Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск оригинальных селективных анксиолитиков среди производных бензодиазепинового ряда, полученных при модификациях молекулы гидазепама

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Г| На правах рукописи

КОСАЧ ИРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

ПОИСК ОРИГИНАЛЬНЫХ СЕЛЕКТИВНЫХ АНКСИОЛИТИКОВ СРЕДИ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗОДИАЗЕПИНОВОГО РЯДА, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ МОДИФИКАЦИЯХ МОЛЕКУЛЫ ГИДАЗЕПАМА.

14.00.25 - Фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории фармакологической генетики НИИ фармакологии РАМН (директор - член-корр. РАМН, профессор С.Б.Середенин)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук Ю.А.Бледное

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Т.А.Воронина

доктор медицинских наук, профессор В.П.Онсенко

J

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится " " 1995 года в часов на

заседании Специализированного Ученого Совета Д.001.25.01 НИИ фармакологии РАМН (125315, Москва, ул.Балтийская, д.8)

С диссертацией можно ознакомиться в научной части Института Автореферат разослан " " октября 199В года

Ученый секретарь специализированного созета: кандидат медицинских наук

Е.А.Вельдг-\пн

1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность. В ряде исследований, направленных на выяснение причин индивидуальных различий в действии бензодиазепиновых транквилизаторов была установлена зависимость их эффектов от наследственно-контролируемого типа эмоционально-стрессовой реакции (ЭСР) (С.Б.Середенин, А.ИВедерников, 1979). Показано, что транквило-активирующее влияние бекзодиазепмюв формируется у инбредных животных, характеризующихся freezing реакцией при эмоционально-стрессовом воздействии, в отличии от преимущественно седативного эффекта у активных животных (S.B. Seredenin et al., 1987). Сходные закономерности выявлены в беспородных популяциях и в экспериментах на добровольцах (А.В.Вальдман, А.В.Мартынихин, 1982; В.А. Badyshtov et al., 1995; Н.В.Колотипинская, 1995) и в клинике (G.G. Neznamov et al., 1994). Совокупность этих результатов позволила поставить задачу поиска селективного анксиолитика, вызывающего транквило-активирующее действие при "пассивном" фенотипе ЭСР и не обладающего гипноседативным действием при "активном" фенотипе ЭСР (SJ3. Seredenin, Y.A. Biednov, 1993).

Фармакогенетическое изучение ряда бензодиазепинов выявило препарат гидазепам (1 -гидразинокарбонилметил-7-бром-5-фенил-1,2-дигидро-ЗН-1,4-

бензодиазепин-2-он), который, в определенном диапазоне доз, соответствовал указанным требованиям. Однако, диапазон доз педазепама, в которых регистрировался селективный анксиопитический эффект, оказался незначительным (С.Б.Середенин и соавт., 1992; S.B. Seredenin, YA Biednov, 1994). Для увеличения широты анксиопитических дозировок д.м.н. Ю.А. Бледновым (1990) были предложены основные направления химической модификации молекулы гидазепама с изменениями боковой группы в положении N,; введение атома С1 в фенильную группу; образование координационной 1М4-оксидной связи в диазепиновом кольце. Соответствующие структуры были синтезированы в Одесском физико-химическом институте им.А-В.Богатского АН Украины под руководством академика С.А.Дндронати. В результате получерны оригинальные соединения: БД-638, БД-643, БД-556, БД-1328, БД-1144, БД-1377, БД-1378, БД-1156, БД-1158.

Изучение их фармакологической активности, проявление сепективн анксиопитического действия в зависимости от химической структуры и механизл взаимодействия активных соединений с ГАМК-бензодиазепиновым рецегтторн комплексом явилось основной целью настоящей работы. ..

Для ее достижения необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить дозоеую зависимость влияния синтезированных соединений на поведе* мышей пинии C57BI/6 с ¿ктивным фенотипом ЭСР и линии Baib/c с пассивн фенотипом ЭСР в тесте "открытое поле".

2. Отобрать и провести психофармакологическое изучение наиболее перспектива в качестве селективного анксиолитика соединения стандартными методами ouei эффектов бензодиазепиновых транквилизаторов. • ¡

"3. Исследовать влияние отобранных соединений на кинетические парамет связывания 3Н-диазепама методами in vivo и in vitro.

4. Изучить влияние отобранных соединений на связывание ^S-t бутилбициклофосфоротионата (TBPS) в мембранах мозга мышей обеих инбредь пиний.

5. Провести корреляционный анализ зависимости психофармакологических эффект изученных бензодиазепинов от кинетических параметров связывания Н'-диазепа при их добавлении in vitro.

Научная новизна. В результате проведенного исследования изуче закономерности структура-эффект, доза-эффект для вновь синтезировав бензодиазепиновых соединений. Показано, что введение атома CI в 6окое фенильную фуппу в положении С, усиливает как транквилизирующий, так и остальн эффекты N бензодиазепинов, однако, приводит к падению степени анксиоселекгивности. Замена гидразиновой группировки на метокси-группу положении N, повышает, степень анксиоселекгивности. Для новых соединеь подтверждена ранее установленная для бензодиазепинов прямая корреляцией зависимость' выраженности гипноседативного и миорелаксирующего эффектов аффинности связывания с бензодиазепиновым рецептором (БДЯ). Показано, чт< изученном ряду. снижение аффинности рецепторного связывания и сниже( способности ингибировать связывание "S-TBPS сопровождалось увеличена

[иапазона доз селективного анксиолитического (транквило-активирующего) действия, ¡ыявлено, что введение атома С1 в боковую фенилъную группу в положении С5 риводит к повышению аффинности связывания бензодиазепинов с БДР и к усилению IX способности ингибироватъ связывание ^З-ТБРЭ с мембранами мозга мышей. 1редварительное стрессовое воздействие в тесте ОП снижает способность БД нгибировать связывание ^Э-ТБРЭ с мембранами мозга мышей обеих линий.

