Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Патогенетическое и клиническое значение плазмоцитоидных дендритных клеток при вирусном гепатите С у детей и взрослых

На правах рукописи

Хохлова Ольга Николаевна

Патогенетическое и клиническое значение плазмоцитоидных дендритных клеток при вирусном гепатите С у детей и взрослых

14.01.09 - инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

з ок г ¿и и

Москва-2013

005533930

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель.

доктор медицинских наук, профессор РЕИЗИС Ара Романовна

Официальные оппоненты:

ФЕКЛИСОВА Людмила Владимировна доктор медицинских наук, профессор

Г ПУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский кчииический институт им. М.Ф.Владттрского», руководитель отдела детских инфекций

КАЛЮЖИН Олег Витальевич доктор медицинских наук, профессор

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медш^тский университет им. И. М. Сеченова» МЗ РФ, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. A.A. Евдокимова» МЗ РФ

Защита диссертации состоится «25» октября 2013 года в_час._мин. на заседании

диссертационного совета ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора по адресу: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, д. 3А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «_» сентября 201 Згода.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Горелов Александр Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Вирусные гепатиты представляют серьёзную проблему здравоохранения, подлинную угрозу для человечества, ввиду повсеместного распространения гепатитов В, С, Д, наличия хронического носительства, а также тяжёлых и фульминантных форм и исхода в цирроз печени с угрозой малигнизации и развития гепатокарциномы [Покровский В.И., 1996-2004г.; Соринсон С.Н., 1996-1998г.; Михайлов М.И. и др., 1996-2004г.].

В настоящее время особенно тревожна ситуация с хроническим гепатитом С (ХГС): в мнре насчитывается 180 миллионов (по некоторым данным до 500 миллионов) инфицированных люден, то есть от 3% до 8% всемирной популяции, и ежегодно выявляются новые 3-4 миллиона случаев. В связи с этим, изучение данной проблемы приобретает с каждым годом всё большую актуальность.

Наряду с огромными успехами, связанными с открытием возбудителя, внедрением молеку-лярно-биологических методов диагностики и возможностей противовирусной терапии [Михайлов М.И., 1990г.; Михайлов М.И., Шахгпльдян И.В., Онищенко Г.Г., 2003г.; Мукомолов C.JI. и др., 1994г.], многое в проблеме вирусных гепатитов остаётся не изученным.

Для решения вопросов течения, прогресснрования и исходов вирусных гепатитов первостепенное значение имеет знание глубинных механизмов патогенеза этих заболеваний, в том числе особенностей иммунного ответа.

Одним из новейших и многообещающих направлений в понимании механизмов иммунного ответа при вирусных гепатитах является изучение недавно открытого уникального типа иммунных клеток - плазмоцнтоидных дендритных клеток (ПДК), роль и значение которых, как возможных ключевых факторов патогенеза вирусных гепатитов, начали изучать лишь в самое последнее время.

ПДК являются отдельным видом клеток крови, близким по развитию и генетическому профилю общим дендритным клеткам, впервые описанным R.M. Steinman и Z.A. Cohn в 1973 году. ПДК были открыты Celia М., Jarrosay D., Fecchetti F. et al ; Siegal F.P., Kadowaki N., Shodell M. et al в 1999году. Они имеют костномозговое происхождение и развиваются из стволовой клетки через ряд предшественников [Merad М., Manz M.G. 2009], в этом процессе основополагающую роль играет ген, названный Е2-2 [открыт в 2008 году Reizis В. et al], который регулирует этапы развития и диффереицировки ПДК. У здоровых людей ПДК обнаружены в крови и лнмфоидных органах и в минимальных количествах присутствуют в других органах и тканях. Единственным органом, где они представительствуют и куда могут эффективно мигрировать в зрелом состоянии, является печень.

При активации во время воспалительного ответа ПДК мигрируют как в зону Т-клеток лимфо-идных органов, так и в воспалённую ткань паренхимы [Celia М„ Jarrossay F. et al 1999; Lai W.K., Curbishley S.M. et al 2007]. Эти клетки, генетически родственны дендритным клеткам и обладают морфологией плазматических клеток, в связи с чем имеют уникальную двойственную природу.

С одной стороны, ПДК являются основными естественными продуцентами интерферонов (ИНФ) I типа и способны продуцировать в 100-1000 раз больше интерферона — а, чем другие типы клеток, в ответ на вирусемию, что ставит их на первое место, как принципиально важных участников антивирусного иммунного ответа [Celia М., Jarrosay D., Fecchetti F. et al 1999год, Kadowaki N.. Shodell M. et al 1999]. Первый тип интерферона напрямую активирует натуральные киллеры, усиливая их цитотоксическую активность [Lee С.К., Rao D. Т., Gertner R. 2000] и стимулирует продукцию интерлейкина-15 [Nguyen К.В., Salazar-Mather Т.Р. et al 2002], который играет роль в их пролиферации. С другой стороны, кроме продуцирования интерферона, ПДК могут напрямую взаимодействовать почти со всеми клетками иммунного типа, в том числе с анти-генпрезентирующими дендритными клетками (АПК), обеспечивая отчётливый механизм их активации [Yoneyama Н., Matsuno К., Maísuno N., Toda Е. et al 2005], а также самостоятельно выступать в этом качестве.

Таким образом, характеризуясь сочетанием уникально быстрой и массивной продукции интерферона 1 типа с активацией презентации антигена, ПДК обладают одновременно свойствами

как лимфоцитов, так и классических дендритных клеток, что позволяет им быть ключевым связующим звеном между врождённым и приобретённым иммунитетом [B.Reizis et al 2010].

Клинические работы по изучению ПДК появились в самое последнее время [Banchereau J., Palucka A.K. 2005; Vicari A. 2002; Pacrensny S. 2004; De Vries 2003]. Работы по изучению роли ПДК при вирусных гепатитах единичны и касаются только взрослых пациентов [Ito Т., Kanzler Н„ Liu Y.J. 2006; Ulsenheimer А„ Gerlach J.T., Jung М.С. et al 2005;Kanto Т., Inoue M„ Miyatake H. 2004]. У детей подобные исследования отсутствуют.

Всё это определяет актуальность н перспективность избранной нами темы, и явилось основанием для проведения настоящей работы. Цель исследования

Установление патогенетического и клинического значения плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) при хроническом гепатите С у детей и взрослых. Задачи исследования

1. Определить нормальные количественные показатели и функциональное состояние ПДК (выработка ими интерферона) у детей и взрослых.

2. Установить количество и функциональное состояние ПДК у детей с вирусным гепатитом С, в зависимости от течения и фазы инфекционного процесса, характера и стадии противовирусного лечения.

3. Исследовать те же параметры ПДК у взрослых пациентов, больных вирусным гепатитом С.

4. Выявить особенности и дать сравнительную характеристику изменений количества и функционального состояния ПДК у взрослых и детей, больных вирусным гепатитом С.

5. На основании полученных результатов сформулировать положения о роли ПДК в патогенезе вирусного гепатита С, их влиянии на течение инфекционного процесса, а также на эффективность противовирусной терапии (ПВТ).

Научная новизна

1. Впервые установлены нормальные количественные и функциональные показатели (интенсивность интерфероногенеза (ИФН-генез)) ПДК у здоровых детей и их соотношение с показателями у здоровых взрослых лиц.

2. Обнаружен феномен наличия в крови здоровых детей и взрослых ингибиторов ИФН - генеза в ПДК, в связи с чем ПДК здоровых лиц находятся в состоянии «покоя» (выработка ИФН в них не определяется).

3. Выявлено, что количественные и функциональные показатели ПДК у детей и взрослых, страдающих ХГС, достоверно отличаются от таковых у здоровых лиц, а также, что параметры ПДК в детском возрасте существенно отличаются от показателей у взрослых, больных ХГС.

4. Впервые продемонстрировано важное участие ПДК в патогенезе ХГС у взрослых и детей в виде тесЕюй взаимосвязи количества и функции ПДК с вирусной нагрузкой, степенью цитолиза и фиброза, т.е. с основными факторами, определяющими течение и исход ХГС:

- Количество ПДК снижено у всех больных ХГС.

- Количество клеток обратнопропорционально уровню цитолиза (снижается при повышении активности трансаминаз).

- Степень снижения максимальна при продвинутом фиброзе (4 балла).

- Высокой виремии соответствует низкий интерфероногенез в ПДК.

