Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Пищевод Барретта как предраковое состояние, особенности экспрессии опухолевых маркеров

На правах рукописи

Демура Татьяна Александровна

Пищевод Барретта как предраковое состояние, особенности экспрессии опухолевых маркеров

/14.00.15 - патологическая анатомия/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003454978

Москва 2008

003454978

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М.Сеченова Росздрава

Научный руководитель: Академик РАМН и РАН, профессор, зав. кафедрой патологической анатомии с курсом общей патологии

ГОУ ВПО ММА имени И.М. Сеченова Михаил Александрович Пальцев

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент, РАМН, доктор медицинских наук, профессор, директор ГУ НИИ

морфологии человека РАМН Лев Владимирович Кактурский

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной патологии отдела патологической анатомии

опухолей человека РОНЦ РАМН Карселадзе Аполлон Иродионович

Ведущая организация:

ГУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН.

заседании диссертационного совет

Медицинская Академия имени И.М.Сеченова Росздрава (119991 Москва, Трубецкая ул., д. 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии имени И.М.Сеченова Росздрава (117998 Москва, Нахимовский пр., д. 49).

Защита диссертации состоится

Автореферат диссертации разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

Олег Николаевич Бартош

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность 1емы. Пищевод Баррепа (ПБ) - заболевание нижней трети пищевода, развивающееся при длительном течении гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) и характеризующееся метаплазией многослойного плоского неороговевающего эпителия в цилиндрический кишечного тина. ПБ в ряде случаев осложняется развитием диенлазии и аденокарциномы (АК).

Актуальность проблемы связана с ростом заболеваемости ГЭРБ, ПБ и АК пищевода. По данным ВОЗ ПБ выявляется при эндоскопическом исследовании примерно у 10-20% людей с симптомами ГЭРБ. По данным РОНЦ им. Н.Н.Блохииа, риск развития АК на фоне ПБ в 30-125 раз выше, чем среди всего населения [Давыдов М.И. и соавт , 2003].

По данным ВОЗ за 2000 г., частота АК пищевода каждый год возрастает на 5-10%, что превышает аналогичные показатели при всех других формах рака [Hamilton S., Aaltonen L. WHO classification of tumours. Tumours of digestive system. IARC/Ve.v.v Lyon 2000|. Единственной возможностью повышения показателей выживаемости при АК пищевода является диагностика на стадии интраэгштелиальной неоилазии (ИН). Но даже при микроскопическом исследовании морфологические проявления ИН не всегда очевидны. Для объективизации диагностики диспластических изменений пищевода необходимо внедрение в практику молекулярных и иммуногистохимических (ИГХ) методов исследования, основанных на изучении экспрессии онкомаркеров.

Молекулярные механизмы развития ПБ, ИН и АК пищевода остаются недостаточно изученными. В литературе сообщается об изменениях отдельных онкомаркеров, которые могут участвовать в канцерогенезе АК на фоне ПБ. Так известно, что при ИН на фоне ПБ изменяется экспрессия генов супрессоров опухолевого роста (р53, р16, FHIT, Rb, APC), генов регуляторов клеточного цикла (Cyclin D1, MDM2), факторов роста и их рецепторов (EGF-R, TGF-A, с-егЬВ2), молекул клеточной адгезии (E-cadhenn, P-cadherin, a-catenin, p-catenin), a также молекул межклеточных плотных контактов (ПК) - клаудинов (Кл). ПК - вид

межклеточного соединения мембран эпителиальных и эндотелиальных клеток. Они осуществляют прочную механическую связь клеток и препятствуют транспортировке веществ по межклеточным пространствам, участвуют в дифференцировке и пролиферации клеток.

В соответствии с поставленными вопросами сформулированы цель и задачи настоящего исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение морфологических молекулярных аспектов морфогенеза и патогенеза пищевода Барретга ка предракового состояния.

Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить морфогенез АК на фоне ПБ, от стадии ГЭРБ-эзофагита, д кишечной метаплазии (КМ), ИН и АК на фоне ПБ;

2) оценить соотношение процессов пролиферации и апоптоза на разных стадиях морфогенеза АК на фоне ПБ;

3) оценить по маркерам дифференцировки нарушения процессов созревани эпителиальных клеток при КМ, ИН и АК на фоне ПБ;

4) изучить изменения ПК по экспрессии Кл на разных стадиях морфогенез АК на фоне ПБ;

5) сравнить ИГХ особенности диагностики КМ, ИН и АК на фоне ПБ р составить гипотетическую схему канцерогенеза АК на фоне Г1Б.

Научная новизна.

Новизна диссертационной работы связана с тем, что представлены охарактеризованы этапы опухолевой профессии АК на фоне ПБ.

Автором установлены молекулярно-биологические особенности КМ, ИН и АК н фоне ПБ и выявлено достоверное повышение пролиферации и апоптоза в ряду желудочной метаплазии (ЖМ) к КМ и ИН на фоне Г1Б. На этапе перехода от ИН к АК н фоне ПБ отмечается повышение пролиферации, тогда как апоптоз снижается, чт

обеспечивает рост и профессию карциномы и является прогностически неблагоприятным признаком.

Впервые обнаружены отличия в экспрессии р53 юлсгокишечной метаплазии (ТлКМ) от других гипов цилиндроклегочной метаплазии. Автором установлено, что ТлКМ является фоном для развития ИН и характеризуется экспрессией муташною р53, что делаег ее прогностически менее благоприяшой. Полученные данные изменения уровня пролиферации, апопгоза и р53 помогают прогнозировагь течение Г1Б и ИН при ПБ, что сущесгвенно для решения вопроса о хирургическом лечении таких пациентов.

Обоснована метаиласгическая теория происхождения цилиндрического эпителия из тканевой мультипотентной клетки-предшественницы, общей для плоского и цилиндрического эпителия, что подтверждается наличием экспрессии в ПБ маркеров плоскою (СК 10/13 и Кл 1) и цилиндрического эпшелия (СК 8, Кл 2,3,4,5,7).

Пракпическая значимость

Полученные данные целесообразно использовать в практическом здравоохранении при проведении диагностики ИН при ПБ, для определения риска развития АК и для выбора тактики лечения больных.

Практическая значимость работы также связана с установлением молекулярных маркеров для дифференциальной диагностики между цилиндрическим метапластическим эпителием в ПБ и желудочным эпителием в биоптатах пищевода. Маркеры ПК Кл 1, 2 и 7 выявляются в КМ ПБ и не определяются в желудочном эпителии.

Материалы диссертации используются в практической работе при анализе биопсийного материала на кафедре патологической анатомии с курсом общей патологии и кафедре пропедевтики внутренних болезней ГОУ ВПО ММА имени И.М. Сеченова.

Положения, выносимые на защиту

1. Морфогенез А К на фоне ПБ является многоступенчатым процессом и включает следующие стадии: хроническое воспаление в виде ГЭРБ-эзофагитс без и с желудочной метаплазией, пищевод Барретта с тонкокишечной и толстокишечной метаплазией, интраэпителиальная неоплазия и инвазивная карцинома на фоне ПБ, что доказывается обнаружением у одного пациент сочетания перечисленных изменений.

2. Опухолевая прогрессия от стадии цилиндроклеточной метаплазии до стадий интраэпителиальной неоплазии низкой и высокой степени и развития АК н фоне ПБ сопровождается потерей плотных контактов, что проявляете уменьшением вплоть до полного исчезновения экспрессии Кл 1,2,3,4,5,7 апикальной мембране и усилением их накопления в цитоплазм эпителиоцитов.

3. Опухолевая прогрессия при АК на фоне ПБ сопровождается нарушениям баланса между процессами пролиферации и апоптоза, что подтверждаете изменениями экспрессии Кл-67, р53 и индекса апоптоза. Установлен повышение уровней пролиферации и апоптоза в цилиндрическом эпителш от стадии желудочной метаплазии, до кишечной метаплазии интраэпителиальной неоплазии. Переход от интраэпителиальной неоплазии АК в ПБ сопровождается усилением пролиферации и относительны\ снижением апоптоза.

4. Экспрессия СК 10/13, СК 8 и Кл 1 в плоском эпителии в норме и пр эзофагите, и в очагах цилиндроклеточной метаплазии может свидетельсгвоваг об общности их происхождения из мультипотентной тканевой клетк предшественницы.

