Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Патофизиологические механизмы формирования хронической обструктивной болезни легких ( клинико-экспериментальное исследование)

^ 003474307

На правах рукописи

КУЗУБОВА Наталия Анатольевна

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.43 - пульмонология 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 5 ИЮ9 2003

Санкт-Петербург - 2009

003474307

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

ИЛЬКОВИЧ

МИХАИЛ МИХАЙЛОВИЧ

ДАНИЛОВ

ЛЕВ НИКОЛАЕВИЧ

ЧУЧАЛИН

АЛЕКСАНДР ГРИГОРЬЕВИЧ КОРОВИНА

ОКСАНА ВСЕВОЛОДОВНА НИКОЛАЕВ

ВАЛЕНТИН ИВАНОВИЧ

Ведущая организация: «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова».

Защита состоится «22» сентября 2009 года в 1315 часов на заседании диссертационного совета Д.208.090.02 при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова, в НИИ пульмонологии (197089, Санкт-Петербург, ул. Рентгена, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.6/8).

Автореферат разослан «_»_2009 года

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук,

профессор А.Л. Александров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в мире и приводит к значительному и постоянно растущему экономическому и социальному ущербу [GOLD, update 2007]. Адекватное лечение может значительно увеличить продолжительность и улучшить качество жизни (КЖ) больных, страдающих этой легочной патологией [Чучапин А.Г., 2004]. В основе возникновения и прогрессирования ХОБЛ лежит хроническое воспаление, которое, с одной стороны, является универсальной реакцией на воздействие факторов риска развития болезни, а с другой - главной причиной всех функциональных и морфологических проявлений ХОБЛ. В развитии ХОБЛ предполагается участие факторов воспаления, прежде всего системы цитокинов, а также факторов, регулирующих пролиферацию соединительной ткани: систем коллагенолиза и фибринолиза. Недостаточно изучено влияние противовоспалительных (ПВ) цитокинов, в частности EL-10, на персистенцию воспалительного процесса при ХОБЛ как в очаге воспаления, так и на системном уровне. Отсутствуют сведения об адекватном увеличении синтеза этих цитокинов по мере прогрессирования заболевания. Кроме того, за последние два года появились факты в пользу развития системного воспаления при ХОБЛ как независимого процесса [Augusti А., 2003], этот вопрос продолжает обсуждаться в литературе. Несмотря на проведение исследований, имеется мало сведений, касающихся влияния изучаемых полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ (ММР) на особенности развития ХОБЛ. В Японии частота промоторного варианта гена ММР-9 (С-1562Т) была связана с патологией легких при ХОБЛ, хотя не было обнаружено корреляций с клиническими нарушениями легочных функций [Ito A. et а!., 2005]. Сведения о роли полиморфизмов в других ММР при формировании ХОБЛ недостаточны и неоднозначны. Одним из наиболее изученных генных полиморфизмов является делеция или вставка (I/D) в регуляторном участке гена ангиотензинконвертирующего энзима (АСЕ) АСЕ-1. Показана связь ряда полиморфизмов (I/D гена АСЕ-1, S/L гена транспортера серотонина (5-НТТ)) с легочной гипертензией (ЛГ) при ХОБЛ [Eddahibi D. и соавт., 2003; Sayed-Tabatabaei F.A. et al„ 2006]. Ввиду доказанной роли ММР в коллагенолизе и фиброзе бронхоальвеолярной системы при ХОБЛ, представляется целесообразным исследовать функциональные промоторные полиморфизмы ММР-1 1G/2G и ММР-3 5А/6А, активно участвующие в разрушении межклеточного матрикса, и на примере российской популяции определить частоту гиперактивных аллелей генов (АСЕ-1, 5-НТТ), влияющих на сосудистый тонус, а, следовательно, играющих важную роль в патогенезе ХОБЛ и в формировании ЛГ.

Вследствие ряда последовательных патологических изменений в

стенке сосудов малого круга кровообращения (МКК), гипоксемии, полицитемического синдрома при ХОБЛ формируется «легочное сердце», декомпенсация которого является одной из причин инвалидизации и смертности больных. В литературе обсуждается роль системной дисфункции эндотелия (ДЭ) в инициации и прогрессировании ХОБЛ, ее взаимосвязи с изменением показателей легочной гемодинамики и функциональным состоянием сердца [Кароли H.A. и др. 2004]. Однако отсутствуют работы, посвященные изучению влияния ПВ терапии на ДЭ и гемоциркуляторные нарушения при ХОБЛ.

В настоящее время ведется поиск лекарственных средств, способных повлиять на воспаление при ХОБЛ и, тем самым, замедлить или остановить течение болезни [Birell MA, et al., 2005]. Кортакостероиды (КС) являются основными препаратами, обладающими ПВ эффектом. Ингаляционные глкжокортикостероиды (ИГКС) при ХОБЛ, как известно, менее эффективны, чем при бронхиальной астме, что связано с активизацией различных типов клеток воспаления и усилением синтеза различных медиаторов при этих двух заболеваниях. Несмотря на это, метанализ результатов ряда клинических исследований продемонстрировал, что ИГКС у пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением болезни улучшили статус здоровья, в т.ч. снизили частоту обострений и уровень смертности [Sin D. et al., 2005]. Есть данные, что ИГКС оказывают положительный эффект и на гиперреактивность бронхов, определяющуюся у 60-80% больных ХОБЛ [Donohue J.F. 2005]. Одним из условий успешного лечения этого заболевания является преодоление КС-рефрактерности, которая может быть обусловлена не только уже известными молекулярными изменениями [Barnes Р., 2005]. В настоящее время изучается возможность применения в лечении больных ХОБЛ нового поколения ингибиторов провоспалительных медиаторов или рецепторов к ним. Одним из них является фенспирид [Шмелев Е.И., 2003; Чучалин А.Г., и др. 2005]. С учетом известных фармакологических эффектов препарата [Шмелев Е.И., 2003; Визель A.A. и др., 2007] представляется перспективным изучить его влияние на системное воспаление и показатели легочно-сердечной гемодинамики при ХОБЛ. В доступной литературе отсутствуют указания на подобные исследования.

В развитии любого воспаления, в т.ч. и при ХОБЛ участвует и нервная система, которая первой реагирует на все внешние воздействия и участвует в формировании ответных реакций. Известно, что негеномные эффекты КС реализуются через ряд нейрогенных звеньев: увеличивается число тормозных пресинаптических М2-рецепторов в функциональном модуле, улучшается их функция и, соответственно, снижается бронхиальная гиперреактивность; уменьшается число М2- и М3-холинорецепторов на гладких мышцах (ГМ) дыхательных путей (ДП); увеличивается активность ацетилхолинестеразы в

синапсе функционального модуля; прямо и опосредовано КС увеличивают релаксирующую активность р2-агонистов [Johnson М. et al., 2001]. Очевидно, что при ХОБЛ перестройка бронхолегочной ткани затрагивает и нейрогенные структуры, а это, в свою очередь, способствует формированию дополнительных механизмов КС-рефрактерности, изучение которых может внести существенный вклад в достижение положительных результатов лечения.

Цель работы: установить клеточно-молекулярные и нейрогенные механизмы, участвующие в формировании и прогрессировании ХОБЛ, определить возможность медикаментозной коррекции выявленных нарушений.

Задачи.

1. Определить роль клеточно-молекулярных факторов (показателей врожденного и адаптивного иммунитета, цитокинов, ростовых факторов) в развитии локального и системного воспаления на различных стадиях ХОБЛ и оценить возможность коррекции выявленных изменений.

2. Провести генотипирование функционально активных промоторных аллелей генов ММР-1 (1G/2G16"7); ММР-3 (5А/6А-6"0); 5-НТТ S/L (участок HTTLPR), а также интронного полиморфизма гена АСЕ-1 Ю для определения роли некоторых патогенетически значимых функциональных генных вариантов в формировании клинических проявлений ХОБЛ.

3. Оценить влияние ПВ терапии беклометазон дипропионатом (БДП) и фенспиридом на клиническое течение и показатели качества жизни у больных ХОБЛ в зависимости от тяжести течения заболевания.

4. Изучить влияние ПВ терапии БДП и фенспиридом на микроциркуляцию (МЦ) МКК, показатели легочной и центральной гемодинамики у больных ХОБЛ в зависимости от тяжести течения заболевания.

5. Изучить вазорегулирующую функцию эндотелия в зависимости от стадии ХОБЛ, сопоставить ее с основными показателями легочно-сердечной гемодинамики и определить возможность медикаментозной коррекции выявленных нарушений БДП и фенспиридом.

6. Создать математическую модель, прогнозирующую клиническую эффективность лечения ИГКС.

7. Создать модель ХОБЛ в эксперименте и определить особенности течения воспалительного процесса в очаге воспаления и на системном уровне.

8. Изучить роль автономной нервной системы в развитии обструктивных нарушений на различных этапах формирования ХОБЛ в эксперименте.

9. Выявить нейрогенные механизмы КС-рефрактерности и определить оптимальные сроки применения ИГКС при формировании ХОБЛ в эксперименте.

10. Изучить возможность медикаментозной профилактики формирования и

прогрессирования ХОБЛ в эксперименте.

Научная новизна.

■ Разработано новое направление в патогенезе ХОБЛ - установлена роль

сосудистых и нейрогенных механизмов в формировании этого

заболевания:

- доказано, что у пациентов ХОБЛ без выраженной артериальной гипертензии и ишемической болезни сердца уже на 2 стадии (ст.) заболевания определяется системная ДЭ и нарушение легочно-сердечной гемодинамики. БДП и фенспирид оказывают положительное влияние на показатели легочно-сердечной гемодинамики у больных со среднетяжелым течением ХОБЛ;

- построена математическая модель, прогнозирующая клиническую эффективность назначения ИГКС. Показано, что основными индикаторами, определяющими прогноз, являются показатели, характеризующие васкулярные процессы: уровень гемоглобина (Hb), величина систолического давления в легочной артерии (СДЛА) и диастолический размер правого желудочка (ПЖд);

- впервые показано корригирующее влияние БДП и фенспирида на васкулярные нарушения у больных 2 ст. заболевания, что опосредуется ингибированием нейрогенных механизмов воспаления и лежит в основе реализации клинического эффекта применяемых лекарственных средств;

- впервые выявлена прогностическая значимость генотипа ACE D как фактора высокого риска развития системной ДЭ при ХОБЛ, а также выявлена взаимосвязь между частотой носительства аллеля D гена АСЕ и частотой обострения ХОБЛ. Показано, что генотип D/D гена АСЕ у больных ХОБЛ ассоциирован с ранней смертью среди лиц мужского пола.

- создана экспериментальная модель ХОБЛ при использовании диоксида азота (N02) в качестве инициирующего фактора (решение о выдаче патента от 19.02.2009 г.). Впервые показано, что N02 взаимодействует с афферентными капсаицин-чувствительными С-волокнами ДП, инактивируя их по мере увеличения срока воздействия;

- в эксперименте доказана роль автономной нервной системы в развитии обструктивных нарушений на этапах формирования ХОБЛ: на ранних стадиях заболевания нарушается работа афферентного звена и постганглионарных пресинаптических М2-холинорецепторов, на поздних -снижается сократительная активность мышц ДП;

- впервые установлено, что КС, взаимодействуя с эфферентными С-волок-нами на ранних стадиях формирования ХОБЛ, оказывают дилатационное действие на бронхи; на поздних стадиях, напротив, вызывают бронхоко-нстрикторный эффект. Инактивация рецепторов С-волокон является одним из механизмов КС-рефрактерности при прогрессировании ХОБЛ;

- в эксперименте впервые доказана возможность замедления формирования ХОБЛ при использовании некортикостероидного ПВ препарата фенспирида. Это может стать одним из направлений для разработки первичной медикаментозной профилактики этого заболевания при длительном воздействии агрессивных ингаляционных факторов.

■ Установлено, что на 2 и 3 ст. ХОБЛ в очаге воспаления и на системном уровне отсутствует компенсаторное увеличение содержания ПВ цитокинов (IL-Ira, IL-10). Выявлено независимое течение системного и локального воспаления.

■ Впервые установлено прогностическое значение генов, определяющих ремоделирование межклеточного матрикса при воспалительных процессах в легких как факторов высокого риска развития ЛГ (генотип ММР-1 1G/1G) и трахеобронхиапьной дискинезии (ТБД) (генотип ММР-3 5А/5А) при ХОБЛ.

■ Показано, что развитию дыхательной недостаточности (ДН) у больных ХОБЛ способствует генотип L гена 5-НТТ, регулирующий транспорт и захват серотонина.

Практическая значимость работы. Возможность коррекции сосудистых нарушений, оказывающих существенное влияние на формирование и прогрессирование ХОБЛ, определяет эффективность ПВ терапии при этом заболевании. Результаты исследования позволили обосновать раннее (начиная со 2 ст.) назначение ИГКС больным ХОБЛ.

Доказано, что прогностическими критериями эффективности терапии ИГКС у больных ХОБЛ являются уровень Hb, величина СДЛА, размер ПЖд. Определение этих показателей доступно в лечебной практике.

Установлено, что комбинация ИГКС и фенспирида при ХОБЛ может замедлить развитие сосудистых изменений, способствующих нарушению гемодинамики МКК, формированию хронического легочного сердца (ХЛС) и инвапидизации больных. Раннее назначение фенспирида может замедлить прогрессирование заболевания даже при условии продолжающегося влияния поллютантов, что следует учитывать при ведении пациентов, имеющих контакт с агрессивными ингаляционными факторами.

Для оценки функционального состояния эндотелия в клинической практике может быть использован широко доступный интегральный метод УЗ диагностики сосудодвигательной функции плечевой артерии.

Научно обоснована необходимость определения функционального варианта I/D гена АСЕ-1 для определения кардиоваскулярного риска и коррекции лечения у всех пациентов с ХОБЛ мужского пола.

Положения, выносимые на защиту. l.Ha фенотипические особенности ХОБЛ влияют функциональные полиморфизмы генов ММР-1, ММР-3, АСЕ-1 и 5-НТТ: а) генотип ММР-1 1G/1G является фактором повышенного риска развития

ЛГ;

б) носительство генотипов ММР-3 5 А/5 А и ММР-1 2G/2G и НТТ S влияет на частоту встречаемости ТБ Д;

в) гиперактивный аллель L гена 5-НТТ ассоциирован с прогрессированием ДН;

г) генотип АСЕ D является фактором высокого риска развития системной ДЭ.

2. Дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов способствует прогрессированию хронического воспаления при ХОБЛ.