Научно-практическая ценность. Фармакологически изучено новое ригинальное соединение - БД-1158, обладающее наряду с типичными- для ензодиазепинов эффектами свойствами селективного анксиолитика с транквило-ктивирующим действием. Дозовый диапазон анксиосепективных эффектов БД-1158 начительно больше, чем у гидазепама По токсичности БД-1158 сходно с известными репаратами бензодиазепинового ряда На изученное соединение представлена аявка на патент РФ, регистрационный номер. 95112132 с приоритетом от 12 июля 995 года

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использованы мыши-самцы линий Ва1Ь/с и С57В1/6 массой 20-22 г, а акже беспородные белые крысьнсамцы массой 150-200 г (питомник "Столбовая" 'АМН). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 собей (мыши) или по 5 особей (крысы) в каждой, в течение не менее двух недель до ачала эксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде, при 12-ти асовом световом режиме (свет с 8.00 до 20.00). Все эксперименты проводили в ериод времени с 9.00 до 13.00.

Химическая, структура оригинальных, использованных в" работе ензодиазепиновых производных, представлена на Рис. 1. Препараты вводили нутрибрюшинно в виде их водной суспензии после предварительного тщательного астирания субстанций с несколькоми каплями Т\гееп-80 за 30 мин до начала ксперимента из расчета 0,1 мл раствора на 10 г веса животного.

На этапе скрининга влияние отобранных соединений на поведение мышей в гсте ОП изучали по методу, описанному . П.М.Бородиным и .соавт. (1976). татистическая обработка результатов выполнена по 1-крктерню Стъюдента.

ся дпимим х

СЯ у 1 МИИВ 2

Ш>-«3 «B-S5«

Рис.1. Химическая структура изученных производных 1,4-бензодиазепин;

Анксиолитическое действие БД-1158 исследовали с опьгтах на беспорсд; крысах-самцах в тесте конфликтной ситуации по Vogel при столкновении питьевог оборонительного рефлексов при действии внезапного болевого раздражителя экстремального фахтора (ГАВоронина и соавт., 1983). Статистическую обрабс полученных данных проводили, используя 1-критерий Стьюдента.

Для оценки седатившго ¡эффекта использован метод измерения спонтан: двигательной активности мышей в приборе "Optovarimex", как было описано ра (С.Б.Середенин и соавт., 1992)^ Статистичекую оценку полученных данных провод используя непараметрический критерий Манна-Уитни.

Миорепаксацию отобранных соединений регистрировали на беспородных мьш самцах в тесте "вращающегося стержня" (Т.А.Воронина и соавт., 1983). Устанавлиз

средние эффективные дозы, вызывающие нарушение координации движений или потерю мышечного тонуса по методу Литчфильда-Уилкоксона.

Снотворное действие отобранных веществ оценивали по тесту потенциирования эффекта гексенала (60 мг/кг, в/бр) (Ю.И.Вихляев и соавт., 1971; ТАВоронина и соавт., 1982). Результаты обрабатывали статистически с помощью {-критерия Стъюдента.

Антагонизм с коразолом оценивали по способности препаратов предупреждать тонико-кпонический компонент судорожного припадка у животных и их гибель (ТАВоронина и соавт., 1982). Статистическую обработку полученных данных проводили, используя метод угловых преобразований Фишера.

Выделение и отмывку мембранных препаратов мозга мышей, а также эксперименты по радисшигандному связыванию N-метил-'Н-диазепама (уд. радиоактивность 79,3 Кю/ммоль; Amersham, Англия) и ^S-tert-Бутилбициклофосфоротионата (уд.радиоактивностъ 87,7 Кю/ммоль, New England Nuclear, США) проводили в соответствии с ранее описанными методиками (ЮАБледнов и соавт., 1987; 1989; 1990). Для расчета кинетических параметров связывания радиолигандов использовали компьютерную обработку результатов с .помощью пакетов программ "Inplot" и "Ligand".

Острую токсичность измеряли в опытах на белых беспородных мышах при внутрибрюшинном введении испытуемых соединений в виде их суспензии в 1% растворе крахмала. Оценивали величину 50% эффективной летальной дозы по методу Л итчфильда-Уилкоксона

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Фармакологические эффекты в тесте "открытое поле*.

В данном разделе представлены данные, описывающие влияние отобранных для скрининга производных гидазепама на поведение инбредных мышей линий С и В6 в тесте ОП.

Гкпазепам в дозах 1,0 и 2,5 мг/кг повышал уровень двигательной активности (ДА) у мышей линии С, тогда как в дозе 10,0 мг/кг снижал ее уровень у обеих линий мышей ниже контрольных показателей (Рис.2а). У животных линии В6 уменьшение ДА отмечалось после введения препарата из расчета 2,5 и 5,0 мг/кг, но не достигало статистически значимого уровня (Рис.2а).

Соединение БД-643 в дозах 5,0 и 8,0 мг/кг увеличивало общую ДА мышей пинии в два раза, а, начиная с дозы 9,0 мг/кг, этот показатель значительно снижался г сравнению с контрольным уровнем для данной пинии животных. Однако, у мыше линии В6 статистически значимое снижение уровня всех видов ДА наблюдалось у» начиная с дозы 1,0 мг/кг (Рис.2Ь).

Изучение влияния соединения БД-638 на поведение мышей линии С в тесте О выявило довольно широкий диапазон доз - от 0.5 мг/кг до 10 мг/кг, в которо наблюдался выраженный активирующий эффект (Рис.2с). В тоже время небольшое;- н достоверное снижение общей ДА у животных линии В6 выявлялось, начиная лишь дозы в 10 мг/кг (Рис.2с).