5. Впервые установлено, что противовирусная терапия (ПВТ) существенно влияет на показатели ПДК: резко стимулирует ИФН - генез в ПДК в процессе терапии. Показано, что ответ на ПВТ закономерно связан с изменениями количества и функции ПДК, а степень подъёма выработки ИФН в ПДК может служить надёжным прогностическим тестом ответа на противовирусную терапию (заявка на патент № 2012157606 от 27.12.2012).

6. Продемонстрирован особый механизм воздействия ПВТ на характер иммунного ответа при ХГС: без неё состояние авиремин достигается максимальным напряжением ИФН - генеза в ПДК. Напротив, после ПВТ при достижении авиремии происходит нормализация функции ПДК.

7. На основании полученных данных сформулированы новые научные положения о роли ПДК при ХГС, их влиянии на течение заболевания и эффективность противовирусной терапии. Практическая значимость работы.

1. Установление нормальных параметров количества и функционального состояния ПДК у детей делает возможным использование этих методов в педиатрии.

2. Полученные данные могут служить дополнительными критериями оценки течения и прогнозирования исходов ХГС у детей и взрослых.

3. На основании результатов исследования предложен прогностический тест, который может служить критерием оценки эффективности проводимой терапии. Суть нового прогностического теста заключается в том, что степень повышения уровня ИФН - генеза в ПДК на 12ой неделе терапии является показателем её эффективности: повышение выработки ИФН в 2,6x102 раз у взрослых и 1,2x102 у детей позволяет надёжно (с достоверностью 96%) предсказать стойкий вирологический ответ (заявка на патент: per. № 2012157606 от 27.12.2012).

Своевременная (в первые 12недель) оценка ответа на противовирусную терапию является важнейшей составляющей современной персонализированной терапии ХГС. Внедрение результатов

Результаты исследования внедрены в практику работы клинико-диагностического центра ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора и Детского Гастроэнтерологического Центра Департамента Здравоохранения г. Москвы. Апробация материалов диссертации

Результаты исследований были доложены на IV и V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (март 2012г и 2013г, Москва); XVII и XVIII Ежегодном Российском Конгрессе «Гепатология сегодня» (март 2012г и 2013г); на 18-й Российской Гастроэнтерологической неделе с международным участием (октябрь 2012г.); на Всероссийской конференции «Хочу всё знать по вирусным гепатитам» (декабрь 2012г.) Работа принимала участие и заняла I место в Конкурсе молодых ученых на V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (март 2013г.) и XVIII Ежегодном Российском Конгрессе «Гепатология сегодня» (март 201 Зг). Материалы работы приняты к публикации и постерному докладу на конференции «GASTRO 2013 APDWAVCOG Shanghai» (сентябрь 2013г.), а также к устному докладу на конференции «United European Gastroenterology Week Berlin» (октябрь 201 Зг.). United European Gastroenterology присудило автору работы звание «National Scholar Award 2013». Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 научные работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ и 1 работа в зарубежном журнале.

Лнчный вклад. Автор осуществлял планирование и принимал непосредственное участие в сборе анамнеза, осмотре, иммунологическом обследовании больных, в назначении патогенетической терапии. Лично автором проводилось регулярное наблюдение больных. Автором лично проведена оценка клинико-лабораторных, иммунологических, вирусологических показателей в динамике, на фоне проводимой ПВТ. Автором подготовлен аналитический обзор зарубежных и отечественных источников, осуществлен отбор методов исследования и статистическая обработка полученных результатов; проведен анализ и интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список цитированной литературы, включающий 130 источников, приложение. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 49 таблицами; приведены 4 выписки из историй болезни. Материалы и методы

Данная работа проводилась в период с 2010 по 2012 г. в клиническом отделе инфекционной патологии ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (директор - академик РАМН, профессор В.И. Покровский), на базе научно-консультативного клинико-диагностического центра

ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (заведующий - к.м.н. Чуланов В.П.) и лаборатории иммунологии СНИО ЭП СПИД (директор -академик РАМН, профессор Покровский В.В).

В амбулаторных условиях нами обследован 161 человек: 133 пациента, страдающих хроническим гепатитом С, в возрасте от 1,5 до 64 лег и 28 человек - здоровые лица в возрасте от 4 до 47 лет. Кратность обследования больных хроническим гепатитом С составляла 1 -3 раза. Здоровые лица обследованы однократно. Общее количество исследований - 184.

Под нашим наблюдением находилось 58 детей в возрасте от 1,5 до 18 лет и 75 взрослых пациентов в возрасте от 19 до 64 лет в различные фазы хронического гепатита С. Средний возраст детей 7,6 лет+0,27. Взрослые больные на момент обследования имели средний возраст 30 лет ±0,8. В исследовании детей преобладали лица мужского пола (63,8%), тогда как у взрослых - лица женского пола (60%).

При хроническом вирусном гепатите С у обследованных детей преобладала репликативная фаза заболевания (86,2%), тогда как у взрослых больных соотношение репликативной фазы заболевания и нерепликативной составило 41% и 59% соответственно. Неактивный процесс (нормальные значения АлТ/АсТ) преобладал как у детей (62%), так и у взрослых (64%) больных

хгс.

Установлено, что в эпиданамнезе детей - 36,2% составили медицинские парентеральные вмешательства, но преобладал вертикальных путь заражения (46,6%). У 17,2% детей не удалось установить источник заражения. У взрослых, более чем в половине (53,3%) случаев установить источник заражения не было возможности, тогда как парентеральный путь заражения составил 44%, а у 2,7% отмечался вертикальный путь передачи ВГС. Необычно высокая частота вертикального пути передачи в нашем случае связана не с особенностями эпидпроцесса (вертикальная передача ВГС обычно не превышает 5-7%), а с характером выборки (концентрация таких пациентов в условиях гепатологического центра).

Как известно, для хронического гепатита С характерно длительное течение заболевания при скудной клинической картине. У наблюдавшихся нами пациентов клинические симптомы были минимальны, однако как у детей (44,8%), так и у взрослых (65,3%) отмечался довольно выраженный астенический синдром, жалобы на тяжесть в правом подреберье (20,7% и 52%), диспеп-тический синдром (36,2% и 57%), наблюдалось увеличение печени (17,2% и 34,7%) и селезёнки (5,2% и 8% соответственно). Кожные покровы при ХГС были обычной окраски. Довольно часто встречалась сопутствующая патология в виде поражения желудочно-кишечного тракта (44,8% и 44%), аллергических заболеваний (13,8% и 14,7% соответственно). При этом обращает на себя внимание различие в относительной частоте отдельных клинических проявлении у взрослых и детей. Так, у детей все основные симптомы встречались существенно реже, чем у взрослых пациентов.

При ХГС у наших пациентов активность процесса была невысокой: средние значения показателя аланннтрансаминазы (АлТ) в целом не превышали 1,5 норм, и в группе детей статистически не отличались от таковых у взрослых. Также отмечено преобладание нормальных уровней тран-саминаз, причём с одинаковой частотой как в группе детей - 62,1%, так и у взрослых пациентов -68%.

У больных ХГС уровень вирусной нагрузки имеет большое значение как для течения и исходов заболевания, так и для решения вопроса о назначении противовирусной терапии. Более чем у половины (51,7%) наблюдавшихся нами детей определялся высокий уровень вирусной нагрузки, тогда как у взрослых больных отсутствие вирусной репликации (40%) и высокий уровень вирусной нагрузки (45,3%) определялись с примерно одинаковой частотой. Низкий уровень вирусной нагрузки был у трети больных детей (34,5%), у взрослых только 14,7% больных имели низкие уровни вирусной репликации.

Генетика вируса играет важную роль в патогенезе заболевания, ответе на противовирусную терапию и риске возникновения рецидива. Как у детей, так и у взрослых больных ХГС в нашем исследовании преобладал 1В генотип (63,8% и 65,3% соответственно). Несколько чаще у детей (24,1%), чем у взрослых (16%) встречался ЗА генотип.

Степень выраженности фиброза является важным фактором при оценке прогноза заболевания и оптимизации лечения. В нашем исследовании большинству больных (77,4%) была проведена фиброэластография печени для определения уровня фиброза по шкале Метавир. По данным фнброэластографии, у обследованных нами детей отсутствовала группа с уровнем фиброза F3 и выше, тогда как у 12% взрослых пациентов определялась клинико-лабораторная картина цирроза печени. Процентный состав групп с минимальным уровнем фиброза был несколько выше у детей, чем у взрослых (74,1% и 58,7% соответственно).

