты Критерии Американской ревматологической Ассоциации - АС Я (1987 год). Этническая принадлежность определялась по официальным документам и данным генеалогического анамнеза в трех поколениях (согласно рекомендациям 8-го Международного Уоркшопа в 1980г., Лос-Анджелес, США).

Среди общего количества обследованных больных РА было 83 женщины (83%) и 17 мужчин (17%). Возраст больных был от 19 до 75 лет, средний возраст составил 51,5±12,0 лет. Возраст начала заболевания от 12 до 68 лет, средний возраст начала заболевания составил 40,7±13,1 лет. Все пациенты были классифицированы по группам согласно рабочей классификации ревматоидного артрита [Муравьев Ю.В., 2007].

В качестве контрольной группы использовали популяционную выборку, сформированную на основе ДНК-банка потенциальных доноров стволовой клетки ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови». Контрольную группу составили 202 человека русской национальности,

являющихся донорами Челябинской областной станции переливания крови и постоянно проживающих в Челябинской области. Одним из критериев отбора образцов было отсутствие родства между индивидуумами.

Среди общего количества обследованных доноров женщин было 90 человек (44,6%), мужчин 112 человек (55,4%). Возраст обследуемых лиц был от 18 до 59, средний возраст составил 34,2±11,28 лет.

Исследование полиморфизма генов HLAII класса (локусы DRB1, DQA1, DQB1 и аллелей гена DRB1*04) проводили методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции с помощью наборов реагентов «HLA-ДБК-ТЕХ» (НПФ «ДНК-Технология», Москва). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (НПФ "ДНК-Технология", Москва). Геномную ДНК для исследования выделяли из периферической крови сорбционным методом с помощью наборов реагентов DIAtom™ DNA PreplOO (ООО «Лаборатория Изоген», Москва) согласно инструкции производителя.

Продукт, полученный в ходе амплификации, определяли методом горизонтального электрофореза в окрашенном бромистым этидием 3%-ом агарозном геле. Электрофорез проводили при напряжении 200-250 V. Оценка результатов проводилась на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.

Серологические исследования

Серологическое обследование заключалось в определении антител класса IgG к модифицированному цитруллинированному виментину, ревматоидного фактора классов IgM,G,A и ревматоидного фактора класса IgM в сыворотке крови. Для определения роли аутоантител, специфичных для РА, мы обследовали 53 человека с достоверным диагнозом РА (группа РА) и 53 человека с различными заболеваниями, протекающими с поражением суставов (группа неРА). Группа сравнения состояла из 30 клинически здоровых кадровых доноров ЧОСПК.

Определение аутоантител проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотке крови.

Определение антител класса IgG к модифицированному цитруллинированному виментину (анти-MCV) проводили с помощью наборов реагентов «Anti-MCV» (Orgentec, Германия). В соответствии с рекомендациями производителя, положительным результатом выявления антител к MCV считали концентрацию антител больше 20 ед/мл.

Определение суммарного ревматоидного фактора классов IgM,G,A (РФсум) проводили с помощью наборов реагентов «ВектоРевматоидный фактор суммарный - стрип» А-8654 (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Определение ревматоидного фактора класса IgM (РФ^м) проводили с помощью наборов реагентов «ВектоРевматоидный фактор класса М — стрип» А-8652 (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с рекомендациями производителя.

Статистическая обработка результатов

Для анализа полученных результатов применяли следующие статистические методы.

1. Частота встречаемости антигена Ах (%) [Зарецкая Ю.М., 1983]

2. Частота гена, кодирующего каждый антиген HLA, (Рх) рассчитывалась из закона Харди-Вайнберга. Определенная по формуле частота гена была проверена путем сравнения наблюдаемого в выборке распределения гомо- и гетерозиготных индивидуумов с теоретически рассчитанным в соответствии с законом Харди - Вайнберга.

3. Достоверность различий в частоте встречаемости генов и гаплотипов рассчитывалась согласно критерию Пирсона [Svejgaard А., 1994], а в случае малой выборки с поправкой Yates на непрерывность [Реброва 0.ю.,2002]. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р<0,05, незначимыми при р>0,10; для промежуточных значений р (0,05<р< 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

4. Для определения частоты трехлокусных гаплотипов методом максимального правдоподобия (maximum-likelihood) использовали программу «Арлекин», версия 3.1 (URL:http://anthro.unifte.ch/arlequin).

5. Показатель отношения шансов (OR) — отношение шансов события в одной группе к шансам этого же события в другой группе, 95% доверительный интервал (95% Confidence Interval - 95%С1) вычисляли по методу Woolf [Реброва О.Ю., 2002].

6. В качестве операционных характеристик диагностического теста использовали показатели чувствительности и специфичности [Власов В.В., 1988].

7. Для оценки значимости различий в чувствительности и специфичности использовали критерий Макнемара (McNemar).

8. В качестве вероятностной оценки диагностической эффективности показателей количественного теста использовали графический анализ характеристической кривой - ROC-анализ (receiver operating characteristic curve). Расчет и построение характеристической кривой проводили с помощью программы ROCKIT (WINDOWS version 1.0.1 BETA 2).

Статистическую обработку результатов исследований проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ «Statistica 6.0 for Windows», и программы Ms Excel пакета Ms Office.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На сегодняшний день в многочисленных исследованиях показана предрасполагающая и протективная роль генов локусов HLA П класса DRB1, DQA1 и DQB1 в развитии ревматоидного артрита. Однако результаты этих исследований носят противоречивый характер, что определяется наличием межпопуляционных и внутрипопуляционных различий в распределении полиморфизмов HLA II класса, исследованием популяций, проживающих в различных географических и экологических районах, небольшой выборкой,

влиянием генов, не входящих в НЬА П класс, т.е. теми факторами, которые позволяют отнести РА к мультифакторным заболеваниям [ОкзепЬе I., 2006]. В свете сказанного, объем накопленных данных пока не позволяет выделить общие закономерности и выстроить стройную гипотезу, поэтому изучение иммуногенетической составляющей РА продолжается. Нами был проведен анализ распределения специфичностей НЬА II класса среди больных РА русской популяции, проживающих на территории Челябинской области.

Полиморфизм генов локуса БШН в ассоциации с ревматоидным артритом

В таблице 1 представлены данные о распределении полиморфизмов гена НЬА БШИ в группе больных РА и в контроле.