На Рис.2с1 представлены данные по изучению влияния соединения БД-556 н поведение мышей линии С в тесте ОП. Показано, что лишь в очень узком диапазон доз (от 0,65 до 0,85 мг/кг) БД-556 статистически значимо повышал общую ДА, начиная с дозы 3,5 мг/кг уровень общей ДА достоверно снижался. У мышей В6 во все1 диапазоне испытанных доз (0,5 -15,0 мг/кг) уровень общей ДА статистически значим уменьшался по сравнению с контрольными значениями (Рис.2с1).

На Рис^За -представлены данные, описывающие влияние соединения БД-1377 н поведение мышей пинии С в тесте ОП. Показано, что в широком диапазоне доз (1,0 10,0 мг/кг) БД-1377 увеличивал уровень общей ДА в 3-4 раза по сравнению контрольными показателями. В том же диапазоне доз не было выявлено изменени поведения животных линии В6 (Рис.3а). Только, начиная с дозы 15,0 мг/кг наблюдал достоверное снижение уровня центральной ДА, а значимый ингибирующий эффек БД-1377 на все виды ДА проявлялся лишь в дозе 20,0 мг/кг.

Соединение БД-1378 в узком диапазоне доз от 0,5 мг/кг до 1,0 мг/кг достоверн активировало общую ДА мышей С (Рис.ЗЬ). У животных линии В6 данное соединение не оказывало влияния на ДА в дозе 0,5 мг/кг, однако, достоверно

Рис.2. Влияние гидазепама, соединений БД-643, БД-638,и БД-556 на поведение инбредных мышей а тесте "открытое попе" (М + тД. э оси ординал общая двигательная активность. По оси абсцисс дозы препаратов (мг/кг). * -атистачески достоверные отличия от контроля ^-критерий Стъюдента).

(ижапо уровень центральной и общей видов ДА в дозе 1,5 мг/кг по сравнению с >нтрольными показателями (Рис.ЗЬ).

Данные, демонстрирующие влияние соединения БД-1156 на поведение ышей линии С, представлены на Рис.3с. В дозах от 0,5 мг/кг до 2,0 мг/кг данное ¡единение не вызывало каких-либо эффектов на ДА животных, в дозе 3,0 мг/кг ■мечапось достоверное повышение уровня общей ДА, а в доза 5,0 мг/кг ее атистически значимое падение ниже контрольных значений. У мышей В6 введение Ц-1156 в дозе 1,5 мг/кг вызывало снижение уровня центральной и вертикальной ДА в за раза, при этом не • изменяя показатели периферической и, общей . ДА

«I БД-1377

ЫБД-1378

5 • »

х

5 в

«а 1 •

ДОЗЫ (мгЛх) «) БД-1156

4

ДОЗЫ (мг/кг)

3 , ю ■ -з о

ДОЗЫ (мг/кг)

5

К

5 ™

с

£ »

41

о

*- - —«Ы - СЖТШ/Ш

й-Ч- * 1 >1 , | * |

1

ММ - М/в

V 11 » и к

ДОЗЫ (мг/кг)

Рис.3. Влияние соединений БД-1377, БД-1378, БД-1156 и БД-1158 на поведение инбредных мышей в тесте ."открытое попе" (М + т,). .

По оси ординат: общая двигательная активность. По оси абсцисс: дозы препаратов (мг/кг) статистически достоверные отличия от контроля ^-критерий Стъюдента).

относительно контрольного уровня (Рис.Зс). Однако, при введении БД-1156 в дозе мг/кг уровень ДА мышей линии В6 не отличался от контрольного для данной ли животных.

• Для соединения БД-1158 было характерно выраженное устойчивое увеличе уровня периферической и общей ДА у мышей линии С в очень широком и, в цел необычном для БД производных диапазоне доз от 1 мг/кг до 25 мг/кг (Рис.3с1). Толь» дозе 30,0 мг/кг значения этих показателей ДА не отличались от контрольного уроЕ Кроме того, при введении БД-1.158 в дозах 2,5 и 5,0 мг/кг наблюдалось статистиче достоверное повышение. уровня центральной ДА. Небольшое, но статистиче значимое снижение общей ДА у животных линии В6 выявлялось, начиная лишь с д( 20 мг/кг, после чего оставалось неизменным до дозы в 30 мг/кг. Новое, более рез падение уровня ДА этих мышей наблюдали только в дозе 35 мгУкг (Рис.Зс!). В тех

дозах было зафиксировано статистически значимое падение уровня центральной и вертикальной активности животных данной линии.

Использованный нами фармакогенетический подход для изучения анксиоселективного эффекта основан на оценке: широты дозоеого /диапазона, в котором наблюдается активация поведения мышей с пассивным типом эмоционально-стрессовой реакции (линия С) и степени его совпадения с дозами, ингибирующими поведение мышей с "активным" типом ЭСР (линия В6).

С этих позиций результаты проведенного скрининга показали, что наиболее перспективным соединением с точки зрения анксиоселективности его фармакологического действия, является соединение БД-1158, поэтому оно и было избрано для дальнейшего углубленного анализа.

3.2. Изучение анксиолитической активности соединения БД-1158 в тесте

"конфликтная ситуация*.

Как видно из Рис.4 соединение БД-1158 в дозах от 2,5 мг/кг до 20 мг/кг (в/бр) обладает отчетливым анксиолитическим эффектом. Необходимо отметить, что число наказуемых взятий воды, наблюдаемое после введения соединения БД-1158 в максимальной дозе, достоверно отличалось от влияния более низких доз. При этом общая двигательная активность -животных в экспериментальной камере заметно не изменялась. Таким образом, на основании проведенных экспериментов можно заключить, что испытанное соединение обладает выраженным анксиолитическим действием в широком диапазоне доз без сопутствующих внешних признаков седации или миорелаксации.