5. Опухолевая прогрессия АК на фоне ПБ характеризуется следующим! особенностями:

• толстокишечная метаплазия в отличие от других типо цилиндроклеточной метаплазии является фоном для развита

интраэпителиальной неоплазии, характеризуется нарастанием экспрессии р53, что дслаег ее upoiностически менее благоприятной;

• при развитии интраэпителиальной неоплазии на фоне ПБ усиливается экспрессия р53, увеличиваются уровни апопгоза и пролиферации, учитывая экспрессию Ki-67, происходит уменьшение экспрессии клаудинов в области плотных контактов, нарушается дифференцировка клеток;

• при развитии АК на фоне ИБ по сравнению с интраэпителиальной неоплазией увеличивается экспрессия р53, пролиферация и накопление клаудинов в цитоплазме, снижается апоптоз и накопление клаудинов в области ПК.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на кафедре патологической анатомии с курсом общей патологии лечебного факультета ММА имени И.М.Сеченова 6 ноября 2008 г. Результаты исследования докладывались и обсуждались на научных конференциях кафедры патологической анатомии, на Московском обществе патологоанатомов (ноябрь 2006), на 5-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, январь 2007 г.), на международном конгрессе Европейского общества патологов в Стамбуле (сентябрь 2007 г.), на международном медицинском форуме (февраль 2008 г.), на международной конференции иммуногистохимии и иммуноцитохимии в Гданьске (август 2008 г.), на международной конференции Европейского общества гастроэнтерологов (октябрь 2008 г).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в центральной печати.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 122 страницы машинописного текста, а также 11 страниц списка литературы. В работе использовано 6 таблиц, 17 гистограмм, 25 рисунков (из них 11 монтажей микрофотографий). Проанализировано 108 источников литературы, в том числе 15 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Исследование выполнено на материале эндоскопических биопсий и операционном материале. Обследовано 135 пациентов - 120 с ГЭРБ (средний возраст 44,7 лет) и 15 относительно здоровых добровольцев (средний возраст 46,8 лет). По результатам морфологического исследования (окраска гематоксилином-эозином и PAS-реакция) было отобрано 65 пациентов с различными вариантами ГЭРБ и АК пищевода, биопсии которых подверглись ИГХ исследованию (таблица 1). Всем проводилась эзофагогастродуоденоскопия с четырех-квадрантной биопсией слизистой оболочки дистального отдела пищевода (4 фрагмента, расположенные на 12, 3, 6, 9 часах на 2 см выше Z-линии, а также из отдельных очагов измененной слизистой). Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливался в парафин. С каждого блока готовились серийные парафиновые срезы (не менее 22 серийных срезов), толщиной 4-5 микрон. Срезы фиксировали на предметные стекла, покрытые адгезивом (полилизин, APES). По стеклу с каждого блока окрашивали гематоксилином-эозином и проводили PAS-реакцию для выявления бокаловидных клеток.

Таблица 1. Распределение нацистов, включенных в морфолошческое и последующее ИГХ исследование, по группам по типу морфологических изменений слизистой пищевода.

Группы Количество нациенгов

Мужчины Женщины Всего

группы кошроля (норма) 8 7 15

ГЭРБ-эзофагит 9 6 15

ГЭРБ-эзофагит, желудочная метаплазия 8 7 15

ГЭРБ-эзофагит, пищевод Барретта 11 7 18

Тонкокишечная метаплазия 5 4 9

Толстокишечная метаплазия 6 3 9

Интраэиителиальная неоплазия 6 4 10

Аденокарцинома 6 1 7

Всего 48 32 80

ИГХ реакции проводились на деиарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм, расположенных на стеклах, покрытых APES - слоем (Janice А., 1983). Демаскировка антигенов осуществлялась в микроволновой печи в растворе 10 шМ цитратного буфера (рН 6,0). В качестве первичных антител использовались поли- и моноклональные антитела к Кл 1, 2, 3, 4, 5 и 7 (Кл 1 1:100, Кл 2 1:100, Кл 3 1:50, Кл 4 1:100, Кл 5 1:100, Кл 7 1:100, Zymed), к Ki-67 (1:40, Dako Cytomation), р53 (1:50, Dako Cytomation), CK8 (rcady-to-use, Dako Cytomation) и CK10/13 (1:100, Dako Cytomation). Для метки вторичных антител использовался стрептовидин-биотиновый комплекс (SBK KIT, DAKO). Для визуализации месга связывания антитела с антигеном использовали пероксидазу хрена, в присутствии субстрата — перекиси водорода - и колориметрического реактива с 3,3-диаминобензидином (LSAB, Dako Cytomation). В качестве фонового окрашивания использовали гематоксилин.

Для выявления клегок вступивших в апоптоз применялся TUNEL-test (terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt)-mediated deoxyuridine triphosphate (d-

UTP) nick end labeling) в системе Enzo ApopDetek cell death assay system (Enzo Diagnostics, US). Тест основан на присоединении терминальной диоксинуклеотид-трансферазы к свободным З'-ОН концам ДНК, которые становятся доступными на ранних стадиях апоптоза в результате повышенной активности эндонуклеазы, разрезающей ДНК в данных участках.

Для ИГХ реакций ставили положительные (для Кл - ткань почки, для Ki-67, р53, СК8, СК10/13 и апоптоз - рак легкого) и отрицательные контроли (без первичных антител). Проводилась полуколичественная и количественная оценка результатов реакций.

Результаты ИГХ реакции для цитокератинов и Кл оценивались полуколичественным методом в баллах по количеству позитивно окрашенных клеток. Оценка интенсивности реакции проводилась по 6-ти балльной системе: 2 балла - до 20% окрашенных клеток; 4 балла - от 20 до 40% окрашенных клеток; 6 баллов - более 40% окрашенных клеток. Для Кл отдельно оценивалась локализация продукта реакции - мембранное и цитоплазматическое (диффузное) окрашивание, а также его интенсивность. При анализе результатов ИГХ Кл следует учитывать специфическую локализацию белка в области ПК, а также цитоплазматическую, свидетельствующую о синтезе и нарушенной транспортировке. Оценка экспрессии Ki-67 и р53 осуществлялась путем подсчета процента окрашенных ядер на 3000 клеток. Результаты ApopDetek теста представлены в виде промилей окрашенных клеток на 3000 клеток.

Статистический анализ результатов проводили при помощи программного пакета "SPSS 13 for Windows". Использовались методы нспараметрической статистики - для сравнения выраженности и активности изучаемых маркеров в основной и контрольной группах - (J-тест Манна-Уитни и тест Уайта для малых выборок (обработка результатов ИГХ анализа с малыми выборками был проведена вручную при помощи калькулятора и таблиц значений F). При оценке достоверности выявленных различий между средними значениями выборок и достоверности выявленной корреляции рассчитывалась вероятность ошибки р (р < 0,05).

Резулыагы исследования и их обсуждение.

Морфолошческая характерно ика ГЭРБ-эзофагша, пищевода Баррстта, интраэпителналыюй неоплазии и аденокарциномы на фоне пищевода Барретта.

Хронический эзофагит при ГЭРБ (15 наблюдений) характеризовался агрофией многослойного плоского эшпелия, баллонной дистрофией, выраженной в промежуточном и поверхностном слоях, инфильтрацией его нейтрофильными и эозинофильными лейкоцитами. При длшелыюм течении симптомов ГЭРБ в ряде случаев развивалась метаплазия многослойного плоского эпителия в железистый эпителий желудочного или кишечного типов.

ГЭРБ с ЖМ была обнаружена у 15 больных. При этом на фоне типичной каргины ГЭРБ-эзофагита выявлялись очаги, где многослойный плоский эпителий замещался цилиндрическим, в котором определялись париетальные, главные и добавочные клетки в железах. Покровный эпителий формировал типичные валики, покрытые покровно-ямочным эпителием желудочного типа. При этом железы были немногочисленны, сдавлены разрастаниями соединительной ткани и диффузным лимфоплазмоцитарным инфильтратом. Обнаруживалась ЖМ как фундального, так и кардиального типа.

ПБ нами выявлен у 18 больных и характеризовался наличием ГЭРБ-эзофагига, с фокусами КМ в нижней трети пищевода выше 7-линии, которые в отдельных наблюдениях сочетались с очагами ЖМ (в 3 случаях) В нашем исследовании, в соответствии с международной классификацией, случаи, имевшие только ЖМ не были включены в группу ПБ.

КМ характеризовалась замещением плоского эпителия пищевода кишечным, образующим виллезные складки. В составе клеток выстилавших структуры, напоминавшие кишечные крипты, определялись бокаловидные клетки. В ПБ выявлялась как ТнКМ, так и ТлКМ. ТнКМ (9 больных) отличалась от ТлКМ (9 больных) наличием в составе цилиндрического эпителия эндокринных клеток и клеток Панета

ИН в ПБ диагностирована у 10 пациентов. Во всех наблюдениях ИН развилась на фоне ТлКМ. ИН низкой степени выявлена в 7 случаях, она характеризовалась нарушением структуры крипт и клеточным атипизмом. Ядра эпителия гиперхромные, увеличены в размере. ИН высокой степени обнаружена у 3 пациентов, для нее характерен более выраженный тканевой и клеточный атипизм: структура крипт нарушается, становится ветвящейся, железы располагаются «спина к спине», выстланы полигональными клетками, которые теряют полярность, с большими гиперхромными ядрами и ядрышками, отмечается значительное увеличение ядерно-цитоплазматического отношения, встречаются мигозы.

АК на фоне ПБ была выявлена в 7 случаях. Наряду с опухолью определялись очаги ИН и ТлКМ, граничащие с фокусами ГЭРБ-эзофагита (4 случая). При гистологическом исследовании, опухоль представлен полиморфными клетками железистого эпителия с полигональными гиперхромными ядрами и ядрышками, выявляются множественные фигуры митоза. Клетки образовывали уродливые железистые структуры, местами инвазировапи базальную мембрану. Выявлялась умеренно (5 случаев) и низкодифференцированная (2 случая) тубулярная АК первой стадии прораставшая слизистую оболочку, подслизистый и мышечный слой.

Последовательность развития ЖМ и КМ подтверждается и клинико анамнестическими данными. Средний возраст наших пациентов с КМ состави 62 ± 13 лет, с ЖМ — 39 ± 15 лет. Разница в возрасте была статистичесю достоверной (р=0,005). Между возрастом и частотой КМ нами установлен прямая корреляционная связь (г=0,3, р=0,01). При ПБ наблюдалось боле длительное течение заболевания, чем у остальных больных с ГЭРБ. В среднем для развития ЖМ эпителия пищевода потребовалось от 2 до 10 лет течени заболевания, а для развития КМ от 5 до 14,5 лет. Различия в длительное™ заболевания были достоверными (р=0,008). Определялась прямая корреляционна связь продолжительности заболевания и развития II Б.