Таблица 1

Сравнительный анализ распределения генов НЬА ОНВ1 у больных РА и в

контроле

Пациенты с PA, n=100 Контрольная группа, n=20 xJ P OR CI 95%

Ax (%) Pi Ax (%) Px

DRB1*01 36,0 0,200 27,23 0,147 2,44 1,50 0,09-2,52

DRB1*03 26,0 0,139 18,32 0,096 2,39 1,57 0,88-2,78

DRB1*04 57,0 0,344 18,81 0,099 45,24 <0,001 5,72 3,36-9,74

DRB1*07 18,0 0,094 23,76 0,127 1,30 0,70 0,38-1,29

DRB1*08 3,0 0,015 8,42 0,043 2,33 0,34 0,10-1,18

DRB1*09 2,0 0,010 4,46 0,023 0,54 0,44 0,06-2,08

DRB1*10 4,0 0,020 3,47 0,017 0,01 1,16 0,33-4,08

DRB141 10,0 0,051 18,81 0,099 3,89 <0,05 0,48 0,23-1,01

DRB1*12 3,0 0,015 3,47 0,017 0,02 0,86 0,22-3,42

DRB1*13 12,0 0,062 27,72 0,149 9,48 <0,05 0,36 0,18-0,70

DRB1*14 2,0 0,010 3,47 0,017 0,11 0,57 0,12-2,81

DRB1*15 13,0 0,067 26,73 0,144 7,31 <0,05 0,41 0,21-0,80

DRB1*16 4,0 0,020 5,45 0,028 0,06 0,72 0,22.-2,34

03/04 13,0 0,067 1.98 0,010 13,22 <0,05 7,40 2,33-23,4

01/04 14,0 0,072 1,98 0,010 15,10 <0,05 8,06 2,57-25,33

Полученные данные свидетельствуют, что частота встречаемости гена НЬА DRB1*04 в группе больных РА достоверно выше, чем в контрольной группе (57,00% у больных РА против 18,81% в контроле, х?=54,24, р<0,001, OR=5,72 и 95% CI 3,36-9,74), что определяет предрасполагающую роль этого гена в развитии РА. Эти данные совпадают с выводами работ о положительной ассоциации DRB1*04 с РА в большинстве европейских популяций [Zanelli Е., 2000; Goronzy J.J., 2005].

В нашем исследовании количество больных РА с сочетанием специфичностей HLA DRBl*03/04 в генотипе составило 13%, тогда как в

контрольной группе всего 1,98%. Данные являются достоверными (х2=13,22, р<0,05, OR=7,4 95%С1=2,33-23,44), что является теоретически ожидаемой для данной популяции (0,26*0,57=14,82) в связи с высокой частотой встречаемости как гена DRB1 *03, так и DRB1 *04.

Определена статистически достоверная разница в частоте встречаемости генотипа DBl*01/04, состоящего из двух генов предрасположенности к РА -X,2—15,10, р<0,05, OR=8,06, 95% С1=2,57-25,33.

Следовательно, сочетание в генотипе двух генов HLA DRB1*03 и 04 (OR=7,40), и DRB1*01 и *04 (OR=8,06) является сильным предрасполагающим фактором развития такой аутоиммунной патологии как РА.

У больных РА, проживающих в Челябинской области, достоверно реже встречаются следующие варианты гена HLA DRB1: *11 (10% против 18%, Х2=3,89, р<0,05, OR=0,48 при 95%С1=0.23-1.01), *13 (12,0% против 27,7%, Х2=9,48, р<0,05 OR=0,36 при 95С1%=0,18-0,70), *15 (13,0% против 26,7%, Х2=7,31, р<0,05, OR=0,41 при 95%С1=0,21-0,80). Так как OR этих генов меньше 0,5 и эти значения с учетом 95% доверительного интервала меньше единицы, то полученные результаты позволяют рассматривать данные варианты HLA DRB1 как протекторные для развития предрасположенности к РА у русских Челябинской области.

Распределение HLA DRB1 в зависимости от возраста начала ревматоидного артрита

Установлено, что ревматоидный артрит чаще диагностируется у людей после 40 лет [Насонов E.JL, 2008]. Возможно, что наличие генов предрасположенности должно способствовать более раннему развитию. Поэтому были выделены две подгруппы больных: с ранним началом РА -возраст начала заболевания меньше 40 лет, и поздним началом РА — когда начало заболевания приходится на возраст после 40 лет. Анализ сравнения частот встречаемости генов DRB1 HLA П класса в этих группах показал отсутствие ассоциации с возрастом начала РА, что согласуется с данными ряда авторов [Firestein G.S., 2005; Plenge R.M., 2005].

Распределение аллельных вариантов гена HLA DRB1*04 у больных ревматоидным артритом

В нашем исследовании определилась однозначная предрасполагающая к РА роль гена HLA DRB1*04. Однако известно, что аллельные варианты HLA-DRB1*04 неодинаково ассоциированы с ревматоидным артритом [Мякоткин В.А., 2003; Gorman J., 2004]. Для выявления значимости аллельных вариантов гена DRB1*04 в формировании предрасположенности / устойчивости к РА было проведено типирование 27 аллельных вариантов гена HLA-DRB1*04, из которых в нашей выборке было обнаружено только 9.

В исследуемой группе больных РА русской популяции определена предрасполагающая роль аллеля *0401 (х2=5,59, р<0,05, OR=2,7, 95%С1=1,16-6,3), что согласуется с результатами исследований в европейских популяциях

[Jaini R., 2002; Gorman J.D., 2004; Kazkaz L., 2007]. Этот аллель входит в группу генов, кодирующих одинаковую последовательность аминокислот третьей гипервариабельной области в положении 70-74, называемую «общим эпитопом» (shared epitope - SE) [Gregersen P., 1987].

Аллельный полиморфизм гена DRB1*04 в выборке больных РА представлен вариантами, кодирующими SE-эпитоп: *0401, *0404, *0405, *0408, и аллельными вариантами, которые не кодируют SE-эпитоп: *0402, *0403, *0406, *0407. Поэтому на следующем этапе мы провели сравнительный анализ встречаемости аллелей, кодирующих SE-эпитоп, в выборке больных РА и у здоровых представителей русского населения.

Анализ показал, что аллели, кодирующие общий эпитоп, встречаются у 90,47% больных РА русских, несущих ген DRB1*04, что достоверно выше, чем в группе здоровых лиц русской популяции 69,09% (%2=5,22, р<0,05). При этом критерий отношения шансов составил 4,25, 95%С1=1,29-14,0, что определяет предрасполагающую роль этих аллелей. Остальные аллели, не кодирующие общий эпитоп, встречаются в группе больных только в 11,9% случаев, при этом различия между выборками на уровне тенденции х2=3,88, р=0,489.

Таким образом, нами определена предрасполагающая роль как одного аллеля DRB1*0401, так и группы аллелей гена DRB1*04, кодирующих общий эпитоп, в развитии РА в популяции русских Челябинской области.