3. Сосудистые изменения играют значительную роль в формировании и развитии ХОБЛ:

а) увеличение концентрации эндотелина-1 (ЕТ-1), расстройства легочной МЦ, повышение уровня СДДА выявляются на 2 ст. ХОБЛ. При прогрессировании заболевания эти показатели достоверно не изменяются, однако нарастают вентиляционные расстройства;

б) положительный клинический эффект ПВ терапии БДП и фенспиридом реализуется за счет оптимизации состояния легочного сосудистого русла;

в) функциональные варианты генов ММР-1, ММР-3, АСЕ-1 и 5-НТТ патогенетически значимые при ХОБЛ, ассоциированы с развитием патологических васкулярных реакций.

4. Пусковым моментом развития нейрогенного воспаления при экспериментальном воспроизведении ХОБЛ является активация афферентных нервных окончаний С-волокон длительными ингаляциями N02.

5. Рефрактерность к КС при ХОБЛ определяется не только молекулярными факторами, но и нейрогенным (негеномным) механизмом. Дилатация ГМ бронхов при использовании КС опосредована их влиянием на рецепторы С-волокон. При прогрессировании заболевания снижается возможность нервных структур принимать участие в адекватном ответе на КС, что уменьшает вероятность достижения клинического эффекта.

6. Применение низких доз фенспирида за счет активации рецепторов С-волокон препятствует формированию ХОБЛ в эксперименте.

Апробация и практическая реализация материалов диссертации. По теме диссертации написаны клинические рекомендации и 2 пособия для врачей. Получено положительное решение о выдаче патента от 19.02.2009 г. на заявку №2008111053 от 25.03.08 «Способ моделирования ХОБЛ». Материалы диссертации были представлены на 15-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (БОД) (Санкт-Петербург, 2006), на 16-м Конгрессе Европейского Респираторного Общества (ERS) (Германия, Мюнхен, 2006), на научно-практической конференции, посвященной 40-

летию НИИ пульмонологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2007), на Санкт-Петербургском обществе терапевтов имени С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2007), на 17-м Национальном Конгрессе по БОД (Казань, 2007), на Научном Совете СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2007), на 17-м Конгрессе ERS (Швеция, Стокгольм, 2007), на республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы пульмонологии» (республика Карелия, Петрозаводск, 2008), на научно-практической конференции «От научных исследований к практической пульмонологии» (Санкт-Петербург, 2008), на научно-практической конференции «ХОБЛ - актуальная проблема респираторной медицины» (Самара, 2008), на 7-м Конгрессе терапевтов Санкт-Петербурга и СевероЗападного Федерального округа России (Санкт-Петербург, 2008); на 18-м Национальном конгрессе по БОД (Екатеринбург, 2008), на 18-м Конгрессе ERS (Германия, Берлин, 2008), на научной сессии НИИ пульмонологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2009).

Результаты исследования внедрены в практическую работу клиники НИИ пульмонологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, районных поликлиник и пульмонологических отделений стационаров г. Санкт-Петербурга, Великого Новгорода, Петрозаводска.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК - 12; в научных журналах - 2; глав в монографии - 1; в сборниках трудов Национальных конгрессов - 3; в сборниках трудов международных конгрессов - 7.

Личный вклад автора. Исследования, представленные в диссертационной работе, выполнены при непосредственном участии автора в ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации: в НИИ пульмонологии, в научно-методическом центре молекулярной медицины, на кафедре рентгенологии и радиационной медицины, а также в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Самостоятельно проводилось клиническое обследование больных. Методики, описанные в клиническом и экспериментальном разделах, осуществлялись под личным контролем автора. На исследования, выполненные совместно, имеются ссылки в диссертации и в совместных публикациях. Доля участия автора в накоплении, обобщении и анализе материала составляет 100%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 399 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 2 разделов, включающих 12 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 82 таблицами и 120 рисунками.

Библиографический указатель содержит 419 источников, в том числе 351 -зарубежных авторов.

КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Материалы и методы исследования. В исследование вошли 90 больных ХОБЛ, находившиеся на лечении в клинике НИИ пульмонологии с 2004 года по 2007 год. Оценка стадии ХОБЛ проводилась в соответствии с классификацией тяжести ХОБЛ согласно требованиям GOLD 2007 г. Все обследованные больные - лица мужского пола со стажем курения не менее 20 пачка-лет. Средний возраст пациентов составил 60,7±5,56 лет. Показания для включения больных в исследование: ХОБЛ средней (2 ст.) и тяжелой (3 ст.) степени тяжести, отсутствие клинически значимой сопутствующей патологии. В исследование не включались пациенты, имеющие сопутствующую патологию легких, требующие проведения длительной кислородотерапии и использующие ранее ПВ терапию. Перед началом исследования пациенты подписали форму информированного согласия. Было сформировано 3 группы пациентов: 1 группа - больные ХОБЛ 2 ст., которым был назначен фенспирид в дозе 80 мг/сут.; 2 группа - больные ХОБЛ 2 ст., которым был назначен БДП в дозе 800 мкг/сут.; 3 группа - больные ХОБЛ 3 ст., которым был назначен БДП в той же дозе. Пациенты трех групп получали ипратропиум бромид ежедневно в дозе 160 мкг/сут. на протяжении всего периода наблюдения (6 мес.).

Исследование КЖ больных ХОБЛ до и после лечения было проведено с помощью респираторной анкеты больницы Святого Георгия.

Комплексное исследование функции внешнего дыхания. Проходимость ДП оценивали спирометрическим методом на аппарате «Мастер-скрин» («Э. Егер», Германия). Выраженность изменений оценивалась согласно градациям изменений по Р.Ф. Клементу с соавторами (1986). Газовый состав и кислотно-основное состояние артериализованной капиллярной крови (парциальное напряжение кислорода и углекислого газа в условиях покоя оценивались с помощью микрометода Аструпа на аппарате «AVL» (Австрия). Жизненная емкость легких (ЖЕЛ), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ]), мгновенная объемная скорость при выдохе 25, 50, 75% (МОС25, М0С50, МОС75) определялись при анализе спирометрии. Общая емкость легких, остаточный объем легких определялись методом общей плетизмографии. Определение диффузионной способности легких проводилось: в устойчивом состоянии вентиляции (ДСЛу) и при задержке дыхания (ДСЛзд). Электрокардиография проводилась на 12-канальном аппарате «MAC 1200» фирмы «ST GE Medikal Systems IT» (Германия). Рентгенография грудной клетки выполнялась на рентгеновской установке фирмы «Fillips Optimus» (Германия). Компьютерная томография грудной

клетки (KT) и высокоразрешающая функциональная KT проводилась на мультисрезовом спиральном KT сканере фирмы Toshiba Astenion (США) [Muller N.L. et al., 1997]. Сцинтигрифия легких выполнялась на гамма-камере "Sigma -410 S. Эмболизирующий радиофармацевтический препарат -Макротех (Москва) вводился внутривенно в дозе 1-1,5 мБк на 1 кг веса исследуемого. Сбор информации осуществляли в течение 2-4 минут при поверхностном дыхании пациента в трех проекциях с набором 300.000 импульсов на каждую сцинтиграмму. Последующий анализ проводился путем компьютерной обработки по шести условным зонам легких (верхняя, средняя и нижняя в обоих легких). Эходоптерокардиографая выполнялась на УЗ сканнере экспертного класса GE VIVID7 Dimension (General Electrics, США, 2005). Определялись планиметрические и расчетные гемодинамические показатели. Оценка функции эндотелия осуществлялась с помощью пробы с реактивной гиперемией плечевой артерии по методу D.S. Celermajer и соавт. (1992) и по содержанию эндотелина в плазме крови методом иммуноферментного анализа (ИФА), с использованием коммерческих тест-систем фирмы BIOMEDICA (Австралия). Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM-3000» фирмы DRG (США) при длине волны 450 нм. Бронхоскопические методы исследования включали бронхофиброскопию, сегментарный бронхоальвеолярный лаваж для проведения цитологических, морфологических и иммунологических исследований. Бронхофиброскопия выполнялась бронхофиброскопами фирмы «01утри8»(Япония) модели: BFT10, BFT20, а также фирмы «Pentax» (Германия): модель FBI8Р. В оценке эндоскопических данных была использована классификация бронхоскопической картины воспалительных изменений

трахеобронхиального дерева, предложенная проф. В.А. Герасиным (1989). Степень ТБД определялась по классификации Овчинникова A.A. [Лукомский Г.И.идр„ 1982 г.].

Иммунологические и молекулярно-биологические методы исследования. Разделение клеток иммунной системы на основные популяции проводилось с помощью набора моноклональных антител к специфическим дифференцировочным антигенам, которые экспрессируются на поверхности разных типов клеток. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов изучали в тестах спонтанного и стимулированного микробными полисахаридами (продигиазаном и зимазаном) фагоцитоза. Уровень цитокинов IL-8, IL-1 ß, IL-lra определяли методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем ТОО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM-3000» фирмы DRG (США) при длине волны 450 нм. Уровень трансформирующего фактора роста Р (TGFß) определяли методом твердофазного ИФА с использованием

тест-систем фирмы DRG (США). Уровень циркулирующих комплексов (ЦИК) в сыворотке крови и ЖБАЛ определяли по методу V.Haskova (концентрации полиэтиленгликоля: 3,75% - для осаждения крупных ЦИК и 7% - для осаждения средних ЦИК). Проводилось генотипирование функционально активных промоторных аллелей генов ММР-1 (1G/2G16117), ММР-3 (5А/6А"М1) и PAI-1 (4G/5G"675), 5-НТТ S/L (участок HTTLPR), а также интронного полиморфизма гена АСЕ-I I/D (инсерционный и делеционный варианты). Геномную ДНК для исследования выделяли из лейкоцитов крови больных и доноров после лизиса, иммобилизации и очистки ДНК на сорбенте с применением набора «ДНК-Сорб» (Литех, Москва). Генотипы ММР-1 (1G/2G), ММР-3 (5А/6А) определяли с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Подбор соответствующих праймеров осуществляли с помощью программы Primer Express (Applied Biosystems, Германия), причем искомый точечный полиморфизм располагали на З'-конце передних праймеров. Для определения инсерционных и делеционных аллелей генов АСЕ-1 и 5-НТТ использовали ранее описанные пары праймеров. Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 5х ПЦР-буфер (Амплисенс, Москва); смесь дезоксинуклеотидов (MBI Fermentas, Каунас, Литва), праймеры (от 0,05 до 0,3 пМ) производства «Синтол» (Москва), ДНК-Taq полимеразу («ДНК-Технология, Москва», 1,0 ME в пробе) и геномную ДНК (2,5 мкл на реакцию) в общем объеме 10 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе ICycler (Bio-Rad, США). Режимы ПЦР были следующими: 94°С, 5 мин; 40 циклов ПЦР: денатурация: 94°С, 30 с; отжиг в течение 30 с: 55°С (ММР-1), 54°С (ММР-3/5А), 49°С, (ММР-3/6А), 65°С (5-НТТ), 67°С (АСЕ-1); элонгация: 72°С, 30 с (40 циклов); 72°С, 7 мин. Продукты ПЦР оценивали после электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле при окраске этидий-бромидом. Визуализацию специфических продуктов осуществляли с помощью УФ - трансиллюминатора. Изображения фиксировали с помощью цифровой фотокамеры Canon PowerShot А70.

Статистическая обработка данных проведена с помощью системы анализа данных SPSS 16.0. Для построения моделей заболевания была использована программа многофакторного дискриминантного анализа с пошаговым отбором наиболее информативных переменных на основе F -статистики Фишера. С его помощью построены дискриминантные функции в виде линейных комбинаций предиктных переменных, обеспечивающих наилучшее разделение групп больных с положительной и с отрицательной клинической динамикой, а также без динамики.

Результаты исследования и их обсуждение.

Клиническая характеристика больных ХОБЛ. Основные результаты клинико-функционального обследования больных ХОБЛ в исходном состоянии представлены в табл. 1. Выявлено, что выраженные нарушения

перфузии в легких определяются уже при среднетяжелом течении ХОБЛ и существенно не отличаются от расстройств легочной МЦ при тяжелом течении заболевания. Это свидетельствует о раннем включении сосудистого звена в патологический процесс. Полученные результаты демонстрируют сопоставимость больных 1 и 2 групп по изучаемым клинико-функционапьным признакам, что позволило после периода 6-месячной терапии провести корректную оценку влияния различных ПВ препаратов (БДП и фенспирида) на особенности и характер течения заболевания у пациентов со среднетяжелым течением ХОБЛ. Больные 3 группы существенно отличались по результатам клинического и функционального исследований от пациентов 1 и 2 групп.

После 6-месячного курса лечения положительная клиническая динамика выявлена у 9 (30,4%) больных 1 группы, у 15 (50%) больных 2 группы и у 10 (33,3%) больных 3 группы. Клинический эффект у пациентов, принимавших БДП, реализовывался за счет следующих показателей: уменьшения ощущения одышки, частоты обострений заболевания, увеличения толерантности к физической нагрузке и уменьшения проявлений эндобронхита, выявляемого при бронхологическом исследовании. Позитивное изменение указанных параметров было более выраженным у пациентов со среднетяжелым течением заболевания (табл. 2).

Таблица 1.

Результаты клинико-функционального обследования больных ХОБЛ (п=90).

-^1Спинико-функц —.^пок-ли Группы больны?Г~-- Длительность заболевания (лет) Степень ДН ДН по шкале Борга (баллы) Тест 6 мин ходьбы (м)

I 11

1 6,3±3,4 27 3 3,8±0,6 356,4±6,8

2 5,8±2,4 26 4 4,2±0,5 368,7±8,4

3 10,4±5,1 22 8 5,8±0,7 330,9+5,1

Таблица 1 (продолжение).

Клинико -функц. _1Юк"-ЛИ ЖЕЛ, <%Д) ОФВ, (%Д) ООЛ, (%Д) Очаговые нарушения МЦ (число очагов) Диффузное снижение кровотока (%)

Группы больных Правое легкое Левое легкое Правое легкое Левое легкое

1 82,9±2,9 54,4±4,0 164±7,19 3,4+0,3 4,4+0,2 51,7±11,1 54,4+9,1

2 85,9±5,9 58,2±4,7 165,1 ±8,7 3,6+0,3 4.2+0,7 55,8±3,8 51+3,2

3 71,6+1,2 36,4±2,1 210,8±12,3 3,9+0,9 4,4+0.2 62,5±2,7 58.4±0,9

У больных, положительно отреагировавших на лечение фенспиридом,

отмечены сходные клинические изменения, однако не удалось добиться увеличения толерантности к физической нагрузке. У всех обследованных пациентов ХОБЛ выявлено существенное снижение показателей КЖ до лечения. Терапия БДП способствовала улучшению КЖ больных со 2 ст. заболевания. При тяжелом течении патологического процесса выраженной динамики изучаемых шкал КЖ не отмечено. На фоне терапии фенспиридом достоверных изменений показателей КЖ также не произошло, выявлено уменьшение влияния заболевания на повседневную жизнь больных и увеличение числа больных позитивно оценивающих лечение.