Базовые методы обследования проводились в лаборатории ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (заведующий - к.м.н. Шипулин Г.А.) и в иммунологической лаборатории СНИО и ЭП СПИД (заведующий - академик РАМН, профессор Покровский В.В.)

-Клинический анализ крови определялся на гематологическом анализаторе AST diff (производство Beckman Coulter).

-Биохимический анализ крови (определение АсТ и АлТ, билирубина, протромбинового индекса,уровня общего белка и белковых фракций и др.) проводился при помощи тест-системы Abbott Diagnostics ARCHITECT.

Исследование маркёров репликации вируса гепатита С (РНК вируса гепатита С качественное и количественное исследование) и определение генотипа вируса в сыворотке проводилось на базе ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, в клинико-диагностическом отделении (зав. отд. - к.м.н. Чуланов В.П.). Для определения использовали метод полимеразной цепной реакции. РНК HCV определяли с использованием коммерческих наборов реагентов производства ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии»" Роспотребнадзора; Россия: «АмплиСенс HCV-MoiiHTop-FL" и "АмплиСенс HCV-iciionm-FL".

При необходимости уточнения диагноза, проведения дифференциальной диагностики с другими видами поражения гепатобилиарной системы и определения степени фиброза проводились дополнительные методы исследования: УЗИ брюшной полости, фиброэластография печени на аппарате «Фиброскан» и др. в соответствии с конкретными диагностическими задачами.

Специальные методы исследования.

Для определения количества и функции плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) в периферической крови у детей и взрослых, больных хроническим вирусным гепатитом С, а также у здоровых лиц, использовались специальные методы исследования. Исследование проводилось на базе иммунологической лаборатории СНИ и ОЭП СПИД (заведующий академик РАМН, профессор Покровский В.В., зав. иммунологическим подразделением - к.м.н. JI.B. Серебровская).

Количественное (относительное и абсолютное количество) определение ПДК проводили методом проточной цитометрии, на цитофлуориметре EPICS XL (Beckman Coulter) с добавлением моноклональных антител (MaT-CD303 и МаТ -CD123, производства фирмы Miltenyi Biotec) и частиц FlowCount (Beckman Coulter) для абсолютного счета.

Определение функционального состояния ПДК (выработка ими интерферона). Для получения супернатантов, плазмоцитоидные дендритные клетки обрабатывались специфическими стимуляторами, с последующим определением выработки интерферона. Стимуляция образцов периферической крови больных ХГС и здоровых лиц проводилась в инкубаторе при 37°С и 5% СОг с использованием специфических стимуляторов, таких как ODN2216 - синтетический олигонукле-отид, содержащий CpG ODN в определённых последовательностях, специфичный для распознавания TLR 9 и приводящий к сильному иммуностимулирующему эффекту-активации выработки интерферона в ПДК (InvivoGen, USA) и интерлейкин 3 (IL3) - полипептидный цитокин, относящийся к группе гранулоцитарно-макрофагальных колониестимулирующих факторов, применяемый для стимуляции и дифференцировки клеточного роста наиболее ранних предшественников кроветворных клеток.

Определение выработки ИФН в супернатанте клеток проводили методом иммуноферментного анализа, с использованием наборов реагентов ELISA.

Дополнительные специальные методы

В связи с возникновением в ходе исследования ряда новых задач потребовалось применение дополнительных методов.

Для того, чтобы плазмоцитоидные дендритные клетки отмыть от плазмы крови, ПДК выделяли из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови у 4 здоровых доноров (2 детей и 2 взрослых). Кровь, разведенную в 2 раза средой 1£РМ1 1640 , центрифугировали при 40С^ в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-ПАК. ПДК, образовавшие интерфазное кольцо, собирали и трехкратно отмывали в среде ЯРМ1 1640. После каждой отмывки в 10-кратном объёме среды клетки осаждали центрифугированием при 200§. Затем «отмытые» ПДК инкубировали при тех же условиях, что и не «отмытые», после чего, как было описано выше, собирали супернатант и определяли количественный уровень ИФН в исследуемых образцах.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи статистической программы СгарЬРас! Рпят5 с определением средней величины (М) и ошибки средней величины (ш). При определении достоверности различий применялись как параметрические, так и непараметрические критерии обсчёта полученных результатов. Для параметрических распределений применяли I- критерий Стьюдента и Р критерий, при использовании непараметрических методов —критерий Манна-Уитни. Для разработки прогностического теста был применён многофакторный дискри-минантный анализ результатов с использованием статистического пакета ЭТАТВТЮА 7.

Результаты исследования.

Количественные показатели ПДК у здоровых детей и взрослых.

В работе впервые установлены нормальные количественные показатели ПДК у здоровых детей: абсолютное количество клеток в микролитре - 17,31+1,83, процентное количество клеток при выборке из 100 тыс. лимфоцитов - 0,38+0,04. Эта норма оказалась статистически отличима от нормальных показателей, полученных у взрослых - 10,25+1.75 и 0,27+0,05 соответственно (р=0,01 и р=0,05)

Количественные показатели ПДК у больных ХГС

По нашим данным, у детей, больных ХГС, отмечается снижение как абсолютного количества ПДК - 13,9+1,0 кл\мкл. так и процентного состава клеток - 0,26+0,01 кл\1 ООтыс. лимф., по сравнению со здоровыми лицами - 17,31+1,83 и 0,38+0,04 (р<0,05 и р=0,05 соответственно).

У взрослых больных также отмечено снижение количественных показателей ПДК (8,1+0,6 кл\мкл и 0,19+0,01 % кл.) по сравнению со здоровыми лицами (р<0,05). Однако при однонаправленности этих изменений (снижение уровня ПДК у больных ХГС как детей, так и взрослых), исследуемые показатели достоверно ниже у взрослых, чем у детей (рис. 1).

р<0,05

I здоровые I больные

р=0,0003

8,1 ±0,6

Дети

Взрослые

Дети Взрослые

Рис. 1 Количественные показатели ПДК у взрослых и детей, больных ХГС

Связь количественных показателей ПДК с клинико-лабораторными параметрами у детей, больных ХГС.

Установлено, что в группе детей с отсутствием вирусной репликации абсолютное количество ПДК оказалось в 2.2 раза ниже, чем в группе с высоким уровнем репликации вируса (р=0,002). Отмечено снижение процентного количества клеток в группе с отсутствием репликации вируса (0.17+0.06). по сравнению со здоровыми лицами (0,38+0.04, р=0,013). Однако, при высоких уровнях репликации вируса абсолютное количество ПДК - 14,3+1.3 существенно не отличается от такового у здоровых детей 17,3+1,8, тогда как процентное содержание клеток в периферической крови достоверно ниже нормы (р=0,02) (рис.2).

р'-""=0,002 17,3*1,8

■ здоровые****

Рис. 2 Соотношение количественных показателей ПДК и уровня вирусной репликации

у детей, больных ХГС

При сравнении показателей ПДК в группах детей с различным генотипом вируса гепатита С, установлено более выраженное снижение абсолютного количества ПДК -13,35+1,04 при 1В генотипе вируса относительно показателей при генотипе ЗА - 16.7+3,045 (р=0.001), которые не отличаются от нормы. Процентное количество ПДК при генотипе 1В (0.27 +0,021) также снижено в 1,4 раза по сравнению с нормой (0,38+0,04; р=0,01 соответственно).

При обследовании детей отмечено, что пол не оказывает заметного влияния на показатели ПДК: мальчики и девочки имеют одинаковые количественные значения этих клеток.

Однако удалось выявить существенные возрастные особенности количественных показателей ПДК. При анализе возрастных групп нами обнаружены достоверные различия: абсолютное количество ПДК снижается в 1.4 раза в пубертатном периоде, являющимся важнейшим и весьма уязвимым периодом развития ребёнка, и не отличается от здоровых детей в младшем детском возрасте. В то же время процентное содержание клеток не изменяется, оставаясь сниженным у больных ХГС во всех возрастах (рис.З).

Рис. 3 Соотношение количественных показателей ПДК и возраста детей, больных ХГС

Связь количественных показателей ПДК с клииико-лабораториыми параметрами у взрослых, больных ХГС.

Как у детей, так и у взрослых обнаружена связь количественных показателей ПДК и уровня вирусной репликации. Как в группе с отсутствием репликации вируса (7+1,37), так и при имеющейся (7,45±1,2) репликации количественные показатели ПДК остаются в 2,5 раза ниже нормы (17,3+1,4; р<0,05). Однако, отмечено достоверно большее снижение абсолютного количества клеток при отсутствии вирусной репликации - 7±1,37, по сравнению с группой, где репликация вируса была высока - 7,9+0,8 (р=0,096).