Полиморфизм генов локусов DQA1 и DQB1 в ассоциации с ревматоидным артритом

Помимо генов локуса DRB1 в литературе обсуждается вклад полиморфизмов локусов DQA1 и DQB1 в предрасположенность к PA [Zanelli Е., 2000; Wagner U., 2003]. Сравнительный анализ распределения вариантов гена HLA DQA1 показал, что в группе больных РА достоверно повышена частота аллеля DQA1*0301 относительно контроля (61,0% против 23,3%, Х2=41,45, р<0,001, OR=5,16 95%С1=3,07-8,67). Аллели DQA1*0102, *0103 встречаются достоверно реже (х2=7,54, р<0,05 и х-5,36, р<0,05), что позволяет предположить протективую роль этих аллелей в развитии предрасположенности к РА. Данные представлены в таблице 2.

В локусе DQB1 у больных РА достоверно повышена частота аллеля *0302 (34,0% против 14,36%, £45,63, р<0,001, OR=3,07, 95%С1=1,73-5,45). В меньшей степени оказалась повышенной частота другого аллеля DQB1*0301. Однако это повышение не достигало уровня статистической значимости (р>0,05). Достоверно и очень существенно снижена частота встречаемости аллеля DQB1 *0602/8 в группе больных ревматоидным артритом (16,0% против 40,1%, х2=17,82, р<0,001, OR=0,28,95%С1=0,16-0,52).

Таким образом, в группе больных РА среди генов HLA П выявлено статистически достоверное повышение частоты встречаемости гена DRB1*04, аллеля DRB 1*0401 и группы аллелей гена DRB1*04, кодирующих общий эпитоп, аллелей DQA1*0301, DQB1*0302, генотипов DRBl*01/*04 и *03/*04 и

достоверное снижение частоты встречаемости генов 1ЖВ1*П, ОЯВ1 *13, БЯВ1 * 15 и аллелей 0(2А1 *0102, БОА1 *0103, БС^В1 *0602-8.

Таблица 2

Сравнительный анализ распределения вариантов гена НЬА ЭС>А1 и БОВ! у больных РА и в контроле

Пациенты с РА, п=100 Контрольная группа, п=202 ■it Р OR 95% CI

Ах (%) Рх Ах (%) Рх

DQA1

*0101 36,00 0,200 32,67 0,179 0,33 1,16 0,70-1,92

*0102 16,00 0,083 30,69 0,167 7,54 <0,05 0,43 0,23-0,80

*0103 9,00 0,046 20,30 0,107 5,36 <0,05 039 0,18-0,84

*0104 3,00 0,015 0,99 0,005 0,63 3,09 0,5-18,95

*0201 18,00 0,094 23,76 0,127 1,30 0,70 0,38-1,29

*0301 61,00 0,376 23,27 0,124 41,45 <0,001 5,16 3,07-8,67

*0401 3,00 0,0 ¡5 6,93 0,035 J ,26 0,42 0,12-1,49

*0501 41,00 0,232 44,55 0,255 0,34 0,86 0,53-1,41

*0601 0,00 0 0,50 0,002 0,16

DQB1

*0201 32,00 0,175 35,15 0,195 0,30 0,87 0,52,-1,45

*0301 42,00 0,239 35,64 0,198 1,15 1,31 0,80-2,14

*0302 34,00 0,188 14,36 0,075 15,63 <0,001 3,07 1,73-5,45

*0303 14,00 0,073 9,90 0,051 U2 1,48 0,71-3,08

*0304 2,00 0,010 0,50 0,002 0,37 4,10 0,36-46,2

*0305 0,00 0 0,50 0,002 0,16

*0401/2 3,00 0,015 6,44 0,033 0,95 0,45 0,12-1,62

*0501 39,00 0,219 31,19 0,170 1,82 1,41 0,85-2,33

*0502/4 6,00 0,030 6,44 0,033 0,01 0,93 0,34-2,53

•0503 0 0 2,97 0,015 1,66

*0601 3,00 0,015 4,95 0,025 0,23 0,59 0,16-2,22

*0602-8 16,00 0,083 40,10 0,226 17,82 <0,001 0Д8 0,16-0,52

Распределение гаплотипов у больных ревматоидным артритом

В свете современных данных молекулярной иммунологии участие отдельных полиморфных молекул HLA II класса на развитие предрасположенности или устойчивости к РА можно объяснить, в какой-то степени тем, что эти гены могут быть сцеплены с генами других локусов главного комплекса гистосовместимости, способными внести более существенный/определяющий вклад в реализацию патологического процесса. Считают, что ассоциация заболевания с определенным гаплотипом является более достоверной, чем с отдельными генами, входящими в этот гаплотип [Шабалин В.Н., 1988; Авербах М.М., 1994; Walsh Е.С., 2003]. С целью проверки этой гипотезы мы провели статистический расчет встречаемости

двухлокусных DQA1-DQB1 и трехлокусных DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов по результатам нашего исследования.

Гаплотипы DQA1-DQB1

Некоторые исследователи выделяют определяющую роль в генетической предрасположенности к РА гаплотипов DQA1-DQB1 (DQ) [Zanelli А., 2000; Perdriger А., 2001; Wagner U., 2003] В нашем исследовании была определена предрасполагающую роль гаплотипа DQ3 (DQB1*03-DQA1*03, х2=36,49, р<0,05, OR=4,75, 95%С1=2,81-8,04). В свете последних данных [Zanelli Е., 2000] DQ3 включает в себя два гаплотипа: DQ7 (DQA1*0301-DQB1*0301) и DQ8 (DQA1*0301-DQB1*0302). Анализ их частоты встречаемости в нашем исследовании показал, что согласно значениям критерия отношения шансов, риск развития РА у носителей гаплотипа DQ7 (OR=17,27) выше, чем у носителей DQ8 (OR=13,83), что определяет особенность исследуемой группы больных РА русской популяции Челябинской области.

Гаплотипы DRB1-DQA1-DQB1

Так как гены локусов DRB1, DQA1, DQB1 находятся в неравновесном сцеплении, было проведено сравнение частот встречаемости трехлокусных гаплотипов HLA II класса у больных РА и в контроле для оценки их ассоциации с развитием предрасположенности или устойчивости к РА.

В ходе исследования нами было установлено, что положительно ассоциированными с заболеванием являются следующие гаплотипы: DRB1 *04-DQA*0301 -DQB*0301 (/M 9,00 Р<0,05, OR=4,73, 95%CI=2,91-10,01) и DRB1 *04-DQA*0301 -DQB*0302 (¿4 3,4 P<0,05, OR=2,91, 95%CI=l,62-5,25), в состав которых входит ген DRB 1*04. Генотип около 30% больных РА имеет именно эти гаплотипы, в то время как в группе здоровых людей они встречаются всего в 7% случаев, что соответствует литературным данным [Seidl С., 2001; Vos К., 2001, Pascual M., 2003; Stanevichal V., 2007].

