Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Особенности метаболизма кальция и его регуляция на различных этапах адаптации в условиях микрогравитации и при их наземном моделировании

на правах рукописи

РГ6 од

3 о СЕН юоо

Бобровник Евгений Владимирович

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА КАЛЬЦИЯ И ЕГО РЕГУЛЯЦИИ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ АДАПТАЦИИ В УСЛОВИЯХ МИКРОГРАВИТАЦИИ И ПРИ ИХ НАЗЕМНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ

14.00.32 - Авиационная, космическая и морская медицина

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1999

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации Институте медико-биологических проблем

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Б.В. Моруков

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор

А.И.Воложин

Кандидат медицинских наук Л. Б. Буравкоаа

Ведущее учреждение: Государственный научно-исследовательский испытательный Институт военной медицины МО РФ.

на заседании диссертационного совета К 074.31.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Государственном научном центре РФ - Институте медико-биологических проблем (123007, Москва, Хорошевское шоссе, дом 76-А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем

Автореферат разослан "_" _1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита диссертации состоится "

1999 г. в час.

кандидат биологических наук

И.Г1. Пономарева

Актуальность темы:

Изменения обмена кальция в организме человека под действием факторов невесомости находится под пристальным вниманием исследователей с самого начала эры пилотируемых космических полетов. Результаты, полученные при обследовании космонавтов и добровольцев в наземных модельных экспериментах, свидетельствуют о развитии отрицательного баланса кальция в организме человека, ведущего к снижению минеральной насыщенности костной ткани /Какурин Л.И,, Бирюков E.H., 1966; Vogel J., 1971; Whedon et al., 1973; Григорьев А.И., Дорохова Б.Р., 1990; Григорьев А.И., Воложин А.И., 1994 и др./.

В настоящее время накоплен обширный экспериментальный материал в области исследования обмена кальция и его регуляции в условиях, моделирующих физиологические эффекты невесомости. Однако выраженные индивидуальные различия, особенности космических полетов (КП) и используемых средств профилактики, небольшое число исследований, выполненных непосредственно в ходе космического полета, не позволяют сделать однозначных выводов о динамике и механизмах обнаруженных изменений. Поэтому проблема неблагоприятного влияния невесомости на минеральный обмен и состояние костной ткани является актуальной, и можно утверждать, что эти изменения остаются одним из факторов, лимитирующих продолжительность космических экспедиций.

Целью исследований являлось изучение особенностей обмена кальция и его регуляции на различных этапах адаптации в условиях микрогравитации и при их наземном моделировании.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработка и экспериментальная апробация метода исследования кинетики кальция с помощью стабильных изотопов;

- исследования кинетики кальции в условиях длительного космического полета продолжительностью 115 суток и длительной антиоргостатической гипокинезии (120 суток);

- изучение обмена кальция и оценка гуморальных механизмов его регуляции при воздействии микрогравитации и ее наземном моделировании;

- изучение особенностей регуляции обмена кальция кальцийсвязьшающими системами крови в остром периоде адаптации к условиям суточной ангиортостатической гипокинезии;

- апробация новых экспериментальных схем применения бисфосфонатов как средств, воздействующих на ремодеотрование костной ткани, в модельных исследованиях на животных (вывешивание).

Научная новизна:

Впервые для комплексной оценки метаболизма кальция в условиях космического полета была применена методика комбинированного введения стабильных изотопов кальция (^Са перорально и Са внутривенно), которая позволяет оценить изменение процессов всасывания и выведения кальция, а также дает исходные данные для расчета баланса кальция в костной ткани. В эксперименте со 120-суточной гипокинезией для этих целей был использован изотоп 44Са, применение которого в будущем значительно упрощает выполнение методики в условиях космического полета. Впервые прямым методом в исследованиях с участием человека показано значение снижения абсорбции кальция в кишечнике для формирования его отрицательного баланса.

Методическая новизна исследования гуморальной регуляции кальция заключается в комплексном определении содержания остеокальцина и паратиреоидного гормона (по срединному и С-терминальиому фрагменту) в сыворотке крови, что позволяет оценить метаболизм данного полипептида органами и тканями организма.

В модельных экспериментах на крысах апробирована эффективность введения лодроната по новым схемам, включая их превентивное и циклическое введение.