В отличие от детей, удалось установить связь количественных показателей ПДК с цитолизом у взрослых, больных ХГС: процентное количество клеток выше при нормальном уровне транса-миназ, и снижается при повышении показателей цитолиза (табл.1).

Таблица 1

Соотношение количественных показателей ПДК с цитолизом у взрослых, больных ХГС

Взрослые Коэффициент достоверности различий, р

Больные ХГС Здоровые

Уровень цитолиза

Норма Выше р<0,05 р>0,05

кл\мкл 8,35 ± 0,9 і 6,8 + 1,1" 10,25+1,753 р1-=о,з р13=0,35 р23=0,1

% кл. на ЮОтыс. лимф. 0,2 + 0,02і 0,16 + 0,02' 0,27+0,045і р"=0,05 р1-=0,2 р13=0,2

Состав группы взрослых больных, в отличие от детей, кроме того позволил проанализировать важное соотношение количества ПДК с выраженностью фиброза печени. Нами выявлено резкое снижение (в 2,3 раза) абсолютного - 3,9+0,9 и процентного - 0,12+0,04 содержания ПДК при циррозе печени, в отличие от больных с отсутствием фиброзных изменений в печеночной ткани: 9+1,4 и 0,24±0,03 соответственно. Тот факт, что резкое падение количества ПДК, по полученным нами данным, наступает лишь при крайних степенях фиброза печени (Г4, цирроз), дополнительно объясняет отсутствие выявления этой закономерности у детей, у которых в наших исследованиях фиброз не превышал 1-2баллов (табл.2).

Таблица 2

Соотношение количественных показателей ПДК и фиброза печени у взрослых, больных ХГС

Уровень фиброза по шкале Мета-вир (баллов) Коэффициент достоверности различий, р

Р0 И 1-3 ¥4 р<0,05 р>0,05

Абс. кол-во кл. (кл\мкл) 9+1,4і 8+0,8" 3,4+0,9і р13=0,0048 р2 3=0,0022 р12=0,5

% кл. на ЮОтыс. лимф. 0,24+0,03' 0,21 ±0,02" 0,12+0,04" р13=0,02 р23=0,01 р12=0,39

Как у детей, так и у взрослых пациентов нами проанализировано соотношение количественных показателей ПДК и генотипа вируса. Снижение процентного количества ПДК отмечается лишь в группе с 1В генотипом вируса (0,17+0,02; р=0,004). Больные с генотипом ЗА, так же как и в детском возрасте, по показателям ПДК не отличаются от таковых у здоровых лиц. Возможно, эти данные объясняют более гладкое течение и быстрый ответ на ПВТ у больных с генотипом ЗА.

У взрослых больных пол также, как у детей не влиял на показатели ПДК. От возраста достоверно зависело и абсолютное, и процентное содержание ПДК: количественные показатели ПДК существенно снижены в группе больных после 40 лет ( до 40 лет - 9,043+0,8; 0,21+0,017 против 5,8+0,7; 0,014+0,02 после 40 лет; р=0,003 и р=0,009 соответственно).

Таким образом, в нашем исследовании при сравнительном анализе количественных показателей ПДК с клинико-лабораторными параметрами у взрослых, больных ХГС, обнаружена достоверная связь изучаемых показателей ПДК с основными факторами, обуславливающими течение и исходы ХГС, такими как уровень вирусной нагрузки, показатели цитолиза, фиброза печени. Так, абсолютное количество ПДК снижено в группе больных с отсутствием вирусной репликации, в отличие от группы, где репликация вируса была высока. Эти данные могут быть обусловлены миграцией ПДК из периферической крови в зону поражения - печень. Процентное количество ПДК снижено при показателях АлТ, АсТ выше нормы. Активность процесса в печёночной ткани также может приводить к миграции ПДК в зону воспаления и, как следствие, снижению их процентного количества в периферической крови. Фиброз печени неразрывно связан с показателями ПДК. В работе показано, что абсолютное количество ПДК резко снижено у больных с циррозом печени, что вероятно говорит об истощении всей популяции ПДК в этой стадии поражения печени. В исследовании обнаружено также влияние возраста на количественные показатели ПДК, которые снижены у детей в пубертатном периоде и в группе больных старше 40 лет. Полученные нами данные говорят о важной роли, которую играют ПДК в патогенезе ХГС.

Сравнительная характеристика количественных показателей ПДК у детей н взрослых, больных ХГС

В связи с тем, что количественные показатели ПДК играют существенную роль в патогенезе ХГС как у детей, так и у взрослых, представляло большой интерес установить различия их в детском возрасте и у взрослых, больных ХГС.

Показано, что у детей эти изменения менее выражены (табл.3). Подобный факт, возможно, объясняет более мягкое течение и лучший ответ на ПВТ в детском возрасте.

Таблица 3

Соотношение количественных показателей ПДК и уровня вирусной репликации у больных

ХГС, детей и взрослых

Больные (уровень репликации вируса; коп.\мл) Коэффициент достоверности различий, р

Дети Взрослые

Менее 300 10Л2-10Л4 10Л5 и более Менее 300 10Л2-10Л4 10Л5 и более

Абс. кол. кл. (кл\мкл) 6,4+2,02' 15,5+22 14,3+1,3' 7+1.374 7,45±1,25 7,9+0,8" р"=0,0018 рм=0,0001 р'"4=0,8115

% кл. на ЮОтыс. лимф. 0,17±0,0б' 0,3+0,04" 0,3+0,02' 0,17+0,024 0,21 ±0,03' 0,19±0,02" р" =0,0013 рм =0,0148 р" =0,0912

Это подтверждается н тем, что при сравнении соотношения количественных показателен ПДК с цитолизом у детей и взрослых, больных ХГС, установлено: как при нормальном уровне тран-саминаз, так и при его повышении, показатели ПДК остаются более высокими в детском возрасте (табл.4).

Аналогичные закономерности обнаружены и при анализе соотношения фиброза печени и показателей ПДК у детей и взрослых: в группе с минимальным (Р0-Р1) фиброзом абсолютное количество ПДК в детском возрасте (16,1+1,7 и 8+0,8; р=0,02) в 2 раза, а процентное содержание (0,3+0,03 и 0,21+0,02; р=0,0004) в 1,4раза превышает показатели у взрослых. В целом, как уже отмечалось, более высокое содержание ПДК в детском возрасте может лежать в основе более благоприятного течения ХГС и ответа на ПВТ у детей.

Таблица 4

Соотношение количественных показателе» ПДК и цитолиза у детей и взрослых, больных

ХГС

Уровень цитолиза Коэффициент достоверности различии, р

Дети Взрослые

Норма Выше нормы Норма Выше нормы р<0,05 р>0,05

кл\мкл 14,38 + 1,6' 14,41 + 1,342 8,4±0,9' 6,8± 1.14 р'-=0,0017 р2"1 <0,0001 р3_,=0,26

% кл. на 100тыс. лимф. 0,3 + 0,03' 0,28 + 0,022 0,2+0,02' 0,16± 0,024 р'-3 =0,012 р24=0,0015 р'"2=0,7 р34=0,21

При рассмотрении в сравнительном аспекте влияния генотипа вируса ГС на количественный состав ПДК у детей и взрослых, установлено, что при генотипе вируса ЗА абсолютное количество ПДК в группе детей достоверно выше, чем у взрослых, и составляет 16,7+3,045 и 9,09+2 соответственно (р=0,005). А при генотипе1В количественные показатели ПДК у детей существенно превышают таковые у взрослых больных как в абсолютном (13,35+1,04 и 7,33+0,7; р=0,005), так и в процентном выражении (0,27 +0,02 и 0,17 ±0,02; р=0,003) . Эти данные ещё раз говорят о том, что обнаруженное нами по состоянию ПДК более глубокое поражение иммунологического звена при генотипе вируса - 1В менее выражено у детей.

В целом, проведённые исследования показали, что как у здоровых детей, так и на фоне ХГС количественные показатели ПДК у детей более благоприятны, чем у взрослых, что возможно лежит в основе известного факта более мягкого течения ХГС в детском возрасте.

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПДК ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С

Особое значение в нашем исследовании придаётся изучению функционирования плазмоцито-идных дендритных клеток, в частности выработке ими ИФН I типа.