Таблица 2.

Клинико-функциональные показатели у больных ХОБЛ с положительной

клинической динамикой на фоне ПВ терапии (п=34).

Клинико-функц. Группы больных"""-— Тест 6 мин. ходьбы (м) ДН по шкале Борга (баллы) ОФВ! (%Д) ДСЛзд (%Д)

1 До лечения 360,1+10,2 4,3+0,2 52,1 ±0,2 61,0+5,3

После лечения 369,3+9,4 3,1+0,5* 58,2+0,5 57,5±4,7

2 До лечения 413,3+7,2 5,1+0,7 62,0+0,2 61,0+5,3

После лечения 463,3+5,3* 3,3+0,9 62,1+0,5 78,0+4,7*

3 До лечения 366,5+2,2 6,9+1,2 45,8+4,2 60,6+5,3

После лечения 372,3+4,1 5,7+1,1 43,5+3,5 60,9+2,2

Таблица 2 (продолжение).

Клинико-функц. пок-ли Группы больных^ Диффузные МЦ нарушения (%) Очаговые нарушения МЦ (число очагов)

Правое легкое Левое легкое Правое легкое Левое легкое

1 До лечения 48,1+1,2 51,8+0,8 3,2+0,3 4,1+0,2*

После лечения 51,1+1,1 54,1+0,2 1,5+0,1* 2,1+0,2*

2 До лечения 58,3+3,8 60,3+1,5 2,3+0,08 2,4+0,1

После лечения 69,8+4,1* 71,4+1,7* 2,1+0,07 2,5+0,09

3 До лечения 66,6+3,8 63,3+1,5 3,8+0,1 4,3+0,08

После лечения 58,3+5,2 65+1,7 2,1+0,11* 2,2+0,09*

* р<0,05 - различия достоверны внутри группы до и после лечения.

Назначение БДП и фенспирида позволило у всех больных ХОБЛ независимо от степени тяжести заболевания и клинического эффекта стабилизировать вентиляционную функцию легких на протяжении срока наблюдения.

Результаты исследования клеточно-молекулярных факторов у больных ХОБЛ. У больных ХОБЛ определялись нормальные значения сывороточных иммуноглобулинов 1«А, ^М, увеличение числа ЦИК.

Повышение ЦИК могло быть связано как с наличием хронического воспалительного, так и аутоиммунного процессов. Повышенный уровень IgE отмечался у больных ХОБЛ преимущественно с тяжелым течением заболевания, однако это повышение не сопровождалось эозинофилией, что согласуется с данными литературы [de Jong JW., 1997]. Отмечено незначительное снижение соотношения CD4+/CD8+, числа циркулирующих натуральных киллеров (CD 16+ клеток). У 73-76% пациентов 1 и 2 групп и 83% больных 3 группы установлено повышение фагоцитарного числа/индекса моноцитов и/или нейтрофилов, что могло быть обусловлено увеличением поступления в кровяное русло Т-лимфоцитов, подвергнувшихся апоптозу [Comnair S. et al., 2002]. Кроме того, в большинстве случаев эволюция ХОБЛ сопровождается бактериальной и вирусной инфекцией [Шмелев Е.И. и др., 2003], что также способствует увеличению фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов.

Результаты исследования молекулярных факторов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) и в сыворотке крови до начала терапии представлены в таблице 3.

Установлено, что для больных ХОБЛ характерно значительное увеличение уровня IL-8 как в ЖБАЛ, так и в сыворотке крови, прогрессирующее по мере нарастания тяжести заболевания. Отмечалось повышение содержания провоспалительного цитокина IL-ф в очаге воспаления у больных средней степени тяжести заболевания, которое не изменялось по мере прогрессирования патологического процесса. Наличие обратной корреляции между содержанием IL-lp в ЖБАЛ и значением ОФВ| (г=-0,53) подтверждает роль этого медиатора в патогенезе заболевания.

Таблица 3.

Уровни про- и противовоспалительных цитокинов, активности эластазы в ЖБАЛ и в сыворотке крови пациентов ХОБЛ 1,2 и 3 групп в исходном

состоянии.

Показатели ЖБАЛ

1 фуппа 2 группа 3 группа

IL-8, пг/мл 169,2±75,2 180,2+71,5 323,4±94,5*

IL-ip, пг/мл 53,3±5,9 46,1+5,9 62,1 ±3,3

IL-10, пг/мл 4,3±0,8 3,5+0,4 3,6±0,8

IL- Ira, пг/мл 848±85* 667+75 862±91

IL-lra/IL-ip 15,9±5,3 14,5+5,6 13,9±5,6

TGF Р, пг/мл 12,8±3,2 18,1+2,2 20,1 ±4,1

Эластаза, нМ/мл мин 3,3±0,7 3,6±0,7 6,4±1,1*

Таблица 3 (продолжение).

Показатели Сыворотка крови

1 группа 2 группа Згруппа

EL-8, пг/мл 38,5+13,8 43,6+13,2 86,5±12,6*

IL-1Р, пг/мл 48,3±12,5 33,4± 14,1 110,2+25*

IL-10, пг/мл 5,8+1,8 4,9±0,9 5,1 ±2,3

IL-1га, пг/мл 535±68 458±62 394±59

IL-1 ra/IL-1Р 11,1 ±2,1 13,7+5,1 4,6+1,9

TGF Р, пг/мл 14750±3200 195СЮ±4210 14040+1572

Эластаза, нМ/мл мин 378,8±43,2 375±25,6 427±28,9

* - р<0,05 - различия достоверны по сравнению с показателями 1 и 2 групп.

В сыворотке крови у больных 3 ст. ХОБЛ уровень ЕИр был выше (р<0,05), чем у пациентов с 2 ст. заболевания (рис. 1), однако корреляционной зависимости между содержанием П_-1 (5 и показателем ОФВ! не было установлено (р=-0,24). При этом не нарастало соотношение 1Ь-1га/1Ь-1р, которое характеризует ПВ эффект, замедляя формирование патологических процессов при ХОБЛ. Отсутствовало увеличение уровня ПВ цитокина ГЬ-10 как в ЖБАЛ, так и в периферической крови при разной степени тяжести заболевания, что подтверждает гипотезу о том, что низкий уровень 1Ь-10 может быть одним из патогенетических факторов прогрессирования хронического воспаления при ХОБЛ (рис. 1) [ТакапавЫ 8., Hasegawa У., 1999].

И

о ЖБАЛ

■ СЫ1М)|>0 II

о

2 ст. з С, N 2 ст. 3 ст N

Рис. 1. Уровень 1Ь-1(3 (А) и 1Ь-10 (Б) в ЖБАЛ и в сыворотке больных ХОБЛ (* р<0,05 - различия достоверны по сравнению с 2 ст. ХОБЛ).

У больных определялся высокий уровень TGFp в ЖБАЛ, увеличивающийся по мере нарастания тяжести течения ХОБЛ (табл. 3); при этом содержание TGFp коррелировало с числом макрофагов в ЖБАЛ (рис. 2), что подтверждает гипотезу о влиянии TGFp на хемотаксис макрофагов [Boer W. et al., 1998]. Значительное увеличение уровня TGFp в сыворотке крови и отсутствие различий между содержанием TGFp при разной степени тяжести

свидетельствует о формировании системных изменений у больных средней степени тяжести заболевания и может, в частности, являться одной из причин формирования ЛГ [Уое1кт N.. Тис1ег Я.. 1995].

К=0.0М

14 (щ/м-1)

Рис. 2. Уровень ТСР(3 (А) и корреляционная зависимость содержания макрофагов и ТСРР (Б) в ЖБАЛ больных ХОБЛ.

Т.о., у больных ХОБЛ был выявлен дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов, обусловленный увеличением содержания провоспапительных цитокинов и отсутствием компенсаторного нарастания ПВ цитокинов, необходимого для сдерживания прогрессирования хронического воспалительного процесса. Эти нарушения не ограничивались только очагом воспаления, а проявлялись и на системном уровне.

Параллелизм в динамике изменений исследуемых клеточно-молекулярных факторов в очаге воспаления и на системном уровне не был отмечен. Установлена корреляционная зависимость между уровнями про- и противовоспалительных цитокинов (1Ь-8, П^-1 (3, 1Ь-1га), активностью эластазы в ЖБАЛ и показателями функции внешнего дыхания (ФВД) (ОФВ, и/или ЖЕЛ). Аналогичные взаимосвязи в сыворотке крови не наблюдались, что подтверждает гипотезу о независимом формировании местного и системного воспаления у больных ХОБЛ.

Сравнение действия фенспирида и БДП выявило отсутствие их влияния на уровни про- и противовоспалительных цитокинов, Тврр, активность эластазы как в очаге воспаления, так и в периферической крови даже у больных с положительной клинической динамикой, что подтверждает представления об отсутствии влияния КС на уровень синтеза этих медиаторов у больных ХОБЛ и согласуется с данными литературы [ВеМэ! М„ 2004].

Таким образом, одним из основных патофизиологических механизмов формирования ХОБЛ является развитие иммунного воспаления, проявляющегося нарушением равновесия в соотношении про/противовоспалительных цитокинов, что обусловлено, прежде всего,

относительной недостаточностью ПВ цитокинов. Это нарушение происходит как в очаге воспаления, так и в периферической крови. Увеличение активности протеаз, в том числе эластазы, а также фактора роста ТСБр у больных ХОБЛ свидетельствует об активации процессов протеолиза и фиброзирования, а следовательно, ремоделирования легочной ткани, нарастающего с увеличением степени тяжести заболевания. Отсутствие параллелизма в динамике выявленных изменений в очаге воспаления и на системном уровне свидетельствует об их независимом течении. ПВ терапия фенспиридом и БДП не оказывала влияния на показатели иммунного воспаления.

Состояние легочно-сердечной гемодинамики у больных ХОБЛ. Установлено, что уже на 2 ст. ХОБЛ существенно изменялись показатели легочно-сердечной гемодинамики, хотя в литературе имеются лишь единичные указания, согласующиеся с полученными результатами [Кароли, 2007]. К ведущим нарушениям гемодинамики МКК у больных ХОБЛ можно отнести повышение легочного сосудистого сопротивления и умеренный рост давления в ЛА, что впоследствии приводит к структурным изменениям и недостаточности правых отделов сердца. У больных ХОБЛ выявлено повреждение сосудистого звена уже на 2 ст. заболевания, о чем свидетельствуют значительные расстройства легочной МЦ и нарушения легочно-сердечной гемодинамики, существенно не прогрессирующие при нарастании патологического процесса. Так у пациентов ХОБЛ 2 ст. до лечения отмечено умеренное расширение и гипертрофия ПЖ, ЛГ 1 степени, диастолическая дисфункция ПЖ, что дало основание для постановки диагноза «легочное сердце» у 80% обследованных пациентов со среднетяжелым течением ХОБЛ. В группе больных ХОБЛ 3 ст. признаки «легочного сердца» были выявлены у 100% обследованных. У этих пациентов наблюдалась тенденция к дальнейшему прогрессированию ЛГ и гипертрофии миокарда ПЖ. Таким образом, результаты исследования соответствуют мнению о том, что персистенция хронического воспалительного процесса у больных ХОБЛ обусловливает возникновение и прогрессирование нарушений гемодинамики в МКК, приводит к развитию ЛГ и легочного сердца [Чучалин А.Г., 2008].

В отличие от больных со среднетяжелым течением ХОБЛ у пациентов с 3 ст. заболевания были зарегистрированы признаки диастолической дисфункции обоих желудочков. Кроме того, у всех обследованных больных ХОБЛ независимо от степени тяжести регистрировались более низкие средние значения ФВ ЛЖ относительно контрольной группы, что свидетельствует о снижении функциональной активности миокарда не только правого, но и левого желудочков вследствие изменения межжелудочковых взаимодействий и кардиального проявления системного воспаления (рис. 3).

После 6-месячного курса ПВ терапии БДП у больных 2 группы произошли позитивные изменения со стороны легочно-сердечной гемодинамики (табл. 4). У пациентов, имеющих положительную клиническую динамику на фоне лечения БДП. было отмечено достоверное снижение уровня СДЛА и улучшение диастолической функция ПЖ (рис. 4 и 5). Этим изменениям способствовала оптимизация легочной МЦ, проявившаяся улучшением диффузного капиллярного кровотока. У пациентов с тяжелым течением ХОБЛ (независимо от клинических результатов) после 6-месячного курса лечения БДП не выявлено достоверных изменений показателей легочно-сердечной гемодинамики, что опосредовано менее

выраженной динамикой легочной перфузии по данным сцинтиграфии легких.

%

КДР ПЖ ТМ ПС ПЖд сдлд

Рис. 3. Отличие ЭХОДКГ показателей у пациентов 3 ст. относительно пациентов 2 ст. ХОБЛ.

Е/А ЛЖ и ПЖ - соотношения пиковых скоростей пассивного и активного наполнения ЛЖ и ПЖ; КДР - конечнодиас-толический размер; ТМ ПС ПЖд - толщина миокарда передней стенки ПЖ в диастолу.

Рис. 4. СДЛА в группе больных ХОБЛ с положительной клинической динамикой после лечения.

Таким образом, уменьшение выраженности диффузных расстройств кровотока в легких на фоне терапии БДП у больных ХОБЛ способствовало улучшению диффузионной способности легких, положительным изменениям гемодинамики МКК и сопровождалось оптимизацией клинического течения заболевания. Вероятно, что одним из механизмов, лежащих в основе положительного клинического эффекта при использовании препаратов с ПВ активностью у больных ХОБЛ, является их позитивное влияние на нарушения легочной МЦ, что, в свою очередь, подчеркивает значение

сосудистых процессов в патогенезе этого заболевания.

После 6-месячного курса лечения фенспиридом у больных 1 группы также была выявлена тенденция к позитивным изменениям легочно-сердечной гемодинамики (табл. 4). У пациентов с положительным клиническим результатом произошло достоверное снижение уровня СДЛА (рис. 4). Снижение СДЛА при лечении фенспиридом реапизовывапось, вероятно, за счет уменьшения легочного сосудистого сопротивления и улучшения перфузии в легочных капиллярах. Показано также, что применяемый препарат влиял на контрактильную активность миокарда ЛЖ (рис. 5), так как у всех больных, лечившихся фенспиридом, отмечено увеличение фракции выброса (ФВ) ЛЖ.