Практическая значимость:

1. Разработанная и апробированная в эксперименте со 120-суточной гипокинезией методика исследования кинетики кальция с пероральным введением '"Са в виде метки в настоящее время проводится в условиях реального космического полета.

2. Несмотря на наличие тенденции к восстановлению основных биохимических показателей метаболизма кальция, его отрицательный баланс в костной ткани сохраняется в послеполетном периоде. В связи с этим целесообразно

контролировать основные параметры гомеостаза кальция в качестве показателей эффективности реабилитационных мероприятий.

3. Показана эффективность применения препаратов группы бисфосфонатов для предотвращения иммобилизацяонного остеопороза у крыс в условиях, моделирующих физиологические эффекты невесомости. При этом предпочтительной является схема с превентивным и циклическим введением препарата.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях микрогравитации и длительной антиортостатической гипокинезии развитие отрицательного баланса кальция определяется в большей степени снижением абсорбции кальция в желудочно-кишечном тракте, в то же время увеличение экскреции кальция с мочой отображает мобилизацию кальция в костной ткани.

2. В периоде острой адаптации к антиоргостатическому воздействию изменение гомеостаза катьцим обусловлено перераспределением фракций, связывающих этот ион в крови, компенсация данных сдвигов осуществляется за счет увеличения экскреции кальция почками.

3. Отклонения уровня паратгормона в крови в ответ на изменение гравитационного воздействия не всегда отражают его секрецию, они могут быть обусловлены специфическим метаболизмом ГТГГ. Изменения концентрации остеокальцина в крови после завершения длительных космических полетов связаны со стимуляцией остеогенеза в послеполетном периоде.

4. Использование лодроната у крыс при циклическом и превентивном введении в условиях вывешивания эффективно для профилактики сдвигов метаболизма кальция, иммобшшзационного остеопороза, снижения прочностных свойств костной ткани.

Апробация работы и публикации:

Диссертация апробирована на заседании научной конференции отдела 05 ГНЦ-РФ ИМБП 14 августа 1998 г. Материалы работ доложены и обсуждены на Международном конгрессе по физиологическим наукам в С.-Петербурге в 1997 г., Международном симпозиуме по гравитационной физиологии в Риме в 1998 г., на Международной

конференции студентов и аспирантов "Ломоносов-98" в Москве. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа изложена на 101 странице машинописного текста и содержит 12 рисунков, 17 таблиц, библиографический указатель включает 266 источников литературы, из них 149 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

■ Материалы и методы исследований.

С целью изучения влияния космического полета на состояние обмена кальция проведено обследование 10 космонавтов, совершивших полет на орбитальной станции (ОС) "Мир" продолжительностью от 129 до 197 суток. Взятие венозной крови и суточный сбор мочи проводили в фоновом периоде, а также на 1 -е и 7-е сутки после завершения космического полета.

Развитие методических подходов и совершенствование технологии биохимических исследований и математической обработки результатов позволило в последние годы разработать метод, позволяющий исследовать в динамике основные звенья метаболизма кальция /Neer R., Berman R., 1967; Wastney M.E., 1996; Hurvvithz S., Fishraan S., 1987; Siva Subramanian K.N., 1995/. Метод основан на введении в организм стабильных изотопов кальция, при этом возможны варианты пероратьного и комбинированного (перорально и внутривенно) введения. Он позволяет количественно оценить основные потоки кальция в процессе его обмена (такие, как абсорбция кальция в кишечнике, его эндогенная экскреция в пищеварительной системе) то динамике изменений концентраций стабильных изотопов в биологических жидкостях и экскретах. 'Полученные результаты позволяют произвести расчет потоков кальция "костная ткань» внеклеточная жидкость" и таким образом определить баланс кальция для костной ткани.

Исследование кинетики кальция, его гормональной регуляции и маркеров костного обмена проводилось у членов экипажа, совершившего 115-суточный космический полет. Циклограмма исследований включала трехкратный фон в течение предполетного периода,

исследование во время КП (115-е сутки полета), а также после полета на ОС "Мир" и космическом корабле многоразового непользования "Шаттл" (день приземления, 9-е и 70-90-е сутки реабилитационного периода). Исследования кинетики кальция проводились с помощью двух стабильных изотопов кальция, один из которых вводился перорально (43Са), а другой внутривенно (46Са). Полученные результаты анализировались с использованием программного обеспечения SAAM (Simulation, Analysis and Modeling) и специальной технологии моделирования. Абсорбция, экскреция и баланс кальция для костной системы были рассчитаны по математической модели. /Neer R., Berman R., 1967/.