Функциональное состояние ПДК у здоровых детей и взрослых

Нами проанализированы функциональные показатели ПДК (выработка ими ИФН) у здоровых людей (16 детей и 12 взрослых). Полученные данные говорят о том, что у здоровых лиц (как в детском возрасте, так и у взрослых), выработка ИФН плазмоцитоидными дендритными клетками в 100% случаев фиксируется ниже уровня детекции применяемого для этой цели и используемого нами высокочувствительного метода (нижняя граница определения ИФН - Зпг\мкл). Оценка полученных результатов подтолкнула нас к более глубокому изучению функционирования ПДК. Мы предположили наличие в крови здоровых людей неких ингибиторов, блокирующих выработку ИФН.

Для подтверждения данного предположения мы провели дополнительное исследование. Выработка ИФН в отмытых от плазмы ПДК у здоровых лиц резко возросла и составила: у детей -5227±2422пг\мл, у взрослых -3337+1760пг\мл. Данные, полученные при дополнительном исследовании, подтверждают наше предположение о наличии в периферической крови здоровых лиц пока не известных ингибиторов. Предположительный биологический смысл обнаруженного на-

ми феномена, возможно, заключается в том. что ингибиторы защищают эти важнейшие иммунные клетки от «случайных», недостаточно биологически мотивированных воздействий.

Функциональное состояние ПДК у больных ХГС детей и взрослых

Однако, в отличие от здоровых лиц, у больных ХГС выработка ИФН в ПДК, как у детей -113,3+21,7 пг\мл. так и у взрослых - 321 ±141,2 достоверно выше нормальных значений (р=0.0002 и р=0.0034 соответственно), оставаясь более интенсивной у взрослых (р<(),0001). Более низкие показатели выработки ИФН в ПДК у детей, больных ХГС. вероятно, имеют большое биологическое значение: известно, что ИФН имеет антипролиферативное действие, в связи с чем его высокие концентрации не желательны в растущем организме (рис.4).

Рис. 4 Соотношение функциональных показателей выработки ИФН у больных ХГС (детей и

взрослых) и здоровых

Таким образом, выработка ИФН в ПДК достоверно выше у больных ХГС. чем у здоровых (как детей, так и взрослых). Высокие уровни выработки ИФН в ПДК у больных ХГС могут быть обусловлены постоянной стимуляцией ПДК реплицирующимся вирусом ГС.

Связь функционального состояния ПДК с клинико-лабораторнымн параметрами у детей, больных ХГС

У детей отмечена чёткая взаимосвязь выработки ИФН в ПДК и показателей вирусной нагрузки. Оказалось, чем ниже выработка ИФН в ПДК тем выше уровень репликации вируса: при уровне ИФН 75,8+20,7 - репликация вируса 10Л5 и более, тогда как у больных с высокой выработкой ИФН в ПДК репликация низкая (197,6±49,7- репликация 10л2-10л4; р=0.033). Вероятно, снижение уровня выработки ИФН в ПДК. функциональная недостаточность этих клеток может лежать в основе и способствовать более активной вирусной репликации, демонстрируя важную роль этих клеток в патогенезе ХГС.

Также нами обнаружена достоверная связь функционального состояния ПДК и цитолиза: выработка ИФН в ПДК выше при нормальных уровнях трансаминаз - 138,1+33.85. нежели при их повышении - 86.19+23.6 (р=0.01).

У детей установить связь между выработкой ИФН в ПДК и фиброзом печени не удалось. По нашим данным, генотип вируса ГС также не оказывает существенного влияния на выработку ИФН в ПДК в детском возрасте.

Представляло интерес установить связь показателей выработки ИФН в ПДК с возрастом и полом детей, больных ХГС. Установлено, что у детей в группе 1,5-10 лет функциональная активность в ПДК выше (145,8+30.8), нежели в группе детей 11-18 лет (54.6+19,5; р=0,02). Интересно, что более низкие показатели ИФН-генеза в ПДК приходятся на подростковый возраст, период наиболее интенсивного роста, что коррелирует с ранее высказанными соображениями относительно антипролиферативного действия ИФН и известным фактом снижения иммунной защиты у подростков.

Выявлена также зависимость функционирования ПДК от пола детей: у мальчиков и у девочек (107,6+27,8 и 123,5+35.4. р>0.05) показатели выработки ИФН статистически значимо различались в сторону более высокого ИФН-генеза у девочек, что тоже соответствует более мягкому течению и лучшему ответу на ПВТ у представительниц женского пола.

Связь функционального состояния ПДК с клинико-лабораторнымн параметрами у взрослых, больных ХГС

У взрослых функциональное состояние ПДК при ХГС проанализировано по той же схеме, что и у детей. Так, нами обнаружена связь функционального состояния ПДК и уровня вирусной репликации. Показано, что высокие уровни выработки ИФН (422,8+191,5) характерны для низких уровней репликации вируса и наоборот, низкие показатели выработки ИФН в ПДК определяются при наличии высокой репликации вируса ( 147,1+59,8; р=0,009 соответственно).

Отмечена связь выработки ИФН в ПДК с цитолизом. Уровень выработки ИФН значительно выше при высоких цифрах трансаминаз (314,9+137,7), нежели при нормальных значениях (132,8+42,7; р<0,0001).

Важным, на наш взгляд, является установленная чёткая взаимосвязь уровня выработки ИФН с фиброзом. Чем активнее фиброз, тем выше продукция ИФН в ПДК (рис.5), достигая максимальных значений при Р2-3 (472,1±210,9). Однако на стадии ЦП (Р4) ИФН генез в ПДК снижается (291,3+195,9), оставаясь тем не менее в 17 раз выше, чем в группе с отсутствием фиброза (16,7+9,2; р<0,0001).

500 - У

7 У

= 400 ■

Я 300 - /

-

* с 200 - У /

о. 100 -

м 0 -

-291:3119»-

I

р,.,<0.0001 Ри <0.0001 ры<0.0001 ры=0.0031

р-ч=0.01 р,.,<0.0001 Рз_5=0,003 Р4_5=0.04

5 ' I ' 2 ' 3 '

Здоровые Р0 Р1 Р2-3

Уровень фиброза печени но шкале Метавир,баллы

Рис. 5 Соотношение выработки ИФН в ПДК и фиброза

Нами выявлена также связь между генотипом вируса ГС и выработкой ИФН в ПДК. Оказалось, что у взрослых больных, страдающих ХГС с генотипом вируса 1В, уровни вырабатываемого ИФН достоверно выше (242,8±75,7), чем у больных с генотипом - ЗА (92,84±3445; р<0,0001 соответственно).Возраст пациентов и уровень выработки ИФН также взаимосвязаны между собой. В группе до 40лет уровень выработки ИФН почти в 5 раз выше, чем после 40 лет (рис.6). Полученные нами данные подтверждают тот факт, что возраст является одним из существенных факторов для прогноза течения заболевания и эффективности терапии у больных ХГС.

Анализируя связь функционального состояния ПДК с полом пациентов, мы, как и у детей, показали, что у мужчин, больных ХГС, выработка ИФН в ПДК в 2 раза ниже, чем у женщин: 194,1+94,7 против 393,9+216 (рис.6), что согласуется с известным фактом лучшего течения ХГС у женщин по сравнению с мужчинами.

Рис. 6 Соотношение возраста, пола и функционального состояния ПДК

Сравнительный анализ функционального состояния ПДК у детей и взрослых, больных ХГС

По данным нашей работы, выработка ИФН в ПДК взаимосвязана с уровнем вирусной репликации, оставаясь как у детей, так и у взрослых выше нормы. Однако продукция ИФН в 2раза ниже у детей, чем у взрослых (табл.5).

Таблица 5

Соотношение функциональных параметров ПДК и вирусной нагрузки у детей и взрослых,

больных ХГС.

Больные ХГС Коэффициент достоверности различии, р

Уровень вирусной нагрузки (коп.\мл)

менее 300 10А2-10Л4 10Л5 и более р<0,05 р>0,05

Дети Взрослые Дети Взрос лые Дети Взрослые

Выработка ИФН пг\мл 45,42 + ЗУ1 52,9 ± 30,з2 197,6 + 49,73 422,8 ± 191,54 75,7 + 20,75 147,1 + 59,86 р2-5=0,0001 р3-б<0,0001 Р1 4=0,8831

Интересно, что зависимость функционального состояния ПДК и цитолиза у детей и взрослых носит разнонаправленный характер. У детей выработка ИФН ниже, а у взрослых она повышается (рис.7). Возможно, связь с цитолизом опосредована виремией, степень которой у детей чаще, чем у взрослых не соответствует уровню трансаминаз

В „„, 314,9±137,7 © 4ии 132,8+42,7 |.....