Таблица 4.

Показатели легочно-сердечной гемодинамики у пациентов с ХОБЛ до и _после лечения (М±т).__

Показатель 1 (п=30) 2 (п=30) 3 (п=30)

До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения После лечения

TM ЗС ЛЖд (см) 0,94+0,14 1,04+0,16 1,04±0,22 0,99±0,14 1,08+0,18 1,15+0,18

ФВ ЛЖ 0,60±0,04 0,66±0,02* 0,64+0,10 0,62+0,18 0,61 ±0,04 0,60±0,05

КДР ПЖ (см) 3,21 ±0,29 3,19+0,23 3,11 ±0,25 3,14+0,33 3,4±0,08 3,43+0,19

ТМ ПС ПЖд (см) 0,44±0,03 0,47±0,05 0,47±0,03 0,47±0,04 0,51 ±0,02 0,52±0,07

СДЛА (мм рт.ст.) 36,6±5,3 33,6+3,5 37,2+6,1 30,7±5,0 40,2+5,3 39,8±2,7

E/A ЛЖ 0,96±0,28 0,98±0,25 1,16+0,08 1,17+0,20 0,78+0,12 0,87±0,20

E/A ПЖ 0,86±0,22 0,92±0,23 0,92+0,16 1,26+0,13* 0,80+0,21 0,87±0,21

: - р<0,05, различия достоверны внутри группы до и после лечения

%40-f

'р<0,05

Рис. 5. E/A ПЖ и ФВ ЛЖ в группе больных ХОБЛ с положительной клинической динамикой после лечения.

насосной функции сердца на фоне

Это может быть обусловлено нормализацией межжелудочковых взаимодействий после снижения нагрузки на ПЖ, системным ПВ воздействием фенспирида, снижением общего периферического сопротивления вследствие умеренного

спазмолитического эффекта препарата, а также блокадой нейрогенных вазоактивных механизмов воспаления [Ме11от В., 2002]. Положительный сосудистый эффект и повышение терапии фенспиридом способствовали

уменьшению числа очаговых расстройств МЦ по данным сцинтиграфии легких.

Т.о., изменения легочно-сердечной гемодинамики и ремоделирование правых камер сердца выявляются у большинства больных ХОБЛ уже на 2 ст. и прогрессируют по мере увеличения степени тяжести заболевания. БДП по сравнению с фенспиридом обладает более выраженным положительным воздействием на легочное сосудистое русло. Положительный эффект БДП в более полном объеме проявляется на 2 ст. ХОБЛ.

Функциональное состояние эндотелия у больных ХОБЛ. Немаловажное значение в патогенезе ХОБЛ и, в первую очередь, в развитии патологических изменений в легочной циркуляции имеет функциональное состояние эндотелия, которое характеризуется супрессией процессов вазодилатации и экспрессией вазоконстрикции. Уже на 2 ст. ХОБЛ в плазме больных установлено повышение концентрации ET-1, которое достоверно не прогрессировало при нарастании степени тяжести заболевания. Увеличение уровня ЕТ-1 в плазме на ранних этапах ХОБЛ может рассматриваться как признак возникновения ДЭ, которая опосредует один из механизмов раннего вовлечения васкулярных процессов в патогенез ХЛС и способствует развитию МЦ расстройств у пациентов уже со 2 ст. заболевания.

УЗ диагностика вазоактивной функции эндотелия является высокочувствительным способом оценки и отражает совокупное влияние не только ЕТ-1, но и ряда других вазорегулирующих факторов. По данным пробы УЗ метода ДЭ выявлена у 53% больных ХОБЛ на 2 ст. заболевания, что соответствует результатам единичных исследований [Кароли H.A., 2004; Сироткин С.А, 2007]. Выявления ДЭ при тяжелом течении составило 73% (рис. 6).

Концентрация ЕТ-1 у больных со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания была выше нормальных значений и достоверно не различалась, однако отличие этих групп по изменению прироста диаметра плечевой артерии в ответ на пробу с реактивной гиперемией было достоверным. Очевидно, что выявление ДЭ с помощью метода УЗ диагностики позволяет оценить результат взаимодействия комплекса сложных механизмов эндотелий-зависимой регуляции сосудистого тонуса. После 6-месячного курса ПВ лечения БДП отмечено значительное снижение уровня циркулирующего ЕТ-1 в группе больных 2 ст. ХОБЛ, однако у пациентов с тяжелым течением заболевания концентрация циркулирующего в плазме ЕТ-1 после лечения осталась практически неизменной (рис. 7). Полученные результаты свидетельствуют о возможности КС редуцировать на ранних стадиях ХОБЛ синтез эндотелина клетками эндотелия, обладающими рецепторами к этим препаратам [Цой А.Н., 2009]. Это является одним из позитивных эффектов действия ИГКС препаратов при этом заболевании.

Аналогичные результаты получены и при оценке функции эндотелия после лечения БДП методом УЗ диагностики. При этом у больных ХОБЛ 2 ст. с положительной клинической динамикой на фоне лечения БДП было выявлено не только улучшении функции эндотелия, но и ее нормализация. Терапия фенспиридом достоверно не изменила выраженность ДЭ.

Рис. 6. Прирост диаметра плечевой Рис. 7. Изменение уровня артерии в ответ на пробу с циркулирующего ЕТ-1 на фоне ПВ реактивной гиперемией, на фоне терапии ПВ терапии

Т.о., БДП по сравнению с фенспиридом оказывал более выраженное положительное влияние на функциональное состояние эндотелия у пациентов со среднетяжелым течением ХОБЛ, а прогрессирование заболевания резко снижало эффект действия ИГКС. Улучшение функционального состояния эндотелия в определенной степени способствовало оптимизации легочной МЦ, что в свою очередь приводило к позитивным изменениям гемодинамики МКК.

Выявленные в ходе корреляционного анализа закономерности указывают на наличие взаимосвязи показателей, характеризующих эндотелиальную функцию, с показателями легочно-сердечного кровообращения, что подтверждает мнение о роли ДЭ в развитии и прогрессировании ХЛС при ХОБЛ. Так, выявлено наличие умеренной обратной зависимости между степенью поток-зависимой вазодилатации и СДЛА (г=-0,47, р<0,05), что свидетельствует о возможности оценки функции эндотелия сосудов МКК по легко доступному для диагностики сосуду большого круга кровообращения (БКК). Статистически достоверной была и обратная зависимость между степенью поток-зависимой вазодилатацией и размером ПЖ в диастолу (г=-0,62, р<0,05), а также прямая связь (г=0,32, р<0,05) между уровнем циркулирующего ЕТ-1 и СДЛА, что подтверждает роль

васкулярных нарушений в прогрессировании ПЖ недостаточности и формировании ХЛС. Кроме того, при оценке взаимосвязи изученных методов диагностики функциональной активности эндотелия - интегрального, учитывающего сложные и разнонаправленные биохимические процессы (степень эндотелий-зависимой вазодилатации), и одного из маркеров эндотелиальной активации - концентрации циркулирующего мощного вазоконстриктора ЕТ-1 выявлена умеренная отрицательная зависимость (г=-0,37, р<0,05), констатирующая не только взаимосвязь этих показателей между собой, но и с функциональной активностью эндотелия.

С целью выявления факторов, определяющих терапевтический эффект ИГКС, была построена прогностическая модель. Наиболее информативными оказались три показателя: уровень НЬ, размер ПЖд и величина СДЛА. Таким образом, достижение клинического результата при назначении ИГКС определяется возможностью влияния на сосудистые изменения при ХОБЛ. Кроме того, чем тяжелее течение ХОБЛ, тем менее вероятно рассчитывать на положительный клинический эффект при лечении ИГКС. Точность прогнозирования составила 77% в целом по группе и 88% для положительного клинического эффекта.

Исследование функциональных генных полиморфизмов у больных ХОБЛ. Для исследования были выбраны гены с высокой частотой альтернативных функциональных полиморфизмов. Установлено, что частота распределения промоторных аллелей этих генов близка к «менделевской» (1:2:1) (табл. 5). В группе больных ХОБЛ и в группе сравнения распределение аллелей исследуемых генов ММР-1 (Ю/20), ММР-3 (5А/6А), 5-НТТ (Б/Ь) и АСЕ (Ш) соответствовало аналогичным данным по генеральной выборке популяции Санкт-Петербурга и Северной Европы, что свидетельствует об отсутствии существенного влияния исследуемых функциональных вариантов генов на встречаемость ХОБЛ в популяции (табл. 5).

Таблица 5.

Распределение изученных генных вариантов у больных ХОБЛ (п=72).

Изучаемый ген Генные варианты и их относительная встречаемость

ММР-1 Ю/2С"1(*" Ю/Ю: 27,8% \GI2G: 54,2% 20/20:18,1%

ММР-3 5 А/6 А"" 5А/5А: 20,6% 5А/6А: 57,5% 6А/6А: 21,9%

АСЕЮ Ш: 24,7% 1Ю: 49,3% Ш): 26,0%

5-НТТ Б/Ь 16,9% Б/Ь: 40,9% Ь/Ь: 42,2%

Было изучено влияние указанных функциональных полиморфизмов на фенотипические проявления данного заболевания. Выявлена достоверная связь между носительством гиперактивного аллеля 2С гена ММР-1 и ЛГ у

больных ХОБЛ (рис. 8). Среди больных с уровнем ЛГ>40 мм рт.ст. частота этого гиперактивного аллеля была ниже, чем в остальной группе (85% или 8/15 против 53% или 28/33, р=0,02). Это происходит вследствие замедления деградации коллагена и прогрессирования фиброза, затрагивающего сосудистую сеть легких, что способствует увеличению давления в МКК и развитию ЛГ. В свою очередь, альтернативный аллель гена ММР-1 1G/1G, отличающийся меньшей транскрипционной активностью, выявлялся с частотой 47% (17/15) при выраженной ЛГ (выше 40 мм рт.ст.) по сравнению с остальной группой больных (частота 15% или 5/33, р=0,03).

Выявлена существенная взаимосвязь между выраженностью ТБД, косвенно отражающей нарушения механических свойств бронхиальной стенки, и частотой генотипа 2G/2G гена ММР-1 (г=0,301; р=0,025) (рис. 9). Частота генотипа 2G/2G гена ММР-1 составила 0% в группе больных с отсутствием ТБД; 12,5% - при 1-й степени (1/8); 15,8% - при 2-й степени (3/19) и 40% (2/5) - при 3-й степени ТБД.

Таким образом, полученные результаты подтверждают связь между гиперактивной промоторной формой гена ММР-1 и клиническими признаками дефицита фиброзной ткани, приводящего к нарушениям механических свойств бронхиальной стенки.

Ген другого фермента коллагенолиза ММР-3 также имеет 2 частых промоторных варианта (5А и 6А) в позиции -600, из которых аллель 5А более активно влияет на синтез мРНК.

Легочная гкпертензия саышэ 40 мм рт.ст.

Рис. 8. Частота встречаемости гиперактивного аллеля 2С гена ММР-1 при различной степени ЛГ.

0,60,5" 0,4" 0,3" 0,2" О.Г

о.о-

Степень ТБД

Рис. 9. Частота встречаемости аллеля 2С гена ММР-1 при различной степени ТБД.

В проведенном исследовании показана взаимосвязь между гиперактивным аллелем ММР-3 (генотип 5А/5А) и ТБД (п=43; р=0,04). Т.к. гены ММР-1 и ММР-3 находятся в соседних сегментах хромосомы 11, и аллели Ш ММР-1 и 5А гена ММР-3 сцеплены между собой достаточно сильно (г=0,3-0,4; р<0, 001), проведена оценка взаимосвязи между частотой встречаемости этого гаплотипа и нарушениями механических свойств бронхов. Отмечено, что сочетание генотипов ММР1/Ю - ММРЗ/5А наиболее

часто встречалось у больных без признаков ТБД и уменьшалось по мере прогрессирования степени выраженности патологического процесса, т.е. этот гаплотип обладает протективным эффектом в отношении развития ТБД у больных ХОБЛ (рис. 10).

Таким образом, гиперактивные промоторные аллели генов коллагеназ (ММР1-1С и ММР-3 5А) оказывают однонаправленный эффект на изменения механической функции бронхов, обусловленный усилением ремоделирования коллагеновых структур легких при ХОБЛ.

Частота генотипа 1/1 гена АСЕ оказалась связанной с фактором наследственной предрасположенности к ХОБЛ. В группе больных с наличием симптомов ХОБЛ у одного из родителей по сравнению с остальными больными частота генотипа АСЕ 1/1 была существенно выше: соответственно 39% (14/36) по сравнению с 11% (4/36) (р=0,006) (рис. 11).

; S 120

8 ?

! к юо

S £

8 6 i I

Ж

степень ТБД

Наследственность (по отцу)

Рис. 10. Протективное влияние гаплотипа MMP1/IG - MMP3/5G на развитие ТБД у больных ХОБЛ.

Рис. 11. Частота встречаемости генотипа АСЕ 1/1 у больных, имеющих симптомы ХОБЛ у родителей.

Анализ возрастной динамики показал, что частота генотипа D/D достоверно снижалась с возрастом больных, достигая минимальных значений к возрасту 70-80 лет (рис. 12). В связи с выявлением корреляции между возрастом больных, стадией заболевания и генотипом ACE D/D логично предположить наличие взаимосвязи между генотипом ACE D/D и клинической стадией заболевания, т.к. оба этих показателя зависят от возраста пациентов. На рис. 13 отражена зависимость стадии заболевания от варианта генотипа АСЕ-1: более активный (высокопродуцирующий) генотип D/D встречается у больных 1-2 ст. ХОБЛ чаще (45% или 9/20), чем у пациентов с более тяжелым течением заболевания (19% или 10/52, р=0,03).

Снижение частоты встречаемости генотипа ACE D/D на более поздних стадиях заболевания связано с возрастной динамикой этого генотипа, представленной выше. Этот генотип высокого кардиоваскулярного риска в исследуемой мужской популяции привел к снижению выживаемости по мере старения организма. В свою очередь у больных, проживших до 70-80 лет, имелась более тяжелая стадия ХОБЛ, однако возможность дожить до этого

возраста в некоторой степени определяло отсутствие у них генотипа D/D гена АСЕ-1. Полученные нами данные согласуются с ранее опубликованными результатами [Arias-Vasquez et al., 2005], где сообщалось о пониженной выживаемости курящих людей в возрасте моложе 65 лет с генотипом АСЕ D/D. Таким образом, этот генотип является фактором естественного отбора в среднем и старшем возрастах.