3.3. Изучение седативного эффекта соединения БД-1158.

В следующей серии экспериментов было изучено влияние соединения БД-1158 на спонтанную двигательную активность мышей С и В6 в приборе "ОрКигаптех" (Рис.5). Лишь доза 30 мг/кг достоверно снижала уровень спонтанной ДА ниже контрольных показателей у мышей обеих линий. Таким образом, заметная седация наблюдалась после введения БД-1158 в дозах, значительно превышающих анксиолитические дозировки. . .

I

10

80 1

р<0.05

3

60 -

2 40 -

20 -

Рис.4. Влияние соединения БД-1153 на поведение крыс в условиях конфликтной ситу51

(М + т„).

По оси ординат: число наказуемых взятий воды. По оси абсцисс: дозы препарата (мг/кг). * статистически достоверные отличия от контроля (р<0.05; р<0.01 соответственно, 1-крите Стьюдента).

£ 1500-

контроль 10

контролыО

Рис. 5. Влияние соединения БД-1153 на спонтанную двигательную активность инбредньи мышей в приборе "Ор^омаптех" (М + т^. По оси ординат: спонтанная двигательная активность. По оси абсцисс: дозы препарата (мг/ " - статистически достоверные отличия от контроля (непараметрический критерий Ман Уитни). а) Ва1Ь/с; Ь) С57В1/6.

3.4. Изучение противосудорожной активности соединения БД-П5В.

При оценке лротивосудорожной активности при подкожном введении коразег.; дозе 120 мг/кг мышам линии С, соединение БД-1158 проявляло достоверный защити эффект начиная с дозы 5 мг/кг. При этом предотвращалось развитие тоничеаа

припадка и гибель животных, с повышением дозы до 15,0 мг/кг эффект распространялся и на клонические судороги (Табл.1). В дозе 5,0 мг/кг соединение БД-1158 статистически значимо удлиняло латентный период развития тонического припадка, а в дозе 10,0 мг/кг и клонических судорог (Табл.2).

Таблица 1. Влияние соединения БД-1153 на судороги, вызываемые коразолом у мышей линии Ва!Ь/с.

"■ Доза Вид активности

клонические тонические гибель

контроль - 10/10 10/10 9/10

- 1.0 мг/кг 9/9 9/9- 9/9

мг/кг 9/9 9/9 9/9

5.0 мг/кг 9/9 4/9 4/9

10.0 мг/кг 5га 0/9 0/9

15.0 мг/кг 2/9 0/9 0/9

* •

Примечание: первая цифра - число животных с развитием соответствующего эффекта, вторая -число животных в экспериментальной группе. (*) - статистически достоверные отличия от контроля (Р< 0.05, критерий угловых преобразований Фишера).

Для сравнения, гидазепам, предотвращал развитие тонического припадка и гибель животных линии С уже в дозе 0,5 мг/кг, не влияя на появление клонических подергиваний. В тоже время в дозе 0,25 мг/кг гидазепам статистически значимо увеличивал латентный период развития клонических судорог и тонического припадка. Дополнительные эксперименты, проведенные с целью выявления возможной просудорожной активности низких доз соединения БД-1158 (1,0 и 2,5 г/кг) при их введении с субсудорожными дозами коразола (50 мг/кг подкожно), позволили данный эффект исключить.

Таблица 2. Влияние соединения БД-1158 на латентный период развития кораэоловы: судорог у мышей пении Ва!Ь/с (М + шж)

Латентный период (мин)

Дозы (мг/кг) Клонические / Тонические

Контроль 2,76+1,02 10,04 + 2,19

п=10 п=10

1,0 5,14 + 2,01 17,34 + 5,19

п=9 п=9

2Д> 5,95 + 1,62- 17,44 + 2,96

п=9 п=Э

5,0 1Ц23 + 7,39 25,40 + 6,76

п=9 П=4

10,0 . 10,8 + 3,02

п=5

Примечание: п - число животных; \ ** - статистически достоверные отличия от контроля (Р<0,05; Р<0,01 - соответственно, Г-кретерий Стьюдента).

3-5. Тест "вращающегося стержня".

Данные, характеризующие миорелаксантную активность соединения БД-1158 беспородных мышей представлены в Табл.3. Видно, что уже в дозе 5,0 мг/кг 33,3 ' животных не способны удержаться на вращающемся стержне в течение сро> тестирования (2 мин). Величина Ейи оказалась равной 13,177 мг/кг при ЕО„ = 3,2£ мг/кг и = 52,758 мг/кг. Сравнительный анализ миорелаксантной активное гидазспама (Табл.4) показал, что величина ЕОи для этого препарата составляет 9,5! мг/кг, при Ей,, = 2,742 мг/кг и ЕО„ = 33,325 мг/кг. •

3.6. Параметры гексеналового сна.

В Табл.5 приведены результаты экспериментов по изучению влияния соединен! БД-1158 на параметры гексеналового сна у беспородных мышей. Видно, что толь начиная с дозы 20,0 мг/кг препарат вызывал статистически значимое, дозозазисим увеличение времени продолжительности сна экспериментальных животных б выраженных изменений латентного периода их засыпания.

Таблица 3. Влияние соединения БД-1158 на поведение беспородных мышей в тесте "вращающегося стержня".