Рисунок 1. Экспрессия Кл 1 и 2 при различных вариантах ГЭРБ и в АК при ПБ (мембранное и цитоплазматическое окрашивание).

Иммунопероксидазная реакция В - ТлКМ и эзофагит при ПБ, Кл 1, х250 3-ГЭРБ-эзофагит, Кл 1, х350 в-ЖМиТнКМ приПБ, Кл 1,х150 г - ТнКМ и эзофагит при ПБ, Кл 2, х200 д - ТлКМ при ПБ, Кл 2, х250 е - ИН при ПБ, Кл 2, х400

□ мембрана В цитоплазма

□ мембрана ■ цитоплазма

ТнКМ ТлКМ

ТнКМ ТлКМ

Рисунок 2. Гистограммы среднего уровня экспрессии клаудинов 1,2,3,4,5,7 в эпителии пищевода при ГЭРБ, ПБ, ИН и АК на фоне а — Кл 1; б — Кл 2; в — Кл 3; г — Кл 4; д — Кл 5; е — Кл 7. Условные обозначения: ЛЭ — плоский эпителий

и

Иммуногистохимическая экспрессия К1-67

70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

о ПЭ

□ ПЭ ГЭРБ

□ ЖМ

□ КМ ■ ИН

И

виды эпителия в пищеводе

виды эпителия в пищеводе

Иммуногистохимическая экспрессия р53

1

1

■

т —

пг

нпэ

■ ПЭ ГЭРБ

□ ЖМ

□ ТнКМ

■ ТлКМ

■ ИН

□ АК

виды эпителия в пищеводе

Иммуногистохимическая экспрессия СК 8

Иммуногистохимическая экспрессия СК 10/11

Ш

виды эпителия в пищеводе

Иммуногистохимическая экспрессия Кл 1, СК8 и СК10/13 в е эпителии пищевода в норме и при ГЭРБ I——I

100% 90%

50% 40% 30% 20% 10% 0%

II

□ Кл 1 мемб ■ СК-8

□ СК-Ю/13

виды эпителия

Рисунок 3. Гистограммы среднего уровня Кл-67, апоптоза, р53 СК 10/13 и СК 8. Условные обозначения: ПЭ - плоский эпителий

Гипотеза морфогенеза АК на Фоне пищевода Барретта

Пищевод Барретта (Р53Т, К| 67Т, АроТ, СК 10/131, СК8Т $Кл-ММБ+++, Кл-ЦПЛ-

Дисплазия

(Р53ТТ, Ю 67ТТ, АроТТ, СК 10/1311, СК 8Т Кл-ММБ ++. Кл-ЦПЛ

М(ЩШ

(Р53ТТТ, К! 67ТТТ, АроТ, СК 8Т

пролиферация=Аро крушение диф-ки

£

пролиферация=Аро нарушение диф-ки появление клеточного атипизма

пролиферация»Аро нарушение диф-ки клеточный атипизм инвазивный рост

Рис. 4 Гипотеза морфогенеза АК на фоне ПБ.

Кл-мембранно, СК 10/13

пролиферация (Ю 67, РСЫА, р53) анеуплоидия, Сох2, Кп-цитопл.

апоптоз

Этапы неопластической прогрессии эпителия при развитии аденокарциномы на фоне пищевода Барретта

Мутации генов р53, р16, циклина О

рефлюкс-эзофагит без исжм

полная и неполная КМ

.л и аденокарцинома

ИН

.„,„,-.„„„„ высокой степени пдиишна низкои степени яшчЖШ

Рис. 5 Схема этапов неопластической прогрессии эпителия при развитии АК в ПБ.

Резюмируя результаты микроскопического исследования и анализа клинико-анамнесткческих данных можно заключить, что морфогенез А К на фоне ПБ является многоступенчатым процессом и включает следующие стадии хроническое воспаление в виде ГЭРБ-эзофаппа без и с ЖМ, Г1Б с ТнКМ и ТлКМ, ИН и инвазивную карциному на фоне Г1Б, что доказывается обнаружением \ одного пациента сочетания перечисленных изменений.

Иммуногистохимическая характеристика ГЭРБ-эзофагита, пищепола Барретта, интраэпитслиалыюй неоплазии и адепокарщшомы на фоне пищевода Баррегга.

Клаудины.

Маркер ПК Кл 1 при ГЭРБ обнаруживался как в виде мембранною (в области ПК), так и цитоплазматичсского окрашивания. Мембранная локализация Кл соответствует зонам ПК. Цитоплазматичсская локализация Кл, как и других мембранных белков, в условиях патологии (ГЭРБ, Г1Б, АК) может быть связана с усилением их синтеза в клетке и нарушением транспорта к базальной мембране. В плоском эпителии продукт реакции локализовался в мембране клеток. При ТнКМ и ТлКМ выявлялось, как правило, мембранное окрашивание, а в зоне ИН и АК -преимущественно цитоплазматическое Накопление Кл 1 в цитоплазме эпителиоцитов увеличивалось от КМ к ИН и АК (р<0,05), а мембранное окрашивание уменьшалось от КМ к ИН низкой степени и отсутствовало при ПН высокой степени и АК (р<0,05) (рис. 1 а, рис. 2 а, б, в).

Таким образом, можно предположить, что экспрессия Кл 1 как в плоском, так и железистом эпителии КМ в ПБ указывает на общность их происхождения, а также подтверждает теорию метапластической природы эпителия в ПБ.

Кл 2 выявлялся во всех видах эпшелия при ГЭРБ - в виде мембранного окрашивания, реже цитоплазматичсского окрашивания. Плоский эпителий пс экспрессировал Кл 2 В участках ТнКМ и ТлКМ выявлялось преимущественно мембранное окрашивание, в ИН и АК - циюплазматическое. Уровень экспрессии

Кл 2 в мембране и цшонлазме различался. Выявлено, что экспрессия Кл 2 в цшонлазме увелнчивае1ся ог ИН к АК (р<0,05), тогда как мембранное окрашивание уменьшается ог КМ к ИН низкой степени и отсу1ствует в ИН высокой степени и АК (р<0,05) (рис. 1 б, рис. 2 г, д, е).

В эпителии при ГЭРБ Кл 3, 4 и 7 определялись как в мембране, так и в цшонлазме. В плоском эпшелии Кл 3, 4 и 7 отсутствовали. В ТнКМ и ТлКМ выявлялось преимущес1венно мембранное окрашивание, в ИН и АК -преимущес1венно цитоплазма! ическое. Накопление Кл 3 в мембране и цитоплазме эиителиоциюв изменяется в зависимости от вида паюлогического процесса. При количественной оценке уровня экспрессии Кл 3 выявлено увеличение процента диффузно окрашенных клеток от КМ к ИН и к АК (р<0,05), югда как мембранное окрашивание уменьшалось от КМ к ИН и становилось минимальным в АК (р<0,05) (рис. 1 в, г, е).

Кл 5 в контрольной группе определялся в виде мембранного окрашивания эшероцитов. Данный маркер при ГЭРБ выявлялся во всех видах цилиндрического эпителия в виде мембранного и, реже, цитоплазматического окрашивания. Особенностью данного маркера являлось его выявление также в эндотелиальных кле1ках. Продукт реакции располагался как в цитоплазме, так и в мембране, в плоском эпителии Кл 5 отсутствовал. В ТнКМ и ТлКМ выявлялось преимущественно мембранное окрашивание, в ИН и АК - в основном цитоплазма тическое. Уровень экспрессии Кл 5 различался в мембранах и цшонлазме клеток' отмечено появление цитоплазматического окрашивания только в ИН и раке (р<0,01), тогда как мембранное окрашивание снижалось от КМ к ИН и становилсь минимальным в АК (р<0,01) (рис. 1 д).

Таким образом, переход от ИН низкой степени к высокой и к АК на фоне ПБ сопровождается исчезновением мембранного окрашивания Кл 1,2,3,4,5,7 и появлением цитоплазматического окрашивания, чю, вероятно, свидетельствует о синтезе данного белка в цшонлазме и нарушении ею транспортировки в зону ПК.

Кл 4,5,7 выявлялись в виде диффузного и латерального окрашивания только и дисплазии и АК в Г1Б

Обобщение полученных результатов и данных литературы, позволяе! нам выдвинуть гипотезу о роли Кл в морфогенезе АК на фоне ПБ, согласно ко юрой морфогенез являс!ся многостадийным процессом. По мерс нрогрессировання КМ и развития ИН, а затем АК теряется апикальное окрашивание Кл и появляется диффузное, которое отражает нарушения в образовании ПК. Отсутствие ПК в ЛК - путь к повышению пролиферации, появлению клеточного атипизма и инвазивному росту. Следовательно, можно заключить, что в ИН и АК одним из проявлении клеточного атипизма опухолевых клеток является потеря ими ПК Известно, что влияние ПК на дифференцировку клеток, их пролиферативную ак| явность и подвижность. Молекулы Кл продолжают синтезироваться опухолевыми клетками, но, по-видимому, не достигают зон ПК, поэтому при данной патологии их экспрессия возрастает в цшоплазме клетки, а не в апикальной части мембраны.

Переход от ИН низкой степени к высокой и к АК на фоне ПБ сопровождается потерей ПК, что проявляется исчезновением аиикально! о окрашивания Кл 1,2,3,4,5,7, при этом параллельно усиливается цигоплазматическое окрашивание за счет накопления вышеупомянутых Кл Потеря способности аккумулировать Кл в области плотных контактов в АК при ПБ приводит к исчезновению ПК и способствует профессии опухоли (пролиферации, инвазии и метастазированию).

