Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Особенности состояния системы глутатиона, перексиного окисления липидов и метаболизма лимфоцитов крови в патогенезе инсулинзависимого сахарного диабета

На правах рукописи

ГЕРШКОРОН «Прима Ароновна

ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА, ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И МЕТАБОЛИЗМА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ИНСУЛИНЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Красноярский государственный университет» на кафедре биохимии и физиологии человека и животных

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Савченко А.А. кандидат биологических наук, профессор Титова Н.М.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Власов Б.Я. кандидат биологических наук Петрова В.А.

Ведущая организация:

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Защита состоится «__»_2005 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.054.01. в ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения Российской академии медицинских наук» (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения Российской академии медицинских наук» (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16).

Автореферат разослан -10" ь^М^^гт г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Шолохов Л.Ф.

fyf?

' ' r r ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Сахарный диабет занимает третье место среди причин смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. В настоящее время в мире насчитывается около 160 млн больных сахарным диабетом, каждые 10 - 15 лет число больных во всех странах мира удваивается. Предполагается, что к 2010 году количество больных диабетом превысит 230 млн человек (Северин Е.С., 2000, Imura Н., 2000, Пашинцева Л.П. с соавт., 2001, Аметов А.С., 2002).

В манифестации инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД), его течении и развитии осложнений одно из основных мест отводится изменениям в иммунном статусе организма. В деструкции (3-клеток островков Лангерганса участвуют как клеточные, так и гуморальные звенья иммунитета (Шишко П.И. с соавт., 1993, Escobar-Morreale H.F. et al., 2000).

В живых организмах в ходе нормального клеточного метаболизма постоянно протекают реакции с образованием активных форм кислорода (АФК) (Forman H.J, Boveris А., 1992, Зенков Н.К. с соавт., 2001, Георгиева Н., Гаджева В., 2002). В физиологических условиях образование АФК в клетках поддерживается на низком уровне системой ферментативных и неферментативных антиоксидантов (Микаэлян Н.П. с соавт., 2002, Но Y.-S., 2002). Преобладание продукции АФК в результате повышения их образования или истощения антиоксидантов сопровождается активацией деструктивных процессов, что получило название «окислительный стресс» (Мартинчик А.Н., Бондарев Г.И., 1986, Кулинский В.И., 1999, Betteridge D.J., 2000, Mayne S.T., 2003). Окислительный стресс является характерным звеном патогенеза ряда заболеваний, включая диабет (Дубинина Е.Е., 2001, Yasunari К. et al., 2002).

Взаимодействие свободных радикалов с полиненасыщенными жирными кислотами приводит к цепным реакциям перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Власов А.П. с соавт., 2000, Shibuki Н. et al., 2000, Пасечник И.Н., 2001). Процессы ПОЛ являются одними из инициирующих звеньев в формировании функциональной неполноценности иммунокомпетентных клеток (Булыгин Г.В. с соавт., 1998).

Эффективность функционирования двух механизмов антиоксидантной защиты - цепи биоантиоксидантов и группы антиперекисных ферментов -зависит от фонда атомов водорода (НАДН и НАДФН). Этот фонд пополняется в процессах биологического ферментативного окисления -

дегидрирования энергетических субстратс 1998).

- Л.Е- 1996. Snolarics Z.,

«»ОС НАЦИОНАЛЬНА9 БИБЛИОТЕКА,

Однако работы по исследованию антиоксидантного статуса, активности метаболических ферментов лимфоцитов крови при ИЗСД являются единичными, отсутствуют данные по комплексной оценке состояния антиоксвдантной системы (АОС), процессов свободнорадикального окисления и метаболической системы лимфоцитов больных ИЗСД.

Цель исследования. Изучить функциональную активность системы глутатиона, интенсивность процессов ПОЛ и метаболический статус лимфоцитов крови детей и подростков в патогенезе ИЗСД в зависимости от степени компенсации и продолжительности заболевания.

Задачи исследованиях

1. Исследовать состояние системы глутатиона и процессов ПОЛ в лимфоцитах детей и подростков, больных ИЗСД.

2. Исследовать активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови детей и подростков, больных ИЗСД.

3. Оценить зависимость уровней компонентов системы глутатиона, продуктов ПОЛ, метаболических ферментов лимфоцитов больных ИЗСД от длительности заболевания.

4. Оценить зависимость уровней компонентов системы глутатиона, продуктов ПОЛ, метаболических ферментов лимфоцитов больных ИЗСД от степени компенсации.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование метаболического статуса, системы глутатиона и интенсивности процессов ПОЛ в лимфоцитах крови в патогенезе ИЗСД.

Впервые показано, что в лимфоцитах крови ИЗСД сопровождается возрастанием активности глутатионредуктазы (ГР), снижением активности глутатион-Б-трансферазы (ГБТ) и глутатионпероксидазы (ГП), сохранением уровня восстановленного глутатиона (ГБН) в пределах контрольного диапазона.

Установлено, что в лимфоцитах крови детей и подростков, больных ИЗСД, повышается уровень активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ, активируется пентозофосфатный путь (ПФП) окисления глюкозы, снижается уровень реакций гликолиза, цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), аминокислотного обмена.

Показано, что различные периоды длительности ИЗСД характеризуются изменением в лимфоцитах уровней ферментов ЦТК, аминокислотного и липидного обмена, НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДФИЦДГ), фермента АОС - ГБТ.

Обнаружена динамика уровней ферментов ЦТК, аминокислотного обмена, НАДФИЦДГ, первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) в лимфоцитах в зависимости от степени компенсации.

Практическая значимость. Комплексное исследование прооксидантных, ангиоксидантных и метаболических систем лимфоцитов больных ИЗСД позволяет составить представление о состоянии внутриклеточных процессов в иммунокомпетентных клетках, что в свою очередь может бьггь использовано при разработке методов диагностики и терапии данного заболевания.

Динамика определенных показателей в зависимости от длительности заболевания, в частности: снижение активности ГБТ в лимфоцитах больных ИЗСД менее года, достижение НАД-зависимой изоцитратдегцдрогеназой (НАДИЦДГ) уровня контрольных значений в лимфоцитах больных ИЗСД более 5 лет позволяет использовать указанные изменения в качестве дополнительных параметров, характеризующих определенные периоды длительности заболевания.

Снижение содержания первичных продуктов ПОЛ -ДК в фазу субкомпенсации может быть использовано при установлении степени компенсации.

Определение окислительно-восстановительного индекса,

представляющего собой соотношение уровней активности НАДФ- и НАДФН-зависимых реакций дегидрогеназ, позволяет оценить состояние процессов восстановительного синтеза в лимфоцитах крови в патогенезе ИЗСД.

Методы проведенных исследований внедрены в практику работы Краевой детской клинической больницы (г. Красноярск) и ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (г. Красноярск). Положения, выносимые на защиту.

1. Патогенез ИЗСД характеризуется повышением активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови при снижении уровней интенсивности дегидрогеназных реакций гликолиза, ЦТК и аминокислотного обмена. Повышение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и ГР способствует сохранению концентрации ГвН в пределах контрольных значений, в результате чего предотвращается накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ.

2. Независимо от длительности заболевания патогенетические процессы ИЗСД сопровождаются повышением активное™ Г6ФДГ, НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы (НАДФМДГ) и ГР, снижением уровней терминальных реакций гликолиза, подавлением активности

глутаматдегидрогеназы (ГДГ) в лимфоцитах крови. В группе с длительностью заболевания менее года снижается уровень активности TST. Активность НАДИЦДГ, пониженная у детей с длительностью ИЗСД менее 5 лет, при длительности заболевания более 5 лет достигает уровня контрольных значений.

3 Стадия субкомпенсации характеризуется снижением содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК, стадия декомпенсации -достижением концентрации ДК уровня контрольных значений, повышением активности НАДФИЦДГ. Как стадия субкомпенсации, так и стадия декомпенсации сопровождаются повышением уровней активности Г6ФДГ, НАДФМДГ, ГР, подавлением реакций гликолиза, ЦТК, аминокислотного обмена в лимфоцитах крови больных ИЗСД. Апробация материалов диссертации.

Основные положения диссертации обсуждены на: 1 Всероссийской конференции «Актуальные проблемы эволюционной и популяционной физиологии человека» (Тюмень, 2001); Южно - Сибирской международной научной конференции студентов и молодых ученых (Абакан, 2001); 2 ой научной конференции с международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, ); Научно -практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2002); 4-ом Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003); Конференции молодых ученых «Актуальные вопросы здравоохранения регионов Сибири» (Красноярск, 2003); 3-ей Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Красноярском крае: Метаболические механизмы иммунореакгивности» (Красноярск, 2004).

Публикаиии. Основные положения диссертации опубликованы в 11 печатных работах.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав: обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы; содержит 3 таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 265 библиографических источников (158 отечественных и 107 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В процессе работы было обследовано 208 человек: 109 детей и подростков в возрасте от 7 до 14 лет с ИЗСД и 99 здоровых детей и подростков в том же возрастном диапазоне. Обследование детей и подростков с ИЗСД проводилось в эндокринологическом отделении Краевой детской клинической больницы г. Красноярска. Диагноз ИЗСД ставился на основании клинико - лабораторного обследования. Все дети были осмотрены узкими специалистами (окулист, невропатолог, кардиолог) для раннего выявления осложнений и сопутствующих заболеваний. Здоровые дети и подростки были отобраны в школах города Красноярска врачом-педиатром по данным школьных медицинских карт и клинического осмотра.

По длительности заболевания больных ИЗСД разделили на 3 группы: с длительностью заболевания менее года -29 человек, с длительностью ИЗСД от года до 5 лет - 48 человек, с длительностью заболевания более 5 лет - 21 человек.

Наблюдаемые дети получали человеческий рекомбинантный инсулин в индивидуальной дозе по интенсифицированной схеме. Стадию компенсации углеводного обмена за последние 3 месяца оценивали по уровню гликозилированного гемоглобина (гликоНЬ) - НЪА,С: содержание гликоНЬ: < 6% - компенсация; 6 -10 % - субкомпенсация; > 10 % - декомпенсация.

В работе использовали кровь, полученную у обследованных пункцией локтевой вены и стабилизированную гепарином. Выделение лимфоцитов производили центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина по методу Boyum А. (1968) в модификации, описанной Натвигом Дж.Б. (1980).

Состояние антиоксидантной системы лимфоцитов детей и подростков, больных ИЗСД, оценивали на основании данных по исследованию уровней компонентов системы глутатиона: концентрации TSH, активности ГП, Г8Т и ГР. Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов судили по содержанию продуктов липопероксидации -ДК и малонового диальдегида (МДА). Состояние метаболического статуса лимфоцитов детей и подростков, больных ИЗСД, оценивали по уровню активности ферментов гликолиза, ЦТК, ПФП, аминокислотного обмена, а также НАДФ-зависимых МДГ и ИЦЦГ.

Для определения уровней компонентов АОС и продуктов ПОЛ использовались спектрофотометрические методы анализа. Содержание rSH, активность ГП и TST определяли по методике Карпшценко А.И. с соавт. (1997). Определение содержания ДК в лимфоцитах проводили по методике Гаврилова В.Б., Мишкорудной М.И. (1983) в нашей модификации.

Содержание МДА определяли по методике Андреева Л.И. с соавт. (1988) в нашей модификации. Биолюминесцентное определение активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ проводили по ранее разработанным методикам (Савченко А.А., 1996).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ SPSS 8,0. Проверку гипотезы о статистической достоверности двух выборок осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни. Оценку достоверности различий средних проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для исследования силы взаимосвязей показателей вычисляли коэффициент корреляции. Достоверность различий коэффициентов корреляции оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Для решения задач системного анализа использовали нейросетевой классификатор и предиктор (Горбань А.Н., 1990).

2. Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании в лимфоцитах крови антиоксидантного статуса, который определяется соотношением прооксидантных и антиоксидантных систем (Соколовский В.В., 1988, Yahia D.A. et al., 2003), в общей группе детей и подростков с ИЗСД обнаружено (табл. 1) снижение активности TST -важнейшего компонента АОС. TST - семейство мультиферментных белков, использующих rSH для обезвреживания ксенобиотиков, которое может осуществляться путем конъюгации субстратов с глутатионом, в результате нуклеофильного замещения, а также восстановления органических пероксидов до спиртов (Колссниченко Л.С., Кулинский В.И, 1989, Rahman 1., MacNee W., 1999, Северин Е., 2003). Понижение активности фермента либо указывает на истощение АОС лимфоцитов, либо является следствием ингибирования.

У больных ИЗСД возрастает активность ГР - фермента, осуществляющего восстановление окисленной формы глутатиона за счет НАДФН, образующегося в ПФП в глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции (Колесниченко Л.С., Кулинский В.И., 1989, Вартанян Л.С. с соавт., 2001, Lee J.H. et al., 2003). Возрастание активности ГР, вероятно, свидетельствует о повышенном уровне образования окисленной формы глутатиона, что может происходить как при непосредственном взаимодействии PSH с АФК, так и в реакциях, катализируемых глутатион-зависимыми ферментами (Кения М.В. с соавт., 1993, Wheeler C.L. et al., 2003).

Содержание TSH - ключевого внутриклеточного восстанавливающего areina (Rahman I., MacNee W., 1999), а также активность ГП,

осуществляющей восстановление перекиси водорода и других органических гидроперекисей при участии глутатиона (Meister А. et al., 1983, Зборовская И.А., Банникова М.В., 1995, Gilgun-Sherki Y. et al., 2002), в лимфоцитах крови больных ИЗСД находятся в пределах контрольного диапазона. При этом ГП является основным глутатион-зависимым ферментом, участвующим в нейтрализации перекисных соединений, в лимфоцитах крови больных ИЗСД, на что указывает прямая корреляционная зависимость TSH - ГП (г = 0,58, Р< 0,05).

Таблица 1

Содержание восстановленного глутатиона, продуктов ПОЛ и активность ферментов системы глутатиона в лимфоцитах крови детей с ИЗСД (Х± от)

Показатели Здоровые N=109 ИЗСД N=99 Р

TSH, мкмоль/106кл. 26,83 ± 1,20 29,51 ± 1,60

ГП, мкмоль rSH/минх Ю6 кл. 12,46 ± 0,89 12,33 ±1,53

TST, мкмоль rSH/минх 106 кл. 12,44 ±1,83 8,14 ± 0,77 Р<0,05

ГР, мкЕ/104 кл. 3,6 ± 0,98 11,3 + 2,16 Р<0,01

ДК, ммоль/106кл. 0,42 ± 0,03 0,35 ± 0,02 Р«0,05

МДА, мкмоль/106кл. 12,29 ± 0,73 11,26 ±0,62

В группе детей и подростков, больных ИЗСД, наблюдается снижение содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК. Снижение концентрации ДК может быть связано с высокой скоростью преобразования дэдшых продуктов ПОЛ в МДА, так как практически одновременно с накоплением конъюгированных диенов происходит их окислительная деструкция с образованием карбонильных соединений (Ланкин В.З. с соавт., 2002). Однако уровень вторичного продукта ПОЛ -МДА соответствует в группе больных ИЗСД контрольному, что может свидетельствовать о высоком уровне функционирования АОС.

При исследовании активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови детей и подростков с ИЗСД в общей группе обследованных обнаружено (табл. 2) повышение активности Г6ФДГ -фермента, осуществляющего дегидрирование глюкозо-б-фосфата с образованием 6-фосфоглюконолактона в первой реакции ПФП и использующего в качестве ко-фактора НАДФ+. Г6ФДГ является ключевым

ферментом ПФП, который поставляет рибозо-5-фосфат и НАДФН - два важных исходных соединения для анаболических процессов: НАДФН необходим для биосинтеза жирных кислот и изопреноидов, а также для регенерации ГБН; рибозо-5-фосфат является предшественником в биосинтезе нуклеотидов (Кольман Я., Рем К.-Г., 2000, Ргеёепкз \У.М. е1 а1., 2003). Следствием повышения активности фермента, вероятно, является интенсификация пентозного цикла в целом. Известно, что повышение уровня Г6ФДГ в лимфоцитах происходит в условиях окислительного стресса, когда истощается пул ГБН (8а1уетш Р. е1 а1., 1999).

Таблица 2

Активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ (мкЕ) в лимфоцитах крови детей с ИЗСД (X ± т)

Показатели Здоровые N=48 ИЗСД N=33 Р

Г6ФДГ 0,53 ±0,13 6,49 ± 1,14 Р<0,001

ГЗФДГ 0,18 ±0,04 0,31 ±0,10

НАДЛДГ 33,02 ± 3,29 4,17 ±0,57 Р<0,001

НАДМДГ 16,53 ± 2,24 32,15 ±4,60 Р<0,01

НАДГДГ 4,70 ±1,80 0,85±0,26 Р<0,05

НАДИЦДГ 3,34 ± 0,52 0,16 ±0,03 Р<0,001

НАДФМДГ 4,30 ± 0,75 10,46 ±1,76 Р<0,001

НАДФГДГ 0,98 ± 0,20 0,58 ±0,16

НАДФИЦЦГ 16,05 ±2,87 25,94 ± 4,36 Р<0,01

НАДНЛДГ 119,51 ± 16,63 29,98 ±4,51 Р<0,001

НАД НМД!" 126,75 ± 16,40 59,48 ± 8,36 Р<0,01

НАДНГДГ 41,8915,58 29,82 ±4,09

НАДФНГДГ 163,54 ± 17,12 34,49 ± 3,76 Р<0,001

В группе детей и подростков, больных ИЗСД, происходит снижение уровней активности НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (НАДНЛДГ) и НАД-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (НАДЛДГ). Понижение уровня терминальной реакции анаэробного гликолиза, катализируемой НАДНЛДГ, вероятно, сказывается на снижении скорости процесса в целом. Следствием подавления активности НАД-зависимой ЛДГ может являться снижение уровня включения пирувата в процессы дальнейшего расщепления.

В общей группе больных ИЗСД наблюдается повышение активности НАДФ-зависимой МДГ, осуществляющей окислительное декарбоксилирование малата с образованием пирувата. Возможно, активация фермента необходима для компенсации недостаточного уровня образования пирувата вследствие подавления реакций гликолиза.

У больных ИЗСД наблюдается понижение активности НАДИЦДГ. Фермент катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата, приводящее к образованию ск-кетоглутората и НАДН. НАДИЦДГ является лимитирующим ферментом ЦТК и регулирует скорость процесса в целом (Ceccarelly С. et al., 2002, Wrenger С., Muller S., 2003).

Активность НАДФ-зависимой ИЦДГ, так же катализирующей реакцию окислительного декарбоксилирования изоцитрата с образованием а-кетоглутората (однако в данном случае в качестве ко-фермента используется НАДФ+), в группе детей и подростков, больных ИЗСД, повышается. Существуют данные о возрастании активности НАДФИДГ в условиях выраженного окислительного стресса (Медведева Л.В. с соавт., 2002). Протективная роль НАДФИЦДГ против окислительных повреждений может быть связана с повышением уровня НАДФН, необходимого для регенерации глутатиона (Jo S.-H. et al., 2001, Lee S. M. et al., 2002).

В общей группе детей и подростков с ИЗСД повышается активность фермента ЦТК - НАД-зависимой малатдегидрогеназы (НАДМДГ), катализирующей реакцию дегидрирования малата с образованием оксалоацетата; последний, вступая в реакцию с ацетил-КоА, запускает новый оборот цикла. Известно, что оксалоацетат в низких концентрациях является мощным ингибитором сукцинатдегидрогеназы - фермента ЦТК, катализирующего реакцию восстановления янтарной кислоты. В условиях равновесия направление малатдегидрогеназной реакции сдвинуто в сторону реакции восстановления оксалоацетата, что позволяет избежать накопления оксалоацетата (Уайт Л. с соавт., 1981). Однако уровень активности НАДН-зависимой реакции МДГ (НАДНМДГ) в лимфоцитах больных ИЗСД понижен, что, вероятно, будет способствовать усилению подавления реакций ЦТК. НАДНМДГ также является ключевым ферментом малатаспартатного шунта (Пашинцева Л.П. с соавт., 2001). Возможно, активация НАДМДГ необходима дня осуществления трансгидрогеназной реакции, в ходе которой происходит перенос атомов водорода с НАДН на НАДФ+. Данная реакция является обратимой, однако протонный потенциал смещает равновесие в сторону восстановления НАДФ+ и резко ускоряет этот процесс (Болдырев A.A., 1989).

НАД-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДГДГ) катализирует реакцию окислительного дезаминирования глутамата с образованием а-

кетоглутарата, который далее может включаться в ЦТК. Снижение уровня активности фермента, вероятно, вносит дополнительный вклад в подавление реакций ЦТК.

Снижение активности НАДФН-зависимой реакции

глутаматдегидрогеназы (НАДФНГДГ), в ходе которой осуществляется восстановительное аминирование ск-кетоглутарата до глутамата, по-видимому, отражает понижение уровня образования субстратов (в частности, а-кетоглутарата) в ЦТК. Известно также, что снижение активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ может быть связано с окислением сульфгидрильных групп белковой части молекул ферментов образующимися активными формами кислорода и азота (Телушкин П.К., 1998).

Активность НАДН-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы (НАДНГДГ) и НАДФ-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) в общей группе больных ИЗСД находится в пределах контрольного диапазона. Положительная корреляционная связь ГП -НАДФГДГ (г = 0,64, Р < 0,05), обнаруженная в группе детей с ИЗСД, вероятно, свидетельствует о том, что реакция окисления глутаминовой кислоты может являться источником ко-фермента для восстановления окисленной формы глуташона, образующейся в ходе глутатионпероксидазной реакции.

Учитывая значительные изменения уровней активности НАДФ- и НАДФН-зависимых реакций дегидрогеназ в группе больных ИЗСД, определяли окислительно-восстановительный индекс (ОВИ), представляющий собой соотношение уровней активности (А) НАДФ- и НАДФН-зависимых реакций дегидрогеназ:

ОВИ = (АгбФдг + Анадфмдг + Анадфицдг + А надфгдг) / (Агр + Анадфнгдг)

Повышение значения ОВИ в общей группе больных ИЗСД (рис. 1) свидетельствует о значительном усилении генерации фонда НАДФН в лимфоцитах детей и подростков, больных ИЗСД.

При определении информативности уровней активности метаболических ферментов лимфоцитов в модели нейросетевого классификатора Здоровые - Больные наиболее значимыми оказались изменения уровней активности НАДФНГДГ, НАДНМДГ, НАДЛДГ, Г6ФДГ, НАДФИЦДГ.

Сравнительный анализ групп здоровых детей и больных ИЗСД, разделенных по половому признаку, не выявил существенных различий в состоянии метаболизма, системы глутатиона и процессов ПОЛ в лимфоцитах крови.

з - ....

Р< 0,001

Здоровы* ИЗСД

Рис. 1. ОВИ в лимфоцитах крови

Таблица 3

Содержание восстановленного глутаггиона, продуктов ПОЛ и активность

ферментов системы глутатиона в лимфоцитах крови детей и подростков с ИЗСД в зависимости от длительности заболевания

(Х±т)

Показатели Здоровые N=47 1 ИЗСД

до 1 года N=16 2 1-5 лег N=29 3 5 лети более N=12 4

Ген, мкмоль/106 кл. 26,83±1,2 29,49±3,21 29,52±2,28 29,52±3,89

ГП, мкмоль ГБИ/минх 106 кл. 12,46±0,89 13,83±2,7б 12,39±2,51 9,22±2,74

ГБТ, мкмоль Г8Н/минх106кл. 12,44±1,83 6,58±0,80 Р,<0,05 9,66±1,35 7,60±2,51

ГР.мкЕ 3,60±0,98 14,78±6,55 Р,<0,001 9,85±2,79 Р,<0,001 11,26±4,75 Р,<0,01

да ммоль/10бкл. 0,42±0,032 0,35±0,04 0,37±0,03 0,34±0,05

МДА, мкмоль/ 106кл. 12,29±0,73 11,41±1,30 10,66±0,85 12,26±1,50

Таблица 4

Активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ (мкЕ) в лимфоцитах крови детей с ИЗСД в зависимости от длительности заболевания

(Х±ю)

Показатели Здоровые N=47 1 ИЗСД

до 1 года N=10 2 1-5 лет N=15 3 5 лет и более N=17 4

Г6ФДГ 0,53±0,13 10,72±4,37 Р,<0,001 7,39±3,37 Р,<0,001 12,88±4,21 Р,<0,001

ГЗФДГ 0,18±0,04 0,13±0,12 0,67±0,39 0,93±0,50 0,1>Р2>0,05

НАДЛДГ 33,02±3,29 3,99±1,08 Р1<0,001 4,93±1,19 Р,<0,001 7,63±3,09 Р,<0,01

НАДМДГ 16,53^2,24 22,21 ±7,27 33,59±7,39 Р(<0,01 46,82±10,84 Р,<0,01 Р2<0,05

НАДГДГ 4,70±1,84 0,48±0,27 0,97±0,44 Р,<0,05 1,22±0,80

НАДИЦДГ 3,34±0,52 0,96±0,62 Р)<0,01 0,6810,42 Р!<0,001 4,03±1,99 Р2,з<0,05

НАДФМДГ 4,30±0,75 10,33±2,69 Р|<0,05 7,67±1,85 Р,<0,05 17,89±6,34 Р1<0,05

НАДФГДГ 0,98±0,20 0,56±0,31 0,87±0,32 0,24±0,22

НАДФИЦДГ 16,05±2,87 20,62±6,51 23,64±6,48 Р1<0,05 59,07±21,48 Р, 3<0,01 Р2<0,05

НАДНЛДГ 119,51,±16,63 44,22± 16,71 Р,<0,05 46,48±18,53 Р,<0,01 36,46±9,09 Р,<0,05

НАДНМДГ 126,75±16,40 60,18±20,58 Р,<0,05 80,38±25,05 56,61*15,47

НАДНГДГ 41,89±5,58 24,14±8,13 32,14±6,10 33,87±11,11

НАДФНГДГ 163,54±17,12 36,85±8,81 Р,<0,001 35Д5±5,96 Р,<0,001 29,92±6,42 Р!<0,001 |

ИЗСД сопровождается изменением уровней компонентов системы глутатиона, метаболических ферментов в различные периоды длительности заболевания (табл. 3,4).

Повышенный уровень активности Г6ФДГ, НАДФМДГ, снижение активное™ НАДН- и НАД-зависимой реакции ЛДГ, НАДФНГДГ наблюдается во всех группах больных ИЗСД с различной длительностью заболевания. Полученные данные свидетельствуют о повышении уровня реакций ПФП и подавлении реакций гликолиза, о необходимости интенсификации процессов, протекающих с вовлечением НАДФН, о сниженном участии интермедиатов ЦТК в реакциях аминокислотного обмена Ь на протяжении всего исследуемого срока заболевания.

При этом, вероятно, основным акцептором НАДФН, образующегося в реакции, катализируемой Г6ФДГ, является ГР, уровень которой также повышен на протяжении всего периода длительности ИЗСД.

Снижение уровня активности TST происходит лишь в группе больных ИЗСД менее года.

Повышение активности НАДФИЦДГ в группе с длительностью ИЗСД более 5 лет (как по сравнению с контрольной группой, так и с группой больных ИЗСД менее 5 лет), вероятно, свидетельствует о возрастании потребности в интенсификации процессов восстановительного синтеза у больных с длительностью ИЗСД более 5 лет.

Увеличение продолжительности ИЗСД сопровождается повышением уровня реакций ЦТК, на что указывает изменение активности ферментов цикла: повышение активности НАДИЦДГ до уровня контрольных значений в группе с длительностью ИЗСД более 5 лет, повышение уровня активности НАДМДГ в группе больных ИЗСД более года, достижение НАДНМДГ уровня контрольных значений при длительности ИЗСД более года.

Снижение активности НАДГДГ в группе больных ИЗСД от года до 5 лет, вероятно, выявляет подавление реакций ЦТК и аминокислотного обмена в данный период длительности заболевания.

В группе детей и подростков, больных ИЗСД, более 5 лет, повышается активность НАД-зависимой глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (НАДГЗФДГ) * по сравнению с группой больных ИЗСД менее года. Фермент катализирует

реакцию окисления глицерол-3-фосфата с образованием диоксиацетонфосфата, который далее может включаться в гликолиз. Активация ГЗФДГ, вероятно, выявляет компенсаторную роль фермента в повышении уровня реакций гликолиза в данный период течения заболевания, так как на уровне реакции, катализируемой НАДГЗФДГ, поток углерода быстро и эффективно переключается в направлении гликолиза (Великий H.H. с соавт., 1992)

В модели нейросетевого предиктора, определяющего длительность ИЗСД, наиболее информативными оказались уровни активности: ГЗФДГ, Г6ФДГ, НАДФГДГ, НАДНГДГ.

Установлено повышение значения ОВИ во всех группах больных ИЗСД с различной длительностью заболевания (рис. 2); повышение данного показателя в группе больных ИЗСД более 5 лет по сравнению с данными в группе с длительностью заболевания от года до 5 лет, вероятно, определяется изменением уровня активности НАДФ-зависимой ИЦДГ.

s 8

I в

1 » ?

1 -

п О

I—. А?.0..4®!.

Pj<MМ.

здоровые ИЗСД менее ИЗСД от ИЗСД более гада гада до я 5 лат лет

Рис. 2. Изменение ОВИ в лимфоцитах крови в зависимости от длительности ИЗСД

Примечание: Р] - достоверность различия с группой здоровых детей и подростков; Р4 - достоверность различия с группой больных ИЗСД более 5 лет.

Таким образом, в лимфоцитах детей и подростков, больных ИЗСД обнаружены изменения уровней FST, НАДФИЦЦГ, ферментов цикла Кребса, аминокислотного и липидного обмена, специфичные для определенных периодов длительности заболевания, что предполагает возможность использования указанных показателей в качестве дополнительных критериев, характеризующих течение ИЗСД.

Выявленные в результате проведения исследования изменения уровней метаболических ферментов, компонентов системы глутатиона, продуктов ПОЛ в возрастных группах больных ИЗСД в большей степени определяются длительностью заболевания, чем возрастом обследованных.

Выяснение состояния окислительно-восстановительных процессов при сахарном диабете в зависимости от степени компенсации углеводного обмена позволяет оценить эффективность проводимой терапии (Билич И.Л., Тригулова B.C., 1982).

Возрастание активности НАДФ-зависимых Г6ФДГ и МДГ, а также снижение активности НАДН- и НАД-зависимой реакции ЛДГ происходит в условиях субкомпенсации и декомпенсации (табл. 5).

Повышение активности НАДМДГ, возможно, способствующей участию восстановленной формы НАД1" в передаче протонов на НАДФ+, также происходит в условиях субкомпенсации и декомпенсации.

Уровень активности НАДФ-зависимой ИЦДГ возрастает лишь в стадию декомпенсации, что, по-видимому, выявляет необходимость интенсификации процессов восстановительного синтеза в условиях инсулиновой недостаточности.

Подавление реакций ЦТК, определяемое снижением активности ключевого фермента - НАДИЦДГ, происходит в условиях субкомпенсации и декомпенсации.

Снижение активности НАДГДГ в стадию декомпенсации усиливает снижение уровня реакций ЦТК недостаточностью субстратного наполнения и, возможно, является следствием подавления транспорта аминокислот в клетку, регулируемого инсулином (Кононяченко В.А., 1986, Лейкок Дж.Ф., Вайс П.Г., 2000).

В целом низкий уровень реакций ЦТК в условиях декомпенсации отражается и в подавлении активности НАДНМДГ, а также НАДФНГДГ, пониженный уровень активности которой наблюдается уже в стадию субкомпенсации, однако в условиях декомпенсации происходит дальнейшее снижение активности фермента, что, возможно, будет сказываться на подавлении реакций аминокислотного обмена, в частности синтеза глутаминовой кислоты, а соответственно и синтеза глутатиона de novo.

Снижение уровней активности дегидрогеназ в условиях субкомпенсации и декомпенсации может быть также связано с подавлением процессов анаболизма белков, стимулируемых инсулином (Fryburg D.A et al., 1995, Старкова Н.Т., 2002, Zhang X.-J. et al., 2002).

В модели нейросетевого предиктора, вычисляющего концентрацию гликозилированного гемоглобина в условиях субкомпенсации наиболее значимыми оказались изменения уровней активности Г6ФДГ, НАДНМДГ, НАДИДГ, в условиях декомпенсации - ГР, НАДФГДГ, НАДГДГ, Г6ФДГ. О различиях в направленности внутриклеточных метаболических процессов в фазы субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена свидетельствует также изменение фактической и вычисленной по уровню активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ концентрации гликозилированного гемоглобина в модели нейросетевого предиктора.

ОВИ возрастает как в условиях субкомпенсации, так и в условиях декомпенсации (рис. 3), что либо выявляет повышенную потребность в

генерации фонда НАДФН, либо является следствием значительного снижения активности НАДФН-зависимой реакции ГДГ.

Таблица 5

Активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ (мкЕ) в лимфоцитах крови детей с ИЗСД в зависимости от стадии компенсации заболевания (X ±

. _Ш_

Показатели Здоровые N=47 1 ИЗСД

субкомпенсация N=11 2 декомпенсация N=19 3

Г6ФДГ 0,53±0,13 5,07±1,57 Р,<0,001 9,29±2,70 Р,<0,001

ГЗФДГ 0,18±0,04 0,34±0,15 0,73±0,35

НАДЛДГ 33,02±3,29 3,90±0,88 Р,<0,001 5,31 ±1,07 Р,<0,001

НАДМДГ 16,53±2,24 32,80±8,37 Р,<0,01 30,60±5,88 Р,<0,01

НАДГДГ 4,70±1,84 0,68±0,30 0,70±0,34 Р1<0,01

НАДИЦЦГ 3,34±0,52 0,78±0,52 Р,<0,01 1,28±0,61 Р,<0,001

НАДФМДГ 4,30±0,75 9,17±2,58 Р,<0,05 10,54±2,59 Р,<0,05

НАДФГДГ 1,67*0,42 0,58*0,30 0,66±0,26

НАДФИЦЦГ 1б,05±2,87 19,82±5,81 31,12±6,59 Р1<0,01

НАДНЛДГ 119,51±16,63 36,77±14,72 Р,<0,01 49,31±14,66 Р,<0,01

НАДНМДГ 126,75±16,40 64,50±16,82 0,1>Р,>0,05 75,03±20,64 Р,<0,05

НАДНГДГ 41,89±5,58 34,14±7,35 29,84±5,82

НАДФНГДГ 163,54±17,12 46,19±8,66 Р,<0,001 28,85±3,97 Р, <0,001 Р2<0,05

Рис. 3. Изменение ОВИ в лимфоцитах крови больных ИЗСД в зависимости от

степени компенсации

Примечание: Р, - достоверность различия с группой здоровых детей и подростков.

В АОС наблюдаются лишь изменения в активности ГР (табл. 6), уровень которой повышается как в стадию субкомпенсации, так и в условиях декомпенсации.

Уровень процессов ПОЛ, показателем которого в данном случае является содержание ДК, у больных ИЗСД, находящихся в состоянии субкомпенсации, понижен; в условиях декомпенсации уровень первичных продуктов ПОЛ повышается до контрольного, что, вероятно, объясняется усилением процессов липолиза, вызванным дефицитом инсулина, в результате чего возрастает концентрация субстратов ПОЛ - СЖК (Кендыш И.Н., 1985, Остапова В.В., 1994). Изменения содержания МДА в условиях субкомпесации и декомпенсации не установлено (табл. 6).

При тестирование базы данных больных ИЗСД, находящихся в состоянии декомпенсации, через нейросеть, определяющую концентрацию гликоНЬ по уровням активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах детей, больных ИЗСД и находящихся в состоянии субкомпенсации, происходит снижение фактической и вычисленной по уровням активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ концентрации гликоНЬ.

При тестировании базы данных больных ИЗСД, находящихся в состоянии субкомпенсации, через нейросеть, определяющую концентрацию гликоНЬ по уровням активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах детей, больных ИЗСД и находящихся в состоянии декомпенсации, фактическая и вычисленная по уровням активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ концентрация гликоНЬ возрастает.

Полученные данные, вероятно, указывают на изменения, зависящие от степени компенсации и происходящие в системах, которые регулируют уровни активности исследованных дегидрогеназ.

Таблица 6

Содержание восстановленного глутатиона, продуктов ПОЛ и активность

ферментов системы глутатиона в лимфоцитах крови детей с ИЗСД в зависимости от стадии компенсации заболевания (X ± т)

Показатели Здоровые N=47 1 ИЗСД

субкомпенсация N=26 2 декомпенсация N=23 3

ген, мкмольЛ06кл. 26,83±1,20 29,64±2,97 29,95±1,87

ГП, мкмоль Г8Н/минх106кл. 12,46±0,89 10,35±1,68 15,52±2,86

ГБТ, мкмоль ГвН/минхЮ6 кл. 12,44±1,83 7,92±1,12 8,87±1,45

ГР, мкЕ 3,60±0,98 11,98±3,27 Р1<0,001 12,65±3,79 Р,<0,001

ДК, ммоль/106кл. 0,42*0,03 0,32±0,02 Р,<0,05 0,40±0,04 0,1>Р2>0,05

МДА, мкмоль/106кл. 12,29±0,73 10,75±0,81 11,92±1,03

Таким образом, фазы субкомпенсации и декомпенсации в лимфоцитах крови больных ИЗСД сопровождаются активацией ПФП, повышением уровня активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ, подавлением активности ферментов гликолиза, ЦТК, аминокислотного обмена, изменением содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК, возрастанием активности ГР.

Установленные изменения уровней активности ферментов гликолиза, ЦТК, ПФП, аминокислотного и липидного обмена, ферментов системы глутатиона, зависимость указанных изменений от степени компенсации и длительности заболевания, а также специфический характер взаимосвязей исследуемых показателей в лимфоцитах крови больных ИЗСД могут являться одними из факторов, определяющих проявление иммунного ответа при данной патологии.

ВЫВОДЫ

1. В патогенезе ИЗСД в лимфоцитах крови установлено изменение уровней компонентов системы глутатиона: снижение активности ГБТ, ГП, повышение активности ГР. Обнаружено снижение содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК.

2. Метаболизм лимфоцитов крови детей и подростков, больных ИЗСД, характеризуется активацией ПФП, повышением уровней активности ферментов, участвующих в генерации НАДФН, подавлением реакций гликолиза, ЦТК и аминокислотного обмена.

3. Состояние системы глутатиона в первый год длительности ИЗСД определяется снижением активности ГвТ. Повышение уровней активности ГР, Г6ФДГ на протяжении всего исследуемого срока длительности ИЗСД способствует сохранению концентрации ГвН в пределах контрольного диапазона.

4. Периоды длительности ИЗСД менее года и от года до 5 лет характеризуются подавлением уровня реакций ЦТК. При длительности ИЗСД более 5 лет активность ключевого фермента - НАДИЦДГ достигает уровня контрольных значений, повышается активность НАДФИЦЦГ, ГЗФДГ. Повышение активности НАДФМДГ, снижение уровня реакций гликолиза и аминокислотного обмена обнаруживается на протяжении всего исследуемого периода течения ИЗСД. При длительности заболевания от года до 5 лет подавление уровня реакций обмена аминокислот усиливается снижением активности НАДГДГ.

5. Снижение содержания ДК в условиях субкомпенсации, повышение уровня данного показателя до контрольного в условиях декомпенсации, соответствие концентрации МДА уровню контрольных значений как в условиях субкомпенсации, так и в фазу декомпенсации может являться следствием эффективности функционирования А ОС, состояние которой в условиях субкомпенсации и декомпенсации характеризуется сохранением концентрации ГБН в пределах контрольного диапазона, повышением уровней активности ГР и Г6ФДГ.

6. Метаболическая активность лимфоцитов в условиях субкомпенсации определяется снижением уровня реакций обмена аминокислот, в условиях декомпенсации - повышением активности НАДФИЦЦГ, усилением подавления реакций аминокислотного обмена. Снижение уровня реакций ЦТК, гликолиза, повышение активности НАДФМДГ характерно как для стадии субкомпенсации, так и для условий декомпенсации.

7. Выявленные специфические, характерные для группы больных ИЗСД и не наблюдающиеся в контрольной группе, корреляционные связи в

изменении уровней метаболических ферментов и компонентов системы глутатиона, указывают на основополагающую роль ГП в восстановлении перекисных соединений с вовлечением TSH, а также на возможность НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназной реакции поставлять НАДФН для реакции восстановления глутатиона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование содержания восстановленного глутатиона в лимфоцитах детей и подростков, больных инсулинзависимым сахарным диабетом// Сборник научных трудов 1-ой Всероссийской конференции «Актуальные проблемы эволюционной и популяционной физиологии человека». -Тюмень. - 2001. - С. 43-44. (В соавторстве с Титовой Н.М., Савченко A.A.)

2. Исследование антиоксидантной системы лимфоцитов детей и подростков, больных инсулинзависимым сахарным диабетом// Материалы Южно-Сибирской международной научной конференции студентов и молодых ученых. —Абакан. - 2001. - С. 134-135. (В соавторстве с Савченко A.A., Титовой Н.М.)

3. Исследование активности глутатионпероксидазы в лимфоцитах детей и подростков, больных инсулинзависимым сахарным диабетом// Тезисы докладов 2-ой научной конференции с международным участием «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии». - Новосибирск. - 2002. - С. 38. (В соавторстве с Савченко A.A., Титовой Н.М., Панфиловой В.Н., Петровой М.Н.)

4. Исследование содержания восстановленного глутатиона и активности глутатионпероксидазы в лимфоцитах детей и подростков, больных инсулинзависимым сахарным диабетом// Материалы итоговой научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири». - Красноярск. - 2002. - С. 40-42. (В соавторстве с Савченко A.A., Титовой Н.М.)

5. Антиоксидантный статус лимфоцитов детей и подростков, больных инсулинзависимым сахарным диабетом// «Актуальные проблемы медицины и биологии». - Томск. - 2003. - Вып. 2. - С. 19-20. (В соавторстве с Титовой Н.М., Савченко A.A.)

6. Исследование активности глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы в лимфоцитах при инсулинзависимом сахарном

диабете// «Актуальные вопросы здравоохранения и медицинской науки». - Красноярск. - 2003. - Вып. 3. - С. 47-51. (В соавторстве с Титовой Н.М., Савченко АЛ.)

7. Исследование активности глутатион-З-трансферазы в лимфоцитах при инсулинзависимом сахарном диабете// Сборник статей по материалам 4-го конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск. - 2003. - С. 148-149.

8. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в лимфоцитах при инсулинзависимом сахарном диабете// Материалы итоговой научной конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири». - Красноярск. -2003. - С. 179-180. (В соавторстве с Титовой Н.М., Савченко A.A.)

9. Метаболическая активность лимфоцитов при инсулинзависимом сахарном диабете// Сборник тезисов 3-ей конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. -2004. - С. 59-60.

10. Зависимость антиоксидантного статуса лимфоцитов больных инсулинзависимым сахарным диабетом от степени компенсации углеводного обмена// Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Красноярском крае: Метаболические механизмы иммунореактивности». - Красноярск. - 2004. - С. 125-127. (В соавторстве с Савченко A.A., Титовой Н.М.)

11. Зависимость метаболической активности лимфоцитов крови больных инсулинзависимым сахарным диабетом от степени компенсации углеводного обмена// Деп. ВИНИТИ. - 2005. - 22 с. (В соавторстве с Савченко A.A., Титовой Н.М.)

Подписано в печать 12.05 05 Тираж 100 экз Заказ 202 Бумага офсегнаа Отпечатано с готовых оригинал-макетов а ООО РПБ «Амальгама» г Красноярск., ул Лебедевой, 89 т.23-48-60

»10499

PH Б Русский фонд

2006-4 9494