Доза Параметры

(мг/кг) Число -' • удержавшихся животньифт/т) Ыремя удерживания (сек) Процент неудержавшихся -животных

Контроль 120 100

5,0 вэ 922+14,0 33,3

10,0' БО 81,1 +15,5 33,3

15,0 5/10 73,2 + 16,3 50,0

20,0 4/10 78,0 +14,0 60,0

30,0 4/13 47,3 +14,4 69,2

60,0 1/10 30,2 + 11,5 90,0

Примечание: п - число животных, удержавшихся в течение 2-х минут эксперимента, т - общее число животных в экспериментальной группе; *, " - статистически достоверные отличия от контроля (Р<0,05; Р<0,01 '-"соответственно, Ифигерий Стъйде'нта). ■ • - ■

Таблица 4. Влияние гкдазепама на поведение беспородных мышей в тесте "вращающегося стержня".

Доза Параметры

(мг/кг) Число удержавшихся жиаотных(п/т) Время удерживания (сек) Процент неудержавшихся животных

Контроль 11/11 120 100

10,0 „6/10 71,2 + 15,9 40.0

20,0 5Í10 66,4+18,1 50,0

30,0 1Л0 23,4+10.2 ' 90,0

Примечание: п - число животных, удержавшихся в течение 2-х минут эксперимента, т - общее число животных в экспериментальной группе;" - статастически достоверные отличия от контроля (Р<0,05; Р<0,01 - соответственно, I-критерий Стьюпента).

Таблица 5. Влияние соединения БД-1158 на гексеналовый сон у мышей пинии Ва1Ь/с (М + ш,).

ДОЗА Латентный период Продолжительность

(мг/кг) засыпания (сек) сна (сек)

Контроль 170,0 + 29,7 2007,2+160,9

п=11

5,0 157,5 + 14,6 1913,3 + 31,0

п=6

10,0 108,8+113 2417,1 +362,4

п=11

20,0 133.3 + 12,4 2861,7 + 164,4

п=12 **

30,0 92,7 + 15,2 ,4099,7 + 367,0

п=6

Примечание: п - число животных, " - статистически достоверные отличия от соответствующего контроля (Р< 0.05, {-критерий Стъюдента).

3.7. Острая токсичность.

Измерение острой 24-часовой токсичности соединения БД-1158 было проведено после его внугрибргашинного введения в крахмальной суспензии мышам линии С (Табл.6). Величина оказалась равной 803,4 мг/кг (при 95% доверительном интервале 540,2 -1194,7 мг/кг).

Таблица 6. Острая токсичность соединения БД-1158 через 24 часа после его внутрибрюшинного введения у мышей линии Ва1Ь/с.

. Доза (мг/кг) Показатели

- Гибель Выжившие животные <*>..

100 6/6 100

250 6IS 100

500 5/5 83,3

600 5/Б 83,3

1000 0/6 . 0

1500 1/6 16,7

Примечание: первая цифра - число выживших животных, вторая - число животных в экспериментальной группе.

3.8. Влияние отобранных соединений на связывание 'Н-диазепгма.

В Табл.7 и 8 представлены данные, описывающие кинетические параметры связывания отобранных БД производных с БДР. Видно, что все изученные соединения характеризовались значительно более низкой аффинностью к БДР и меньшим числом связывающих мест, чем диазепам. В тоже время величины коэффициента Хилла для большинства соединений оказались ниже 1,0.

Таблица 7. Влияние беизодиазепиновых производных на связывание эН-диазепама с мембранами мозга мышей линии Ва!Ь/с in vitro.

Соединение В_ пМ/мг белка К» нМ к, НМ нМ

Диазепам 1.406+0.053 0.953+0.088 4.886+0543

Гидазепам 0.637+0.048 0.S44+0.033 595.97+40.9

БД-643 0395+0.043 0.783+0.095 34.076+2.5

БД-638 0.910+0.037 0.877+0.003 212.81+7.59

БД-556 0.910+0.056 0.735+0.026 32^25+1.55

Примечание: * - достоверные отличия показателей связывания исследованных бензодиазепинов от диазегама (р<0.01, t-кригерий Стъюяента): ® - достоверные отличия or гидазепама; # - достоверные отличия БД-556 от БД-643; 4 - достоверные отличия БД-556 от БД-638

Таблица 8. Влияние беизодиазепиновых производных на связывание 'Н-диазепама с мембранами мозга мышей линии Balb/c in vitro.

Соединение Bw пМ/мг белка К,нМ К^нМ I

Диазепам 1.406+0.053 0.559+0.038 4.836+0543

БД-115В 0.951+0.061 0.922+0.019 2981.7+206.4

БД-1156 0.814+0.045 0.888+0.033 882.99+45.48 Q

БД-1377 0.403+0.068 *; * 0.514+0.021 7367.7+750.5 *

БД-1378 0.419+0.017 *;$ 0.681+0.028 875.45+177.7

Примечание: * - достоверные отличия показателей связывания исследованных бензодиазепинов от диазелама (р<0.01,1-критерий Стьюдента);@ - достоверные отличия БД-1156 от БД-1158; # - достоверные отличия БД-1377 от БД-1153; & - достоверные отличия БД-1378 от БД-1377; 5 - достоверные отличия БД-1378 от БД-1156.

Введение альпразолама, гидазепама и соединения БД-1158 в дозах, оказывающих селективное транквило-активирующее действие у мышей линии С, приводило к снижению аффинности, повышению числа связывающих мест для диазепама и увеличению коэффициента Хилла, в сравнении с животными, получавшими контрольную инъекцию физиологического раствора (Рис.6), но не влияло на относительное связывание 3Н-диазепама с мембранами мозга животных (Рис.7).

9 В 7 6^ 5 4 3

О

•* -

--- ■é

I

i

---------------------------

* + *

гт ш

KD. пМ

Вшах. рМ

Ш11 Со

контроль' 1 | апьлразола [ggálj ЕД-1158

гидазепаы

Рис. Б. Кинетические параметры связывания 'Н-диазелама с мембранами мозга мышей Ва1Ыс после предварительного введения гидазепама, альпразолама и соединения БД-1158 ín vivo.