Полученные данные показывают предрасполагающую роль гена DRB1*04 и в то же время значимость аллелей других локусов в развитии РА, что подтверждает многофакторность изучаемой патологии.

В группе больных РА достоверно снижена частота встречаемости следующих четырех гаплотипов, по сравнению с контрольной группой: DRBl*13-DQA*0103-DQB*0602-8 (£=6,19 Р<0,05, OR=0,27, 95%С1=0,10-0,72), DRBl*15-DQA*0102-DQB*0602-8 (£=6,54 Р<0,05, ÛR=0,34, 95%CI=0,15-0,76) и DRB1 *07-DQA*0201-DQB*0201 (>>5,98 Р<0,05, ÛR=0,34, 95%С1=0,14-0,79). Обнаружена тенденция в снижении частоты встречаемости DRB1*11-DQA*0501-DQB*0301 (х2=3,78 Р<0,05, OR=0,44, 95%С1=0,20-0,96). Шанс развития заболевания (OR) для всех этих гаплотипов меньше 0,5 при 95% доверительном интервале меньше единицы. Эти данные позволяют говорить о них как о протективных для развития данного заболевания.

О влиянии протективных и предрасполагающих гаплотипов на развитие РА в русской популяции говорит и тот факт, что в выборке больных из 100

человек нет ни одного больного гомозиготного по протективным гаплотипам, тогда как в контрольной группе из 202 человек их 40 (19%).

Достоверных данных об ассоциативной роли других трехлокусных гаплотипов в нашем исследовании не обнаружено.

Таким образом, сравнительный анализ распределения двух и трехлокусных галпотипов в выборке больных РА и здоровых доноров русских Челябинской области показал:

1. Определена предрасполагающая роль двухлокусного гаплотипа DQ3 и входящих в его состав гаплотипов DQ7 и DQ8.

2. Определена предрасполагающая роль в развитии РА трехлокусных гаплотипов DRB1 *04-DQA*0301 -DQB*0301 (OR=4,73), DRB1*04-DQA*0301 -DQB*0302 (OR=2,91).

3. Определена протективная роль в развитии РА следующих трехлокусных гаплотипов: DRBl*13-DQA*0103-DQB*0602/8 (OR=0,27), DRB1*15-DQ А* 0102-DQB *0602/8 (OR=0,34), DRB1*07-DQA*0201-DQB*0201 (OR=0,34).

Сравнительная оценка аутоантител различных типов при ревматоидном артрите

На сегодняшний день наряду со всесторонним изучением иммуногенетических аспектов интенсивно исследуются серологические показатели РА, как заболевания с аутоиммунным компонентом. Большинство авторов считают, что определенные полиморфизмы локуса DRB1 регулируют продукцию специфических аутоантител при PA [Auger I., 2005; Kuhn К.А., 2006]. В свете сказанного, нами была поставлена задача установить наличие взаимосвязи между геном DRB1 *04 и серологическими маркерами РА у больных. Данный этап работы включал несколько разделов.

Первый раздел включал сравнительный анализ частоты встречаемости аутоантител различных типов и их комбинации у больных РА по сравнению с больными не РА и здоровым контролем.

Была проведена оценка диагностической информативности основных специфических аутоантител при РА, для этого были проанализированы результаты серологического обследования больных. Результаты представлены в таблице 3.

Анализ сравнительной распространенности аутоантител различных типов и их комбинации среди обследуемых групп больных показал, что все три показателя являются высоко специфичными для РА, положительные результаты этих тестов достоверно чаще встречаются именно в группе больных РА. Максимальные значения критерия отношения шансов характерны для показателя анти-MCV антител OR=24,19. Учитывая данные о важном прогностическом значении анти-MCV антител в отношении возможности развития РА у пациентов с «ранним» артритом [van Jaarsveld С.Н., 1999; Kroot E.J., 2000; Schellekens G.A., 2000] можно полагать, что у ряда

больных с положительными результатами определения анти-МСУ антител в дальнейшем разовьется «достоверный» РА.

Таблица 3

Сравнительная распространенность аутоантител и их комбинации у больных РА и в группе сравнения

Группа РА (%) Группа не РА(%) х2 (Ж 95% СГ

МСУ + 84,9 18,9 43,66 24,19 8,63-67,81

РФс,К + 59,2 15,4 15,59 7,98 2,78-22,89

РФ,гм + 71,4 17,9 22,80 11,43 4,04-32,35

МСУ+/ РФсум + 57,1 7,7 21,16 16,00 4,25-60,20

МСУ+/РФ,™- 28,6 15,4 1,46 2Д0 0,74-6,50

МСУ-/ РФ„„ + 2,0 7,7 0,56 0,25 0,02-2,59

МСУ-/РФсу„- 12,2 69,2 27,71 0,06 0,02-0,19

МСУ+/РФ1еМ + 69,4 7,7 31,44 27,20 7,09-104,29

мсу+/рф1еМ- 16,3 15,4 0,03 1,07 0,33-3,46

МСУ-/ РФ,гИ + 2,0 10,3 1,42 0,18 0,02-1,76

МСУ-/ РФ,2М - 12,2 66,7 25/49 0,07 0,02-0,21

Рфетм+/Рф1ем+ 59,2 15,4 15,61 7,98 2,78-22,89

РФе™ +/ РФ1гМ - 0,0 0,0 0

РФ„», -/ Рф[ем + 12,2 2,6 1,61 5,30 0,59-47,47

РФетм -/ РФ,гМ - 28,6 82,1 22,80 0,09 0,03-0,25

МСУ+/РФ„м +/РФ1Ем + 57,1 7,7 21,16 16,00 4,25-60,20

МСУ-/РФ„„-/РФ,гМ- 12,2 66,7 25,49 0,07 0,02-0,21

Анализ частоты встречаемости комбинации аутоантител показал, что (Ж показателей РФ,^,, и РФГгм повышается в несколько раз в случае, если обнаруживаются в сочетании с показателем анти-МСУ ((Ж рфсум=7,98, (Ж мсу+/рфсум +=16,00, (Ж Рф1Вм =11,43, (Ж мсу+/ рфтвм +=27,20). Дня группы больных РА характерна позитивность по всем трем исследуемым показателям: МСУ+/РФсум+/РФ18м+ (СЖ=16,00). Сочетание РФоум +/ РФ(8М+, в которое не входит анти-МСУ, также достоверно чаще встречается в группе больных РА, но критерий отношения шансов для него гораздо ниже и составляет всего 7,98.

Особый интерес в клинике представляет поиск специфических лабораторных маркеров серонегативного клинико-иммунологического варианта РА, так как поставить диагноз серонегативного варианта на этапе раннего РА крайне трудно. В исследуемой группе больных РА ревматоидный фактор РФсум не обнаружен у 20 человек (37,74%), среди которых частота выявления антител к МСУ составила 70%.