Число больных в группах

Генотип ACE D/D

Рис. 12. Зависимость частоты генотипа ACE D/D от возраста больных.

Рис. 13. Частота генотипа D/D гена АСЕ-1 у больных ХОБЛ с различной стадией заболевания.

1,0"

0,9'

О.Г

0 ,Г

Кроме того, выявлена тенденция к нарастанию частоты обострений заболевания у больных, носителей высокопродуцирующего аллеля О гена АСЕ-1 (рис. 14).

Еще одна клинико-генетическая взаимосвязь выявлена при сопоставлении генотипа АСЕ-1 и наличия ДЭ, определяемой УЗ методом. Аллель Б гена АСЕ у больных с выявленной ДЭ определялась в 90% случаев (27/33), тогда как в случае ее отсутствия - только в 58% (19/33), р=0,004 (рис. 15).

Исследования в

выборке больных в Санкт-Петербурге не подтвердили взаимосвязь «гиперактивного» генотипа Ь/Ь гена 5-ННТ с ЛГ у больных ХОБЛ. В то же время была выявлена взаимосвязь между генотипом 5-НТТ и степенью ДН. Установлено, что более активный аллель Ь гена 5-НТТ встречался значительно чаще у больных с более выраженной степенью ДН: при ДН 2 - в 88,5% случаев (46/52), при ДН 0-1 -в 69%случаев (9/20) (р=0,05) (рис. 16).

Частота аллеля D „

гена АСЕ-1 т

'' / /

Число

обострений

1-2 3-4 5 и более

Рис. 14. Зависимость между числом обострений в год и частотой встречаемости аллеля Б гена АСЕ-1.

Чисто бальных в группах

*-р=0.004.

Рис. 15. Частота генотипа АСЕ О в зависимости от функционального состояния эндотелия.

Рис. 16. Сравнительная частота аллеля I. гена 5-НТТ у больных с различной степенью ДН.

Это указывает на роль генетических факторов, регулирующих транспорт и захват серотонина, в развитии ДН при ХОБЛ, что может быть обусловлено усилением дисфункции гладкомышечных структур сосудов и бронхов. Показана также связь между носительством аллеля Б гена НТТ и повышенной частотой развития ТБД (частота дискинезии - 84% при наличии генотипа НТТ-8 и 56% при отсутствии этого аллеля; р=0,04, п=43).

Т.о., в патогенезе ХОБЛ наряду с прочими механизмами определенную роль играют изменения, происходящие на васкулярном уровне, что подтверждается следующими фактами: 1. У больных ХОБЛ уже на 2 ст. существенно изменяются показатели, характеризующие васкулярные процессы: функциональное состояние эндотелия, легочная МЦ, уровень СДЛА. При нарастании степени тяжести заболевания и прогрессировании вентиляционных расстройств достоверная динамика этих показателей отсутствует, что указывает на раннее включение в патогенез ХОБЛ сосудистого звена. 2. Гены, участвующие в основных патофизиологических процессах при ХОБЛ (ММР-1; ММР-3; 5-НТТ; АСЕ-1), оказывают активное влияние и на регуляцию васкулярных изменений при этой патологии, ассоциируясь с развитием ряда особенностей течения заболевания, что указывает на взаимообусловленное развитие происходящих изменений. 3. Клинический эффект при лечении ПВ препаратами может быть опосредован влиянием на различные уровни сосудистого звена: улучшается функциональное состояние эндотелия и легочная МЦ, что приводит к положительными изменениям легочно-сердечной гемодинамики и замедлению формирования одного из основных осложнений ХОБЛ -легочного сердца. 4. При построении математической модели клинической эффективности ИГКС в качестве прогнозирующих факторов выявлены

показатели, характеризующие состояние васкулярных процессов: уровень НЬ, размер ПЖд и СДЛА.

Однако не выявлены механизмы, лежащие в основе произошедших сосудистых изменений на фоне терапии ПВ препаратами, отсутствовала динамика клеточно-молекулярных факторов, определяющих формирование и персистенцию иммунного воспаления при ХОБЛ. С целью поиска других механизмов, регулирующих развитие и прогрессирование патологического процесса при ХОБЛ, и оценки влияния на них проводимой ПВ терапии было проведено экспериментальное исследование.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Воспроизведение ХОБЛ в эксперименте. Исследование роли региональной нервной системы легких в формировании ХОБЛ. Для воспроизведения ХОБЛ в эксперименте крыс на протяжении 60-90 дней ежедневно в течение 1,5 часов подвергали ингаляционному воздействию 1Ч02 (30-40 мг/м3). Формирование изменений, соответствующих ХОБЛ, подтверждено результатами гистологических, морфометрических, иммуногистохимических и иммунологических исследований (решение о выдаче патента «Способ моделирования хронической обструктивной болезни легких» 19.02.09; заявка № 2008111053 от 25.03.08). Исследование роли нейрогенных механизмов в развитии хронического воспаления и бронхообструктивного синдрома проводили на изолированных препаратах бронхов крыс на разных сроках воспроизведения ХОБЛ (15, 30, 60 и 90 дней воздействия 1Ч02) с использованием методик стимулирования электрическим полем различных звеньев функционального модуля ДП и фармакологической блокады рецепторного аппарата бронхов. Опыты проводили на сегментах бронхов 2-6 порядка с участком бифуркации, где располагаются интрамурапьные ганглии. Сокращение ГМ бронха регистрировали электромеханическим датчиком смещений. Оценивали сократительную реакцию ГМ на контрольную стимуляцию (клинический эквивалент -обычная физическая нагрузка) и дополнительную стимуляцию (клинический эквивалент - повышенная физическая нагрузка).

Препараты бронхов крыс, подвергнутых воздействию N02 в течение 15-60 дней (период формирования ХОБЛ), отвечали усилением сократительной активности ГМ на контрольную стимуляцию преганглионарных нервов (ПГН) и практически не реагировали на раздражение самой ГМ. На этапе дальнейшего прогрессирования ХОБЛ (90 дней Ж)2) активность ГМ бронхов снижалась при стимуляции как ПГН, так и ГМ, задерживалось начало сократительной реакции, что могло быть следствием ухудшения функционального состояния ГМ. Амплитуда сокращения ГМ бронхов в ответ на дополнительную стимуляцию ПГН увеличивалась на 13-17% в сравнении с контрольной стимуляцией (рис. 17).

После 60-90 дней воздействия N02 при дополнительной стимуляции самой ГМ отмечалось уменьшение амплитуды ее сокращения (рис. 17).

Усиление сокращения ГМ бронхов в ответ на дополнительную стимуляцию ПГН могло быть связано с функцией либо сенсорного звена, либо нейронов функционального модуля. Был проведен анализ сократительной реакции ГМ на длительное раздражение ПГН. постганглионарных нервов и ГМ (рис. 18). После 15 дней воздействия N02 амплитуда сокращения ГМ бронхов возрастала с каждой последующей стимуляцией ПГН, максимальный прирост составил 32%. При стимуляции постганглионарных нервов увеличение амплитуды сокращений ГМ на 12% достигалось уже при 2-й стимуляции, после чего величина ответа ГМ бронхов стабилизировалась. При стимуляции ГМ амплитуда ее сокращения не изменялась. Таким образом, воздействие N02 уже к 15 дню приводило к нарушению функции как афферентного, так и эфферентного звена функционального модуля ДП (мускариновых Мг-рецепторов постганглионарных холинергических волокон), а на более поздней стадии (60 дней)-к снижению сократительной активности самой ГМ.

Диоксид азота, как и любой аэрогенный поллютант, в первую очередь, взаимодействует с эпителием и рецепторами бронхов.

Рис. 17. Амплитуда сокращения ГМ Рис. 18. Амплитуда сокращения ГМ препаратов бронхов в ответ на бронхов после 15-дневной экспози-дополнительную стимуляцию ПГН ции N02 в ответ на серию допол-(ст. нервов) и ГМ (ст. мышцы). нительных стимуляций преганглио-

нарных (пре) и постганглионарных (пост) нервов и ГМ (мышца).

Рецепторный аппарат эпителия ДП представлен быстроадаптирующимися рецепторами, которые реагируют в основном на скорость воздушного потока, и капсаицин-чувствительными окончаниями С-волокон, реагирующими на химические вещества, в частности, поллютанты. Механизм действия капсаицина на С-волокна заключается в деполяризации мембраны и

повышении проводимости катионных каналов, что ведет к внутриклеточному накоплению Са2+ и выделению нейромедиаторов (тахикининов) из терминапей С-волокон и, как следствие, к их десенситизации. Для инактивации нервных окончаний С-волокон крысам подкожно вводили капсаицин (1 мг/кг), после чего в течение 15 дней подвергали воздействию N02. Это приводило к снижению амплитуды сокращения ГМ бронхов как при контрольной, так и дополнительной стимуляции ПГН и ГМ относительно величины сокращений ГМ бронхов крыс, которые подвергались воздействию N02 без введения капсаицина (рис. 19). Такие ответы ГМ бронхов были характерны для препаратов бронхов крыс, ингалированных N02 60-90 дней. Вероятно, N02 и капсаицин действовали на одно и тоже звено, а именно, на чувствительные окончания С-волокон.

Влияние КС на сократительную активность бронхов в процессе формирования ХОБЛ. На этапах формирования ХОБЛ оценивали влияние преднизолона (П) на сократительную активность ГМ бронхов. П добавляли в перфузат, в котором находились препараты бронхов. Наибольший дилатационный эффект КС проявлялся на острой стадии процесса (15 дней N02): П в концентрации 1 мкг/мл снижал амплитуду сокращения ГМ бронхов, вызванную дополнительной стимуляцией ПГН, на 22,4±1,4% (р<0,01), а в концентрации 10 мкг/мл-на 29,4±2,5% (р<0,01).

После 30 дней воздействия N02 дилатационное влияние П уменьшалось, а при 60- и 90-дневной экспозиции эффект П отсутствовал, вероятнее всего, из-за снижения чувствительности препаратов бронхов к КС.

2 350 * - р<0.05, ** - р<0,01 о" 300 ° 250 о 200 ю 150

3 100

50

ш

0

нерв

□ здоровые ■ 15N02

мышца □ капс+15ГЮ2

дни воздействия NOi

Рис. 19. Влияние капсаицина на сокращения ГМ бронхов, при контрольной стимуляции ПГН и ГМ.) отличие от ответов бронхов крыс, ингалированных Ы02.

Рис. 20. Влияние преднизолона (10 мкг/ мл) на сократительный ответ ГМ бронхов, вызванный дополнительной стимуляцией ПГН, в условиях новокаиновой блокады бронхиальных рецепторов.

При стимуляции ГМ введение П не влияло на амплитуду сокращения ГМ бронхов после всех сроков воздействия Г<Ю2. Это означает, что дилатационный эффект КС связан, главным образом, с нейронапьными

структурами ДП (нейронами функционального модуля и/или их рецепторами), которые инактивируются при длительном воздействии 1Ч02. Блокада рецепторного аппарата ДП новокаином приводила к снижению дилатационного эффекта П, что проявлялось в меньшем (17,6±6,0%), чем до обработки новокаином (27,7±2,5%) снижении амплитуды сокращения ГМ бронхов в ответ на стимуляцию ПГН. При удлинении воздействия ЖЬ до 30 дней новокаин полностью нивелировал дилатационный эффект П, а после 60 и 90 дней КС вместо снижения вызывал усиление сократительных ответов ГМ бронхов - на 25,2±5,6% и 19,9+5,0% соответственно (рис. 20). Этот эффект проявлялся при стимуляции как ПГН, так и ГМ. Т.о., точкой приложения действия N02 и КС служат одни и те же нервные структуры -рецепторы афферентных нейронов функционального модуля легких. Подтверждение этому было получено при исследовании эффекта П на препараты бронхов крыс, подвергавшихся воздействию N02 в условиях инактивации афферентных С-волокон капсаицином. ГМ препаратов бронхов этих крыс не реагировали на введение в перфузат П при стимуляции как ПГН, так и ГМ. Итак, инактивация нервных окончаний афферентных С-волокон капсаицином полностью предотвращала расслабляющий эффект КС на ГМ бронхов. Этот факт послужил основанием считать, что капсаицин и КС взаимодействовали с одними и теми же структурами бронхов -капсаицин-чувствительными афферентными С-волокнами. Рефрактерность ГМ бронхов к КС, вероятно, была обусловлена инактивацией С-волокон в результате длительного воздействия Ж)2. Применение в течение месяца КС-препарата БДП у крыс с ХОБЛ улучшало сократительную способность ГМ бронхов, но не сказывалось на функциональном состоянии нервного аппарата бронхов.

Помимо бронхолитического действия, взаимодействие КС с окончаниями С-волокон способствует развитию ПВ эффекта, так как эти нервные структуры инициируют нейрогенное воспаление. Чувствительные окончания С-волокон выполняют не только афферентную, но и местную эффекторную функцию. В везикулах терминалей С-волокон содержатся нейропептиды, которые при стимуляции нервных окончаний химическими факторами выделяются экзоцитозом и транспортируются не только в центральном, но преимущественно в периферическом направлении. В связи с этим местную эффекторную функцию чувствительных С-терминалей и их роль в инициации нейрогенного воспаления можно представить следующим образом. Под влиянием поллютантов (Ы02) активируются терминали С-волокон и выделяются содержащиеся в них нейромедиаторы (тахикинины и КСЯР). Диффундируя в окружающие ткани, они оказывают влияние на ГМ дыхательных путей, МЦ сеть и секреторные железы, приводя к развитию бронхоспазма и гиперреактивности ГМ бронхов, экстравазации и

гиперсекреции слизи [Barnes, 1986; Tamaoki, 1994; Ramarine, 1996; Федин, 2001]. Эти воспалительные изменения усиливаются за счет афферентной импульсации С-волокон, активирующей нейроны функционального модуля, которые контролируют функцию ГМ ДП, микрососудистого русла и железистых клеток эпителия. Усиление выхода ацетилхолина (АХ) из эфферентных нейронов приводит к гиперактивности ГМ бронхов, выходу экссудата из микрососудов и гиперсекреции. АХ активирует также иммунокомпетентные клетки, в частности, тучные клетки, а выделяемый ими гистамин дополнительно стимулирует чувствительные терминали. КС взаимодействуют с рецепторами капсаицин-чувствительных С-волокон, препятствуя воздействию на них раздражающего агента и запуску нейрогенного воспаления. Таким образом, ПВ эффект КС может реализовываться не только за счет геномного механизма, но и нейрогенного (негеномного).