1

Balb/c

Рис. 7. Относительное связывание 'Н-диазепама с мембранами мозга мышей Balb/с поел предварительного введения гидазепама, альпразолама и соединения БД-1158 in vivo.

Сравнение фармакологических и рецепторных эффектов изученных БД показало высокую корреляцию между аффинностью к БДР и величиной ЕД^ для ингибирования ДА в тесте ОП (Рис.8А) при отсутствии выраженной зависимости между сродством БД к рецептору и широтой диапазона дозировок, активирующих поведение мышей линии С в тесте ОП (Рис.8В).

А-

В

г-0-445 р-0.26в

ЕОи

диапазон активирующих доз

Рис. 8. Зависимость психофармакологических параметров поведения животных от аффинности связывания бензодиазепинов с бензодиазепиновым рецептором.

По оси ординал аффинность к БДР. По оси абсцисс А) ГП_ Для седатквного эффекта в тесте ОП: 1 -БД-643,2 - БД-556, 3 - БД-1378, 4 - шдазепам, 5 - БД-638, 6 - - БД-1156, 7 - БД-1158, 8 - БД-1377; В) диапазон активирующих яозг 1 - БД-553, 2 - БД*1378,3 - БД-1156, 4 -гидазепам, 5 - БД-643, 6 - БД-' 638, 7 - БД-1377, 8 - БД-1158.

3.9. Влияние отобранных соединений на связывание "£>-ТВРЗ.

В следующей серии опытов было изучено влияние отобранных производных бензодиазепинов на связывание ^Э-ТБРЭ, специфического лиганда к рецепторному участку СГ-ионофора.

Видно, что если у мышей линии С гидазепам статистически значимо ингибировал связывание ^Э-ТБРЭ, начиная с концентрации 10"* М, то у животных В6 заметное ингибирование связывания радиолиганда было зафиксировано только в концентрации 10"5 М. Аналоги гидазепама - соединения БД-643 и БД-556 характеризовались заметно более высокой способностью ингибировать связывание радиолиганда. Подобное ингибирование было отмечено уже в концентрации 10"7 М (Рис.9 А,В). ,

Сходные с гидазепамом результаты были получены и для соединения БД-1158 (Рис.10).

Влияние

альпразолама . и

Рис. 9. Влияние гидазепама, БД-643 и БД- Рис.10.

556 на связывание "в-ТВРЭ в мембранах соединения ВД-1158 на связывание *&-

мозга инбредных мышей: ТВРБ в мембранах мозга инбредных

А) Ва1Ь/с; В) С57В1/6. мышей: А) Ва1Ь/с; В) С57В1/6.

Из Рис. 10А видно, что снижение связывания "¡^-ТБРЭ в мембранах мозга мышей пинии С при воздействии альпразолама носит отчетливый двухфазный характер. При этом в диапазоне концентраций 5x10'* М - 10* М наблюдали небольшое снижение уровня связывания радиолиганда, не более 10-15%. Однако, дальнейшее повышение концентрации альпразолама приводило к более резкому ингибированию. Сходные данные были получены и с мембранами мозга животных В6 (Рис. 10В), но так же, как для гидазепама и соединения БД-1158, ингибирование связывания радиолиганда начиналось с более высоких концентраций (10* М) использованного в данной серии бензодиазепина

Рис. 11. Влияние альпразолама на связывание "Э-ТВРЗ с мембранами мозга интахтных и подвергшихся эмоционально-стрессовому воздействию в тесте ОП инбредных мышей. А) Ва!Ь/с; В) С57В1/6.

Рис. 12. Влияние гидазепама на связывание "З-ТВРЭ с мембранами мозга интактных и подвергшихся эмоционально-стрессовому воздействию в тесте ОП инбредных мышей. А) Ва1Ь/с; В) С57В1/6.

Эмоционально-стрессовое воздействие в тесте ОП приводило к выраженному сдвигу кривой ингибирования вправо, увеличивая концентрации бензодиазепинов, способные ингибировать- связывание радиопиганда Это было характерно для всех изученных производных: альпразолама (Рис.11 А,В), гидазепама (Рис.12 А,В), циназепама (Рис.13 А,В) и соединения БДИ 158 (Рис.14 А,В). Подобное снижение чувствительности оказалось в несколько большей степени выражено в мембранах мозга мышей линии С, тогда как у животных линии В6 подобное падение ингибирующей способности было зафиксировано только для циназепама и соединения БД-1158.

Рис.13. Влияние циназепама на связывание "в-ТВРБ с мембранами мозга ■ интактных и подвергшихся эмоционально-стрессовому воздействию в тесте ОП инбредных мышей: А)Ва!Ыс; В)С57В!/6.

Рис.14. Влияние соединения БД-1158 н< связывание "Э-ТВРЭ с мембранами мозг; интактных и-лодвергшихся эмоционально стрессовому воздействию в тесте ОГ инбредных мышей: А) ВаШ/с; В)С57В1/6.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ полученных результатов, проведенный исходя из; основных принцило изложенного ранее фармакогенетического подхода к оценке селективног анксиолитического действия показал, что, найденное в процессе скрининга, соединение 1158 обладало очень широким в отличие от всех изученных ранее производив бензодиазелинового ряда диапазоном дозировок, которые активировали поведени животных с "пассивным" типом ЭСР в тесте ОП. Те же дозы этого соединения не оказываг выраженного влияния на поведение мышей с "активным" типом ЭСР в условиях данно! теста. Более того, наименьшие из выявленных доз, активировавших поведение животнь линии С, оказались близкими к дозам гидазепама, оказывавшими сходный эффект (Б.1 Бегейегоп, УЛ. В1ес)по\л 1994). Исходя из данных, приведенных в работе М.Маулы (1996 •фармакологический эффект низких доз БД-1158 описывается как транквило-активирующи

Транквилизирующее действие этого соединения было подтверждено также в классическом тесте "конфликтной ситуации" по Vogel.