Маркеры ПК Кл 1,2,3,4,5,7 могут быть рекомендованы для определения злокачественною потенциала дисплазии при ПБ, а также для различения нормального эпителия желудка и желудочной метаплазии в пищеводе

Пролиферация и апонтоз. Мутантный р53.

Маркер пролиферации Ю-67 определялся в разных количествах в вице коричневого окрашивания ядер базального слоя плоского эпителия, как в контрольной, так и в основной группе. В группе ГЭРБ-эзофагита без метаплазии отмечено повышение пролиферативного индекса в эпигелиоцитах по сравнению с плоским эпителием в норме (р<0,05) Пролифера!ивный индекс возрастав! ч

КМ, и ИН и достигает наибольшего уровня в АК на фоне 11Б (р<0,05) (рис. 3 а). 11ри этом в АК его экспрессия максимальна.

Таким образом, усиление пролиферации клеюк в ряду ог ГЭРБ-эзофагша, ГЭРБ-эзофанпа с ЖМ, ПБ, ИН и АК пищевода косвенно может свидетельствовать о прогрессивном нарастании нарушений регуляции клеточного роста. Достоверное увеличение уровня экспрессии К1-67 (р<0,05) от КМ к ИН и АК на фоне ПБ может бьпь рекомендовано для дифференциальной диагностики данных процессов.

Апоптозные тельца обнаруживались во всех группах исследуемых образцов в виде телец коричневого цвета. Уровень апоптоза был низким как в плоском эпителии пищевода контрольной гругшы, так и при ГЭРБ-эзофагите, включая очаги ЖМ. (рис. 3 б).

Усиление апопгоза наблюдалось при развитии КМ и ИН (р<0,05). При ИН высокой степени и в ггреиарашх АК апоптоз снижался, что отражает нарушение механизмов клеточного контроля.

При сопоставлении уровней пролиферации и апоптоза в исследуемых г руинах выявлено нарастание пролиферации и апоптоза в ряду от КМ к ИН. На этапе развития АК пролиферация продолжает неуклонно расти, тогда как апоптоз немного снижается. Такие изменения в балансе между пролиферацией и аноптозом приводят к накоплению му таций в опухолевых клетках, к прогрессии опухоли

Прогрессия изменений в ряду от ИН в ПБ до АК на фоне Г1Б сопровождается относительным снижением индекса апопгоза опухолевых клеток и повышением уровня пролиферации, оценивая экспрессию К1-67.

Онкомаркер мугантный р53 при ИГХ обнаруживался в КМ, ИН и АК и не выявлялся в плоском эпителии контрольной гругшы и при ГЭРБ без метаплазии и с ЖМ. Уровень экспрессии р53 в ТнКМ достоверно ниже, чем в ТлКМ (р<0,05). При подсчете среднего уровня экспрессии установлены максимальные баллы в АК при ПБ, средние значения при ИН и минимальные значения при ПБ. Таким

образом, экспрессия р53 существенно увеличивалась при прогрсссированин ИН и становится максимальной при развитии АК (р<0,01) (рис. 3 в).

Полученные данные могу г свидетельствовать, что мутации в гене ТР-53 уже регистрируются на стадии КМ в отдельных клетках, т.к. известно, что НГХ выявляет р53 - продукт мутантного гена. В ходе опухолевой прогрессии значительно увеличивается количество клеток с мутациями в гене ТР-53, что может быть полезно для ранней дна! ностики ИН и АК на фоне ПБ.

Таким образом, определение уровня пролиферации клегок по ¥Л-(П и наличие и количество белка р53 помогает дифференцировать степени ИН и прогнозировать течение заболевания, т.е. во?можную мапигнпзацию и опстпь злокачественный потенциал опухоли.

ИН эпителия в ПБ характеризуется сочетанием клеточного атипизма с высокой экспрессией ¥л-(Л, Р53 и сопровождается увеличением апоптоза Переход от ИН к АК на фоне ПБ сопровождается усилением пролиферации, исходя из показателей экспрессии К1-67 н р53, и относительным снижением апоптоза, что отражает нарушения в механизмах клеточного коп фоля, противоопухолевой защиты клеток.

Проведенное исследование показало, что канцерогенез АК на фоне ПБ характеризуется изменениями в соотношении между процессами пролиферации и апоптоза Рост АК обеспечивается, по всей видимости, не столько увеличением пролиферации опухолевых клеток, сколько уменьшением их гибели пугсч апоптоза.

Цитокератины.

Маркер плоскоклеточной дифференцировки СК-10/13 эксггрсссировался в клетках плоского эпителия. Реакция на данный маркер в клетках цилиндрического эпителия (при ЖМ, КМ) и ИН слабо положительна. В клетках АК антигены не выявлялись. При подсчете среднего уровня экспрессии СК10Ш максимальный уровень маркера выявлен в плоском эпителии контрольной группы и у больных ГЭРБ без метаплазии. В железистом эпителии - ЖМ и КМ, данный

маркер также выявлялся в небольших количествах, повышался от желудочной к КМ, снижался при ИН и исчезал в АК (р<0,05) (рис. 3 г).

СК8 низкомолекулярный цитокерагин, выявляющийся в клетках железистого эпителия. Маркер определялся в мембране и цитоплазме во всех видах исследуемого эпителия. Плоский эпителий контрольной группы и группы ГЭРБ-эзофагит экспрессирует СК8, причем в норме экспрессия маркера выше, чем при эзофаште. В цилиндрическом эпителии при ЖМ и КМ экспрессия СК 8 максимальна. Данный маркер также выявляется на высоком уровне в ИН и АК при ПБ (р<0,01) (рис 3 д).

Анализ полученных данных показывает, что маркеры плоского и железистого эпителия обнаруживаются в разных соотношениях во всех видах эпителия в ПБ. Экспрессия СК 10/13, СК 8 и Кл 1 в плоском эпителии в норме, при эзофагше и в очагах цилиндроклеючной метаплазии может свидетельствовать об общности их происхождения из мультипотентной тканевой клетки предшественницы (рис 3 е).

Обобщая полученные данные, нами выдвинута гипотеза патогенеза АК на фоне Г1Б. Патогенез развития карциномы в Г1Б является многоступенчатым процессом. На первом этапе при повреждении стенки нижней трети пищевода рефлюктатом развивается эзофагит - воспаление слизистой пищевода, выстланной неороговевающим плоским эпителием. В ходе репарации поврежденного эпителия происходит нарушение дифференцировки тканевой клетки-предшественницы с формированием цилиндроклеточной метаплазии в нижней трети пищевода - ЖМ и КМ. Цилиндрический эпителий более устойчив к кислой среде желудочною рефлюкса. Следует предположить, что ЖМ является предшественницей КМ, т.к. ЖМ и КМ практически не отличаются но экспрессии маркеров дифференцировки. При развитии КМ (ПБ) усиливаются процессы пролиферации и апоигоза в метаплазированном эпителии (ИГХ определяется увеличение экспрессии К1-67 и количества апоптозных телец), начинают накапливаться мутации, что офажаегся в появлении экспрессии мутантного р53, нарушается клепочная дифференцировка (в КМ экспрессируюгся маркеры

плоского эпителия - СК 10/13, Кл 1, а также цилиндрического эпителия - СК 8) Изменения еще не затрашваюг функционирование плотных контакюв, чю подтверждается специфической экспрессией Кл в апикальной части мембран клеюк цилиндрического эпителия и отсутствием цигоплазматической. На данном этапе имеются начальные нарушения в дифференцировке клеток и усиление пролиферации, сбалансированной увеличением апогпоза. На следующем этапе -этапе развития ИН в очагах ТлКМ - отмечается дальнейшее возрастание уровня экспрессия К1-67 и мутантного р53, отражающих усиление пролиферации эпителиоцитов, а также увеличивается уровень аноптоза. Имеются признаки нарастания нарушений дифференцировки клеюк, появляется клеточный ашпизм, а также изменяются и ПК В очагах ИН Кл обнаружнвакнея в цитоплазме клеток, где они не несут функциональной нагрузки, в то время как в цигоплазматической мембране их накопление понижается. На последующем этапе - развития АК на фоне ПБ - обнаруживается дисбаланс между процессами пролиферации и апоптозом эпителия, в пользу пролиферации. Это ведет к накоплению н сохранению мутаций, к появлению опухолевых клонов, и, следовательно, к опухолевой прогрессии На данном этапе резко возрастает экспрессия К1-67, р53, снижается уровень апоптоза, возрастает циюплазматическая экспрессия Кл и резко снижается мембранная, что отражает усиление проявлений клегочною атшшзма. Потеря ПК в АК способствует инвазивному росту и мегастазировапию опухоли (рис. 4).

Резюмируя все вышеизложенное, этапы канцерогенеза АК на фоне ПБ можно представить в виде следующих стадийных изменений, сопровождающихс я молекулярными перестройками, ведущими к дисбалансу между процессами пролиферации и апоптоза, нарушениям дифференцировки клеюк и межклеточным взаимодействиям (рис. 5):

1. хроническое воспаление с развитием ГЭРБ-эзофаг ита;

2. репарация эпителия пищевода в очагах повреждения;

3. диерегенерация эпителия с развитием ЖМ;

4. диерегенирация эпителия с развишем КМ — ПБ;

5. ишраэишелиальнаи неоплазии в очагах ТлКМ в ПБ;

6. АК на фоне ПБ.