В эксперименте со 120-сугочной антиортостатической гипокинезией (АНОГ) без применения средств профилактики с участием 6 здоровых мужчин-добровольцев также было проведено исследование кинетики каньция, однако методика была модифицирована с целью существенного упрощения. Использовали стабильный изотоп 44Сав виде раствора хлорида кальция, который вводился перорально. Исследования выполняли во время метаболических сессий продолжительностью 7 дней в фоновом периоде (за 40 суток до начала эксперимента), на 60-е н 100-е сутки эксперимента. В фоновом периоде, на 100-е сутки эксперимента, а также на 30-е сутки периода восстановления выполнялась проба с нагрузкой лакгатом кальция.

Исследование калыдайсвязывающей способности сывороточных белков проводилось в эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией (-6°) с участием 7 мужчин-добровольцев. Ультрафильтруемую фракцию получали путем фильтрации плазмы крови через купролактановый фильтр СР-50 с размерами пор 50° (Amicon, США). До и после воздействия в плазме крови и ультрафильтрате определяли концентрацию общего и ионизированного кальция, показатели кислотно-основного состояния, содержания белковых фракций. Для исключения влияния различных концентраций белка на результаты измерения значения Ca«* пересчитывали на 1 литр воды плазмы. /Мс Lean F.С., Hasting A.B., 1935/.

Апробация новых экспериментальных схем применения бисфосфонатов как средств, воздействующих на ремоделирование костной ткани, проводилась в модельных исследованиях на животных (вывешивание). Применение дихлорметиленбисфосфоновой кислоты (Лодронат, фирма Берингер Мангейм, ФРГ) было исследовано в эксперименте на 110 белых крысах в дозе 5 мг/кг веса. Были использованы различные схемы введения препарата: постоянная и циклическая с превентивным введением (лодронат 1и лодронат 3), а также постоянная и циклическая без превентивного введения (лодронат 2 и лодронат

4) (табл.1). Исследования проводились в течение 10 суток фонового периода и 40 суток периода антиортостатической гипокинезии (вывешивания). Каждая схема введения апробировалась на 2-х экспериментальных группах, одна из которых находилась в условиях обычного содержания в виварии, а другая - в условиях вывешивания по методу Ильина Е.А, и Новикова В.Е. /1980/. Материалом дая исследований служили сыворотка и плазма крови, бедренные и болыпеберцовая кости, костный мозг, ткань селезенки.

Таблица 1. Схема проведения эксперимента с вывешиванием крыс с введением лодронага.

Примечание:

__

-физиологический раствор -лодронат

Исследования масс-метрических параметров, физико-химических и механических характеристик, а также изучение содержания в костной ткани кальция и фосфора выполнялось в бедренных костях животных.

Исследование механических свойств губчатой костной ткани проводили на образцах, изготовленных из головок бедренных костей с помощью машин "TIRA TEST".

Работа выполнялась в рамках программы "МИР-ПАСА", "Наука-НАСА" и Гранта РФФИ № 96-15-98121.

Объем, структура и основные условия исследований представлены в таблице 2. Таблица 2. Объем и структура исследований

NN Условия экспериментов Продолжительность (сутки) Кол-во обследуемых

1. Исследования кинетики кальция в условиях микрогравитации (космический полет) 115 3

2. Исследование обмена кальция, его регуляция и кальцийуретической функции почек у космонавтов до и после длительных космических полетов на орбитальной станции "Мир" 129-197 10

3. 3.1. 3.2. Модельные эксперименты с участием человека: Антиортостатическая гипокинезия (-5") без применения профилактических средств Антиортостатическая гипокинезия (-6°) без применения средств профилактики 120 1 6 7

4. Модельные эксперименты на животных (крысы): вывешивание с введением лодроната 40 110

Аналитические методы исследования.

В проведенных исследованиях в образцах крови, слюны, мочи и фекалий определялось:

-содержание общего кальция и магния методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (IL-951);

-содержание натрия и калия методом пламенной фотометрии (IL-743, IL-943).

Содержание ионизированного кальция в сыворотке крови исследовали на анализаторе NOVA-7.

Общий белок в плазме крови определяли биуретовым методом, альбумин -электрофорезом на ацетат-целлюлозной пленке.

Активность паратареоидного гормона (ГПТ), кальцитонина и остеокалыдана в крови анализировали с использованием коммерческих радиоиммунных наборов CIS bio international (Франция).

В биологических образцах содержание изотопов кальция определялось методом высокотемпературной ионизационной масс-спекгрометрии (TIMS). Исследование содержания изотопов 43Са, 44Са и 46Са в крови, слюне, моче и фекалиях проводили одновременно для каждого обследуемого.

s

При проведении исследований кинетики кальция в космическом полете и в наземных экспериментах содержание общего кальция и магния определяли методом атомяо-абсорбционной спекгрофотометрии (Thermo Jarrel Ash (TJA) Corp. Smith-Hieftji 4000 атомно-абсорбционньш спектрофотометр).

Кроме того, во время космических полетов электролитный состав крови определялся на портативном анализаторе крови (АПК).

. В экспериментах на животных в сыворотке крови исследовали концентрацию неорганического фосфата, активность щелочной и кислой фосфатазы, а также активность креатинкиназы с помощью коммерческих тест-наборов и реактивов фирмы "Берингер" на автоматическом анализаторе "Технякон РА-ЮО".

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования обмена кальция и его регуляции у космонавтов при длительном пребывании в условиях невесомости.

Исследования кинетики обмена кальция и его гормональной регуляции у членов экипажа, совершивших 115-суточный полет на ОС "Мир". Уровень общего кальция не изменялся во время полета, при этом ионизированный кальций в крови повышался во время и сразу после полета.

Интактный паратгормон практически не изменялся во время полета и повышался в раннем послеполетном периоде. Концентрация другого минералотропного гормона, кальцитонина, имела различную по направленности динамику у членов экипажа: уменьшение концентрации параллельно увеличению продолжительности полета у Космонавта-1 (К1) и Космонавта-3 (К-3) и увеличение ее в те же сроки обследования у Космонавта-2 (К-2), В периоде послеполетного обследования практически только у К-3 данный показатель нормализовался к 9-м суткам периода восстановления (ПВ). Закономерным выглядит изменение концентрации остеокальцина, полипептида, являющегося маркером образования костной ткани "de novo". Во время полета его сниженный уровень в крови отмечался у К-1 и К-3 как на 14, так и на 110 сутки. У К-2 его концентрация повысилась с 20 до 41%к 110 суткам.

Следует отметить, что у обследуемых снижалось потребление кальция в полете /Smith S.M., Oganov V.S., Morukov B.V., 1997/. Известно, что некоторое количество

эндогенного кальция экскретируется в желудочно-кишечный тракт с желчными кислотами и пищеварительными соками. При этом выводится не только абсорбирующийся кальций, но и циркулирующий в крови /Романенко В.Д., 1969/. Результаты исследования стабильных изотопов в фекалиях свидетельствуют, что экскреция кальция была неизменной во время полета и после его завершения.

Тем не менее, выведение кальция (%) с фекалиями, с учетом его эндогенной экскреции, снижалось в результате более выраженного уменьшения потребления кальция по сравнению с уменьшением абсорбции. Анализ полученных результатов показал, что абсорбция кальция снижалась на 40% во время полета и сразу после посадки, возвращение этого показателя к предполетному уровню было отмечено только через 2-3 месяца после завершения полета.

Выведение кальция с мочой у всех участников экспедиции на 110-е сутки полета возрастало. Экскреция качьция с мочой повышалась на 33 % на 110-е сутки полета, но довольно быстро снижалась до предполетного уровня после полета.

Баланс кальция для костной системы (рис.1) в полете, определенный методом математического моделирования и рассчитанный как разность между поступлением кальция в костную ткань и его выходом из кости в результате резорбции, был отрицательным и составлял около 250 мг кальция в день /Кеег К.М., Вегтап Ь., 1967/. .

200

100

а

а •

9

О

I

1

Я &

ш

А

8

в

-зоо

-400

Октябрь Январь Февраль-110-е сутки День 9-е "7Э-90-е сутки Предполетный период полета посадки период восстановления

Рис.1. Баланс кальция в костной ткани у членов экипажа в 115-сугочном космическом

полете, рассчитанный по результатам исследования кинетики кальция. Примечание: 9 -- К-1; А- К-2; И--К-3

Скорость поступления кальция в костную ткань уменьшалась в полете на 16% и сохранялась на низком по отношению к предполетным величинам уровне до 9-го дня после полета. Тенденция к возвращению данного показателя до нормальных значений наблюдалась через 2-3 месяца после приземления.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ведущими механизмами развития отрицательного баланса кальция в условиях микрогравитации является снижение абсорбции кальция в желудочно-кишечном тракте и увеличение его мобилизации из кости вследствие увеличения резорбции, при этом образование костной ткани во время космического полета уменьшается.

В послеполетном периоде наблюдается стимуляция остеогенеза под воздействием увеличения опорно-функциональной нагрузки на костную ткань. Однако в раннем послеполетном периоде сохраняется отрицательный баланс кальция, так как наряду с повышением активности образования кости "de novo" остается увеличенной и ее резорбция /Smith S.M., Oganov V S., 1997/, причем в этом случае, в отличие от условий микрогравитации, большее значение, вероятно, может играть повышение секреции паратгормона и увеличение его специфической эффективности, судя по изменению соотношения С-терминального и mm-фрагмента ГТГГ.

Исследования обмена кальция и его регуляции при длительных космических

полетах на ОС "Мир"

При обследовании космонавтов, принимавших участие в длительных космических полетах, наблюдалось увеличение содержания в сыворотке крови концентрации общего кальция, в основном за счет его ионизированной фракции, что подтверждает ранее полученные данные /Газенко О.Г., Григорьев А.Й., 1986; Моруков Б.В., Ларина И.М., 1998/. Изменения ионограммы крови были достоверными на 1-е сутки после приземления. На 7-е сутки периода реабилитации только в отдельных случаях сохранялось увеличение содержания в крови общего и ионизированного кальция.

Наиболее демонстративно представление результатов изменений электролитного состава крови в %% по отношению к предполетному уровню, которое подтверждает результаты, полученные при обработке в абсолютных цифрах. Увеличение содержания ионизированного кальция на 1-е сутки после посадки составляет 15,31 ±1,49%, прирост концентрации общего кальция был более умеренным - 4,34±1,31%.

Результаты исследования выведения электролитов почками анализировались с учетом изменения скорости экскреции в течение суток, что позволяет нивелировать влияние величины суточного диуреза /Наточин Ю.В., 1974/. На фоне снижения диуреза и уменьшения суточного выведения кальция почками отмечается существенное увеличение концентрации данного элемента в моче на 1-е сутки завершения космического полета. К третьим суткам периода восстановления суточное выведение кальция почками имеет тенденцию к восстановлению по отношению к предполетному уровню, при этом на фоне восстановления величины суточного диуреза происходит уменьшение концентрации кальция в моче.

Полученные данные несколько отличаются от опубликованных ранее результатов, свидетельствующих о том, что в раннем послеполетном периоде происходит повышение выведения кальция почками. Тем не менее, увеличение концентрации кальция в моче также отмечалось в предшествующих исследованиях/Григорьев А.И. 1982/.

Результаты исследования содержания калъцийрегулирующих гормонов в пробах крови у космонавтов до и после полетов экспедиций также несколько отличались от данных, полученных ранее /Пожарская Л.Г., Носков В.Б., 1990; Grigoriev A.I., Morukov B.V., 1994/. Содержание паратиреоидного гормона (срединного фрагмента), оставаясь неизменным в 40% случаев, незначительно возрастало у 50% обследованных, снижаясь у одного из них. При этом не отмечено зависимости степени изменений параметра от продолжительности полета. В ранее проведенных исследованиях также не отмечалось зависимости изменения уровня ГГГГ от продолжительности полета, однако выявлялась взаимосвязь пред- и послеполетной концентрации гормона, которая исчезала после полетов продолжительностью более 30 суток /Григорьев А.Й., 1996/.

В предшествующих исследованиях использовался метод определения ПТГ по его С-терминальному фрагменту /Пожарская Л.Г., Носков В.Б., 1990; Пожарская Л.Г., Моруков Б.В., 1985/, который отражает содержание как интактного гормона, так и его неактивных метаболитов. В настоящих исследованиях содержание паратиреоидного гормона определялось как по его С-терминальному, так и по срединному (ММ) фрагменту, характеризующему уровень секреции Ш1 /RoosB.A., 1981/.

По-видимому, отличие ранее полученных результатов может объясняться не только методическими особенностями, то и усилением неспецифического метаболизма ПТГ в почках и печени. В этом случае можно предположить уменьшение его специфических эффектов в тканях-мишенях. Анализ обоих фрагментов при исследовании

одних и тех же образцов крови даст ценную информацию о соотношении активности процессов секреции и тканевого метаболизма. Примечательно, что, несмотря на достоверное увеличение концентрации ионизированного кальция в крови на 1-сутки ПВ, отношение срединного фрагмента молекулы ПТГ к штатному гормону имеет тенденцию к росту с последующим снижением ка 6% по сравнению с предполетным уровнем (рис.2).

%% 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Рис. 2. Отношение концентрации ММ-ПТГ к С-терминальному фрагменту в дополетном периоде и периоде восстановления после продолжительных космических полетов.

Непосредственно в ходе КП было выполнено исследование уровня ПТГ в крови двух операторов. По сравнению с индивидуальным предполетным уровнем у одного из обследуемых на 76-е сутки космического полета выявлено резкое подавление скорости секреции ПТГ, у другого, напротив, активизация данного процесса.

Концентрация кальцитонина после полета в большинстве случаев была снижена или не изменена по сравнению с исходной. Отсутствие значимых изменений уровня кальцитонина может отражать и положительный эффект применения системы профилактических мероприятий, включая потребление рациона питания, сбалансированного по кальцию и фосфору /Rice B.L., Lane H.W., 1995/.

Содержание остеокальшша в послеполетном периоде возрастало практически у всех обследуемых, что могло быть связано со стимуляцией образования костной ткани "de novo" после возвращения космонавтов в условия земной гравитации и с возрастанием опорно-функциональной нагрузки на костно-мышечную систему. Более того, за исключением одного обследуемого, выявлялась однонаправленная послеполетная

динамика данного показателя, а именно дальнейшее увеличение концентрации остеокальцина в течение первой недели периода восстановления после КП (рис.3).

Рис.3. Изменение концентрации остеокальцина в периоде восстановления (ПВ) после продолжительных космических полетов'(в %% по отношению к фону).

Таким образом, исследования обмена кальция и его регуляции у космонавтов, принимавших участие в длительных космических полетах продолжительностью от 129 до 197 суток, в основном соответствовали полученным ранее результатам: Пребывание в условиях микрогравитации, несмотря на применение средств профилактики /Григорьев А.И., Степанцов В.И., 1986/, приводило к характерным изменениям гомеостаза кальция, которые заключались в повышении активности ионизированного кальция в крови, после полетов наблюдалось увеличение концентрации кальция в моче на фоне уменьшения диуреза Выявленные сдвиги имели тенденцию к нормализации уже в раннем послеполетном периоде. Вместе с тем, анализ результатов исследований обмена кальция, полученных при использовании более совершенной методологии в 115-суточном космическом полете, указывает на то, что реадаптация обмена кальция и . систем его регуляции к наземным условиям имеет более сложную и значительно более протяженную во времени динамику.

При исследовании изменений показателей минералотропных гормонов в крови можно отметить полиморфизм отклонений в активности данной системы, несмотря на наличие однотипного сдвига гомеостаза кальция. Отличия от результатов ранее проведенных исследований обусловлены, по-видимому, применением в настоящей работе новой методологии исследований, позволяющей в комплексе оценить секрецию и

неспецифический метаболизм паратиреоидного гормона, что принципиально важно при интерпретации результатов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в условиях микрогравитации мобилизация кальция из костной ткани, вероятно, в меньшей степени обусловлена состоянием дистантных механизмов, чем тканевых, локальных систем регуляции кальция.

Исследование обмена кальция и его регуляции в модельных экспериментах

с участием человека.

Исследование кинетики кальция в эксперименте со 120-суточнои гипокинезией.