Суммируя результаты, полученные при сравнительной оценке седатавного, . снотворного, миорелаксирующего действия гидазепама и соединения БД-1158, можно заключить, что развитие данных эффектов для соединения БД-1158 наблюдалось в диапазоне доз от 10,0 до 30 мг/кг, тогда как для гидазепама - в диапазоне доз от 0,5 до 10,0 мг/кг. В то же время, следует отметить, что основной - анксиотпический (транквило-активирующий) эффект гидазепама наблюдался в дозах 1,0 - 2,5 мг/кг (S.B. Seredenin, Y.А. Blednov, 1994) и совпадал с диапазоном доз, вызывающих другие, характерные для бензодиазепинов типы действия. Напротив, транквило-активирующее действие соединения БД-1158 зарегистрировано начиная с дозы 1,0 - 5,0 мг/кг, что существенно ниже дозировок, вызывавших побочные эффекты (М.Маула, 1996). Представленные данные позволяют сделать заключение о большей селективности основного - анксиопитического эффекта соединения БД-1158 в сравнении с гидазепамом и перспективности вновь выявленного соединения для его дальнейшей разработки в качестве нового селективного анксиолитика. В пользу данного заключения свидетельствуют также полученные данные об относительно низкой острой токсичности соединения БД-1158.

При анализе противосудорожных эффектов изученных препаратов обращает на себя внимание тот факт, что для гидазепама дозы, оказывающие противосудорожное действие, совпадают с вызывающими транквилизирующие и другие эффекты, в то время как соединение БД-1158 обладает противосудорожным действием лиц.ъ в высоких дозах, • совпадающих с гипноседативными и миорелаксирующими. В диапазоне же анксиолитических доз у БД-1158 противосудорожного и просудорожного действия не выявлено. Последнее обстоятельство свидетельствует об отсутствии у данного соединения свойств, характерных для "обратных" агонистов БДР, которые способны усиливать судороги, вызываемые коразолом (M. Williams, 1984). Полученные данные позволяют думать, что БД-1158 реализует свои эффекты не только через бензодиазепиновый рецептор, но и имеет какой-то дополнительный механизм, связь которого с бонзодиазспиновым рецелторным комплексом предстоит выяснить.

В пользу данного предположения свидетельствуют полученные нами результаты по изучению характера связывания изученных производных гидазепама с БДР с •использованием в качестве' радиолиганда классического агониста БДР - диазепама. Оказалось, что практически все изученные производные гидазепама, включая сам гидазепам, характеризовались очень низкой аффинностью связьиания, значительно уступающей диазеламу. В тоже время, показатели коэффициента Хилпа для большей части из mix соединений значительно отличались ст 1,0, достигая статистически значимых

различий для соединений БД-556, БД-1378 и БД-1377, что указывает либо н; взаимодействие этих соединений с различными субпопуляциями БДР, либо на боле! отрицательно-кооперативный характер их связывания с БДР, в сравнении с диазепамом Более того, общее количество связывающих мест, характерное для всех изучении: соединений, также оказалось значительно ниже аналогичного показателя, полученного дл: диазепама. ....

Одна из основных задач данного исследования заключалась в изучении влияни: направленной химической модификации молекулы гидазепама на формирован«! селективного анксиолитического эффекта БД При анализе полученных нами данны: оказалось, что введение атома С1 в фенильное кольцо в положении (^приводит к заметном; усилению общей ■ фармакологической эффективности соединений, что проявляется > снижении активных доз, оказывающих все виды фармакологического действия. Эт. закономерность хорошо прослеживалась во всех изученные парах соединений: гидазепам БД-643; БД-638 - БД-556; БД-1158 - БД-1156; БД-1377 - БД-1378, независимо от боково! группы в положении 14,. При этом повышение фармакологической эффективносп сопровождалось резким снижением степени анксиоселективности изученных соединений что выражалось в заметном сужении диапазона дозировок, активировавших поведени: мышей линии О в тесте ОП. Сходные данные о влиянии атома С1 на фармакологическук активность БД были представлены в работе Кгаак, ЭиЮоуа (1990). Сравнивая по ( отологическим показателям^ влияние ряда БД. на поведение мышей, они показали, чгс альпразолам, нитразепам и оксазепам (не содержащие атома С1) обладают более выраженным анксиолитическим действием в сравнении с соответствующими аналогами содержащими атом С1 (триазолам, клоназепам и лоразепам), которые вызывают более выраженное седативное действие.

На уровне взаимодействия изученных веществ с БДР, проведение подобно» модификации молекулы гидазепама приводило к выраженному снижению величины К,, чте указывает на повышение аффинности связывания соединений, имеющих в структуре аток С1, с БДР. Подобная зависимость была характерна для всех вышеперечисленных па; соединений, вне зависимости от наличия гидразиновой или метокси-группы в положении

При сравнительном анализе значения гидразиновой или метокси-группы в характере связывания изученных соединений с БДР оказалось, что для пар соединений гидазепам • БД-638 и БД-1377 - БД-1158, не содержащих атома С1, замена гидразиновой группы нг метокси-груплу приводит к увеличению общего числа связывающих мест (В_) и-сниженик величины К, (увеличению аффинности), которая остается все же заметно более низкой пс сравнению с аффинностью диазепама. Для пар соединений БД-643 - БД-556 и БД-1378 - БД •1156, содержащих в структуре молекулы атом С1, введение метокси-группы вместе

гидразиновой группировки также приводило к статистически значимому увеличению В_ без заметного изменения сродства рецептора к радиолиганду (величина К,). Наблюдаемое изменение обоих показателей связывания указывает на более сложный характер взаимодействия лиганд-рецегттор, чем ■ при обычном конкурентном вытеснении, что косвенно свидетельствует о возможном участии других субпопуляций БДР.