Таким образом, нами определена высокая распространенность всех трех иммунологических показателей (анти-МСУ, РФсумм, РФг8м) среди больных РА. Сочетания позитивных показателей МСУ+/РФсум+, МСУ+/РФ1вМ+ и МСУ+/РФсум+/РФ1кМ+ являются специфическими маркерами для группы больных РА, а сочетания негативных показателей являются маркерами группы больных неРА. Эти данные позволяют сделать вывод о высокой

диагностической информативности данных иммунологических показателей при ревматоидном артрите.

Чувствительность и специфичность

Основными операционными характеристиками любого диагностического теста являются чувствительность и специфичность. Поэтому второй раздел включал анализ сравнительного изучения диагностической чувствительности и специфичности показателей анти-МСУ, РФсуым, РФ|8м, результаты которого представлены в таблице 4.

Таблица 4

Сравнение чувствительности и специфичности анти-МСУ, РФ и ^М РФ при ревматоидном артрите

Метод Чувствительность (Бе) Специфичность (вр)

Анти-МСУ 0,83 0,81

РФ„„м 0,59 0,85

РФтгМ 0,71 0,83

Анти-МСУ+ РФсумм 0,57 0,93

Анти-МСУ+ РФ^м 0,69 0,93

РФсум+РФ^М 0,59 0,82

Анти-МСУ+ РФ„М+ РФ1йм 0,57 0,93

Значимость различий в чувствительности по Мс№таг (р) Значимость различий в специфичности по МсИетаг (р)

АпИ МСУ РФС„„ 0,0019 0,3428

Апй МСУ <-► РФ1еМ 0,0455 0,5465

РФсум <-» РФыч 0,0412 1,000

Результаты сравнительного изучения диагностической чувствительности и специфичности показателей анти-МСУ, РФсумм, РФ|8м продемонстрировали, что чувствительность показателя анти-МСУ (0,83) была выше, чем у РФ|&М (0,71) и РФсумм (0,59). Анализ различий чувствительности с помощью критерия МсКетаг показал, что эти различия у всех трех серологических маркеров являются достоверными (р<0,05). Достоверных отличий в специфичности этих маркеров не определено (р>0,05).

При оценке позитивности хотя бы по двум из трех иммунологических показателей (анти-МСУ+РФ^, или анти-МСУ+РФ^ или РФсум+РФ^м) отмечено снижение чувствительности, но увеличение специфичности по сравнению с результатами изолированного определения анти-МСУ. Причем в случае определения двух серологических маркеров, один из которых анти-МСУ (анти-МСУ+РФ^ или анти-МСУ+РФ^), показатель специфичности принимает высокие значения (0,93). Одновременное выявление аутоантител всех трех типов было также максимально специфичным (0,93), но менее чувствительным признаком РА (0,57).

Интегральным методом выражения соотношения чувствительности и специфичности является построение характеристической кривой (ЯОС-кривой), которая визуально позволяет сравнить диагностическую эффективность показателей между собой.

Исходя из полученных данных построено две ЯОС-кривые. Кривая А -результат расчета диагностической эффективности теста с учетом контрольной группы, в которую вошли больные не РА. Кривая Б - результат расчета диагностической эффективности теста с учетом контрольной группы, в которую вошли здоровые доноры (рис.1).

Рис. 1. ROC-кривые соотношения чувствительности и специфичности показателя анти-MCV у больных PA (AUC- площадь под ROC кривой).

Анализ ROC-кривых показал, что диагностическая эффективность этого теста у больны РА практически одинаковая и в случае сравнения с группой не РА (кривая А) и в случае сравнения с группой здоровых доноров (кривая Б). Площадь под характеристической кривой - AUC (area under curve), вычисленная по Вилкоксону (Wilcoxon) в случае кривой А составила 0,8943±0,0321 (95%С1 0,08267-0,9506), в случае кривой Б составила 0,8868±0,0355 (95% CI 0,7892-0,9384). Значения показателей AUC кривой А и Б приближены к 1 и отличаются всего лишь на 0,0074, 95% доверительный интервал не включает значение 0,5. Все.эти данные свидетельствует о высокой диагностической эффективности серологического показателя анти-MCV для диагностики ревматоидного артрита.

Таким образом, при сравнении трех серологических маркеров, специфичных дня РА: анти-MCV, РФсумм и РФ1&М, а также комбинации этих показателей, высоко специфичным для диагностики РА является определение анти-MCV антител, а максимальная специфичность достигается при определении комбинаций аутоантител: анти-МСУ+РФсуг>(м или анти-MCV+P®IgM, анти-МСУ+РФсум+РФ^, что позволяет проводить дифференциальную диагностику РА

Ассоциация гена DRB1*04 с наличием антител к модифицированному цитруллинироваиному виментину

В настоящее время известно, что продукция специфических аутоантител при РА находится под контролем генетических вариантов молекул HLA II класса. [Auger I., 2005; Kuhn К.А., 2006] В связи с полученными нами результатами о высокой специфичности для диагностики РА серологического маркера — наличия анти-MCV антител, и предрасполагающей роли гена DRB1 *04, мы провели анализ комбинации этих показателей.

Было проведено разделение группы больных РА, не РА и здоровых доноров на подгруппу носителей DRB1*04 и подгруппу без DRB1*04 и проанализированы частоты встречаемости аугоантител различной специфичности между этими подгруппами в каждой группе. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты определения анти-МСУ, РФсуМм5 РФ^м у больных РА, больных неРА и в здоровом контроле, несущих ОШП*04

Больные РА, п=40 х2 Р Больные неРА, п=27 хг р Здоровые, п=30 х2 Р

DR4 + DR4 DR4 + DR4 DR4 + DR4

п=14 п=26 п=2 3 п=15 п=15

MCV 14 19 4,57 <0,05 1 6 0,33 - 4 0 2,6 0,1

РФсумм 10 11 2,04 - 1 2 0,01 - - - - -

РФ]2м 11 16 0,55 - 1 2 0,01 - - - - -

Из таблицы следует, что в группе больных РА анти-МСУ антитела достоверно чаще встречаются среди носителей гена р<0,05). Тогда как в группе больных неРА и здоровом контроле такой ассоциации не определено. Ассоциация других серологических маркеров с носительством гена Б11В1 *04 в исследуемой группе не подтверждена.

На основании полученных данных было проведено сравнение комбинации 01Ш1*04/МСУ у пациентов с достоверным РА с пациентами неРА и здоровым контролем (таблица 6).

В группе больных РА достоверно чаще встречались комбинации показателей 011В1*04+/МСУ+ при сравнении с группой неРА. Для этой комбинации характерны максимальные показатели отношения шансов (СЖ=13,46). При этом чувствительность составила 1,0 и специфичность - 0,75.