1 I дим^О.ООсК I

|| 200' ^Др^Иоо!

'ё ^^^^, Взрослые

¿3 0 4т1±33,&,.... дети

АлТ норма

АлТ выше нормы

■ Дети

■ Взрослые

Рис. 7 Соотношение функциональных параметров ПДК и цитолиза у детей и взрослых, больных

ХГС.

Столь же сложны взаимоотношения со степенью фиброза печени, анализ которых у наших пациентов оказался затруднён, т.к. у обследованных детей фиброз 2-46. не выявлен.

Влияние генотипа вируса ГС у детей и взрослых однонаправленно: выработка ИФН в случаях с 1В генотипом достоверно выше, чем при генотипе ЗА. Однако, показатели выработки ИФН в детском возрасте у больных с генотипом 1В в 2 раза ниже, чем у взрослых.

Таблица 6

Взаимосвязь выработки ИФН в ПДК и генотипа вируса у детей и взрослых, больных ХГС

Больные ХГС Коэффициент достоверности различий, р

Генотип

1В ЗА р<0,05 р>0,05

Дети Взрослые Дети Взрослые

Выработка ИФН пг\мл 130.9+26,1' 242,8+75.68" 102.7±54.6', 92,84±34,454 Р'А <0,0001 Р~ = 0.8801

Таким образом, выработка ИФН в ПДК у здоровых лиц не определяется и вероятно блокирована пока неизвестными ингибиторами, тогда как у больных ХГС достоверно «разбужена» и определяется выше нормы. Степень изменения функционального состояния ПДК тесно связана с основными факторами, характеризующими течение и исходы ХГС: вирусной нагрузкой, цитолизом, фиброзом и генотипом вируса, а также с полом и возрастом больных. ИФН-образование в ПДК у детей менее интенсивно, чем у взрослых, больных ХГС. Последнее в связи с антипроли-феративными свойствами интерферонов может быть предположительно объяснено необходимостью роста и развития, являющихся биологической сверхзадачей детского возраста.

СООТНОШЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ПДК И ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ (ПВТ) У БОЛЬНЫХ ХГС

Важной частью исследования явился анализ влияния ПВТ на количественные показатели и функциональное состояние ПДК у обследованных пациентов.

Соотношение количественных показателей ПДК и ПВТ у детей

В работе проанализировано изменение количественных показателей ПДК в зависимости от проведения противовирусной терапии (ПВТ) у детей с ХГС. Показано, что в группе больных, обследованных во время проведения противовирусной терапии, абсолютное количество клеток снижено по сравнению с группой больных, в которой терапия не проводилась (7.1 ±1,15 и 15,4+1.2 соответственно р<0,0001 ).У прошедших лечение пациентов абсолютное количество ПДК зависело от её исхода: у больных, не ответивших на ПВТ количество клеток не отличается от такового у больных без терапии и гораздо выше (11.6+1.6), чем в группе лиц, достигших устойчивой вирологической ремиссии (7,1+1,15) (рис.8).

Рис.8 Соотношение количественных показателей ПДК и противовирусной терапии у детей

Отмечено, что процентный состав клеток также изменяется в зависимости от наличия или отсутствия и результата проведения ПВТ. Так, в группе больных, не получавших ПВТ, показатель процентного состава клеток достоверно более высокий (0,3+0,02) по сравнению с группой, обследованной во время её проведения - 0,19+0,03 (р=0,01).Также, как и в абсолютном исчислении, процент ПДК у больных, не ответивших на ПВТ, не отличался от соответствующих параметров у пациентов, не получавших лечения (0,3+0,02 и 0,3+0,04 соответственно р=0,6), и не отличались от нормальных. В то же время у ответивших на ПВТ процентное содержание ПДК было существенно снижено по сравнению с нормой (0,18+0,05 против 0,27+0,045; р=0,004) .

Соотношение количественных показателей ПДК и ПВТ у взрослых

У взрослых, больных ХГС, также как у детей, абсолютное количество клеток ниже в 3 раза в группе, обследованной во время проведении ПВТ -3,7+0.5 относительно группы, не получавшей терапию -9,2+0,93 (р<0,0001). Однако, у взрослых пациентов процентные показатели ПДК больных, не ответивших на терапию (7,2+1,03), не отличаются от таковых в группе не получавшей ПВТ (9,2+0,9), а также от здоровых (10,25+1,75;р>0,05).

Сравнительная характеристика кол и чественн ы.у показателей ПДК и ПВТ у детей и взрослых

При сравнении аналогичных групп детей и взрослых, больных ХГС, оказалось, что как абсолютное число, так и процентный состав ПДК достоверно отличается в группах, обследованных на фоне проведения ПВТ. Так, по нашим данным, как у детей (7,1 + 1,15 и 0,19+0,03), так и у взрослых (3,7±0,5 и 0,14±0.025) отмечено снижение количественных показателей ПДК (р<0,0001 и р=0,01 соответственно), однако у взрослых оно более выражено. В детском возрасте абсолютное количество ПДК достоверно выше в группах, не получавших ПВТ и не ответивших на неё (табл.7). И то, и другое находится в соответствии с установленным нами более высоким содержанием этих клеток у детей.

Таким образом, в нашем исследовании продемонстрирована тесная связь количественных показателей ПДК с наличием или отсутствием ПВТ, а также с её исходом. Снижение количественных показателей во время проведения терапии может быть обусловлено перераспределением ПДК и их миграцией в лимфоидные органы и орган-мишень (печень). В соответствии с полученными данными, успех терапии сопряжён с более выраженной реакцией ПДК в виде миграции их в зону воспаления.

Таблица 7

Сравнительная характеристика количественных показателей ПДК и ПВТ у детей и взрослых,

больных ХГС

Гру ппа № Дети Взрослые Коэффициент достоверности различий, р

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

N 42 11 14 7 7 34 17 28 13 15

Абс. кол-во клеток 15,4 +1,2 7,1+ 1,15 9,3+ 1,2 11,6+ 1,6 7,0+ 1,447 9,2+ 0,93 3,7+ 0,5 7,25 + 0,9 7,2+ 1,03 7,3+ 1,5 р "<0,0001 р2"7<(),0()01 р4"9=0,03

% кол-во клеток 0,3+ 0,02 0,19+ 0,03 0,2+ 0,01 0,3+ 0,04 0,18+ 0,05 0,2+ 0,02 0,14+ 0,025 0,18 + 0,02 0,18+ 0,03 0,17± 0,017 р2_7=0,0135

Соотношение функциональных показателей ПДК и ПВТ у детей, больных ХГС

Проводя сравнительный анализ соотношения функционального состояния ПДК (выработка ИФН) и противовирусной терапии, мы также получили очень интересные данные. Так, у больных, обследованных во время терапии (492,6+228,8). выработка ИФН в ПДК в 3,7 раза выше, чем в группе без терапии (134,4±27,2; р<0,0001 соответственно). По окончании терапии выработка ИФН в ПДК падает (32,4+28,2), оставаясь при этом выше нормы ( не определяется 0 пг\мл; р=0,03).

Соотношение функциональных показателей ПДК и ПВТ у взрослых, больных ХГС

Также, как у детей, у взрослых больных нами обнаружена в 4,7 раз увеличенная продукция ИФН в ответ на ПВТ-2074 +341, в отличие от больных, не получавших ПВТ-453.6+254,2 (р =0,0015).По окончании лечения ИФН-генез в ПДК существенно снижается (111,2+47,2). причём степень этого снижения связана с эффективностью терапии: у не ответивших на терапию количество ИФН. вырабатываемого ПДК. выше в 3 раза (174,3+93,6) по сравнению с группой, достигшей УВО (56,4+32,2; р=0,0008). Отмечено снижение показателей в группе с УВО (56,4+32,2) относительно всей группы больных, обследованных после проведения ПВТ(111,2+47,2; р=0,009).

При сравнении функциональных показателей ПДК в зависимости от ПВТ у детей и взрослых подтверждена уже выявленная нами закономерность: выработка ИФН в детском возрасте достоверно более низкая, чем у взрослых (табл.8).