Выводы:

1. Пищевод Баррепа можно считать ключевым эшпом канцерогенеза аденокарциномы пищевода В пищеводе Барретта закономерно развиваются тонкокишечная метаплазия, [олстокишечная метаплазия и интраэнителиальная неонлазия, возникающая только на фоне толстокишечной метаплазии, а также аденокарцинома.

2. При злокачественной трансформации эпителия в пищеводе Баррепа нарушается баланс между процессами пролиферации и аноптоза. Переход от интраэпигелиальной неоплазии к аденокарциноме сопровождается относительным снижением индекса аношоза опухолевых клеток и повышением уровня пролиферации, судя но экспрессии К>67 и р53.

3. В пищеводе Баррепа нарушается дифференцировка эпителиальных клеток, эксгтрессирующих одновременно маркеры железттстой и плоскоклеточной дифференцировки - Кл 1, СК8 и СК10/13.

4. Злокачест ветшая трансформация эпителия в пищеводе Барретта сопровождается потерей плотных контактов, судя по экспрессии клаудинов. Переход от кишечной метаплазии к интраэпигелиальной неоплазии сопровождается исчезновением апикального окрашивания Кл 1,2,3,4,5,7 и появлением цитоплазматическото окрашивания, что, вероятно, свидетельствует о наличии данного белка в неактивной форме. Потеря способности аккумулировать клаудины в области плотных контактов в аденокарциноме на фоне ПБ приводит к исчезновению плотных контактов и способствует прогрессии опухоли (пролиферации, инвазии и мегастазированию).

5. Толстокишечная метаплазия в пищеводе Барретта отличается от тонкокишечной метаплазии наличием более высокой экспрессии р53 и развитием на ее фоне инграэпителиальной неоплазии.

6. Переход от ншраэпителиальной неоплазии к аденокарциноме в пищеводе Баррепа сопровождается относительным снижением индекса аноптоза

опухолевых клеток и повышением уровня пролиферации, судя по экспрессии Ki-67 и р53, а также исчезновением апикалыюю окрлпншания Кл 1.2,3,4,5,7 и появлением цитоплазматического окрашивания

7. Особенности экспрессии клаудинов и цитокерагинов в желудочном и кишечном эпителии, а также оча1ах кишечной метаплазии в ПБ и в желудке при хроническом атрофическом гастрите подтверждают развитие ПБ in гипотетической клетки-предшественницы плоскою эпшелия путем метаплазии.

8. Маркеры апоптоза, пролиферации, клеточной дифференцировкн и плотных межклеточных контактов - Apodelec test, Ki-67, р53, СК 10/13, СК 8 и клаудины 1,2,3,4,5,7 могут быть рекомендованы для определения злокачественного потенциала интраэпителиальной неоилазии в пищеводе Барретта.

9. Отличия в экспрессии Кл 3,4 и 5 между желудочным эпителием и ЖМ п ПБ moiут быть использованы для дифференциальной диагностики в биоисииипм и операционном материале.

Список pu6oi, опубликованных но теме диссертации

1 Кардашева С С., Трухманов А С , Демура Т А, Коньков М.Ю , Склянская О А , Koian Е.А., Ивашкин ВТ. «Клиническая картина, факторы риска и иммуношстохимические маркеры при пищеводе Барретта»//Российский журнал гастроэнтерологии, гепаюлогии и колопроктологии, 2008, №3, с 15-24

2 Кардашева С С., Коган Е А , Ивашкин В Т Склянская О А., Демура Т А , Трухманов А С «Развитие дисплазии и рака при эзофагите и пищеводе Барретта клинико-морфологические параллели» //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии, 2006, №3, с.4-11.

3 Кардашева С.С., Склянская О.А., Демура Т.А., Коньков М.Ю., Трухманов А.С., Коган Е.А., Ивашкин В Т «Клинико-морфологические параллели при разных вариантах истроэзофагеальной рефлюксной болезни и аденокарциноме пищевода»//Российский журнал гаароэнтерологии, гепагологии и колопроктологии, 2005, №5, с 8

4 Демура Т А «Роль молекул межклеточных контактов в развитии пищевода Барретта и аденокарциномы»//Тезисы работ участников конкурса на лучший инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных ВУЗов (медицинское и фармацевтическое образование) в рамках реализации «Программы формирования инновационного образовательного пространства ММА им И М Сеченова», Москва, 2007, с 62-63.

5 Демура Т.А., Склянская О А , Кардашева С.С. «Патогенетическое обоснование фогодинамической терапии при пищеводе Барретта»//Российский биотерапевтический журнал, 2007, №1, с.14.

6 Трухманов А С , Кардашева С.С , Склянская О.А , Коган Е А., Демура Т.А. «Высокие медицинские технологии в диагностике и прогнозировании исхода терапии предопухолевых заболеваний пищевода»//Материалы II Всероссийской научно-практической конференции «Высокие медицинские технологии», Москва 25-26 сентября 2007, с.108-109.

7 Demura Т , Kogan Е., Moll R «Tight junction molecules in pathogenesis of Barrett's esophagus and adenocarcinoma of the esophagus»//Folia Histochemica et Cytobiologica, 2008.46(S2). S40

8 Demura Т., Kardasheva S, Kogan E, Sklyanskaya O., Ivashkin V., Paltcev M. «Adenocarcinoma (AC) and intraepithelial neoplasia of the esophagus (EIN), Barrett's esophagus (BE) molecular and morphological markers P53, Ki67, CK8, CK10/13 and apoptosis»//Virchow Archive 2007,451 №2: P 220-221.

9 Kardasheva S, Trukhmanov A., Ivashkin V , Konkov M, Demura Т., Sklyanskaya O., Kogan E «РР1 treatment leads to decrease of elevated cell proliferation and increase of apoptotic index in Barrett's esophagus»// Gut, 2008' 57 (SuppI II) A110.

Список сокращении

AK - аденокарцииома

ГЭРБ - гастроззофатсальпая рефлюксная болезнь ЖМ - желудочная метаплазия

ИГХ - иммуногистохимия, иммуногистохнмическии

ПН - интраэпитслиальная нсоплазня

Кл - клаудимы

КМ - кишечная метаплазия

ПБ - пищевод Барретта

ПЖС - иищеводножелудочное соединение

ПК - плотные контакты

ПЭ - плоскии эпителии

ТнКМ - топко-кишечная металла шя

ТлКМ - толсто-кишечная метаплазия

Отпечатано в типографии ООО «Оперативная полиграфия» Москва, пр-т Вернадского, д. 39 Тел.: 645-63-49

Пищевод Барретта (ПБ) — заболевание нижней трети пищевода, развивающееся при длительном течении гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) и характеризующееся метаплазией многослойного плоского неороговевающего эпителия в цилиндрический кишечного типа. ПБ в ряде случаев осложняется развитием дисплазии и аденокарциномы (АК).

Актуальность проблемы связана с ростом заболеваемости ГЭРБ, ПБ и АК пищевода. По данным ВОЗ ПБ выявляется при эндоскопическом исследовании примерно у 10-20% людей с симптомами ГЭРБ. [50]. Такое различие в показателях заболеваемости ПБ связано с одной стороны с трудностями диагностики данной патологии при обследовании, т.к. метаплазия носит очаговый характер и может не визуализироваться при эзофагогастроскопии, а также - с бессимптомным течением подобных изменений. Данные предположения подтверждаются при исследовании аутопсийного материала, в котором выявляется достаточно высокая распространенность бессимптомной метаплазии пищевода среди населения [29, 78].

По данным РОНЦ им. Блохина, риск развития АК на фоне ПБ в 30125 раз выше, чем среди всего населения (Давыдов М.И. и соавт., 2003) [2]. Прогнозируется, что у 7-15% больных с ПБ при первичном эндоскопическом обследовании, будет диагностирована АК [107].

Соотношение мужчин и женщин с АК пищевода составляет 7 к 1, чаще всего это поражение развивается у лиц белой расы, средний возраст больных составляет 65 лет [50]. Данная опухоль крайне редко обнаруживается на ранних стадиях заболевания, т.к. они протекают бессимптомно. Операбельность на момент установления диагноза обычно не превышает 50% [13], а пятилетняя выживаемость при АК пищевода составляет менее 15%, особенно если опухоль прорастает мышечную пластинку и/или в процесс вовлечены лимфатические узлы [1]. К моменту постановки диагноза рака пищевода лимфатические узлы поражаются в 30-75%. Если же АК диагностирована на ранней стадии, когда опухоль не прорастает за пределы подслизистого слоя, 5-летняя выживаемость значительно увеличивается и составляет 63% [95]. По данным ВОЗ за 2000 г., частота АК пищевода каждый год возрастает на 5-10%, что превышает аналогичные показатели при всех других формах рака [50]. Единственной возможностью повышения выживаемости при АК пищевода является выявление предраковых изменений в пищеводе. Но даже при микроскопическом исследовании морфологические проявления дисплазии не всегда очевидны. Для объективизации диагностики диспластических изменений пищевода необходимо внедрение в практику молекулярных и иммуногистохимических (ИГХ) методов исследования, основанных на изучении экспрессии онкомаркеров. Однако по данным разных авторов экспрессия онкомаркеров не всегда однозначно коррелирует с развитием рака на фоне ПБ [27, 31].