Влияние фенспирида на сократительную активность бронхов в процессе формирования ХОБЛ. Для определения точки приложения действия фенспирида было исследовано его влияние на сократительную реакцию бронхов. Предварительная обработка препаратов бронхов новокаином устраняла дилатацию бронхов, вызванную низкими концентрациями фенспирида (1 и 10 мкг/мл), и существенно уменьшала эффект фенспирида в дозе 100 мкг/мл - с 41,0+3,8% до 26,4±9,0% (р<0,05).

После ежедневного (на протяжении 60 дней ингаляций N02) применения фенспирида в дозе 15 мг/кг (суточная доза для человека с учетом межвидового пересчета) величина сокращения ГМ бронхов крыс в ответ на контрольную стимуляцию ПГН и самой ГМ была ниже, чем у крыс без лечения (183,2 ± 17,2 против 237,9 ± 24,5 мг, р<0,05) и не отличалась от интактных животных. При использовании фенспирида в дозе 0,15 мг/кг сократительный ответ ГМ бронхов на контрольную стимуляцию ПГН не отличался от такового у крыс без лечения. Если у нелеченных животных дополнительная стимуляция ПГН усиливала сокращения ГМ бронхов, то на фоне низкой дозы фенспирида усиления сократительной активности ГМ не отмечалось, а при использовании терапевтической дозы амплитуда сокращения ГМ бронхов была меньше, чем у интактных крыс (78,2±4,7%, р<0,05). При дополнительных стимуляциях самой ГМ амплитуды сокращения не различались после применения обеих доз фенспирида и были достоверно меньше, чем в группе без лечения и у интактных животных.

Т.о., при использовании низкой дозы фенспирида его дилатационный эффект опосредован, главным образом, взаимодействием с окончаниями афферентных С-волокон бронхов, при использовании терапевтической дозы - с окончаниями С-волокон и, в основном, непосредственно с ГМ бронхов. Это согласуется с результатами Girard (1997), который показал, что

фенспирид в концентрации <104М уменьшает выброс тахикининов из сенсорных окончаний на пресинаптическом уровне. В более высоких концентрациях (>104М) проявляется постсинаптическое действие фенспирида непосредственно на ГМ бронхов. Фенспирид в терапевтической дозе сильнее, чем П расслаблял ГМ бронхов как интактных животных, так и крыс, подвергнутых воздействию N02. Морфологическое исследование легких крыс, получавших низкую дозу фенспирида, выявило практически нормальную воздушность легочной ткани, редко встречалась незначительная клеточная инфильтрация. Отсутствовали выраженные структурные повреждения, характерные для животных с ХОБЛ. Применение низкой дозы фенспирида препятствовало развитию воспалительных изменений в легочной ткани под влиянием ингаляционного воздействия N02. Это могло быть обусловлено взаимодействием фенспирида с рецепторами С-волокон, что не только способствовало проявлению бронхолитического эффекта, но и препятствовало инициации нейрогенного воспаления. Терапевтическая доза фенспирида влияла непосредственно на ГМ бронхов. Бронхолитический эффект применения терапевтической дозы фенспирида был подтвержден гистологически - просвет бронхов был расширен, уменьшилось число бокаловидных клеток. Однако в просветах большинства альвеол выявлялись серозная жидкость и частично гемолизированные эритроциты (кровоизлияния разных сроков давности). Воспалительные изменения, характеризовавшиеся экссудацией и пролиферацией клеток лимфоцитарно-макрофагального звена, выявлялись только в интерстициальной ткани легких. Морфологические изменения, характерные для развития ХОБЛ, отсутствовали. Полученные результаты позволяют считать фенспирид перспективным для разработки схем, предупреждающих развитие ХОБЛ. Особое значение имеет установленный факт, что для профилактики этого заболевания может быть использована доза фенспирида значительно меньше терапевтической. Это делает возможным длительное применение препарата у лиц, имеющих контакт с агрессивными ингаляционными факторами (поллютанты, сигаретный дым).

Итак, раздражение рецепторов С-волокон N02 вызывает развитие воспалительных изменений, обусловленных нейрогенными механизмами. Васкулярные нарушения возникают одновременно с запуском нейрогенных механизмов воспаления и прогрессируют по мере его развития, приводя на ранних этапах к расстройствам легочной МЦ, а на более поздних - к повышению давления в МКК (рис. 21). Выделение тахикининов и эфферентная функция блуждающего нерва (БН) способствуют развитию вазоконстрикции и ЛГ. Активация вазоконстрикторых факторов на начальных этапах развития ХОБЛ частично нивелируется за счет компенсаторного синтеза вазодилататоров.

При далеко зашедшем патологическом процессе основную роль в развитии ЛГ начинает играть мощный сосудосуживающий фактор ЕТ-1. До тех пор пока можно оказывать влияние на рецепторы С-волокон (начальные стадии ХОБЛ), состояние сосудов МКК может в определенной степени контролироваться. Это частично объясняет положительный эффект применяемого ИГКС и фенспирида у больных со среднетяжелым течением ХОБЛ, т.к. эти препараты, взаимодействуя с сенсорными терминалями С-волокон, препятствуют выделению нейромедиаторов, инициации воспалительных изменений и формированию васкулярных нарушений.

Поллютанты (N02) +

С-волокна

Рис. 21. Схема участия нейрогенных факторов в развитии сосудистых изменений при формировании ХОБЛ.

ИК - нейрокининовые рецепторы, КЙ*Р - капьцитонин-ген родственный пептид, ЯР - субстанция Р, ТХА2 - тромбоксан А2.

Таким образом, возникновение сосудистых изменений в легких на ранних стадиях ХОБЛ реализуется преимущественно за счет нейрогенных механизмов воспаления. Клеточные и молекулярные факторы начинают оказывать существенное влияние на васкулярные процессы на этапе дальнейшего прогрессирования заболевания, когда в легочной ткани эффект нейрогенных механизмов, инициирующих ХОБЛ, сводится на нет. Это опосредует также дополнительный негеномный механизм КС-рефрактерности, обусловленный инактивацией рецепторов С-волокон.

Поэтому у пациентов с 3 ст. ХОБЛ клинический эффект на фоне лечения ИГКС значительно меньше, чем у больных со 2 ст. заболевания: редуцируется возможность влияния на сосудистые события. Это, в конечном итоге, определяет терапевтический прогноз при назначении ИГКС и подтверждается построенной математической моделью.

ВЫВОДЫ

1. Одним из основных патогенетических механизмов формирования хронического воспаления при ХОБЛ является значительное нарастание уровня провоспалительных цитокинов и отсутствие компенсаторного увеличения содержания ПВ цитокинов как в очаге воспаления, так и на системном уровне.

2. Отсутствие параллелизма в изменении концентрации цитокинов в очаге воспаления и в сыворотке крови у пациентов с разной степенью тяжести ХОБЛ может свидетельствовать о независимом течении локального и системного воспаления.

3. Установлено значение генотипа ММР-1 1G/1G как фактора повышенного риска развития ЛГ и генотипов ММР-3 5 А/5 А, ММР-1 2G/2G и 5-НТТ S как факторов формирования ТБД при ХОБЛ.

4. Полиморфизм гена АСЕ можно рассматривать как модификатор клинических проявлений ХОБЛ. Выявлена роль генотипа ACE D как фактора высокого риска развития системной ДЭ; генотип D/D ассоциирован с высоким риском смертности среди лиц мужского пола в среднем и старшем возрастах.

5. Выявлена роль генетического фактора, регулирующего транспорт и захват серотонина (гиперактивный аллель L гена 5-НТТ), в развитии ДН у больных ХОБЛ, что может быть обусловлено усилением дисфункции гладкомышечных структур сосудов и бронхов.

6. При развитии ХОБЛ выявляется раннее повреждение сосудистого звена, в значительной степени опосредуемое нейрогенными механизмами: увеличивается концентрация ЕТ-1 в периферической крови, нарушается легочная МЦ, повышается уровень СДЛА.

7. Установлено, что формирование ХОБЛ в эксперименте происходит вследствие взаимодействия N02 с афферентными капсаицин чувствительными волокнами ДП, что подтверждает роль нейрогенного воспаления в развитии этого заболевания. На ранних этапах развития ХОБЛ гиперреактивность бронхов связана, главным образом, с нарушением работы нейронов функционального модуля: его афферентного звена и М2-холинорецепторов постганглионарных холинергических нервов, регулирующих выделение АХ; на поздних этапах - со снижением сократительной активности мышц ДП.

8. На модели ХОБЛ доказано, что КС в терапевтических дозах вызывают

дилатацию ГМ бронхов, однако по мере прогрессирования воспаления этот эффект уменьшается, вплоть до полного его исчезновения вследствие инактивации афферентных окончаний С-волокон Г*Ю2. На поздних стадиях формирования патологии КС оказывают бронхоконстрикторное действие вследствие непосредственного влияния на гладкие мышцы ДП.

9. Лечение крыс ингаляционными КС на поздней стадии развития модели ХОБЛ оказывает положительное влияние на сократительные свойства гладких мышц ДП, но не препятствует прогрессирующему ухудшению функции нервных структур бронхов.

10. Выраженность положительного клинического эффекта при назначении ПВ препаратов у больных ХОБЛ зависит от степени оптимизации легочной МЦ на фоне проводимой терапии.

11. Разработана модель прогноза эффективности терапии ИГКС, согласно которой прогностическими критериями являются уровень НЬ, величина СДЛА и размера ПЖд сердца.

12. Доказано, что фенспирид по своему влиянию на клиническое течение и микроциркуляторную дисфункцию легких больных ХОБЛ менее эффективен, чем ИГКС. Однако лечение фенспиридом позволяет достигнуть улучшения по некоторым шкалам, характеризующим КЖ больных.

13. Противовоспалительный препарат фенспирид в терапевтической дозе обладает более выраженным, чем преднизолон дилатационным действием на изолированные препараты бронхов крыс с ХОБЛ. Низкие дозы фенспирида (в 100 раз меньше терапевтических) взаимодействуют, главным образом, с нервными окончаниями С-волокон, терапевтические дозы - с нервными окончаниями С-волокон и с мышцами бронхов.

14. Применение низких доз фенспирида препятствует развитию воспаления в бронхолегочной системе при 15-ти дневной ингаляции N02, а при 60-ти дневной ингаляции в легких крыс выявляется только начальная фаза воспалительного процесса (без морфологических изменений). Терапевтическая доза фенспирида защищает крыс от развития ХОБЛ на протяжении любого срока воздействия N02, приводя к формированию патологического процесса иного характера.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с развитием КС-рефрактерности по мере прогрессирования ХОБЛ, раннее назначение ИГКС оказывает положительное влияние на течение заболевания.

2. Эффективность ИГКС у больных ХОБЛ может быть определена с большой степенью вероятности до их назначения на основе следующих показателей: уровня НЬ, СДЛА, ПЖд сердца. Предложенные показатели доступны для практических ЛПУ и необременительны для пациента.

3. На ранних стадиях ХОБЛ в схему лечения необходимо включать фенс-

пирид, т.к. помимо патогенетического лечебного воздействия препарат может замедлять прогрессирование заболевания даже при условии продолжающегося влияния агрессивных ингаляционных факторов.

4. С целью оптимизации ведения больных ХОБЛ у всех пациентов мужского пола необходимо определять функциональный вариант I/D гена АСЕ-1, т.к. генотип D/D способствует высокому кардиоваскулярному риску и существенному снижению выживаемости.

5. Для оценки функционального состояния эндотелия в клинической практике следует использовать метод УЗ диагностики сосудодвигательной функции плечевой артерии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Zdanov V., Kuzubova N. Blood ecology chages in patients with chronic obstructive pulmonary diseases under trental treatment // European Respiratory Journal. - 2003. - Vol. 9, suppl. 23,78 s„ P. 81.

2. Амосов В.И., Золотницкая В.П., Лукина O.B., Кузубова Н.А. Микроциркуляторная дисфункция у больных ХОБЛ // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2005. - №3. - С. 4145.

3. Суркова Е.А., Кузубова Н.А., Сесь Т.П. Клеточные и молекулярные механизмы ремоделирования легочной ткани при хронической обструктнвной болезни легких // Ученые записки. - 2005. - №4. - С. 9-13.

4. Перлей В.Е., Кузубова Н..А. Легочный кровоток при обструктивных поражениях легких // Тез. 15-го Национального Конгресса по БОД. - М., 2006. - С. 214.

5. Kuzubova N., Suchovskaja О. Jmpact of quit smoking on quality of life in patients with COPD // Annual ERS Congress. - 2005. - P. 931. - Abstr. №253361.

6. Кузубова H.A., Перлей B.E., Гичкин А.Ю., Егорова Н.В. Влияние противовоспалительной терапии на состояние легочно-сердечной гемодинамики у больных хронической обструктнвной болезнью легких // Ученые записки. - 2006. - № 4. - С. 25-31.

7. Суркова Е.А., Кузубова Н.А., Егорова Н.В. Дисбаланс цитокинов IL-1|5 и IL-1RA в сыворотке крови и жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных ХОБЛ // Медицинская иммунология. - 2006. - № 5-6. -С. 667-673.

8. Dotsenko Е., Kuzubova N., Kameneva М., Egorova N.. Exhaled breath condensate for evaluation of inflammation in COPD patients //16 th ERS Annual Congress. - Munich, Germani. - 2006. - Abstr. E318.

9. Kuzubova N.A., Fedin A.N., Lebedeva E.S. Role of intramural ganglions in evolution of chronic inflammation with COPD modeling // 16 th ERS Annual Congress. - Munich, Germani. - 2006. - Abstr. PI302.

10. Surkova E., Kuzubova N., Ses T. Interleukin -lß and interleukin -1 receptor antagonist in serum and bronchoalveolar lavage of patients with COPD // 16 th ERS Annual Congress. - Munich, Germani. - 2006. - Abstr. E4282.

11. Герасин В.А., Деревянко A.B., Кузубова H.A., Двораковская И.В., Егорова H.B. Оценка воспалительных изменений в легких у больных хронической обструктивной болезнью легких по данным бронхофиброскопии и бронхоальвеолярного лаважа // Сб. резюме XVI Национального конгресса по болезням органов дыхания. - СПб. - 2006. -ХХХХП.884. - С.244.

12. Илькович М.М., Кузубова H.A., Суховская O.A., Каменева М.Ю., Киселева Е.А. Результаты акции «Куришь - проверь свои легкие» в Санкт-Петербурге» // Сб. резюме XVI Национального конгресса по болезням органов дыхания. - СПб. - 2006. - №582. - С. 163.

13. Федин А.Н., Кузубова H.A., Данилов JI.H., Лебедева Е.С. Нарушение функции нервных структур дыхательных путей у ингалированных диоксидом азота крыс // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2007. - №9. - С. 1071-1077.