Таблица 8

Сравнительная характеристика функциональных показателей ПДК и ПВТ у детей и взрослых,

больных ХГС

Группа № Дети Взрослые Коэффициент достоверности различий, Р

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 р<0,05

N 42 11 14 7 7 33 17 2 13 15

ИФН (пг\мл) в ПДК 134.4 + 27,2 492.6 + 228.8 49.8 + 23.9 67.1 + 39.8 32.44 + 28.2 453,6 + 254,2 2074 + 341 111.2 + 47,2 174.3 ± 93,6 56.4 + 32.2 р- <0,0001 р2-7= 0,0007 3-8 Р = 0,0004 4-У Р =0,0094

Соотношение функциональных показателей ПДК и эффективности ПВТ у детей

Анализ функциональных показателен ПДК в зависимости от эффективности ПВТ у детей показал, что ИФН - генез в ПДК резко повышается у пациентов, ответивших на ПВТ : показатели выработки ИФН на фоне лечения у них в 10 раз выше, чем у тех, кто не ответил на терапию (733,5+331,8 и 71,2+41,4: р=0,003) (рис.9).

0

800 700 600 „500

X

о 400

Л

1-300 ш

200 100 0

733,5+331,8 «До терапии

X

3

/

66,2±62,25 ' ^т 89,8+52,8 71.2+41,4

ш 4Я 6,8+6,8

, Я9 ЯШ шт ^ /

Ответившие Не ответившие Ответившие Не ответившие Ответившие Эффективность ПВТ

Рис. 9 Соотношение функциональных показателей ПДК и эффективности ПВТ у детей

У этой же группы пациентов, достигших УВО. после окончания лечения ИФН - образование в ПДК нормализуется, не отличаясь статистически от показателей у здоровых детей (6,8±6,8 и 0пг\мл; р=0,0б).

Взаимосвязь функциональны.у показателей ПДК и эффективности ПВТ у взрослых

Анализ зависимости ответа на ПВТ от реакции ПДК показал, что продемонстрированное повышение ИФН- генеза у пациентов на фоне ПВТ происходит лишь у тех, у кого ПВТ оказалась эффективной. Так, у ответивших на ПВТ стойким прекращением репликации вируса, выработка ИФН в ПДК на 12-й неделе лечения составила 1855+339,1 пг\мл, тогда как у больных не ответивших на ПВТ, выработка ИФН составила 295,7+295,7 пг\мл; р=0,03 (рис. 10).

Не исключено, что именно этот механизм и лежит в основе благоприятного ответа на ИФН -терапию и достижения УВО.

В работе продемонстрирована тесная связь показателей ПДК и ПВТ. Так, у пациентов, ответивших на ПВТ стойким прекращением репликации вируса стимуляция выработки ИФН в ПДК была достоверно выше, нежели у не ответивших на неё. Эти результаты легли в основу разработанного нами прогностического теста.

2500

Е 1500

500

1959

1

1959±341,5 2 0 0 -(--1----^-1

Ответившие

Не ответившие

3iliJ.au.ui,

Ответившие

П.-Г1- ПОТ

Р|2=0,02 Р13=0,0003 рь4<0,001

ры>0,05

■ До терапии

■ На терапии .УВО

Здоровые

Рис. 10 Соотношение функциональных показателей ПДК и эффективности ПВТ у взрослых

Соотношение показателей ПДК с ПВТ у пациентов с отсутствием вирусной репликации (с авиремией).

В работе отдельно проанализировано соотношение показателей ПДК с ПВТ у пациентов с отсутствием вирусной репликации (с авиремией).

Показано, что абсолютное и процентное количество ПДК существенно падает (4,2+0,5) при авиремии, достигнутой во время проведения ПВТ и после её окончания (6,8±0.9; р=0,01), по сравнению с группами пациентов, удерживающими авиремию без ПВТ (12,9+1.7; 0,3+0.04), и нормальными показателями у здоровых лиц (14,3+1,4; 0,3±0,03;р=0,5 и р=0.3 соответственно) (рис.1

Без ПВТ На ПВТ После ПВТ Здоровые

Рис. 11 Соотношение количественных показателей ПДК и ПВТ

Тоесть во время проведения ПВТ количество ПДК в крови минимально, что возможно объясняется активной миграцией их в зону поражения - печень.

При этом интенсивность ИФН - генеза в ПДК наоборот нарастает, достигая максимальных значений (1553+278,4 пг\мл) (рис.12).

1200 -Ґ ,, 1000 X.

800 4-' У 600 хУ

Уровень репликации вируса менее 300МЕ\мл

Рь2<0,0001 Р'-ЧО.ОООІ Р2-'<0,0001

■ Без терапии

* После терапии с УВО

■ Норма

Рис. 12 Соотношение функиионалъных показателей ПДК с ПВТ у пациентов с отсутствием вирусной репликации (с авиремией).

Таким образом, продемонстрирован важный факт, что интенсивность выработки ИФН в ПДК существенно различается в группах пациентов, удерживающих состояние авиремии без ПВТ. «собственными силами» (1098+932), и авиремии, достигнутой с помощью успешной ПВТ (39.7+19,4; р<0,0001). Т.е. у одних пациентов авиремия достигается постоянным напряжением собственного ИФН - генеза, а у других ИФН - генез стимулируется ПВТ и при достижении УВО нормализуется. Эти данные указывают на то. что ИФН - терапия носит не заместительный характер. а оказывает благотворное патогенетическое действие.

Новый тест для прогнозирования ответа на противовирусную терапию (ПВТ) при хроническом гепатите С (ХГС)

Прогнозирование эффективности лечения больных ХГС представляет собой важную практическую задачу в связи с высокой стоимостью противовирусных препаратов, наличием многочисленных побочных действий при их применении, а также связанной с этим необходимостью выбора и коррекции методов лечения, режимов и длительности его проведения (принцип персонализированной медицины).

На основании данных исследования и для оптимизации работы практикующего врача нами разработан прогностический тест, который позволяет на 12-й неделе лечения предсказать эффективность проводимой противовирусной терапии у больных ХГС детей и взрослых.

Предложено определять уровень выработки интерферона плазмацитоидными дендритными клетками (ПДК) в периферической крови на 12-й неделе противовирусного лечения.

В ходе работы показано, что пациенты, положительно ответившие на ПВТ стойким прекращением репликации вируса, имели на 12-й неделе лечения показатель выработки ИФН в ПДК -1558+277,5шЛмл, а те, кто не дал желаемого ответа - 69,11 +54,33 пг\мл (у здоровых детей и взрослых ИФН в ПДК не определяется, поэтому за уровень выработки ИФН в ПДК у здоровых лиц принято Зпг\мл - верхний уровень детекции метода). Статистическая достоверность различий показателей в сравниваемых группах очень высока (р<0,001). Как указывалось выше, основной (реперной) точкой, к которой «привязаны» критерии оценки эффективности ПВТ и её коррекции является 12 недель от начала лечения.

Полученные нами данные указывают на тесную связь стимуляции ИФН-образования в ПДК с положительным ответом на ПВТ, в связи с этим уровень подъёма ИФН-генеза в ПДК на 12°" неделе лечения может служить надёжным прогностическим тестом эффективности проводимой терапии (рис.13).

все больные с вир. на терапии 12- сразу после терапии бмес и более после нагр. 10л5 и выше 16нед. окончания терапии

Рис. 13 Динамика ИФН-генеза в ПДК в зависимости от ПВТ.

При обследовании пациентов до начала терапии нами также выявлена взаимосвязь выработки ИФН в ПДК с эффективностью проводимой терапии. Так, у больных ответивших на ПВТ, выработка ИФН в ПДК перед лечением была в 4 раза выше (293,7+112,8 пг\мл), чем у пациентов не ответивших на лечение (56,9+35,1) стойким прекращением репликации вируса (р=0,02). Вероятно, определение выработки ИФН в ПДК до терапии также может служить предиктором эффективности проводимого лечения.

Таким образом, удалось показать, что положительный ответ на ПВТ тесно связан с уровнем ИФН - образования в ПДК: чем выше уровень выработки ИФН, тем вероятнее благоприятный ответ на ПВТ.

Если уровень интерферона в выделяемых из крови плазмоцитоидных дендритных клетках увеличился в 2,6х102 и более раз у взрослых пациентов, в 1.2X102 и более раз у детей по сравнению с исходным (определяемым перед началом терапии) прогнозируют эффективность проводимого лечения с вероятностью 96,9%). На основании всего выше изложенного подана заявка на патент (per. № 2012157606 от 27.12.2012).

ВЫВОДЫ.