Предполагают, что ПБ является ключевым этапом изменения эпителия на пути прогрессии к АК пищевода. В литературе сообщается об изменениях отдельных онкомаркеров, которые могут участвовать в канцерогенезе при ПБ. Так известно, что при интраэпителиальной неоплазии (ИН) на фоне ПБ изменяется экспрессия генов супрессоров опухолевого роста (р53, р16, FHLT, Rb, АРС), генов регуляторов клеточного цикла (Cyclin Dl, MDM2), факторов роста (EGF-R, TGF-A, с-егЬВ2), молекул клеточной адгезии (E-cadherin, P-cadherin, a-catenin, (3-catenin), а также протеаз (UPA) [41].

При развитии ИН в ПБ изменяется и пролиферация эпителиальных клеток. Hong МК и Laskin WB с соавт. установили, что экспрессия Ki-67 коррелирует с гистологическим типом ПБ и может рассматриваться как дополнительный показатель клеточной дифференцировки и наличия ИН. Однако только по уровню пролиферации клеток невозможно достоверно дифференцировать дисплазию, рак и очаг хронического воспаления [56].

Данные о влиянии апоптоза на опухолевую прогрессию при ПБ неоднозначны. Получены противоречивые результаты показывающие как повышение, так и понижение уровня апоптоза в ПБ [49]. Важную роль играет соотношение апоптоза и пролиферации.

Другим важным показателем клеточной стабильности и дифференцировки являются плотные контакты (ПК). ПК - вид межклеточного соединения мембран эпителиальных и эндотелиальных клеток. Они осуществляют прочную механическую связь клеток и препятствуют транспортировке веществ по межклеточным пространствам. Ключевыми молекулами ПК являются клаудины (Кл) - семейство интегральных мембранных белков [48].

Остается неизученной качественная и количественная характеристика ПК в ИН различной степени на фоне ПБ. До сих пор не определены точные молекулярные механизмы развития ПБ, ИН и АК пищевода. Нет четкого понимания, какие изменения на молекулярно-генетическом уровне способствуют переходу от кишечной метаплазии (КМ) к ИН.

Резюмируя данные литературы, следует отметить, что молекулярные механизмы развития ПБ, ИН и АК пищевода остаются недостаточно изученными. Нет четкого понимания того, что происходит с клеточным делением и по какой причине не эффективен апоптоз в отношении образовавшихся опухолевых клеток. Непонятно, какие изменения на молекулярно-генетическом уровне способствуют переходу от КМ к ИН. Описаны случаи длительного существования у пациентов ИН без перехода в рак in situ [108]. Отсутствует описание молекулярных патогенетических изменений и стадий перехода от метаплазии до рака. Еще более ненадежны диагностические критерии для ИН низкой и высокой степени, что затрудняет диагностику ранних стадий злокачественной трансформации в ПБ и приводит к низкой выживаемости больных при данной патологии.

В соответствии с поставленными вопросами сформулированы цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: изучить морфологические и молекулярные аспекты морфогенеза и патогенеза пищевода Барретта как предракового состояния.

Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:

1. изучить морфогенез АК на фоне ПБ, от стадии ГЭРБ-эзофагита, до КМ, ИН и АК на фоне ПБ;

2. оценить соотношение процессов пролиферации и апоптоза на разных стадиях морфогенеза АК на фоне ПБ;

3. оценить по маркерам дифференцировки нарушения процессов созревания эпителиальных клеток при КМ, ИН и АК на фоне ПБ;

4. изучить изменения ПК по экспрессии Кл на разных стадиях морфогенеза АК на фоне ПБ;

5. сравнить ИГХ особенности диагностики КМ, ИН и АК на фоне ПБ и составить гипотетическую схему канцерогенеза АК на фоне ПБ.

Научная новизна.

Новизна диссертационной работы связана с тем, что представлены и охарактеризованы этапы опухолевой прогрессии АК на фоне ПБ.

Автором установлены молекулярно-биологические особенности КМ, ИН и АК на фоне ПБ и выявлено достоверное повышение пролиферации и апоптоза в ряду от желудочной метаплазии (ЖМ) к КМ и ИН на фоне ПБ. На этапе перехода от ИН к АК на фоне ПБ отмечается повышение пролиферации, тогда как апоптоз снижается, что обеспечивает рост и прогрессию карциномы и является прогностически неблагоприятным признаком.

Впервые обнаружены отличия в экспрессии р53 толстокишечной метаплазии (ТлКМ) от других типов цилиндроклеточной метаплазии. Автором установлено, что ТлКМ является фоном для развития ИН и характеризуется экспрессией мутантного р53, что делает ее прогностически менее благоприятной. Полученные данные изменения уровня пролиферации, апоптоза и р53 помогают прогнозировать течение ПБ и ИН при ПБ, что существенно для решения вопроса о хирургическом лечении таких пациентов.

Обоснована метапластическая теория происхождения цилиндрического эпителия из тканевой мультипотентной клетки-предшественницы, общей для плоского и цилиндрического эпителия, что подтверждается наличием экспрессии в ПБ маркеров плоского (СК 10/13 и Кл 1) и цилиндрического эпителия (СК 8, Кл 2, 3, 4, 5, 7).

Практическая значимость

Полученные данные целесообразно использовать в практическом здравоохранении при проведении диагностики ИН при ПБ, для определения риска развития АК и для выбора тактики лечения больных.

Практическая значимость работы также связана с установлением молекулярных маркеров для дифференциальной диагностики между цилиндрическим метапластическим эпителием в ПБ и желудочным эпителием в биоптатах пищевода. Маркеры ПК Кл 1, 2 и 7 выявляются в КМ ПБ и не определяются в желудочном эпителии.

Материалы диссертации используются в практической работе при анализе биопсийного материала на кафедре патологической анатомии с курсом общей патологии и кафедре пропедевтики внутренних болезней ГОУ ВПО ММА имени И.М. Сеченова.

Положения, выносимые на защиту

1. Морфогенез АК на фоне ПБ является многоступенчатым процессом и включает следующие стадии: хроническое воспаление в виде ГЭРБ-эзофагита без и с желудочной метаплазией, пищевод Барретта с тонкокишечной и толстокишечной метаплазией, интраэпителиальная неоплазия и инвазивная карцинома на фоне ПБ, что доказывается обнаружением у одного пациента сочетания перечисленных изменений.

2. Опухолевая прогрессия от стадии цилиндроклеточной метаплазии до стадий интраэпителиальной неоплазии низкой и высокой степени и развития АК на фоне ПБ сопровождается потерей плотных контактов, что проявляется уменьшением вплоть до полного исчезновения экспрессии Кл 1,2,3,4,5,7 в апикальной мембране и усилением их накопления в цитоплазме эпителиоцитов.

3. Опухолевая прогрессия при АК на фоне ПБ сопровождается нарушениями баланса между процессами пролиферации и апоптоза, что подтверждается изменениями экспрессии Ki-67, р53 и индекса апоптоза. Установлено повышение уровней пролиферации и апоптоза в цилиндрическом эпителии от стадии желудочной метаплазии, до кишечной метаплазии и интраэпителиальной неоплазии. Переход от интраэпителиальной неоплазии к АК в ПБ сопровождается усилением пролиферации и относительным снижением апоптоза.

4. Экспрессия СК 10/13, СК 8 и Кл 1 в плоском эпителии в норме и при эзофагите, и в очагах цилиндроклеточной метаплазии может свидетельствовать об общности их происхождения из мультипотентной тканевой клетки предшественницы.

5. Опухолевая прогрессия АК на фоне ПБ характеризуется следующими особенностями:

• толстокишечная метаплазия в отличие от других типов цилиндроклеточной метаплазии является фоном для развития интраэпителиальной неоплазии, характеризуется нарастанием экспрессии р53, что делает ее прогностически менее благоприятной;

• при развитии интраэпителиальной неоплазии на фоне ПБ усиливается экспрессия р53, увеличиваются уровни апоптоза и пролиферации, учитывая экспрессию Ki-67, происходит уменьшение экспрессии клаудинов в области плотных контактов, нарушается дифференцировка клеток;

• при развитии АК на фоне ПБ по сравнению с интраэпителиальной неоплазией увеличивается экспрессия р53, пролиферация и накопление клаудинов в цитоплазме, снижается апоптоз и накопление клаудинов в области ПК.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на кафедре патологической анатомии с курсом общей патологии лечебного факультета ММА имени И.М.Сеченова 6 ноября 2008 г. Результаты исследования докладывались и обсуждались на научных конференциях кафедры патологической анатомии, на Московском обществе патологоанатомов (ноябрь 2006), на 5-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, январь 2007 г.), на международном конгрессе Европейского общества патологов в Стамбуле (сентябрь 2007 г.), на международном медицинском форуме (февраль 2008 г.), на международной конференции иммуногистохимии и иммуноцитохимии в Гданьске (август 2008 г.), на международной конференции Европейского общества гастроэнтерологов (октябрь 2008 г).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в центральной печати.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 120 страницы машинописного текста, а также 11 страниц списка литературы. В работе использовано 6 таблиц, 18 гистограмм, 26 рисунков (из них 11 монтажей микрофотографий). Проанализировано 108 источников литературы, в том числе 15 отечественных.

Выводы:

1. Пищевод Барретта можно считать ключевым этапом канцерогенеза аденокарциномы пищевода. В пищеводе Барретта закономерно развиваются тонкокишечная метаплазия, толстокишечная метаплазия и интраэпителиальная неоплазия, возникающая только на фоне толстокишечной метаплазии, а также аденокарцинома.