14. Федин А.Н., Постникова Т.Ю., Кузубова H.A., Данилов Л.Н., Лебедева Е.С. Динамика сокращений гладкой мышцы трахеи и бронхов крыс при ингаляции диоксидом азота // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2007. - №10. - С. 11631170.

15. Илькович М.М., Кузубова H.A., Суркова Е.А. Современные представления о терапевтической коррекции некоторых клеточно-молекулярных механизмов патогенеза хронической обструктивной болезни легких // Пульмонология. Избранные вопросы. - 2007. - №19. - с. 1-5.

16. Данилов JI.H., Кузубова H.A., Федин А.Н., Лебедева Е.С. Особенности повреждения бронхов и региональной нервной системы легких ингаляционными оксидантами в эксперименте // Болезни органов дыхания. -2007.-№1.-С. 96-105.

17. Syssoev К., Surkova Е., Kuzubova N., Ses T., Totolian Areg. Expression of mRNA encoding IL-8 and CXCR in blood and lavage of COPD patients // Annual ERS Congress. - 2007. - P. 584. - Abstr. № P3460.

18. Surkova E., Kuzubova N., Ses T., Totolian Areg. Transforming growth factor beta in serum and bronchoalveolar lavage of COPD patients // Annual ERS Congress. - 2007. - P. 57. - Abstr. № E503.

19. Кузубова H.A., Перлей B.E., Гичкин А.Ю., Суркова Е.А., Лукина Е.Ю. Влияние ингаляционной глюкокортикоидной терапии на эндотелиальную функцию и состояние легочно-сердечной гемодинамики у больных хронической обструктивной болезнью легких // Пульмонология. - 2007. - №5. - С. 84-87.

20. Суркова Е.А., Кузубова H.A., Сесь Т.П., Егорова Н.В., Тотолян Арег А. Уровень TGFß в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже больных хронической обструктивной болезнью легких // Медицинская иммунология, - 2008. - Т. 10. - №1. - С.93-98.

21. Доценко Е.К., Гончарова В.А., Кузубова H.A., Каменева М.Ю., Егорова Н.В. Значение исследования конденсата влаги выдыхаемого воздуха при оценке воспалительных изменений в легких у больных хронической обструктивной болезнью легких // Тер. архив. - 2008. -№3, с.10-14.

22. Илькович М.М., Кузубова H.A. Патогенез хронической обструктивной болезни легких // Гл. в монографии «Хроническая обструктивная болезнь легких» под ред. акад. РАМН А.Г. Чучалина. - Изд. «Атмосфера», Москва. - 2008.

23. Привалова Е.В., Вавилова Т.В., Кузубова H.A. Морфофункциональные хара-кгеристики эритроцитов у курильщиков с хронической обструктивной болез-нью легких // Пульмонология. - 2008. - № 6. - С.48-52.

24. Двораковская И.В., Кузубова H.A., Фионик A.M., Платонова И.С., Лебедева Е.С., Данилов Л.Н. Патологическая анатомия бронхов и респираторной ткани крыс при воздействии диоксида азота // Пульмонология. - 2009. - № 1. - С. 78-82.

25. Кузубова H.A., Чухловин A.B., Морозова Е.Б., Тотолян A.A. Роль функциональных вариантов генов ММР-1, ММР-3, АСЕ-1 и 5-НТТ в формировании некоторых особенностей течения хронической обструктивной болезни легких // Молекулярная медицина. - 2009. - №2. - С. 14-19.

Подписано в печать 21.05.09 г. Заказ №36.Тираж 100 экз. Издательство «Нордмедиздат», С.Петербург, Литовский пр., д. 56/Г.,

оф. 100

Тел. (812) 7647931. Email: medizdat@mail.wplus.net Отпечатано в типографии «Аревик Принт», С.Петербург, наб.кан.Грибоедова, д.5, офис 421. Тел. (812) 9825008 print @ are week-print, ru

I Актуальность.

Хроническая обструктивная болезнь легких является^ одной из ведущих причин заболеваемости и смертности во всем мире и приводит к значительному и постоянно растущему экономическому и социальному ущербу [202].

В' основе возникновения и прогрессирования ХОБЛ лежит хроническое воспаление, которое, с одной стороны, является универсальной реакцией на воздействие факторов риска развития болезни, а с другой -главной причиной всех функциональных и морфологических проявлений-ХОБЛ, в том числе процессов тканевой перестройки (ремоделирования легочной ткани). Одним из перспективных направлений экспертами ВОЗ признано «исследование клеточных и молекулярных механизмов - воспаления с целью дальнейшего поиска лекарственных средств, способных тормозить воспалительные процессы тканевой перестройки, лежащие в основе заболевания [202]. Адекватное лечение может значительно увеличить продолжительность и улучшить качество жизни больных, страдающих этой легочной патологией [59].

В развитии ХОБЛ как хронического воспалительного процесса предполагается участие факторов воспаления, прежде всего — системы цитокинов, а также факторов, регулирующих пролиферацию соединительной ткани: систем коллагенолиза и фибринолиза, о чем свидетельствует усиленная энзиматическая активность и повышенная экспрессия генов коллагеназ и эластаз. Недостаточно изучено влияние противовоспалительных цитокинов, прежде всего IL-10, на персистенцию воспалительного процесса при ХОБЛ как в очаге воспаления, так и на системном уровне. Отсутствуют сведения об адекватном увеличении синтеза цитокинов по мере прогрессирования заболевания. Кроме того, за последние 2 года появились сведения в пользу развития при ХОБЛ системного воспаления как независимого процесса [88], и в настоящее время эта проблема обсуждается в литературе. Несмотря на проведение активных исследований сведений, касающихся влияния известных полиморфизмовt генов ММР на особенности развития^ ХОБЛ недостаточно. Так, в китайской популяции показана возможная роль генотипа - 1562Т ММР-9 как фактора развития ХОБЛ у курильщиков [86]. В Японии частота промоторного варианта гена ММР-9 (С-1562Т) была связана с патологией легких, выявленных при компьютерной томографии у больных ХОБЛ, хотя не было обнаружено корреляций с клиническими нарушениями легочных функций [221]. Сведения о роли полиморфизмов в других генах ММР при формировании ХОБЛ недостаточны и противоречивы. Одним из наиболее популярных генных полиморфизмов является делеция или вставка (I/D)< в регуляторном участке гена ангиотезин-превращющего энзима. Полиморфизм I/D? связан со склонностью к почечной гипертензии, а при ХОБЛ показана его взаимосвязь с легочной гипертензией [335]. Полиморфизм гена транспортера серотонина также может иметь значение в развитии ЛГ при ХОБЛ. Eddahibi Di и соавт. (2003) при-исследовании инсерционногои делеционного (L/S) варианта гена 5-НТТ у больных ХОБЛ- показали, что генотип L/L связан с повышенной вероятностью ЛГ [177]. Это было подтверждено более высоким, уровнем давления в легочной артерии и повышенной экспрессией соответствующего белка в клетках гладких мышц у носителей генотипа. Ввиду доказаннойфоли матриксных ММР в коллагенолизе и фиброзе бронхоальвеолярной системы при ХОБЛ^ представлется целесообразным исследовать функциональные промоторные полиморфизмы ММР-1 1G/2G (инициирующего фермента коллагенолиза) и ММР-3 5А/6А, активно участвующих в дальнейшем разрушении межклеточного матрикса и на примере российской популяции определить частоту гиперактивных аллелей генов (АСЕ-1, 5-НТТ), влияющих на сосудистый тонус, и, следовательно, играющих важную роль в патогенезе ХОБЛ и, прежде всего, в формировании ЛА.

Вследствие ряда последовательных патологических изменений в стенке сосудов малого круга кровообращения, гипоксемии, полицитемического синдрома при ХОБЛ формируется «легочное сердце», декомпенсация.» которого является- одной из причин инвалидизации и смертности больных при этой патологии. До сих пор остается много* нерешенных вопросов» в понимании патогенеза хронического легочного сердца при этом заболевании. В последние годы активно обсуждается роль системной' дисфункции эндотелия в инициации и прогрессировании ХОБЛ, ее взаимосвязи с изменением показателей легочной гемодинамики и функциональным состоянием сердца [26]. В доступной литературе отсутствуют работы, посвященные изучению влияния противовоспалительной терапии, на ДЭ1 и« динамику гемоциркуляторных нарушений при ХОБЛ.

В. настоящее время* ведется поиск лекарственных средств, способных повлиять на воспаление при ХОБЛ и, тем самым, замедлить или остановить течение болезни [116]. Кортикостероиды являются-основными препаратами, обладающими противовоспалительным эффектом и применяются' для лечения ХОБЛ. Ингаляционные глюкокортикостероиды (ИГКС) при ХОБЛ, как известно, менее эффективны, чем при бронхиальной астме, что связано с активизацией различных типов клеток воспаления и усилением синтеза различных медиаторов при этих двух заболеваниях. КС оказывают прямое ингибиторное действие не только на эозинофилы, но и на активность эпителиальных клеток дыхательных путей, эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц бронхов. Однако даже при приеме КС препаратов per os у больных ХОБЛ» не происходит снижения числа клеток воспаления, уровня цитокинов и протеаз в индуцированной мокроте [407]. Более того, гистологический анализ периферических дыхательных путей больных с тяжелой формой ХОБЛ не выявил уменьшения воспалительного ответа, несмотря^ на лечение высокими дозами ИГКС [259]. Только формирование стероидрезистентности при этом заболевании способно нивелировать возможность КС ингибировать обычно подавляемые ими цитокины: IL-8, TNFa и др. [71]. Несмотря на это, метанализ результатов ряда клинических исследованийшродемонстрировал, что ГТГКС у пациентов со среднетяжелым и тяжелым: течением болезни улучшали статус здоровья, в т.ч. снижали частоту обострений, и уровень смертности, [349]. Есть данные; что' ИГКС оказывают положительный эффект и. на; гиперреактивность» бронхов, определяющуюся у 60-80% больных ХОБЛ [176]: Было отмечено; что повышенная бронхиальная гиперреактивность ассоциировалась с увеличением; смертности [130]'. Одним из условий успешного лечения!этого" заболевания является преодоление КС-резистентности, которая» может быть., обусловлена не только уже известными молекулярными изменениями [102].

В'развитии любого воспаления; :в т.ч; и:при ХОБЛ*участвует и? нервная, система, которая первой реагирует на все внешние воздействия и участвует в формировании ответных реакций;-Известно, что эффекты КС реализуютсяs и? через ряд нейрогенных звеньев:: увеличение " числа тормозных прссинаптичееких lVb-рецепторов в функциональном модуле, уменьшение их дисфункции и, соответственно,.снижение бронхиальной гиперреактивности; уменьшение числа М2- и Мз-холинорецепторов на гладких мышцах? дыхательных путей;: увеличение активности; ацетилхолинестеразыг в; синапсе функционального модуля; прямое и опосредованное увеличение релаксирующей активности (Зг-агонистов! [231]. Очевидно, что при? ХОБЛ перестройка бронхолегочной ткани, затрагивает и нейрогенные структуры, а: это, в свою очередь, способствует формированию дополнительных механизмов!. КС-резистентности, изучение которых может внести существенный' вклад в достижение положительных, результатов лечения; пациентов с этой патологией. К сожалению, в настоящее время, такие исследования-отсутствуют.

В настоящее время изучается возможность применения в лечении больных ХОБЛ нового поколения ингибиторов провоспалительных медиаторов» или рецепторов к ним. Одним из них является, фенспирид [62, 66]. Фенспирид, как; и КС-препараты, оказывает ингибирующее действие на активность фосфолипазы А2, блокирует Н]-гистаминовые рецепторы и подавляет образование свободных радикалов [14, 65]. Известно также, что под влиянием фенспирида снижается миграция нейтрофилов в дыхательные пути, вызванная в экспериментальных исследованиях введением эндотоксина [199]. С учетом известных фармакологических эффектов препарата представляется перспективным изучить его влияние на системное воспаление и показатели легочно-сердечной гемодинамики при ХОБЛ. В доступной литературе отсутствуют указания на подобные исследования.

Остаются нерешенными и вопросы профилактики ХОБЛ, единственным известным эффективным методом которой является борьба с табакокурением. Однако не разработаны средства и методы, позволяющие минимизировать воздействие агрессивных аэрогенных факторов на развитие заболевания.

Цель: установить клеточно-молекулярные и нейрогенные механизмы, участвующие в формировании и прогрессировании ХОБЛ, определить возможность медикаментозной коррекции выявленных нарушений.

Задачи.

1. Определить роль клеточно-молекулярных факторов (показателей врожденного и адаптивного иммунитета, цитокинов, ростовых факторов) в развитии локального и системного воспаления на различных стадиях ХОБЛ и оценить возможность коррекции выявленных изменений.

2. Провести генотипирование функционально активных промоторных аллелей генов ММР-1 (1G/2G"1607); ММР-3 (5А/6А"600); 5-НТТ S/L (участок HTTLPR), а также интронного полиморфизма гена АСЕ-1 I/D для определения роли некоторых патогенетически значимых функциональных генных вариантов в формировании клинических проявлений ХОБЛ.

3. Оценить влияние противовоспалительной терапии беклометазон дипропионатом (БДП) и фенспиридом на клиническое течение и показатели качества жизни у больных ХОБЛ в зависимости от тяжести-течения заболевания:

4. Изучить влияние противовоспалительной терапии БДП1 и фенспиридом на микроциркуляцию малого круга кровообращения, показатели легочной и центральной гемодинамики у больных ХОБЛ в зависимости от тяжести течения заболевания.

5. Изучить вазорегулирующую функцию эндотелия в зависимости от стадии ХОБЛ, сопоставить ее с основными показателями легочно-сердечной гемодинамики и определить возможность медикаментозной коррекции выявленных нарушений БДП и фенспиридом.

6. Создать математическую модель, прогнозирующую клиническую эффективность лечения ИГКС.

7. Создать модель ХОБЛ в эксперименте и определить особенности течения воспалительного процесса в очаге воспаления и на системном уровне.

8. Изучить роль автономной нервной системы в развитии обструктивных нарушений на различных этапах формирования ХОБЛ в эксперименте.

9. Выявить нейрогенные механизмы КС-резистентности1 и определить i оптимальные сроки применения ИГКС при формировании ХОБЛ в эксперименте.

10. Изучить возможность медикаментозной профилактики формирования и прогрессирования ХОБЛ в эксперименте.

Научная новизна.