Таблица 6

Комбинация Б1Ш1*04/МСУ в группах больных с достоверным РА, не РА и в контрольной группе

Группа больных РА Группа больных неРА х2 Р (Ж 95% С1

п=40(%) п=26(%)

Ш*В1*04+/МСУ+ 14 (35,0) 1 (3,8) 7,02 <0,05 13,46 1,61-112,77

ОКВ1«04+/МСУ- 0 3(11,5) 2,54 - -

Ш1В1*04-/МСУ+ 19 (47,5) 6(23,1) 3,02 3,02 0,99-9,21

БИВ1*04-Л1СУ- 7 (17,5) 16(61,5) 1139 <0,05 0,13 0,04-0,42

Группа больных РА Здоровый контроль

п=40 п=30

ОНВ1*04+Л1СУ+ 14 (35,0) 4 (13,3) 3,16 <0,10 3,50 0,99-12,41

Г)ЯВ1*04+/МСУ- 0 11 (36,7) 14,74 <0,05 - -

БИВ1*04-/МСУ+ 19 (47,5) 0 17,23 <0,05 - -

ОЯВ1«04-/МСУ- 7(17,5) 15 (50,0) 6,96 <0,05 0,21 0,07-0,64

Эти данные позволяют заключить, что позитивность по двум показателям: Б11В1*04 и анти-МСУ, ассоциирована с РА в выборке русских Челябинской области и является высоко чувствительным и специфическим лабораторным маркером риска развития РА.

Выводы

1. У русских Челябинской области установлены положительно ассоциированные с ревматоидным артритом гены НЬА БЫВ 1*04, аллели БС>А1*0301, БдВ*0302, гаплотипы Б1Ш1*04-БдА1*0301-БдВ1*0301, Б11В1*04-БдА1*0301-БдВ1*0302, Б07 и Бд8, генотипы БЯВ1*03/04 и БПВ1*01/04, а также аллели гена В1Ш1*04: 0401, 0404, 0408, кодирующие общий эпитоп.

2. Протекторными в отношении развития ревматоидного артрита у русских Челябинской области являются варианты генов Б11В1*11, *13, *15, аллели ВО А 1*0102, БОА 1*0103, БОВ1*0602-8, а также гаплотипы Б1Ш1*07-ВдА1*0201-БдВ1*0201, Б11В1*1501-БдА1*0102-ВдВ1*0602-8, Б1Ш1*13-БдА*0103-БдВ*0602/8.

3. Наиболее специфичным для диагностики ревматоидного артрита является определение антител к модифицированному цитруллинированному виментину. Максимальная специфичность достигается при определении комбинаций серологических тестов: анти-МСУ+РФсум* или анти-МСУ+РФщц, анти-МСУ+РФ^+РФ,^ (анти-МСУ - антитела к модифицированному цитруллинированному виментину, РФсу»™ -суммарный ревматоидный фактор, РФ^м — ревматоидный фактор класса ^М), которые позволяют дифференцировать ревматоидный артрит от заболеваний, протекающих с поражением суставов.

4. Определение комбинации иммуногенетического маркера (носительство гена DRB1*04) и серологического показателя (антител к модифицированному цитруллинированному виментину) может служить высоко чувствительным и специфическим лабораторным маркером риска развития ревматоидного артрита в популяции русских Челябинской области.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шамшурина, Е.Б. (Хромова, Е.Б.) Ассоциативная связь аштельных вариантов HLA-DR4 с ревматоидным артритом у русских / Е.Б. Шамшурина, Е.П. Конева, М.А. Турчанинова // Молодые исследователи — медицине и биологии. -Челябинск, 2005. - С. 118-119.

2. Сташкевич, Д.С. Роль генетических систем АРИЛ-1 и HLA-DRB1 в развитии ревматоидного артрита / Д.С. Сташкевич, A.JI. Бурмистрова, Т.А. Суслова, МЛ. Филипенко, E.H. Воронина, Е.Б. Шамшурина (Хромова), И.В. Шмунк, И.В. Девальд // Иммунология Урала. - Уфа, 2005 - № 1(4). - С.91-92.

3. Шамшурина, Е.Б. (Хромова, Е.Б.) Распределение антигенов HLA у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих в Челябинской области / Е.Б. Шамшурина (Хромова), A.JI. Бурмистрова, Т.А. Суслова, И.В. Девальд, Д.С. Сташкевич, И.В. Шмунк // Иммунология Урала. -Уфа, 2005 - № 1(4). - С. 108-109.

4. Сташкевич, Д.С. Распределение генов HLA-DRB1, ILl-Ra у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих на территории Челябинской области / Д.С. Сташкевич, Е.Б. Шамшурина (Хромова) // Всероссийский конкурс инновационных проектов «Живые системы». Тезисы докладов. - ВятГУ. -Киров. - 2005. - С 269 -271.

5. Stashkevich, D.S. Distribution of HLA-DRB1 and IL1-RA genes' frequencies in patients with rheumatoid arthritis under conditions of man-caused loading of Chelyabinsk city / D.S. Stashkevich, E.B. Shamshurina (Khromova), A.L. Burmistrova, T.A. Suslova, M.L. Philipenko, E.N. Voronina, I.V.nDevald, A.O. Isakanova, M.N. Boldiriva, L.P. Alekseev // European journal of natural history. — 2006,—№3.-P.135-137.

6. Шамшурина, Е.Б. (Хромова, Е.Б.) Распределение антигенов HLA у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих в Челябинской области / Е.Б. Шамшурина (Хромова), Т.А. Суслова, A.JI. Бурмистрова, И.В. Девальд, А.О. Исаканова, Д.С. Сташкевич, И.В. Шмунк // Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека. - Челябинск, 2006. - С.94-95.

7. Сташкевич, Д.С. Характеристика частот встречаемости аллелей генов HLA-DRB1*04, IL IRA у больных ревматоидным артритом русской национальности, Челябинской области / Д.С. Сташкевич, Е.Б. Шамшурина (Хромова), О.Н. Димчева, A.JI. Бурмистрова, Т.А. Суслова // Russian Journal of IMMUNOLOGY // 2006,- Vol.9 - Sup.3. - C.94.

8. Суслова, Т.А. Полиморфизм HLA А, В, DRB1, DQA1, DQB1 в поплуяции русских и башкир Челябинской области / Т.А. Суслова, С.И. Янина, АЛ. Бурмистрова, И.В. Девальд, И.В. Шмунк, М.В. Кузина, Т.М. Завьялова, C.JI. Суздалева, Е.Б. Шамшурина (Хромова), М.Н. Вавилов, О.Н. Димчева, А.Ю. Савина // Успехи современного естествознания. - 2006. - №3. -С. 54-56

9. Сташкевич Д.С. Распределение частот генов HLA DRB1/ ILl-Ra у больных ревматоидным артритом, в условиях техногенной нагрузки г.Челябинска / Д.С. Сташкевич, Е.Б. Шамшурина (Хромова), A.JI. Бурмистрова, Т.А. Суслова, МЛ. Филипенко, E.H. Воронина, И.В. Девальд, А.О. Исаканова, М.Н. Болдырева, Л.П. Алексеев // Успехи современного естествознания. - 2006. - №3. - С.88-89.

10. Шамшурина Е.Б. (Хромова, Е.Б.) Распределение аллельных вариантов гена HLA DRB1*04 у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих в Челябинской области / Е.Б. Шамшурина (Хромова), Т.А. Суслова, АЛ. Бурмистрова, И.В. Девальд, М.Н. Болдырева, Л.П. Алексеев // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2006 -№3, 1 (14). — С.278-280.

11. Хромова, Е.Б. Иммуногенетические методы ранней диагностики ревматоидного артрита / Е.Б. Хромова, АЛ. Бурмистрова, Т.А. Суслова // Сборник материалов Международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области». — 2007.- т.1.— с 13-16..

12. Хромова, Е.Б. Ранняя диагностика ревматоидного артрита -иммуногенетические маркеры / Е.Б. Хромова, Т.А. Суслова, АЛ. Бурмистрова, И.В. Девальд, Д.С. Сташкевич // Иммунология Урала. - Ижевск, 2007- №1(6). -С. 158-159

13. Хромова, Е.Б. Вклад гена HLA-DR1*04 и SNP полиморфизмов гена TNFa в предрасположенность к ревматоидному артриту у русских Челябинской области / Е.Б. Хромова, Д.С. Сташкевич, АЛ. Бурмистрова, А.О. Исаканова // Вестник Челябинского государственного университета. Биология. -2008. -Вып1. №4.- С. 32-33.

14. Хромова, Е.Б. Эффективный метод диагностики ревматоидного артрита / Е.Б. Хромова, Т.А. Суслова, АЛ. Бурмистрова, И.М. Шеремеева, С.Г. Степанова // Вестник Челябинского государственного университета. Биология. - 2008. - Вып1. №4. - С. 33-34.

15. Суслова, Т.А. Генетическая предрасположенность к ревматоидному артриту: роль генов и гаплотипов HLA класса II / Т.А. Суслова, АЛ. Бурмистрова, Е.Б. Хромова, Д.С. Сташкевич, И.В. Девальд, А.О. Исаканова, М.Н. Болдырева, Л.П. Алексеев // Иммунология. - 2008. - Т.29. -№3. - С.137-141.

ХРОМОВА Елена Борисовна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ НЬА П КЛАССА И КОМБИНАЦИЯ ОСНОВНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В АССОЦИАЦИИ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск-2009 г.

Подготовлено к печати в издательстве «Челябинская государственная медицинская академия». Лицензия № 01906. Отпечатано в типографии «ПРИНТМЕД». Подписано к печати 19.01.2009. Объем 1 п.л. Формат 64x84. Гарнитура «Times New Roman Суг». Бумага для офисной техники, 80 мг/м2. Тираж 100 экз.

Актуальность темы. Ревматоидный артрит (РА) является одной из актуальных медико-социальных проблем. Это обусловлено отсутствием четких представлений об этиологии и патогенезе РА, комплексного мультифакторного заболевания, для которого характерны гетерогенная клиническая картина, преимущественное поражение лиц трудоспособного возраста, ранняя инвалидизация, снижение качества и продолжительности жизни больных. Все сказанное создает трудности в ранней досимптоматической и дифференциальной диагностике РА, подборе эффективных методов лечения.

Анализ результатов молекулярно-генетических исследований показал, что в развитии РА значительная доля всей генетической составляющей (30-40%) принадлежит генам НЬА II класса главного комплекса гистосовместимости человека. Об этом свидетельствуют результаты экспериментальных работ и клинических исследований: наличие в фенотипе определенных генов НЬА П класса локусов ОКВ1, БС>А1 и БС)В, а также определенных гаплотипических сочетаний ассоциировано с высоким или же минимальным риском развития данной аутоиммунной патологии во многих европейских популяциях. Такие ассоциации являются предметом изучения направления «НЬА и болезнь» [24]. На сегодняшний день наименее изученной в этом плане является территория Российской Федерации, что связано с ее большой протяженностью, различиями географических и экологических районах проживания населения и его многонациональностью. В последние годы получены результаты о предрасполагающей роли гена БИВ 1*04 в популяции русских Московской области [16] и в популяции башкир Челябинской области [8].

К сожалению, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, механизм инициации и персистенции заболевания полностью не раскрыты, что иллюстрируется недостаточной диагностической эффективностью используемых критериев, предложенных в 1987 году Американской коллегией ревматологов (АСЯ) на ранних этапах развития РА. Поэтому наряду со всесторонним изучением иммуногенетических аспектов интенсивно исследуются иммунологические показатели РА, аутоиммунного нарушения, сопровождающегося продукцией специфических для РА аутоантител различных типов. С 2008 года, помимо ревматоидного фактора, одного из «старейших» лабораторных показателей РА, в критерии АСЯ внесен еще один, более специфический — наличие антител к цитруллинированным пептидам, как дополнительный критерий иммунологического варианта РА [19].

В то же время, несмотря на то, что ассоциативная связь РА с генами НЬАII была обнаружена 30 лет назад, а высокоспецифичные для РА антицитруллиновые антитела были открыты более 40 лет назад, только в начале XXI века были выполнены работы, показывающие связь этих показателей, в частности ассоциацию аллелей генов НЬА II класса с продукцией специфических аутоантител, играющих важную роль в проявлении клинических симптомов заболевания.

Цель работы

Анализ ассоциации полиморфизмов генов НЬА П, определяющих чувствительность / устойчивость к ревматоидному артриту, с наличием аутоантител различных типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса 1ёМ) с целью выделения комплексного информативного лабораторного маркера риска развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.

Задачи

1. Изучить особенности распределения аллелей и генов локусов БКВ1, БС)А1, БС)В1 НЬА П класса и их гаплотипических сочетаний в русской популяции больных ревматоидным артритом.

2. Установить аллели, гены и гаплотипы НЬА П класса, определяющие предрасположенность или устойчивость к ревматоидному артриту в популяции русских Челябинской области.

3. Определить распространенность аутоантител различных типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса 1&М) и их комбинаций у больных ревматоидным артритом.

4. Оценить чувствительность и специфичность аутоантител различных типов у больных ревматоидным артритом.

5. Оценить диагностическую эффективность и информативность определения комплекса иммуногенетического и серологических показателей в лабораторной диагностике ревматоидного артрита.

Научная новизна

Определены особенности распределения аллелей и генов локусов ВКВ1, ВС>А1, БС£В1 НЬА П класса у больных ревматоидным артритом и здоровых лиц в популяции русских Челябинской области. Впервые представлены данные об аллелях, генах и гаплотипах локусов БКВ1 и БС>В1 НЬА II класса, определяющих предрасположенность и устойчивость к развитию ревматоидного артрита в популяции русских Челябинской области:

• предрасположенность к РА определяют: ген НЬА БИВ 1*04, аллели 01Ш1*0401, 0(^1*0301, 0(2В1*0302, генотипы ББШ1*01/04, БКВ1*03/04 и гаплотипы БОЗ, БКВ1*04-В(ЗА1*0301-ВС>В1*301 и ВБШ1 * 04-Б(2А1 *0301 -ВС>В1 *0302.

• устойчивость к РА определяют: гены БИВ 1*11, БИВ 1*13, БКВ1*15, аллели БрА1*102, БОАРЮЗ, ВС>В1*0602-8, гаплотипы БИВ 1 *07-БС>А1 *0201-В<ЗВ1 *0201, ВЫВ1*13-ВОА1*103-В(ЗВ1*0602-8, ВБШ1 * 15-Б(2А1 * 102-В(2В 1*0602-8.

Новыми являются данные о частоте встречаемости, чувствительности и специфичности основных серологических показателей у больных ревматоидным артритом: антител к модифицированному цитруллинированному виментину (анти-МСУ), суммарного ревматоидного фактора (РФсум) и ревматоидного фактора класса (РФ^) и их комбинаций. Показано, что наиболее специфичным тестом для диагностики РА является определение анти-МСУ антител. Максимальные значения специфичности достигаются при определении комбинации МСУ+/РФСуМ+> МСУ+/РФгеМ+ и одновременном обнаружении трех типов аутоантител, что позволяет проводить дифференциальную диагностику РА от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.

Показана высокая информативная значимость определения комбинации иммуногенетического маркера и серологического показателя анти-МСУ в лабораторной диагностике ревматоидного артрита. Для комбинации В1Ш1 * 04+анти-МС V характерна максимальная чувствительность (1,0) и высокая специфичность (0,75). Эти данные позволяют заключить, что позитивность по двум показателям: БЫВ 1*04 и анти-МСУ, является высоко чувствительным и специфическим лабораторным маркером при выделении группы риска среди родственников больных РА.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Носительство определенных аллелей, генов и гаплотипов НЬА П класса определяет риск развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.

2. Высоко специфичным для диагностики ревматоидного артрита является определение антител к модифицированному цитруллинированному виментину. Максимальная специфичность достигается при определении комбинации антител трех типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса что позволяет дифференцировать ревматоидный артрит от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.

3. Определение комбинации иммуногенетического (носительство гена ОКВ1*()4) и серологических (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса показателей может служить высоко чувствительным и специфическим лабораторным маркером риска развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.

Практическая значимость

Данные о распределении полиморфизмов генов локусов БЛ и БС> НЬА II класса в группе больных РА и контроле могут использоваться в качестве группы сравнения при проведении иммуногенетических исследований в таких разделах научных направлений как «Генетическое разнообразие человека» и «НЬА и болезни».

Новый подход к оценке генетической предрасположенности/ устойчивости к развитию РА на основании ассоциации аллелей, генов, генотипов и гаплотипических сочетаний НЬА II класса можно использовать для молекулярной диагностики РА и генетического прогнозирования в семьях больных РА русской популяции Челябинской области.

Одновременное выявление у больных РА трех серологических показателей (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса IgM) позволит проводить дифференциальную диагностику группы больных РА от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.

Определение ассоциации аутоантител различных типов, их комбинации между собой и с иммуногенетическим показателем (носительство гена БИВ 1*04) может служить лабораторными маркерами риска развития РА среди родственников больных русских Челябинской области и позволит выработать наиболее эффективную тактику профилактики и лечения РА.

Полученные результаты могут быть использованы в лабораторной практике в рамках технологий молекулярной медицины в качестве вспомогательных факторов, способных дополнить классические факторы риска развития ревматоидного артрита при формировании группы риска.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику зональной лаборатории иммунологического типированния ткани ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови», ревматологических отделений МУЗ Городская клиническая больница

6 и НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Челябинск ОАО РЖД» г. Челябинска. Основные положения работы используются в научно-педагогической деятельности кафедры микробиологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет» в лекционном курсе «HLA и болезни».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на конференции, посвященной 25-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории Челябинской государственной медицинской академии - «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Челябинск, 2006); на всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора H.H. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (г. Пермь, декабрь 2006 г.); на международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (г. Киров, июнь 2007 г.); на конференции «Фундаментальное и прикладное значение оценки гена иммунного ответа» (г. Челябинск, январь 2008 г.)

Публикации

По теме работы опубликовано 15 научных работ.

Выводы

У русских Челябинской области установлены положительно ассоциированные с ревматоидным артритом гены НЬА аллели Б(2А1*0301, Б<ЗВ*0302, гаплотипы БИВ 1 *04-Б(^А 1 *0301 -Б(2В1*0301, БКВ1*04-Б(2А1*0301-БОВ1*0302, и Е)(28' генотипы БИВ1*03/04 и Б11В 1*01/04, а также аллели гена ББШ1*04: 0401, 0404, 0408, кодирующие общий эпитоп. Протекторными в отношении развития ревматоидного артрита У русских Челябинской области являются варианты генов БШ31*^ 1» *13, *15, аллели Б(2А1*0102, Б(2А1*0103, Б(}В1*0602-8, а также гаплотипы Б1Ш1 *07-БС>А1 *0201-БС>В 1*0201, БКВ1*1501~ БС>А 1*0102-Б(}В1 *0602-8, Б11В1 * 13-Б(2А*0103-Б<2В*0602/8. Наиболее специфичным для диагностики ревматоидного артрита является определение антител к модифицированному цитруллинированному виментину. Максимальная специфичд£>сТЬг достигается при определении комбинаций серологических тестов-анти-МСУ+РФсумм или анти-МСУ+РФ1&м, анти-МСУ+РФ^.+РФхв^ (анти-МСУ - антитела к модифицированному цитруллинированному виментину, РФсумм - суммарны я ревматоидный фактор, РФГ8м — ревматоидный фактор класса которые позволяют дифференцировать ревматоидный артрит оТ заболеваний, протекающих с поражением суставов. Определение комбинации иммуногенетического марке?ра (носительство гена БЫВ 1*04) и серологического показате-*151 (антител к модифицированному цитруллинированному виментингу) может служить высоко чувствительным и специфическг^3*1 лабораторным маркером риска развития ревматоидного артрита ® популяции русских Челябинской области.