2. При злокачественной трансформации эпителия в пищеводе Барретта нарушается баланс между процессами пролиферации и апоптоза. Переход от интраэпителиальной неоплазии к аденокарциноме сопровождается относительным снижением индекса апоптоза опухолевых клеток и повышением уровня пролиферации, судя по экспрессии Ki-67 и р53.

3. В пищеводе Барретта нарушается дифференцировка эпителиальных клеток, экспрессирующих одновременно маркеры железистой и плоскоклеточной дифференцировки — Кл 1, СК8 и СК10/13.

4. Злокачественная трансформация эпителия в пищеводе Барретта сопровождается потерей плотных контактов, судя по экспрессии клаудинов. Переход от кишечной метаплазии к интраэпителиальной неоплазии сопровождается исчезновением апикального окрашивания Кл 1,2,3,4,5,7 и появлением цитоплазматического окрашивания, что, вероятно, свидетельствует о наличии данного белка в неактивной форме. Потеря способности аккумулировать клаудины в области плотных контактов в аденокарциноме на фоне ПБ приводит к исчезновению плотных контактов и способствует прогрессии опухоли (пролиферации, инвазии и метастазированию).

5. Толстокишечная метаплазия в пищеводе Барретта отличается от тонкокишечной метаплазии наличием более высокой экспрессии р53 и развитием на ее фоне интраэпителиальной неоплазии.

6. Переход от интраэпителиальной неоплазии к аденокарциноме в пищеводе Барретта сопровождается относительным снижением индекса апоптоза опухолевых клеток и повышением уровня пролиферации, судя по экспрессии Ki-67 и р53, а также исчезновением апикального окрашивания Кл 1,2,3,4,5,7 и появлением цитоплазматического окрашивания

7. Особенности экспрессии клаудинов и цитокератинов в желудочном и кишечном эпителии, а также очагах кишечной метаплазии в ПБ и в желудке при хроническом атрофическом гастрите подтверждают развитие ПБ из гипотетической клетки-предшественницы плоского эпителия путем метаплазии.

8. Маркеры апоптоза, пролиферации, клеточной дифференцировки и плотных межклеточных контактов - Apodetec test, Ki-67, р53, СК 10/13, СК 8 и клаудины 1,2,3,4,5,7 могут быть рекомендованы для определения злокачественного потенциала интраэпителиальной неоплазии в пищеводе Барретта.

9. Отличия в экспрессии Кл 3,4 и 5 между желудочным эпителием и ЖМ в ПБ могут быть использованы для дифференциальной диагностики в биопсийном и операционном материале.

Заключение

ПБ является ключевым этапом изменения эпителия на пути прогрессии к АК пищевода. Из литературы известно, что в канцерогенезе ПБ принимают участие множество генов супрессоров опухолевого роста (р53, р16, FHIT, Rb, АРС), регуляторов клеточного цикла (Cyclin D1, MDM2), факторов роста (EGF-R, TGF-A, с-егЬВ2) и молекул клеточной адгезии (E-cadherin, P-cadherin, a-catenin, p-catenin), а также протеаз (UPA) [41]. На основании полученных результатов и данных литературы нами установлена последовательность молекулярно-генетических изменений происходящих в прогрессии ПБ, ИН и АК пищевода. При развитии ИН в ПБ усиливается экспрессия р53, увеличивается апоптоз, развивается гиперметилирование р16, усиливается экспрессия факторов роста (EGF), увеличивается пролиферация, учитывая экспрессию Ki-67, происходит уменьшение экспрессии молекул клеточной адгезии и молекул плотных контактов (Кл), нарушается дифференцировка клеток. При прогрессии ИН до АК пищевода максимально экспрессируются онкомаркеры, происходит потеря гена Rb, мутации в АРС, клетки теряют гетерозиготность по некоторым аллелям, нарастает пролиферация, увеличивается количество факторов роста (EGF-R, TGF-A, с-егЬВ2), снижается апоптоз, происходит исчезновение или изменение экспрессии молекул клеточной адгезии и ПК.

Глава 4. Общее заключение

Результаты проведенного исследования и анализ данных литературы показывают, что длительное течение ГЭРБ может приводить к последовательным изменениям слизистой нижней трети пищевода. На первом этапе, под воздействие повреждающих факторов в пласте плоского эпителия развивается хроническое воспаление в виде ГЭРБ-эзофагита (15 случаев). При продолжающемся ГЭР нарушается дифференцировка покровного эпителия, что приводит к развитию метаплазии многослойного плоского эпителия в цилиндрический, который является более устойчивым к кислому или щелочному рефлюксу, т.к. способен продуцировать защитную слизь. Метаплазия возникает, судя по данным литературы [95], за счет нарушения дифференцировки тканевой мультипотентной стволовой клетки предшественницы общей для железистого и плоского эпителия.

Цилиндроклеточная метаплазия при ГЭРБ-эзофагите может быть желудочного и кишечного типов. Судя по обнаруженным нами морфологическим изменениям, в начале появляется ЖМ (15 случаев), которая может прогрессировать до кишечной КМ (18 случаев) — ПБ. При этом, как показало наше исследование, нередко обнаруживается сочетание ЖМ и КМ у одного пациента. В свою очередь, КМ при ПБ может быть двух типов — тонкокишечная (9 случаев) и толстокишечная (9 случаев). Последняя менее разнообразна в плане дифференцировки клеток, более примитивна, является фоном для развития дисплазии или ИН (10 случаев) и прогностически менее благоприятна по сравнению с ТнКМ.

АК на фоне ПБ нами обнаружена в 7 случаях, наряду с опухолью определялись очаги ИН и ТлКМ, граничащие с фокусами ГЭРБ-эзофагита (4 случая).

Последовательность развития ЖМ и КМ подтверждается и клинико-анамнестическими данными. Средний возраст наших пациентов с КМ составил 62 ± 13 лет, с ЖМ - 39 ± 15 лет. Разница в возрасте была статистически достоверной (р=0,005). Между возрастом и частотой КМ нами установлена прямая корреляционная связь (г=0,3, р=0,01). При ПБ наблюдалось более длительное течение заболевания, чем у остальных больных с ГЭРБ. В среднем, для развития ЖМ эпителия пищевода потребовалось от 2 до 10 лет течения заболевания, а для развития КМ от 5 до 14,5 лет. Различия в длительности заболевания были достоверными (р=0,008). Определялась прямая корреляционная связь продолжительности заболевания и развития ПБ.

Резюмируя результаты микроскопического исследования и анализа клинико-анамнестических данных можно заключить, что морфогенез АК на фоне ПБ является многоступенчатым процессом и включает следующие стадии: хроническое воспаление в виде ГЭРБ-эзофагита без и с ЖМ, ПБ с ТнКМ и ТлКМ, ИН и инвазивную карциному на фоне ПБ, что доказывается обнаружением у одного пациента сочетания перечисленных изменений. Предложена гипотеза злокачественной трансформации эпителия в ПБ. трансформация складывается из последовательных этапов, включающих рефлюкс-эзофагит, цилиндрическую метаплазию эпителия, ИН низкой и высокой степени и развитие АК на фоне ПБ (рис 23).

Гипотеза патогенеза злокачественной трансформации эпителия в пищеводе Барретта

Ш(ШК1ОТ(1(Ш[Ш ГШР Шшпккш I ли@тг| 4

Эрозивный/ язвенный эзофагит й

Кишечная метаплазия Пищевод Барретта Д

Дисплазия I

Аденокарцинома

Воспаление D

Метаплазия t

Дисплазия И

Неоплазия

Рисунок 23 Гипотеза патогенеза злокачественной трансформации эпителия ПБ.

По результатам экспрессии Кл нами установлено, что переход от ИН низкой степени к высокой и к АК на фоне ПБ сопровождается исчезновением мембранного окрашивания Кл 1,2,3,4,5,7 и появлением цитоплазматического окрашивания, что, вероятно, свидетельствует о синтезе данного белка в цитоплазме и нарушении его транспортировки в зону ПК.

Кл 4,5,7 выявлялись в виде диффузного и латерального окрашивания только в дисплазии и АК в ПБ.

Обобщение полученных результатов и данных литературы, позволяет нам выдвинуть гипотезу о роли Кл в морфогенезе АК на фоне ПБ, согласно которой морфогенез является многостадийным процессом. По мере прогрессирования КМ и развития ИН, а затем АК теряется апикальное окрашивание Кл и появляется диффузное, которое отражает нарушения в образовании ПК. Отсутствие ПК в АК - путь к повышению пролиферации, появлению клеточного атипизма и инвазивному росту. Следовательно, можно заключить, что в ИН и АК одним из проявлений клеточного атипизма опухолевых клеток является потеря ими ПК. Известно, что влияние ПК на дифференцировку клеток, их пролиферативную активность и подвижность. Молекулы Кл продолжают синтезироваться опухолевыми клетками, но, по-видимому, не достигают зон ПК, поэтому при данной патологии их экспрессия возрастает в цитоплазме клетки, а не в апикальной части мембраны.

В нашем исследовании выявлено, что переход от ИН низкой степени к высокой и к АК на фоне ПБ сопровождается потерей ПК, что проявляется исчезновением апикального окрашивания Кл 1,2,3,4,5,7, при этом параллельно усиливается цитоплазматическое окрашивание за счет накопления вышеупомянутых Кл. Потеря способности аккумулировать Кл в области плотных контактов в АК при ПБ приводит к исчезновению ПК и способствует прогрессии опухоли (пролиферации, инвазии и метастазированию).

Маркеры ПК Кл 1,2,3,4,5,7 могут быть рекомендованы для определения злокачественного потенциала дисплазии при ПБ, а также для различения нормального эпителия желудка и желудочной метаплазии в пищеводе.