Ранее было показано, что концентрационная зависимость.ингибирования связывания "Э-ТБРЭ феназепамом и диазепамом описывалась двухфазной кривой (ЮАБледнов и соавт., 1989). Аналогичный характер ингибирования был продемонстрирован в настоящем исследовании для альпразолама и циназепама, которые являются мощными БД с маловыраженной селективностью транквило-активирующего действия (У_А.В!ес1поу е! а!., '1995; М.Маула, 1996). В то же время гидазепам и соединение БД-1158, обладающие значительно более высокой степенью селективности транквило-акгивирующего действия при заметно более слабой седативной активности, утрачивали первую фазу вытеснения (в наномолярной области), свойственную более мощным БД. Одним из наиболее вероятных объяснений выявленных различий в ингибирующей способности различных БД является предположение об их возможном взаимодействии с различными субпопуляциями СГ-ионофор связывающих мест, существование которых можно считать доказанным (УаБш е1 а!.,1985; ТеЬгага е1 а1., 1985; Р!цп е{ а!., 1995). Исходя из изложенных позиций, можно полагать, что однофазный или двухфазный характер вытеснения радиолиганда к хлор-ионсфору связан с более или менее выраженной селективностью анксиолишческого действия БД. В пользу данной гипотезы свидетельствуют, полученные данные по сравнительной способности гидазепама и двух его производных - БД-643 и БД-556 вытеснять меченый лиганд к СГ-ионофору. Для обоих изученных производных оказался характерным резкий сдвиг кривой вытеснения в область наномопярных концентраций при заметном усилении общей фармакологической эффективности и резком падении степени анксиоселективности в сравнении с гидазепамом, что полностью согласуется с увеличением сродства обоих аналогов к БДР в сравнении с аффинностью самого гидазепама.

Суммируя высказанные соображения, можно заключить, что анализ взаимодействия изученных бензодиазепинов, как с БД-, так и с СГ-ионофор-связывающими местами, свидетельствует о важном значении гетерогенности обоих типов связывающих мест для опосредования основного или побочных фармакологических эффектов БД.

В принципе, для объяснения подобной ситуации существует несколько возможных вариантов, включая участие других нейромедИаторных систем и механизмов, отличных от БДРК; участие подтипов БДР, отличающихся от рецептора, связывающего стандартные агонисты БДР, такие как диазепам, флунитразепам и т.д. (УУ^едИаЛ, 1995); не исключена

возможность опосредованного через другие мембранные механизмы влияния БД-1158, приводящего к конформационным изменениям БДР.

6. ВЫВОДЫ.

1. Фармакологически изучено новое.4 оригинальное соединение - 1-Метоксикарбонилметил-7-бром-5-фенил-1,2-дигидро-ЗН-1,4-бензодиазепин-2-он-4-оксид (БД-1158), способное в диапазоне доз от 1,0 до 5,0 мг/кг вызывать анкси оптический транквило-активирующий эффект, не сопровождающийся седацией, снотворным и миорелаксирующим действием.

2. В результате изучения зависимости структура - эффект соединений, синтезированных на основе модификации молекулы .гидазепама установлено, что введение атома С1 в фенильную группу в положение С5 увеличивает эффективность соединений во врем спектре психофармакологической активности, но уменьшает степень анксиоселективности. Степень. аффинности к бензодиазепиновому рецептору и способность к ингибиции связывания KS-TBPS при этом увеличиваются.

3. Химическая модификация молекулы гидазепама с заменой гидразиновой группировки на метокси-группу в положении N,, повышает степень анксиоселективности полученных соединений.

4. В ряду вновь синтезированных соединений подтверждена прямая корреляционная зависимость между показателями их аффинности к бензодиазепиновому рецептору с выраженностью гипноседативного, противосудорожного и миорелаксирующего действия. Анксиоселективность изученных соединений повышается со снижением их аффинности к БДР и способностью ингибировать связывание^ЕЗ-ТВРЗ.

5. Вызванное handling увеличение гетерогенности БДР в нейронах головного мозга мышей линии С снижается в результате' предварительного введения БД-1158, гидазепама и альпразолама в анксиоселективных дозировках, что сопровождаете? увеличением коэффициентом Хилла, уменьшением аффинности бензодиазепиновогс связывания и повышением максимального числа связывающих мест.

Работа выполнена в соответствии с Государственной научно-техническое программой 'Создание новых лекарственных средств методами химического v биологического синтеза". Направление 02, тема N 02-21.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

1. Блкднов Ю.А., Козловская М.М., Маула М., Косач И.В. Изучение спектра психофармакологической активности производных 1,4-бензодиазепина у животных с "пассивным" типом эмоционально-стрессовой реакции. // Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств. / Тез. докл. 1 -ого Съезда Российского научного общества фармакологов. - 9-13 октября -1995. - г. Волгоград. - с.49.

2. Бледнов Ю.А., Косач И.В., Середеник С.Е. Сравнительное изучение влияния гидазепама и альпразолама на бензодиазепиновый рецептор и хлорный канал // Фундаментальные исследования как основа создания лекарства¡ных средств. / Тез. докл. 1-ого Съезда Российского научного общества фармакологов. - 9-13 октября -1995. - г. Волгоград. - с.50

3. Ю.А.Бледное, И.В.Косач, С.Б.Середенин. Влияние производных 1,4-бензодиазепина на связывание З^ЧеЛ-бутилбицикг.офосфоротионата в мозге инбредных мышей с различной эмоционально-стрессовой реакцией. // Принято к публикации в журнале Экспор. и Клин. Фариакол.