Разработано новое направление в патогенезе ХОБЛ — установлена роль сосудистых и нейрогенных механизмов в формировании этого заболевания: - доказано, что у пациентов ХОБЛ без выраженной артериальной гипертензии и ишемической болезни сердца уже на 2 стадии заболевания определяется системная эндотелиальная дисфункция и нарушение легочно-сердечной гемодинамики. БДП' и фенспирид оказывают положительное влияние на показатели легочно-сердечной гемодинамики у больных со среднетяжелым течением ХОБЛ;

- построена математическая модель, прогнозирующая клиническую эффективность назначения ИГКС. Показано, что основными индикаторами, определяющими прогноз, являются показатели, характеризующие васкулярные процессы: уровень гемоглобина, величина систолического давления в легочной артерии и диастолический размер правого желудочка;

- впервые показано корригирующее влияние БДП и фенспирида на васкулярные нарушения у больных 2 стадией заболевания, что опосредуется ингибированием нейрогенных механизмов воспаления и лежит в основе реализации клинического эффекта применяемых лекарственных средств;

- впервые выявлена прогностическая) значимость генотипа АСЕ D как фактора высокого риска развития системной дисфункции эндотелия при ХОБЛ, а также выявлена взаимосвязь между частотой носительства аллеля D гена АСЕ и частотой обострения ХОБЛ. Показано, что генотип D/D гена АСЕ ассоциирован с ранней смертью среди лиц мужского пола в среднем и старшем возрастах;

- создана экспериментальная модель ХОБЛ при использовании диоксида азота в качестве инициирующего фактора (решение о выдаче патента от 19.02.2009 г.). Впервые показано, что NO2 взаимодействует с афферентными капсаицин-чувствительными С-волокнами дыхательных путей, инактивируя их по мере увеличения срока воздействия;

- в эксперименте доказана роль автономной нервной системы в развитии обструктивных нарушений на этапах формирования ХОБЛ: на ранних стадиях заболевания нарушается работа афферентного звена и постганглионарных пресинаптических М2-холинорецепторов, на поздних -снижается сократительная активность мышц дыхательных путей;

- впервые установлено, что КС, взаимодействуя с эфферентными С-волокнами на ранних стадиях формирования ХОБЛ, оказывают дилатационное действие на бронхи; на поздних стадиях, напротив, вызывают бронхоконстрикторный эффект. Инактивация рецепторов Сволокон является одним из механизмов КС-рефрактерности при прогрессировании ХОБЛ; - в эксперименте впервые доказана возможность замедления формирования ХОБЛ при использовании некортикостероидного противовоспалительного препарата фенспирида. Это может стать одним из направлений! для разработки первичной медикаментозной профилактики этого заболевания при длительном воздействии агрессивных ингаляционных факторов.

Установлено, что на любой стадии ХОБЛ в очаге воспаления и на системном уровне отсутствует компенсаторное увеличение содержания противовоспалительных цитокинов (IL-lra, IL-10). Выявлено независимое течение системного и локального воспаления.

Впервые установлено1 прогностическое значение генов, определяющих ремоделирование межклеточного матрикса при воспалительных процессах в легких как факторов высокого риска развития легочной гипертензии (генотип ММР-1 1G/1G) и трахеобронхиальной дискенезии (генотип ММР-3 5 А/5 А) при ХОБЛ.

Показано, что развитию дыхательной' недостаточности у больных ХОБЛ способствует генотип L гена 5-НТТ, регулирующий транспорт и захват серотонина.

Практическая значимость работы.

Возможность коррекции сосудистых нарушений, оказывающих существенное влияние на формирование и прогрессирование ХОБЛ, определяет эффективность противовоспалительной терапии при этом заболевании. Результаты исследования позволили обосновать раннее (начиная со 2 стадии) назначение ИГКС больным ХОБЛ.

Доказано, что прогностическими критериями эффективности терапии ИГКС у больных ХОБЛ являются уровень гемоглобина, величина СДЛА, ПЖд. Определение этих показателей доступно в лечебной практике.

Установлено, что комбинация ИГКС и фенспирида при ХОБЛ может замедлить развитие сосудистых изменений, способствующих нарушению гемодинамики МКК, формированию ХЛС и инвалидизации больных. Раннее назначение фенспирида может замедлить прогрессирование заболевания даже при условии продолжающегося влияния поллютантов, что следует учитывать при ведении пациентов, имеющих контакт с агрессивными, ингаляционными факторами.

Для оценки функционального состояния эндотелия в клинической практике может быть использован широко доступный интегральный метод УЗ диагностики сосудодвигательной функции плечевой артерии.

Научно обоснована необходимость определения функционального варианта I/D гена АСЕ-1 для определения кардиоваскулярного риска и коррекции1 лечения у всех пациентов с ХОБЛ мужского пола.

Положения, выносимые на защиту.

1. На фенотипические особенности ХОБЛ влияют функциональные полиморфизмы генов ММР-1, ММР-3, АСЕ-1- и 5-НТТ: а) генотип ММР-1 1G/1G является фактором повышенного риска развития легочной-гипертензии; б) носительство генотипов ММР-3 5 А/5 А и ММР-1 2G/2G и НТТ S влияет на частоту встречаемости трахеобронхиальной дискинезии; в) гиперактивный аллель L гена 5-НТТ влияет на развитие дыхательной недостаточности; г) генотип АСЕ D является фактором высокого риска развития системной дисфункции эндотелия.

2. Дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов способствует прогрессированию хронического воспаления при ХОБЛ.

3. Сосудистые изменения играют значительную роль в формировании и развитии ХОБЛ: а).1 увеличение концентрации эндотелина-1, расстройства легочной МЦ, повышение уровня* СДЛА выявляются на 2 стадии ХОБЛ. При прогрессировавши заболевания эти- показатели достоверно1 не изменяются, однако нарастают вентиляционные расстройства; б) положительный клинический эффект противовоспалительной терапии БДП и фенспиридом реализуется за счет оптимизации состояния легочного сосудистого русла; в)- функциональные варианты генов ММР-1, ММР-3, АСЕ-Г и, 5-НТТ патогенетически значимые при ХОБЛ, ассоциированы с развитием патологических васкулярных реакций. /

4. Пусковым моментом развита нейрогенного- воспаления при экспериментальном воспроизведении ХОБЛ является активация афферентных нервных окончаний С-волокон длительными, ингаляциями диоксида азота.

5. Рефрактерность. к КС при ХОБЛ. определяется-не только молекулярными факторами* но и нейрогенным (негеномным)- механизмом: Дилатация; гладких мышц бронхов, при использовании КС опосредована их влиянием на рецепторы С-волокон. При прогрессировании заболевания, снижается возможность нервных структур принимать участие в адекватном ответе на кортикостероиды, что уменьшает вероятность достижения клинического эффекта.

6. Применение низких доз фенспирида за счет активации рецепторов С-волокон препятствует формированию ХОБЛ в эксперименте.

Апробация-и практическая реализация материалов диссертации. По теме диссертации'написаны клинические рекомендации и 2 пособия для врачей. Получено положительное решение о выдаче патента от 19.02.2009 г. на заявку №2008111053 РФ, МПК8 А 61В «Способ моделирования ХОБЛ». Материалы диссертации были представлены на 15-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006), на 16-м

Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Германия, Мюнхен, 2006), на научно-практической конференции, посвященной' 40-летию НИИ пульмонологии. СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2007), на Санкт-Петербургском обществе терапевтов имени С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2007), на 17-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007), на Научном Совете СПбГМУ им. акад. ИЛ. Павлова (Санкт-Петербург, 2007), на 17-м Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Швеция, Стокгольм, 2007), на республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы пульмонологии» (республика Карелия, Петрозаводск, 2008), на научно-практической конференции «От научных исследований к практической пульмонологии» (Санкт-Петербург, 2008), на научно-практической конференции «ХОБЛ — актуальная проблема респираторной! медицины» (Самара, 2008), на 7-м 1

Конгрессе терапевтов Санкт-Петербурга и Северо-Западного Федерального округа России (Санкт-Петербург, 2008); на 18-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008), на 18-м Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Германия, Берлин, 2008), на конгрессе пульмонологов врачей' Санкт-Петербурга и Северо-Западного региона (Санкт-Петербург, 2009).

Результаты исследования внедрены в практическую работу клиники НИИ пульмонологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, районных поликлиник и пульмонологических отделений стационаров г. Санкт-Петербурга, Великого Новгорода, Петрозаводска.

По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК — 12; в научных журналах - 2; глав в монографии - 1; публикаций в сборниках трудов Национальных конгрессов — 3; в сборниках трудов международных конгрессов — 7.

Личный вклад автора.

Исследования, представленные в диссертационной работе, выполнены при непосредственном участии автора в ГОУВПО «СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития: в НИИ пульмонологии, в научно-методическом центре молекулярной медицины, на кафедре рентгенологии и радиационной медицины, а так же в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Самостоятельно проводилось клиническое обследование больных. Методики, описанные в клиническом и экспериментальном разделах, осуществлялись под личным контролем автора. На исследования, выполненные совместно, имеются ссылки в диссертации и в совместных публикациях. Доля участия автора в накоплении, обобщении и анализе материала составляет 100%.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 399 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 2 разделов, включающих 12 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 82 таблицами и 120 рисунками. Библиографический указатель содержит 419 источников, в том числе 351 зарубежных авторов.

выводы.

1. Одним из основных патогенетических механизмов формирования хронического воспаления при ХОБЛ является значительное нарастание уровня провоспалительных цитокинов и отсутствие компенсаторного увеличения содержания ПВ цитокинов как в очаге воспаления, так и на системном уровне.

2. Отсутствие параллелизма в изменении концентрации цитокинов в очаге воспаления и в сыворотке крови у пациентов с разной степенью тяжести ХОБЛ может свидетельствовать о независимом течении локального и системного воспаления.

3. Установлено значение генотипа ММР-1 1G/1G как фактора повышенного риска развития легочной гипертензии и генотипов ММР-3 5 А/5 А, ММР-1 2G/2G и 5-НТТ S как факторов формирования трахеобронхиальной дискенезии при ХОБЛ.

4. Полиморфизм гена АСЕ можно рассматривать как модификатор клинических проявлений ХОБЛ. Выявлена роль генотипа АСЕ D как фактора высокого риска развития системной дисфункции эндотелия, генотип D/D ассоциирован с высоким риском смертности среди лиц мужского пола в среднем и старшем возрастах.

5. Выявлена роль генетического фактора, регулирующего транспорт и захват серотонина (гиперактивный аллель L гена 5-НТТ) в развитии дыхательной недостаточности у больных ХОБЛ, что может быть обусловлено усилением дисфункции гладкомышечных структур сосудов и бронхов.

6. При развитии ХОБЛ выявляется раннее повреждение сосудистого звена, в значительной степени опосредуемого нейрогенными механизмами: увеличивается концентрация эндотелина-1 в периферической крови, нарушается легочная микроциркуляция, повышается уровень систолического давления в легочной артерии.

7. Установлено, что формирование ХОБЛ в эксперименте происходит вследствие взаимодействия диоксида азота с афферентными капсаицин чувствительными волокнами дыхательных путей, что подтверждает роль нейрогенного воспаления в развитии этого заболевания. На ранних этапах развития ХОБЛ гиперреактивность бронхов связана, главным образом, с нарушением работы нейронов функционального модуля: его афферентного звена и Мг-холинорецепторов постганглионарных холинергических нервов, регулирующих выделение ацетилхолина; на поздних этапах — со снижением сократительной активности мышц дыхательных путей.

8. На модели ХОБЛ доказано, что КС в терапевтических дозах вызывают дилатацию гладкой мышцы бронхов, однако по мере прогрессирования воспаления этот эффект уменьшается, вплоть до полного его исчезновения вследствие инактивации афферентных окончаний С-волокон диоксидом азота. На поздних стадиях формирования патологии КС оказывают бронхоконстрикторное действие вследствие непосредственного влияния на гладкие мышцы дыхательных путей.

9. Лечение крыс ингаляционными кортикостероидами на поздней стадии развития модели ХОБЛ оказывает положительное влияние на сократительные свойства гладких мышц дыхательных путей, но не препят-ствует прогрессирующему ухудшению функции нервных структур бронхов.

10. Выраженность положительного клинического эффекта при назначении ПВ препаратов у больных ХОБЛ зависит от степени оптимизации легочной микроциркуляции на фоне проводимой терапии.

11. Разработана модель прогноза эффективности ингаляционной глюко-кортикостероидной терапии, согласно которой прогностическими критериями являются уровень гемоглобина, величина систолического давления в легочной артерии и диастолический размер правого желудочка сердца.

12. Доказано, что фенспирид по своему влиянию на клиническое течение и микроциркуляторную дисфункцию легких больных ХОБЛ менее эффективен, чем ИГКС. Однако лечение фенспиридом позволяет достигнуть улучшения по некоторым шкалам, характеризующим качество жизни больных.

13. Противовоспалительный препарат фенспирид в терапевтической дозе обладает более выраженным, чем преднизолон дилатационным действием на изолированные препараты бронхов крыс с ХОБЛ. Низкие дозы фенспирида (в 100 раз меньше терапевтических) взаимодействуют, главным образом, с нервными окончаниями С-волокон, терапевтические дозы - с нервными окончаниями С-волокон и с мышцами бронхов.

Применение низких доз фенспирида препятствует развитию воспаления в бронхолегочной системе при 15-ти дневной ингаляции диоксидом азота, а при 60-ти дневной ингаляции в легких крыс выявляется только начальная фаза воспалительного процесса (без морфологических изменений). Терапевтическая доза фенспирида защищает крыс от развития ХОБЛ на протяжении любого срока воздействия N02, приводя к формированию патологического процесса иного характера.

Практические рекомендации.

1. В связи с развитием КС-рефрактерности по мере прогрессирования ХОБЛ, раннее назначение ИГКС оказывает положительное влияние на течение заболевания.

2. Эффективность ИГКС у больных ХОБЛ может быть определена с большой степенью вероятности до их назначения на основе следующих показателей: уровня гемоглобина, систолического давления в легочной артерии, диастолического размера правого желудочка сердца. Предложенные показатели доступны для практических ЛПУ и необременительны для пациента.

3. На ранних стадиях ХОБЛ в схему лечения необходимо включать фенспирид, т.к. помимо патогенетического лечебного воздействия препарат может замедлять прогрессирование заболевания даже при условии продолжающегося влияния агрессивных ингаляционных факторов.

4. С целью оптимизации ведения больных ХОБЛ у всех пациентов мужского пола необходимо определять функциональный вариант I/D гена АСЕ-1, т.к. генотип D/D способствует высокому кардиоваскулярному риску и существенному снижению выживаемости.

5. Для оценки функционального состояния эндотелия в клинической практике следует использовать метод ультразвуковой диагностики сосудодвигательной функции плечевой артерии.