1. Количественные показатели (абсолютное и процентное содержание) ПДК в крови здоровых лиц достоверно выше в детском возрасте, чем у взрослых.

У больных ХГС количественные показатели ПДК закономерно снижены по сравнению со здоровыми лицами, но степень снижения у детей достоверно меньшая.

2. Количественные показатели ПДК как у детей, так и у взрослых с ХГС тесно связаны с наличием и уровнем вирусной нагрузки, с генотипом вируса и возрастом пациентов: наиболее низкие показатели при высокой виремии, у больных с 1 генотипом вируса, в пубертатном периоде и у лиц старше 40 лет.

У взрослых пациентов количество ПДК также достоверно снижается в связи с нарастанием цитолиза и фиброза.

3. Функциональное состояние ПДК (выработка ИФН) у здоровых лиц (как детей, так и взрослых) блокирована находящимися в плазме ингибиторами, в связи с чем в норме ИФН в ПДК не определяется.

4. У больных ХГС как взрослых, так и детей, выработка ИФН в ПДК достоверно выше нормальных значений. Степень повышения закономерно связана с уровнем вирусной репликации, цитолиза, фиброза и генотипа вируса. Интенсивность ИФН - генеза в ПДК более выражена у взрослых пациентов.

5. Противовирусная терапия существенно влияет на состояние ПДК. Имеет место:

- закономерное снижение количества ПДК в крови, более выраженное у взрослых пациентов

- стимуляция ИФН - генеза в ПДК

6. Степень стимуляции ИФН - образования в ПДК достоверно связана с ответом на ПВТ. Уровень подъема ИФН - генеза в ПДК на 12ой неделе лечения может служить надёжным прогностическим тестом эффективности проводимой ПВТ: чем выше достигнутый уровень выработки ИФН в ответ на ПВТ, тем вероятнее благоприятный ответ.

7. Состояние ПДК у детей, как здоровых, так и больных ХГС, по многим показателям существенно отличается от таковых у взрослых. Главной особенностью ПДК у детей является значительно более высокое содержание этих клеток (как абсолютное, так и процентное по отношению к общему числу лимфоцитов) в норме, при ХГС без лечения и в ответ на ИФН-терапию, что возможно лежит в основе более благоприятного течения и результатов ПВТ у детей.

8. Обнаруженная закономерная взаимосвязь количества и функции ПДК с вирусной нагрузкой, степенью цитолиза и фиброза, а также ответом на ПВТ при ХГС у взрослых и детей демонстрирует важную роль ПДК в патогенезе этой инфекции, её течении, исходах и результатах терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В дополнение к традиционным клинико-лабораторным методам показатель выработки ИФН в ПДК в периферической крови предлагается как новый тест для прогнозирования эффективности ПВТ у больных ХГС (детей и взрослых) на 12 неделе её проведения.

Способ, предлагаемый нами, осуществляется следующим образом: у пациента, страдающего ХГС, проводят забор венозной крови до назначения противовирусной терапии и на 12ой неделе её проведения. Забор венозной крови осуществляют стандартным способом в пробирку 10 мл (или 5 мл) с консервантом ЭДТА. Венозную кровь хранят не более 6 часов. Исследование осуществляют сразу после забора крови, учитывая время, необходимое для клеточной стабилизации (не менее 40мин.). Далее в ламинаре, в стерильных условиях, отбирают

100 мкл крови, к которым добавляют 200 мкл раствора А (для приготовления раствора А необходим стимулятор клеточного роста ODN2216 - синтетический олигонуклеотид, иммуностимулирующий сугубо TLR9 рецепторы) и 200 мкл раствора В (для приготовления раствора В необходим IL3, который стимулирует дифференцировку мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток). Затем пробу помещают в С02 инкубатор на 24 часа, после чего кровь центрифугируют и отбирают супернатант культуры клеггок, который замораживают при -80°С до последующей стадии обработки пробы. На следующем этапе пробы размораживаются и проходят стандартную постановку методом ИФА «ELISA», который предназначен для определения уровня выработки ИФН.

Полученные результаты оцениваются врачом на основании предложенного наш! прогностического теста. Степень повышения уровня ИФН в ПДК на 12°" неделе терапии в 2,6х102 раз у взрослых и 1,2x102 у детей позволяет предсказать стойкий внрологический ответ с высокой достоверностью (вероятность прогноза - 96%), что может служить основой построения персонализированного подхода к противовирусной терапии ХГС у взрослых и детей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рейзис, А.Р. Значение плазмоцитоидных дендритных клеток в патогенезе и интерферонооб-разовании при ХГС у детей и взрослых / А.Р. Рейзис, О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская, В.П.Чуланов, Л.В. Пичугина// Материалы семнадцатого Российского конгресса «Гепатология сегодня», 19-21 марта 2012,-Москва: Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии.-2012.-Т.ХХН.№2- приложение №39.- С.23

2. Рейзис, А.Р. Место плазмоцитоидных дендритных клеток в патогенезе и интерферонообра-зовании при ХГС у детей и взрослых / А.Р. Рейзис, О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская, В.П.Чуланов, Н.А.Шмаков, Л.И.Елезова// Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 26-28 марта 2012.-Москва: Журн. Инфекционные болез-ни.-2012.-Т.10.-приложение №1.- С.316

3. Рейзис, А.Р. Роль плазмоцитоидных дендритных клеток в патогенезе хронического гепатита С /А.Р. Рейзис, О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская // Журнал «Инфекционные болезни». - 2012. -Т.Х. -№1.-С.5-9.

4. Рейзис, А.Р. Хронический гепатит С: новое в иммуно- и интерфероногенезе / А.Р. Рейзис, О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская, В.П.Чуланов // Материалы восемнадцатой Российской Гастроэнтерологической недели, 8-10 октября 2012.-Москва: Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии.-2012.-Т.ХХ11.№5- приложение №40,- С.96

5. Хохлова, О.Н. Количество и функциональные возможности плазмоцитоидных дендритных клеток у здоровых лиц / О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская, В.П.Чуланов, А.Р. Рейзис // Материалы восемнадцатой Российской Гастроэнтерологической недели, 8-10 октября 2012.-Москва: Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологни.-2012,-Т.ХХП.№5- приложение №40,- С. 141

6. Рейзис, А.Р. Обзор литературы: Плазмоцитоидные дендритные клетки и их роль в патогенезе и интерферонообразованни при хроническом гепатите С /А.Р. Рейзис, О.Н. Хохлова // Журнал «В мире вирусных гепатитов». - 2012. - №3-4. - С.17-23.

7. Рейзис, А.Р. Плазмоцитоидные дендритные клетки при хроническом гепатите С у взрослых и детей (роль в патогенезе и ответе на интерферонотерапию) / А.Р. Рейзис, О.Н. Хохлова, Л.В. Серебровская // Журнал «Инфекционные болезни». -2013. - T.XI. - №1. - С.6-10.

8. Рейзис, А.Р. Новый прогностический тест эффективности противовирусной терапии хронического гепатита С у взрослых и детей / А.Р. Рейзис, О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская, A.A. Попова// Материалы V Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням,

25-27 марта 2013.-Москва: Журн. Инфекционные болезни.-2013.-Т. 11 .-приложение № 1 .-С.338

9. Рейзис, А.Р. Новые аспекты иммунного ответа организма на интерферонотерапию при ХГС у взрослых и детей / А.Р. Рейзнс, О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская // Материалы XVIII Российского конгресса «Гепатология сегодня», 25-27 марта 2013.-Москва: Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии.-2013.-Т.ХХШ.№ 1 - приложение №40.- С.41

10. Рейзнс, А.Р. Плазмоцнтоидные дендритные клетки и их роль в патогенезе ХГС у взрослых и детей / А.Р. Рейзнс, О.Н.Хохлова, Л.В.Серебровская // Материалы XVIII Российского конгресса «Гепатология сегодня», 25-27 марта 2013.-Москва: Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии.-2013.-Т.ХХШ.№1- приложение №40.- С.59

11. Khokhlova, O.N. Plasmacytoid dendritic cells in HCV infection and response to iFn therapy in children and adults /O.N. Khokhlova, A. R. Reizis, L.V. Serebrovskaya, B. Reizis// Материалы конференции Gastro 2013 APDW/WCOG. 21-24 сентября 2013.- Shanghai: Journal of Gastroenterology and Hepatology. [Epub ahead of print]

Подписано в печать 21.09.2013 г.

Усл.п.л. - 1.5 Заказ №16325 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru