Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Особенности состояния кроветворения у больных раком молочной железы разных возрастных групп

На правах рукописи

005015110

Мукова Лиана Алиевна

Особенности состояния кроветворения у больных раком молочной железы разных возрастных групп 14.01.30 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 МАР 1Ш

Москва - 2012

005015110

Работа выполнена в Филиале ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития РФ «Научно-клинический центр геронтологии»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Шишина Регина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

Топорова Светлана Геннадьевна

Филиал ГБОУ ВПО РНИМУ

им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ НКЦ геронтологии, ведущий научный сотрудник

доктор медицинских наук, профессор,

Голенков Анатолий Константинович

ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» им. Семашко М.А.

Защита соототся-?.-Р^ШУ/сУ 2012 г. в '/У/ ¿-О часов на заседании диссертационного совета Д.208.072.13 ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 129226, Москва, ул. Леонова, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития РФ по адресу: 129226, Москва, ул. 1-а Леонова, 16.

Автореферат разослан ^(-^/¿(¿¿¿-¿-у 2012 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Соколова Н.М.

Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Рак молочной железы (РМЖ) прочно удерживает первое место в структуре онкологической заболеваемости. Статистические данные последнего десятилетия свидетельствуют о неуклонном росте показателей заболеваемости и смертности в России (Чиссов В.И., 2000). Известно, что опухоль возникает вследствие нарушения процессов обмена веществ в клетках и ослабления контроля за внутриклеточными процессами со стороны организма (Моисеенко В.М., 2002, 2004). Любая онкопатология является мощным неспецифическим стрессом, при котором адаптационные механизмы организма претерпевают изменения и переходят на новый уровень функционирования (Баевский P.M., 2001). В большей степени в процесс адаптации вовлекается система крови, как одна из интегральных систем организма. В пожилом возрасте в силу уже имеющихся изменений функциональных и обменных процессов создаются условия для более выраженных дизадаптационных нарушений и изменений в системе гемопоэза, иммунной системе крови и.т.д. (Анисимов В.Н., 2003). Развитие опухолевого процесса сопровождается выраженными нарушениями практически всех звеньев иммунитета, а применяемые специальные методы лечения в онкологической практике приводят к угнетению кроветворения, развитию лейкоцито - и лимфоцитопении. Исходя из этого, оценка состояния кроветворения онкологического больного является необходимой для проведения целенаправленной и обоснованной сопроводительной терапии. Применение полихимиотерапии, при которой одной из самых атакуемых мишеней является костномозговое кроветворение, может также привести к развитию новых клеточных мутаций и клональных заболеваний (Schnitt S.J., 2001.Vincent Т., 2001). За последние 15 лет получены данные о том, что опухоли молочной железы развиваются на основе выраженных нарушений иммунной системы, возникающих уже при предопухолевых

заболеваниях и усугубляются применяемым комплексным лечебным воздействием (Закенфельд Г.К., 2002, Барышников А.Ю., 2003). Однако, нет объективной картины морфологических признаков деградации как лимфоцитов - основных иммунокомпетентных клеток, так и других клеток гемопопоэза, обеспечивающих защитные функции организма. Тем не менее, накапливаются данные о том, что важная информация может быть получена в результате анализа кроветворения у больных с онкопатологией. Отсюда, мы сочли актуальным провести более углубленное изучение кроветворения при РМЖ, выявить возрастные морфологические и функциональные особенности клеток периферической крови и костного мозга с использованием современных методов количественной цитологии, дополнив имеющиеся знания о раке молочной железы, и привнести новые подходы к диагностике и лечению. Результаты данного исследования важны в теоретическом и практическом плане, поскольку они могут стать дополнительным инструментом для оптимизации лечения, своевременного предупреждения тяжёлых побочных осложнений противоопухолевой терапии, определения факторов риска их развития и оценки индивидуального прогноза течения заболевания. В литературе имеется значительное количество работ, посвященных изучению морфофункциональных характеристик клеток гемопоэза при онкогематологических заболеваниях (острые и хронические гемобластозы), но практически нет сведений по изучению морфологических и цитохимических показателей клеток кроветворения при раке молочной железы. Всё сказанное определило цель и задачи исследования.

Цель исследования: определить возрастные особенности кроветворения у больных раком молочной железы до и после комплексного лечения, и установить факторы риска, ассоциирующиеся с неблагоприятным прогнозом заболевания, на основе комплексного изучения морфофункциональных показателей клеток периферической крови и костного мозга.

Задачи исследования:

1. Изучить возрастные особенности морфологических и цитохимических параметров клеток периферической крови и костного мозга у больных раком молочной железы в период развёрнутых клинических проявлений, до лечения.

2. Исследовать морфометрические характеристики лимфоцитов при раке молочной железы у больных различных возрастных групп до лечения.

3. Провести сравнительный анализ морфологических и цитохимических характеристик клеток периферической крови и костного мозга у больных раком молочной железы до и после комплексного лечения с учётом возраста.

4. Определить факторы, ассоциирующиеся с неблагоприятным исходом рака молочной железы и риском развития гематологических осложнений после комплексного лечения на основе выявленных морфологических и цитохимических нарушений в клетках периферической крови и костного мозга.

Научная новизна работы

Определены возрастные особенности морфологических и цитохимических параметров клеток периферической крови и костного мозга у больных раком молочной железы до и после комплексного лечения, включавшего хирургическое, лучевую и полихимиотерапию.

Установлена функциональная недостаточность кроветворения, сопровождающаяся морфологическими дефектами в основных клеточных линиях периферической крови и костного мозга как до, так и после комплексного лечения, наиболее выраженная в старшей группе больных, что свидетельствовало о наличии неэффективного эритропоэза, количественной и качественной неполноценности гранулоцито - и лимфоцитопоэза. Определены количественные изменения активности миелопероксидазы, кислой и щелочной фосфатазы, неспецифической эстеразы, отражающие

снижение фагоцитарной и бактерицидной функций нейтрофилов и активности клеточного обмена иммунокомпетентных клеток - лимфоцитов. С помощью компьютерной морфоцитометрии выявлена гетерогенность циркулирующих лимфоцитов, и разработана лимфоцитограмма периферической крови для больных раком молочной железы с учётом возраста. Выделены модальные классы лимфоцитов, позволяющие дополнительно оценивать тяжесть течения заболевания. Курсы полихимиотерапии, независимо от возраста, значительно ухудшали морфологические и цитохимические показатели клеток периферической крови и костного мозга, указывая на повышенный риск побочных гематологических осложнений, обусловленных токсичностью противоопухолевой терапии, и вероятность развития новых клеточных мутаций и клональных заболеваний.

Научно-практическая значимость работы

Разработаны дополнительные диагностические тесты, оценивающие нарушения кроветворения при раке молочной железы и позволяющие корректировать и осуществлять сопроводительную терапию, тем самым повышая вероятность благоприятного исхода заболевания. Определены факторы, ассоциирующиеся с неблагоприятным исходом заболевания и риском развития гематологических осложнений: высокие значения морфологических дефектов, содержания полисахаридов в клетках периферической крови и костного мозга и площади клеточных ядер лимфоцитов с низкой активностью гидролаз, снижение активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах (<90%, СЦК<1,60).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Состояние кроветворения у больных раком молочной железы

характеризуется функциональной и количественной недостаточностью

клеток периферической крови и костного мозга, как в период развёрнутых

6

клинических проявлений болезни, до лечения, так и после комплексного лечения, включавшего хирургическое, лучевую и полихимиотерапию, наиболее выраженные у больных пожилого возраста.

Установлены индивидуальные и общие закономерности нарушений гемопоэза, выражающиеся в увеличении морфологически дефектных клеток в трёх основных клеточных линиях, наличии неэффективного эритропоэза и количественной и качественной неполноценности гранулоцито - и лимфоцитопоэза.

2. Изучены морфометрические параметры лимфоцитов при раке молочной железы и выделены модальные классы лимфоцитов для лиц зрелого и пожилого возраста. Наиболее информативным морфометрическим параметром является площадь ядра клетки, которая может быть использована в качестве дополнительного теста определения тяжести и исхода заболевания.

3. Анализ выявленных морфологических и цитохимических нарушений в клетках периферической крови и костного мозга позволяет: оценить состояние кроветворения у больных раком молочной железы; определить факторы, ассоциирующиеся с неблагоприятным течением и исходом заболевания; использовать мониторинг изучения морфологического и функционального состояния клеток кроветворения как до, так и в период применения цитостатической терапии для обоснованной терапии в целях профилактики и лечения осложнений, обусловленных токсичностью противоопухолевых препаратов.

Практическое внедрение полученных результатов

Полученные результаты внедрены в практику ГУЗ «Онкологический диспансер» г. Нальчика, КБР.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены на научной конференции «Состояние онкологической помощи в ЮФО по итогам 2008г.» - Нальчик 2008г. и Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученных.- Нальчик 2011 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из которых 4 опубликованы в рекомендованных ВАК журналах.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 34 таблицами и 5 рисунками. Библиографический указатель включает 188 источника, 95 отечественных и 93 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты, материал и методы исследования

Положения и выводы работы базируются на результатах клинических и

лабораторных исследований 71 больного раком молочной железы. Объектом

морфологического и цитологического исследования в работе явились клетки

периферической крови и костного мозга больных раком молочной железы

разных возрастных групп в период развернутых клинических проявлений

болезни, до лечения и после проведения комплексной программы лечения,

включавшей сочетание хирургического, лучевого и химиотерапию. Работа

выполнена на базе лаборатории возрастной гематологии ГОУ ВПО РГМУ

филиала «НКЦ» геронтологии Росздрава и ГУЗ «Онкологический диспансер»

г. Нальчик, КБР за период 2007-2010 годы. Формулировка диагнозов

8

соответствовала Международной статистической классификации болезней, травм и причин смерти X пересмотра (МКБ-10, 1992 г.). Возрастная градация обследованных пациентов проводилась с учётом классификации, принятой на Международном симпозиуме по проблемам геронтологии ВОЗ (Москва, 1965). Среди наших больных были только лица женского пола в возрасте от 45 до 74 лет (средний возраст составил 56,1 лет). В зависимости от возраста больные были распределены на 2 группы. Первую группу составили 54 пациента в возрасте от 45 до 59 лет (средний возраст 54, 6). Во вторую группу вошли 17 больных в возрасте 60-74 лет (средний возраст 64,4). При морфологических исследованиях клеток гемопоэза контрольную группу составили 30 практически здоровых человека в возрасте 25-55 лет. Общая продолжительность заболевания до обращения к врачу-онкологу колебалась от 6 месяцев до 3 лет. Осмотр пациентов проводили в соответствии со стандартной схемой обследования онкологических больных (сбор жалоб, анамнез заболевания и жизни; объективный осмотр). Всем больным при поступлении в стационар проведен: общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, коагулограмма, флюорографическое исследование органов грудной клетки, ЭКГ, ультразвуковое исследование органов, маммография. Диагноз ставился на основании цитологического исследования материала после пункционной или эксцизионной биопсии опухоли, при негативном ответе - по данным УЗИ и маммографии. 56 больным проведено комплексное лечение: операция - мастэктомия с предварительным проведением предоперационного курса телегамматерапии (ТГТ) на молочную железу и пути регионарного метастазирования на аппарате АГАТ-С. Наряду с оперативным вмешательством и лучевой терапией, применялись курсы адъювантной полихимиотерапия по программе РАС: 5-фторурацил -500мг/м2 внутривенно в 1-ый и 8-й дни; адриамицин -50мг/м2 внутривенно в 1-ый день и циклофосфан - 500мг/м2 внутривенно в 1-ый день. Суммарно проведено 4 и более курсов в зависимости от стадии и состояния больного, соматических заболеваний и имеющихся осложнений.

9

10 больным проводилась только лучевая и химиотерапия, и 5 пациентов от лечения отказались. Исследование кроветворения осуществлялось до комплексной терапии и после лечения (4-х курсов химиотерапии). В своей работе мы использовали клинико-анатомическую классификацию рака молочной железы, в которой выделяется четыре стадии распространенности опухоли. В зависимости от стадии развития опухоли, согласно данной классификации, наши больные распределились следующим образом: IIa стадия болезни имела место всего лишь у 2-х пациентов (2,8%); IIb - у 10 больных (14,1%); Illa - у 22 (31%); Illb стадия - у 23 больных (32,4%); IV -терминальная стадия заболевания имела место у 14 пациентов (19,7 %). В группе пожилого возраста наибольшее число пациентов имело Illa и Illb стадию болезни (11 чел.-15,5 %) и IV стадию (6 чел.-8,5 %) (таблица 1). Что касается сопутствующих патологических процессов, результаты нашего исследования показали, что чаще сопутствующая нозологическая форма патологии встречалась в системе кровообращения.

При оценке состояния кроветворения при РМЖ исследования были сосредоточены на выявлении морфоцитохимических особенностей клеток периферической крови и костного мозга. Проводился количественный подсчёт гемограмм и миелограмм пунктатов костного мозга, изучение морфологических и цитохимических характеристик клеток гемопоэза. Морфологические исследования включали подсчет дефектных клеток (МДК) в эритроидной, гранулоцитарной и лимфоидной линиях периферической крови и костного мозга. В этих же клеточных линиях исследовались цитохимические реакции в целях оценки изменений обменных процессов в клетках. В эритроидных клетках костного мозга определялись количество клеток, содержащих в цитоплазме негемоглобиновое железо и полисахариды.

Таблица 1

Распределение больных раком молочной железы по группам в зависимости от возраста и стадии болезни

Возраст больных (лет) Стадии рака молочной железы

Группа II а II в III а III в IV

45-59 2 (2,8 %) 10 (14,1 %) 20 (28,2 %) 14 (19,7%) 8 (11,2%)

60-74 0 (0%) 0 (0%) 2 (2,8 %) 9 (12,7 %) 6 (8,5 %)

Всего, % 2 2,8 % 10 14,1 % 22 31% 23 32,4 % 14 19,7 %

В нейтрофильных гранулоцитах периферической крови и костного мозга

оценивались активность миелопероксидазы (МП) и щелочной фосфатазы

(ЩФ), а также содержание липидов (ЛП). В цитоплазме лимфоцитов

периферической крови и костного мозга изучались концентрация

полисахаридов (ПС) и активность кислой фосфатазы (КФ) и

неспецифической эстеразы (альфа-нафтил-ацетат эстеразы) (НЭ).

Подсчёт морфологически дефектных клеток периферической крови

производился в мазках из лейкоконцентрата, полученного из венозной крови.

Изучались изменения формы и величины ядра и цитоплазмы, наличие

дегенеративных изменений в них. Для этой цели были разработаны

специальные карты. Оценка результатов цитохимических исследований

проводилась при световой микроскопии мазков периферической крови.

Учитывался процент положительных клеток и вычислялся средний

цитохимический коэффициент (СЦК) на основании подсчета 100 клеточных

элементов каждой из выделяемых категорий клеток по формуле Кеплоу в

модификации Астальди и Верга, по которой СЦК = 1а+2б+3в:100, где

цифры обозначают интенсивность окраски, а буквы - число подсчитанных

11

клеток: а - число подсчитанных клеток с I степенью интенсивности, б - со II степенью интенсивности, в - с III степенью интенсивности. Автоматизированная морфометрия лимфоцитов выполнена с помощью компьютерной системы анализа изображений по специальным программам изучения лимфоцитов на отечественном приборе для автоматического анализа клеток периферической крови АСПЕК. Анализ введенных изображений лимфоцитов осуществлялся путем сегментирования контуров клетки и ядра в полуавтоматическом режиме. В каждом наблюдении измерялось по 100-112 клеток. Набор регистрируемых параметров для лимфоцитов включал: Scell (PI) - площадь клетки (кв.мкм), Pcell (Р2) -периметр клетки (мкм), FF1(P3) - фактор формы клетки 1 (усл. ед), FF2 (Р4) -фактор формы клетки 2 (усл. ед), Scyt (Р5) - площадь цитоплазмы (кв.мкм), ECN (Р6) - цитоплазмо-ядерное отношение (усл. ед), Snuk (Р7) - площадь ядра (кв.мкм); Pnuk (Р8) - периметр ядра (мкм), FF1 (Р9) - фактор формы ядра 1 (усл. ед), FF2 (Р10) - фактор формы ядра 2 (усл. ед). Площадь цитоплазмы Scyt (Р5) и цитоплазмо-ядерное отношение (ECN) являлись производными показателями и вычислялись по алгоритмам, зашитым в компьютерную программу. Все параметры выбраны исходя из представленной фирмой стандартно-измерительной программой. Учет числа вариант в четырех классах гистограмм распределения лимфоцитов по каждому геометрическому параметру производился с помощью теста Genchi-Mori (Bartels, 1979). При вычислении решающего правила (правила классификации) определялись достоверность различий многомерных распределений, коэффициент дискриминации для каждого из выбранных параметров и пороговое значение дискриминантной функции. Статистическая обработка всех цифровых показателей производилась с использованием программы Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corp., USA) с учетом t-критерия Стьюдента. Для всех критериев и тестов критический уровень значимости принимался равным 5%. т.е. нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05.

Основные результаты исследования и их обсуждение

В результате проведённых исследований системы кроветворения у больных раком молочной железы в период развёрнутых клинических проявлений заболевания, до лечения обнаружено наличие анемии лёгкой и средней степени тяжести в 35,2% случаев у больных I -ой возрастной группы и в 41,2 % случаев - во И-ой. Количество лейкоцитов и тромбоцитов в обеих возрастных группах находилось в пределах референтных значений. Однако, в лейкограмме, независимо от возраста, процентное и абсолютное содержание палочкоядерных нейтрофильных гранулоцитов оказалось повышенным в 1-ой группе у 61,1% и во 2-ой - у 58,8% больных в сравнении с физиологической нормой. Напротив, средние показатели, как процентного, так и абсолютного числа лимфоцитов были сниженными, практически у всех больных. Между группами достоверной разницы в показателях гемограмм не имелось. При сравнении данных миелограмм в обеих группах достоверная разница выявлена лишь в количественном содержании миелокариоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, что, скорей всего, обусловлено возрастными особенностями кроветворения. Нами впервые было установлено наличие увеличенного пула морфологически дефектных клеток в 3-х исследованных клеточных линиях (эритроидной, гранулоцитарной, лимфоидной), как в периферической крови, так и в костном мозге, независимо от возраста, наиболее выраженные у пожилых лиц. До лечения частота морфологических дефектов в клетках у них в 2 и более раза превышали нормальные пределы (Таблица 2). Состояние эритроидной системы гемопоэза оценивалось по объему эффективного и неэффективного эритропоэза. Одним из способов определения неэффективного эритропоэза является подсчет эритрокариоцитов, содержащих в цитоплазме повышенное количество полисахаридов, выявляемых с помощью цитохимической ШИК - реакции. При повышении их числа можно говорить о раннем разрушении и судить о величине неэффективного эритропоэза. По нашим данным у больных РМЖ 1-ой группы до лечения

количество эритроидных предшественников, содержащих в цитоплазме полисахариды, в 2 раза, а больных 2-ой группы почти в 3 раза превышало показатели здоровых людей. Это свидетельствовало о неполноценности эритроидных клеток и частичной их гибели в костном мозге. Содержание сидеробластов в костном мозге в обеих группах практически соответствовало нормальным колебаниям (таблица 3).

Таблица 2

Количество морфологически дефектных клеток в периферической крови

у больных раком молочной железы до и после лечения

Срок обследования Показатели Количество дефектных клеток, %

Эритроциты,% Гранулоциты,% Лимфоциты, %

До лечения, 1-ая группа п=40 М+т 2,8 ±0,3 2,4 ±0,5 3,2+0,3

а 1,5 1,3 0,7

М±а 1,3 -4,3 1,1-3,7 2,5-3,9

После лечения, 1-ая группа п=37 М+т 8±1,5 5,4±1,2 3,3±0,6

о 4 2,3 1,8

М+а 4-12 3.1-7,7 1,5-5,1

К1-2) 2,1 2,15 0,69

Р(1-2) <0,05 <0,05 >0,05

До лечения, 2-ая группа п=15 М+т 10,4±3,8 4,8+1,5 5,5+1,5

а 8,4 1 2,2

М+ст 2-18,8 3,8-5,8 6,3 -7,7

После лечения 2-ая группа, п=12 М±т 16,1±4,8 13,7±3 5,1±1,8

а 8,0 2,3 3

М±а 8,1-24,1 11,4-16 3,3-8,1

1(3-4) 2,5 4,5 1,05

р(3-4) р<0,05 р<0,05 р>0,05

Сравнительные данные между группами после лечения 1(2-4) 4 7,5 1,09

р(2-4) р<0,05 р<0,05 р<0,05

Сравнительные данные со здоровыми людьми

К2-5) 3,5 2,13 0,5

Р (2-5) р<0,05 р<0,05 р>0,05

1(4-5) 6,4 12 1,2

р(4-5) р<0,05 р<0,05 р>0,05

Таблица 3

Цитохимические показатели клеток эритропоэза у больных

раком молочной железы до и после лечения

Группы Показатели Костный мозг

Полисахариды Негемоглобиновое железо

% клеток СЦК % клеток СЦК

Больные, п=45 1-ая группа, до лечения М+т 10+1,5 0,18+0,01 20,7±5 0,47+0,08

о 4 0,1 16 0,18

М±ст 6-14 0,08-0,28 4,7-36,7 0,29-0,65

Больные, п=40 1-ая группа, после лечения М+т 16,1+1,5 0,22 ±0,03 22,7±2,4 0,42±0,06

а 9 0,12 13,1 0,33

М±а 7,1-25,1 0,1 -0,34 9,6-35,8 0,09-0,75

1(1-2) 2,83 2 1.12 1,39

Р(1-2) <0.05 <0,05 >0,05 >0,05

Больные, п=15 2-ая группа, до лечения М±т 12+3 0,22+0,09 24±3 0,54±0,16

о 5 0,19 16 0,5

М±а 7-17 0,03-0,41 8-40 0,04-1,04

Больные, п=11 2-ая группа, после лечения М+т 26±3 0.32±0.09 25,3±6 0,64+0,16

с 19 0.29 15 0,52

М+ст 7-45 0,03-0,61 10,3-40,3 0,12-1,16

КЗ-4) 6.83 3.00 1.12 1.39

Р (3-4) <0,05 <0,05 >0,05 >0,05

Здоровые люди, п=30 М+т 5.1+0.6 0.05±0.006 23.7±2.4 0.42±0.06

о 2.7 0.03 13.1 0.33

М±а 2.4-7.8 0.02-0.08 10.6-36.8 0.09-0.75

Анализ цитохимических показателей нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и периферической крови до лечения выявил следующие изменения: у 72,7% пациентов РМЖ в костном мозге и у 56,9% - в периферической крови СЦК содержания липидов в цитоплазме этих клеток был ниже нормальных пределов. Это указывало на изменение обмена в нейтрофильных гранулоцигах и, очевидно, на нарушение мембранного комплекса, что играет отрицательную роль в обеспечении прочности мембраны клетки и тем самым способствует укорочению их жизни. У большинства больных РМЖ в гранулоцитах костного мозга (88%) и периферической крови (89,5%) активность миелопероксидазы (МП) варьировала в

пределах возрастной нормы, что свидетельствовало в пользу относительной сохранности одной из важнейших бактерицидных систем цитоплазмы этих клеток. Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) цитоплазмы клеток, напротив, в большинстве случаев, как в костном мозге (72,7%), так и в циркуляции (74,2%) оказалась выше, чем у здоровых людей. Поскольку фермент является общепризнанным индикатором наличия в организме воспалительного процесса, необходимо подчеркнуть, что в момент его исследования активных воспалительных проявлений у больных не было (Таблица 4). Нами были обнаружены неоднозначные сдвиги в активности цитохимических реакций лимфоцитов на кислую фосфатазу и неспецифическую эстеразу - ключевых гидролитических ферментов, отражающих разный уровень активности обменных процессов в иммунокомпетентных клетках. Активность кислой фосфатазы (КФ) в лимфоидных клетках до лечения, как в процентном выражении, так и по интенсивности реакции (СЦК) была снижена во 2-ой группе в 2 раза по сравнению с активностью этого фермента в лимфоцитах больных 1-ой группы. До лечения независимо от возраста содержание ШИК - положительных клеток более чем в 3 раза превышало нормальные пределы, что свидетельствовало об имеющихся изменениях в обменных процессах лимфоидных клеток (Рис. 1).

Таблица 4.

Цвтохимпческве показатели клеток грат;л ощто поэза у б ольных раком молочаой железы до о после лечения

Срок жйшаш. ння Показа телн Не раферпческая кровь Костный мозг

Щелочная фосфатаза Миелопероксщаза Л и гни ы Щелочная фосфатаза Мяелопероксидаза Лппнли

% СЦК % СЦК % СЦК % СЦК Уз СЦК СЦК

Больные 1-ая гр. до лече-5дя,п=45 М±т 50±10 0,50±0,3 96±11 1Д1+0Д6 94±6 2,06+0,26 23±3 0Д6±0,05 83±7 1,62±0Д6 100 2,240,25

о 34 0,65 37 0,91 21 0,92 9 0,17 25 0,92 0 0,83

Д1+о 16-84 0-1Д5 34-100 0,30-2,12 73-100 1,14-2,98 14-32 0,09-0,43 58-100 0,69-2,53 0 1,39-3,00

0 38,8

Больные 1-ая гр. после лечения, и-40 М±ш 75±5 1,35±0ДЗ 96±1 1,99±0,11 Ю0±0 2,35±0Д 73±6 1,43±0,17 96±1 2,0±0Д4 100±0 2,4»±0Д2

М+ст 47-100 0,6-2,1 90-100 1,34-2,64 100 1,77-2,94 33-100 0,53-1,0 89-100 1,25-2,75 100 1,84-3,0

0 26Д

1 2,33 1,72 2.27 2,79 1 1,43 7,45 6,50 1,85 1,34 0 0,81

Р. <0.05 >0.1 <0.02 <0.01 >0.2 >0.2 <0.001 <0.001 >0.05 >0.1 >0.5 >0.2

Больные 2-ая гр. ло лечения, ^1=15 М±и 53±14 0,68 ±0,3 90+7 1,98 ±0,4 100±0 2,06±0Д6 37+3 0,36±0д 94±6 1,85 ±0,5 99±1 2,53 ±0Д

а 41 0,6 14 0,9 0 0,92 9 0,17 10 0,8 3 0,4

Больные 2-ая гр. после лечешш, 0=11 М±й 50±12 0,5±0,1 7б±1 1,19±0Д1 100±с 2,35±0Д 23±3 0Д6±0,05 76±1 1Д1±0Д4 100±0 2,49±0Д2

1(3-4) 1,33 1,72 2Д7 2,79 1 1,48 1,45 1,50 2,85 3,34 0 0,81

Е(3-4) >0.05 >0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0.05 <0,05 >0.05 >0,05

шл 2,33 1,72 221 1,79 1 1,48 5,45 6,50 1,85 2,34 0 0,81

1(2-4) <0.05 >0.1 <0.005 >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 <0.05 >0.05 <0.05 >0.05 >0.05

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ШИК-реакция КФ НЭ

Рис. 1 Цитохимические показатели лимфоцитов периферической крови у больных РМЖ до лечения

Примечания: больные 1-ой группы (1, 5, 9) больные 2-ой группы (2,6, 10) здоровые люди (3,7, 11)

Таким образом, цитохимические показатели лимфоцитов практически у всех больных независимо от возраста до лечения оказались измененными, что свидетельствовало о нарушении обменных процессов в клетках и соответственно их функциональной недостаточности. Наряду с подсчетом МДК и изучением цитохимических параметров лимфоцитов периферической крови до лечения у больных РМЖ различных возрастных групп, были проведены морфоцитометрические исследования этих клеток с использованием компьютерных программ и автоматического отечественного анализатора АСПЕК. После проведения корреляционного анализа, оценивающего степень взаимосвязи между признаками, оказались наиболее информативными такие показатели как площадь клетки (ЭсеП) в квадратных микронах (кв. мкм), площадь ядра (Бпик) в квадратных микронах (кв. мкм), цитоплазмо-ядерное соотношение (ЕСМ) в условных единицах, которое вычислялось по алгоритму: ЕСК = БсеП - Эпик/ Бпик, и в дальнейшем анализировались только эти показатели. Так, общая площадь клетки по средним величинам оказалась почти в 1,5 раза меньше нормы, площадь ядра -

18

почти в 2 раза. Что касается цитоплазменно-ядерного соотношения, то оно в 2 раза превышало нормальные величины (Таблица 5).

Таблица 5

Данные морфометрии лимфоцитов в норме и у больных РМЖ до лечения

Показатели Контроль (N=23 2300 клеток) Больные (N=29, 2665 клеток) 1 Р

М 52.57 35,3

5се11 т а разброс 1.56 22.42 22.34-177.16 0.31 16,07 10.06-117.33 10,28 <0.05

М 0.28 0,54

ЕОЧ т а разброс 0.015 0.21 0.015-2.0 0.01 0,2 0.02-3.17 26 <0.05

М 40.22 23,27

Бпик т а разброс 0.84 12.05 18.5-72.09 0.2 10,42 4.78-76.54 19,48 <0.05

При распределении лимфоцитов у больных РМЖ использовалась классификация, предложенная Новодержкиной Ю.К. (1994), в основе которой заложены следующие характеристики клетки: размер, плотность ядра и ядерно-цитоплазматическое соотношение. В основу распределения лимфоцитов при РМЖ с учётом возраста положены геометрические характеристики клетки: площадь клетки (8се11, кв.мкм), периметр клетки (Рсе11, мкм), площадь цитоплазмы (Бсу!, кв.мкм), цитоплазмо-ядерное отношение (ЕСИ, усл. ед), площадь ядра (Бпик, кв.мкм) и периметр ядра (Рпик, мкм). Основная масса лимфоцитов при РМЖ независимо от возраста относилась к малым клеткам, что подтверждено статистическим анализом распределения на плоскости главных компонент полученных результатов. Отбор параметров в информативную для распределения лимфоцитов

различных классов комбинацию проводился с учётом меры информативности. Наиболее информативной оказалась площадь ядра (мера информативности 0,85). Визуальный анализ частоты вариант в четырех классах гистограмм распределения лимфоцитов у больных РМЖ, показал, что и у больных 1-ой и 2-ой групп преобладают лимфоциты I и II класса гистограммы распределения. (Таблица 6).

Таблица 6

Количество вариантов в четырех классах гистограмм распределений лимфоцитов у больных РМЖ до лечения.

Параметр

1 -ая группа 2-ая группа

I II III IV I II III IV

Р1 БсеИ 549 305 83 12 749 244 33 2

Р2 Рсе11 445 429 73 2 645 355 28 1

Р5 Эсу! 765 148 31 5 921 104 3 1

РбЕСК 864 84 1 0 972 49 7 1

Р7 Бпио 546 332 71 1 734 255 35 4

Р8 Рпис 337 416 184 12 381 538 99 10

Анализ распределения выборки лимфоцитов у больных раком молочной железы разных возрастных групп позволил выделить модальные классы лимфоцитов и определить средние значения их морфометрических характеристик. Модальные классы у больных отличались по площади ядра, пороговое значение дискриминантной функции (Т-эсоге) находилось на отметке — 18,0 кв. мкм. Как видно из Рис. 2 и 3, в модальный класс лимфоцитов больных 1-ой группы попали клетки с площадью ядра от 8,0 до

18,76 кв. мкм, а модальный класс лимфоцитов у 2-ой - составили клетки с площадью ядра от 17,0 до 28,0 кв. мкм. Средняя площадь ядра у больных 1-ой группы составляла 13,29 кв. мкм, у 2-ой -20,85 кв. мкм.

П л о щ ад ь яд рх (к в -м км )

Рис. 2 Распределение клеток модального класса больных РМЖ 1-ой группы по площади ядра до лечения

Проведенный ретроспективный анализ показал, что площадь ядра клетки можно рассматривать как фактор, ассоциирующийся с течением и исходом заболевания. Доказательством послужил тот факт, что все пациенты РМЖ, имевшие лимфоциты с площадью ядра 27 и более кв. мкм умерли, независимо от возраста. Компьютерные морфометрические исследования лимфоцитов позволили объектевизировать количественные признаки лимфоидных клеток, показать, что размеры ядра клетки занимают в информативной комбинации признаков ведущее место. Нами были получены данные, подтверждающие возрастные отличия лимфоцитов у больных раком молочной железы. В период развернутых клинических проявлений

лимфоциты, независимо от возраста, в основном, представлены мелкими клетками (в 93% случаев).

Свои исследования мы закончили изучением влияния проведённой комплексной терапии на морфологические и цитохимические характеристики клеток кроветворения с учётом возраста.

Рис. 3 Распределение клеток модального класса у больных РМЖ 2-ой группы по площади ядра до лечения

Оказалось, что после полихимиотерапии имелись общие закономерности со стороны показателей кроветворения, выражающиеся в увеличении морфологически дефектных клеток в трёх основных клеточных линиях, сохранении высокого уровня неэффективного эритропоэза, а также о количественной и качественной неполноценности гранулоцито - и

60

Площадь ядра (кв.мкм}

лимфоцитопоэза, что подтверждалось нарушением обменных процессов в клетках периферической крови и костного мозга (Таблицы 2, 3 и 4). Изменение активности таких ферментов как миелопероксидаза, кислая и щелочная фосфатаза, неспецифическая эстераза отражали снижение фагоцитарной и бактерицидной функций нейтрофилов и активности клеточного обмена иммунокомпетентных клеток - лимфоцитов. Количественные изменения содержания полисахаридов указывали на неиспользование клеткой, в полной мере, энергетического материала. Подобные состояния гемопоэза обусловлены как непосредственным воздействием опухоли, так и токсичностью противоопухолевой терапии. Они указывают на возможность развития тяжёлых миелодепрессивных и иммунодепрессивных синдромов и могут явиться плацдармом для возникновения новых клеточных мутаций и развития клональных заболеваний. Эти данные оказались существенными, так как в процессе лечения противоопухолевыми средствами наиболее глубокое угнетение гемопоэза наблюдалось у больных с предшествовавшими до-лечения выраженными морфоцитохимическими изменениями в "клетках кроветворения. Следовательно, в таких случаях в программу лечения необходимо включать гематозащитные средства как до, так и в периоде проведения цитостатической терапии.

Анализ полученных данных позволил выявить особенности и определить факторы риска, ассоциирующиеся с неблагоприятным течением и исхода заболевания. К ним были отнесены: возраст 60 и более лет; анемия 80 г/л и более; лимфоцитопения; увеличение морфологически дефектных клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда; снижение активности миелоперо-ксидазы в гранулоцитах периферической крови и костного мозга до 90% и СЦК- 1,60; стойкое повышение ШИК - положительных эритрокариоцитов и лимфоцитов - до 16% и более, СЦК - более 0,16; площадь ядра лимфоцитов 27 кв. мкм. и более.

Выявленные закономерности в кроветворении, полагаем, можно отнести и к

23

другим формам злокачественных опухолей.

Таким образом, на основании полученных данных определены возрастные особенности морфофункциональных характеристик клеток периферической крови и костного мозга при раке молочной железы до и после комплексного лечения. Выявленные морфологические и цитохимические критерии могут быть использованы в качестве дополнительных дифференциально-диагностических тестов для осуществления обоснованного подбора лекарственных средств сопроводительной терапии, направленной на предотвращение и профилактику осложнений противоопухолевой терапии и своевременное выявление тяжёлых гематологических осложнений, в том числе развитие клональных заболеваний, а также в мониторинге оценки проводимого лечения. Выводы:

1. У больных раком молочной железы установлены морфологические нарушения в 3-х клеточных линиях гемопоэза (эритроидной, гранулоцитарной, лимфоидной) в виде увеличения пула дефектных клеток в два и более раза превышающие физиологическую норму как до, так и после лечения. Этот факт указывает на наличие дизгемопоэза, раннюю гибель клеток и ассоциируется с неблагоприятным исходом заболевания.

2. Выявлены изменения цитохимических характеристик клеток периферической крови и костного мозга у больных старшей возрастной группы:

- снижение активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах более чем в два раза свидетельствует о нарушении фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов;

- снижение активности кислой фосфатазы в лимфоцитах в два раза в сравнении с физиологической нормой указывает на истощение лизосомального фермента и функциональную неполноценность этих клеток.

Высокие значения содержания полисахаридов в эритрокариоцитах как до, так и после лечения, независимо от возраста, отражают степень неэффективного эритропоэза.

3. С помощью компьютерной морфоцитометрии лимфоцитов периферической крови разработана лимфоцитограмма с учётом возраста пациентов и выделены модальные классы клеток в качестве дополнительного теста оценки тяжести течения заболевания.

4. Показано, что проведение комплексной терапии у больных раком молочной железы значительно ухудшает количественные и качественные показатели гемопоэза, что может стать плацдармом для развития тяжёлых гематологических осложнений, в том числе новых клеточных мутаций и клональных заболеваний.

5. Определена прогностическая значимость выявленных нарушений со стороны клеток периферической крови и костного мозга при раке молочной железы. К факторам, ассоциирующимся с неблагоприятным течением заболевания отнесены: анемия (уровень Нв 80 г/л и менее), лимфоцитопения (менее 16%), высокие значения частоты морфологических дефектов, содержания гликогена в клетках, увеличение площади ядра лимфоцита (27 кв.мкм и более), снижение активности миелопероксидазы в гранулоцитах (90% и менее, СЦК - 1,60 и ниже) и кислой фофатазы в лимфоцитах (50% и менее, СЦК- 0,50 и ниже).

6. Рекомендовано дополнительное наблюдение онкологических больных гематологом в ближайшие и отдалённые сроки после лечения с мониторингом изучения морфологического и функционального состояния клеток гемопоэза для обоснованного подбора средств сопроводительной терапии в целях осуществления лечения и профилактики побочных осложнений.

Практические рекомендации

Предложен комплекс морфологических и цитохимических исследований клеток периферической крови и костного мозга для мониторинга изменений в

25

состоянии кроветворения у больных РМЖ при проведении комплексного лечения. Полученная информация позволит обеспечить своевременное выявление групп риска развития гематологических осложнений, осуществить наиболее оптимальный выбор лечебной тактики и оценить эффективность проводимого лечения.

Разработана методология оценки распределения лимфоцитов (в мазках из лейкоконцентрата периферической крови) по морфоцитометрическим параметрам и выделены модальные классы лимфоцитов в качестве дополнительного теста определения тяжести течения заболевания. Комплексная оценка результатов морфофункционального состояния клеток гемопоэза может быть включена в программу обследования онкологических больных.

Список опубликованных работ

1. Мукова Л.А. Морфологические признаки дизгемопоэза у больных раком молочной железы.//Тезисы доклада научной конференции «Состояние онкологической помощи в ЮФО по итогам 2008 года»,- 2008.- Нальчик,- С. 79-81.

2. Мукова Л.А. Морфоцитохимическая характеристика клеток гемопоэза при апластической анемии./Шишина Р.Н., Потапова С.Г., Мукова Л.А., Пронин В.Ю.//Журнал. Гематология и трансфузиология,- 2008,- том 53.- № 2,-С.21-25.

3. Мукова Л.А. Компьютерная морфометрия эритроцитов периферической крови в мониторинге терапии В-12 дефицитной анемии./ Мукова Л.А. Шишина Р.Н., Потапова С.Г.// Материалы докладов IV Всероссийской научно - практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых»,- Москва,- 2008. - С. 157.

4. Мукова Л.А. Морфометрическая характеристика лимфоцитов при

апластической анемии./ Шишина Р.Н., Потапова С.Г., Мукова Л.А. //Журнал.

Гематология и трансфузиология. - 2009. - №2. - С.19-22.

26

5. Мукова Л.А. Морфологическая характеристика эритроцитов периферической крови у лиц пожилого, старческого возраста и долгожителей./ Шишина Р.Н., Мукова JI.A., Пронин В.Ю.//Журнал. Клиническая лабораторная диагностика. -2010.- №1,- С.38-42.

6. Мукова Л.А. Анемия при злокачественных заболеваниях./ Мукова Л.А., Шукаева Л.П., Шишина Р.Н. // Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных,- Нальчик,- 2011.-т. 2. С.309-311.

7. Мукова Л.А. Особенности состояния кроветворения у больных раком молочной железы разных возрастных групп./ Мукова Л.А., Шишина Р.Н., Муков М.Б. // Известия КБГУ,- Нальчик. -2012..- т. 1,- №1. - С.49-57.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КФ - кислая фосфатаза ЛП -липиды

МДК - морфологически-дефектные клетки

МП - миелопероксидаза

НГЖ - негемоглобиновое железо

НЭ - а-нафтил-ацетат-эстераза (неспецифическая эстераза) РМЖ - рак молочной железы ПР - прогестерона рецептор СБЛ - сидеробласты

СЦК - средний цитохимический коэффициент ПС - полисахариды ТТГ - телегамматерапия ЩФ - щелочная фосфатаза ЭР - эстрогена рецептор

Подписано в печать 15.02.2012г Заказ № 255 Тираж 100 шт. Отпечатано в типографии «АллА-принт» Г. Москва, Лубянский пр-д., д.21, стр.5 Тел.: 8 (495) 621-70-09 www.allaprint.ru