Таким образом, усиление пролиферации клеток в ряду от ГЭРБ-эзофагита, ГЭРБ-эзофагита с ЖМ, ПБ, ИН и АК пищевода косвенно может свидетельствовать о прогрессивном нарастании нарушений регуляции клеточного роста. Достоверное увеличение уровня экспрессии Ki-67 (р<0,05) от КМ к ИН и АК на фоне ПБ может быть рекомендовано для дифференциальной диагностики данных процессов.

При развитии КМ и ИН нами выявлено усиление апоптоза. При ИН высокой степени и в препаратах АК апоптоз снижался, что отражает нарушение механизмов клеточного контроля.

При сопоставлении уровней пролиферации и апоптоза в исследуемых группах выявлено нарастание пролиферации и апоптоза в ряду от КМ к ИН. На этапе развития АК пролиферация продолжает неуклонно расти, тогда как апоптоз немного снижается. Такие изменения в балансе между пролиферацией и апоптозом приводят к накоплению мутаций в опухолевых клетках, к прогрессии опухоли.

Прогрессия изменений в ряду от ИН в ПБ до АК на фоне ПБ сопровождается относительным снижением индекса апоптоза опухолевых клеток и повышением уровня пролиферации, оценивая экспрессию Ki-67.

Полученные данные могут свидетельствовать, что мутации в гене ТР-53 уже регистрируются на стадии КМ в отдельных клетках, т.к. известно, что ИГХ выявляет р53 - продукт мутантного гена. В ходе опухолевой прогрессии значительно увеличивается количество клеток с мутациями в гене ТР-53, что может быть полезно для ранней диагностики ИН и АК на фоне ПБ.

Таким образом, определение уровня пролиферации клеток по Ki-67 и наличие и количество белка р53 помогает дифференцировать степени ИН и прогнозировать течение заболевания, т.е. возможную малигнизацию и оценить злокачественный потенциал опухоли.

ИН эпителия в ПБ характеризуется сочетанием клеточного атипизма с высокой экспрессией Ki-67, Р53 и сопровождается увеличением апоптоза. Переход от ИН к АК на фоне ПБ сопровождается усилением пролиферации, исходя из показателей экспрессии Ki-67 и р53, и относительным снижением апоптоза, что отражает нарушения в механизмах клеточного контроля, противоопухолевой защиты клеток.

Проведенное исследование показало, что канцерогенез АК на фоне ПБ характеризуется изменениями в соотношении между процессами пролиферации и апоптоза. Рост АК обеспечивается, по всей видимости, не столько увеличением пролиферации опухолевых клеток, сколько уменьшением их гибели путем апоптоза.

Анализ полученных данных показывает, что маркеры плоского и железистого эпителия обнаруживаются в разных соотношениях во всех видах эпителия в ПБ. Экспрессия СК 10/13, СК 8 и Кл 1 в плоском эпителии в норме, при эзофагите и в очагах цилиндроклеточной метаплазии может свидетельствовать об общности их происхождения из мультипотентной тканевой клетки предшественницы (см. гистограмму № 15).

Обобщая полученные данные, нами выдвинута гипотеза патогенеза АК на фоне ПБ. Патогенез развития карциномы в ПБ является многоступенчатым процессом. На первом этапе при повреждении стенки нижней трети пищевода рефлюктатом развивается эзофагит — воспаление слизистой пищевода, выстланной неороговевающим плоским эпителием. В ходе репарации поврежденного эпителия происходит нарушение дифференцировки тканевой клетки-предшественницы с формированием цилиндроклеточной метаплазии в нижней трети пищевода — ЖМ и КМ. Цилиндрический эпителий более устойчив к кислой среде желудочного рефлюкса. Следует предположить, что ЖМ является предшественницей КМ, т.к. ЖМ и КМ практически не отличаются по экспрессии маркеров дифференцировки. При развитии КМ (ПБ) усиливаются процессы пролиферации и апоптоза в метаплазированном эпителии (ИГХ определяется увеличение экспрессии Ki-67 и количества апоптозных телец), начинают накапливаться мутации, что отражается в появлении экспрессии мутантного р53, нарушается клеточная дйфференцировка (в КМ экспрессируются маркеры плоского эпителия - СК 10/13, Кл 1, а также цилиндрического эпителия — СК 8). Изменения еще не затрагивают функционирование плотных контактов, что подтверждается специфической экспрессией Кл в апикальной части мембран клеток цилиндрического эпителия и отсутствием цитоплазматической. На данном этапе имеются начальные нарушения в дифференцировке клеток и усиление пролиферации, сбалансированной увеличением апоптоза. На следующем этапе — этапе развития ИН в очагах ТлКМ - отмечается дальнейшее возрастание уровня экспрессия Ki-67 и мутантного р53, отражающих усиление пролиферации эпителиоцитов, а также увеличивается уровень апоптоза. Имеются признаки нарастания нарушений дифференцировки клеток, появляется клеточный атипизм, а также изменяются и ПК. В очагах ИН Кл обнаруживаются в цитоплазме клеток, где они не несут функциональной нагрузки, в то время как в цитоплазматической мембране их накопление понижается. На последующем этапе — развития АК на фоне ПБ — обнаруживается дисбаланс между процессами пролиферации и апоптозом эпителия, в пользу пролиферации. Это ведет к накоплению и сохранению мутаций, к появлению опухолевых клонов, и, следовательно, к опухолевой прогрессии. На данном этапе резко возрастает экспрессия Ki-67, р53, снижается уровень апоптоза, возрастает цитоплазматическая экспрессия Кл и резко снижается мембранная, что отражает усиление проявлений клеточного атипизма. Потеря ПК в АК способствует инвазивному росту и метастазированию опухоли (рис. 24).

Гипотеза морфогенеза АК на фоне пищевода Барретта

Пищевод Барретта

Р53Т, Ki 67t, Apot, СК 10/13i, СК 8t ♦ кл-ММБ+++, Кл-ЦПЛпролиферация=Аро Нарушение диф-ки

ММ6 - мембран но ЦП Л - цнтопгаамвт1тч#см

ИН

P53tt, Ki 67ft, Apotf,

СК 10/13U, СК 8t —£ Л"

Кл-ММБ ■*-•«•, Кл-ЦПЛ +) YqII | $1

AR

P53Ttt, Ki 67ftT, Apot, CK 8t Кл-ММБ -. Кл-ЦПЛ пролиферация=Аро нарушение диф-ки появление клеточного атипизма пролиферация»Аро нарушение диф-ки клеточный атипизм инвазивный рост

Рис. 24. Гипотеза морфогенеза аденокарциномы на фоне пищевода Барретта. Условные обозначения: Аро - апоптоз, ММВ - мембранно, ЦПЛ- цитоплазматически.

Резюмируя все вышеизложенное, этапы канцерогенеза АК на фоне ПБ можно представить в виде следующих стадийных изменений, сопровождающихся молекулярными перестройками, ведущими к дисбалансу между процессами пролиферации и апоптоза, нарушениям дифференцировки клеток и межклеточным взаимодействиям (рис. 25):

1. хроническое воспаление с развитием ГЭРБ-эзофагита;

2. репарация эпителия пищевода в очагах повреждения;

3. дисрегенерация эпителия с развитием ЖМ;

4. дисрегенирация эпителия с развитием КМ - ПБ;

5. интраэпителиальная неоплазия в очагах ТлКМ в ПБ;

6. АК на фоне ПБ.

Этапы канцерогенеза аденокарциномы пищевода на фоне ПБ мн аденокарцинома

Мутации генов Р53, р]6, циклина D

Рис. 25. Этапы канцерогенеза аденокарциномы пищевода на фоне ПБ

ПБ является ключевым этапом изменения эпителия на пути прогрессии к АК пищевода. Известно, что в канцерогенезе ПБ принимают участие множество генов супрессоров опухолевого роста (р53, р16, FHIT, Rb, АРС), регуляторов клеточного цикла (Cyclin Dl, MDM2), факторов роста (EGF-R, TGF-A, с-егЬВ2) и молекул клеточной адгезии (E-cadherin, P-cadherin, a-catenin, p-catenin), а также протеаз (UPA) [41]. На основании полученных результатов и данных литературы нами установлена последовательность молекулярно-генетических изменений происходящих в прогрессии ПБ, ИН и АК пищевода. При развитии ИН в ПБ усиливается экспрессия р53, увеличивается апоптоз, развивается гиперметилирование р16, усиливается экспрессия факторов роста (EGF), увеличивается пролиферация, учитывая экспрессию Ki-67, происходит уменьшение экспрессии молекул клеточной адгезии и молекул ПК (Кл), нарушается дифференцировка клеток. При прогрессии ИН до АК пищевода максимально экспрессируются онкомаркеры, происходит потеря гена Rb, мутации в АРС, клетки теряют гетерозиготность по некоторым аллелям, нарастает пролиферация, увеличивается количество факторов роста (EGF-R, TGF-A, с-егЬВ2), снижается апоптоз, происходит исчезновение или изменение экспрессии молекул клеточной адгезии и плотных контактов (рис. 26).

Метаплазия Дисплазия I I низкои степени

TGF-a, EGFR Мутации генов Анеуплоидия,

PTt ri1 R имкпмия П I ЯПППТЛ1Я

Рисунок 26. Маркеры злокачественной трансформации при пищеводе Барретта (Beilstein М, Silberg D) [25].

Дисплазия I высокой степени!

4 Карцинома