Результаты проведенных ранее исследований свидетельствуют о том, что снижение опорно-функциональной нагрузки на костно-мышечную систему приводит к развитию отрицательного баланса кальция /Григорьев А.И., Дорохова Б.Р., 1990/, при этом изменяется содержание гормонов, осуществляющих дистантную регуляцию гомеостаза кальция /Григорьев А. И., Моруков Б. В., 1981; Моруков Б.В., Пожарская Л.Г., 1989/ Понимание генеза изменений обмена кальция в условиях микрогравитации является необходимой предпосылкой для обоснования целенаправленных средств профилактики и коррекции этих изменений.

Результирующим параметром, отражающим взаимодействие всех систем, регулирующих гомеостаз кальция, является его содержание в крови, причем наибольшее значение имеет уровень физиологически активного ионизированного кальция. В ходе эксперимента со 120-суточной антиортостатической гипокинезией так же, как и в ранее проведенных исследованиях /Григорьев А. И., Моруков Б. В., 1981; Моруков Б.В., Дорохова Б.Р., 1980/, отмечалось достоверное увеличение активности ионизированного кальция, концентрация общего кальция существенно возрастала к 60-м суткам эксперимента и оставалась повышенной до конца периода постельного режима.

Уровень ионизированного кальция возрастал в значительно большей степени, в связи с чем можно сделать заключение об изменении под действием факторов АНОГ соотношения кальция, связанного с белками крови, с ионизированным кальцием (СаТ/Са++). Причем наиболее значительно это соотношение увеличилось за счет роста Са*4 в остром периоде. Уменьшение соотношения общего и ионизированного кальция указывает на снижение способности, прежде всего, плазменных белков связывать

дополнительный (вышедший из кости) ион кальция, который вслед за этим может быть выведен почками.

Проведенный анализ содержания изотопа в биологических пробах показал, что отрицательный баланс, кальция формировался у всех 6-ти испытуемых, причем у 5-ти из них за счет снижения абсорбции катания в кишечнике. Прирост выведения изотопа с фекалиями, рассчитанный на 60-е сутки эксперимента, составил 39±8,15%. Данный показатель существенно снизился к 100-м суткам (25,2±14,4%), но, тем не менее, значительно превышал фоновый уровень. Следует отметить, что у одного из исследуемых отрицательный баланс кальция был обусловлен усилением выведения данного элемента почками. Прирост суточной экскреции составил 23,9 и 53,1% на 60-е и 100-е сутки соответственно. Отсутствие значимых изменений абсорбции кальция в кишечнике у данного обследуемого подтверждает наблюдения о том, что у. различных индивидуумов формирование отрицательного баланса кальция может осуществляться с преобладанием активности различных звеньев: либо за счет прироста экскреции кальция с мочой, либо за счет снижения его кишечной абсорбции.

Важнейшим эффекторным органом, поддерживающим постоянство содержания кальция в крови, являются почки /Наточин Ю.В., 1976/. Для изучения ренальных механизмов ионорегу.тяции, для выявления резервных возможностей систем, поддерживающих постоянство электролитного состава крови, широко используется метод функциональных нагрузочных проб/Рябов С.И., Наточин Ю.В., 1979/.

При проведении пробы с кальциевой нагрузкой во время 120-суточной антиортостатаческой гипокинезии было установлено, что пероральное введение лактата кальция вызывало более существенное, чем в условиях обычной двигательной активности, увеличение экскреции кальция с мочой. Активность ионизированного кальция при пробах с кальциевой нагрузкой в условиях гипокинезии возрастала в меньшей степени, чем в условиях обычной двигательной активности.

Изменениям кальцийуретической функции почек в условиях антиортостатической гипокинезии были посвящены специальные исследования /Григорьев А.Й., Моруков Б.В., 1981; Моруков Б.В., Ходкевич Ю.Н., 1979/. В частности, было показано, что уровень фильтрации при кальциевой нагрузке на фоне водного диуреза практически не изменяется /Моруков Б.В., Григорьев А.И., 1978/, а изменения величины фильтрационного заряда кальция определяются, в основном, повышением его фильтруемой фракции в крови.

Исследование активности кальцийтропных гормонов.

Определение кальцийтропных гормонов, оказывающих системное разнонаправленное влияние на обмен кальция, позволило более полно судить об особенностях гормональной регуляции этого иона при длительном ограничении двигательной активности. Уже на 1-е сутки периода гипокинезии было обнаружено возрастание содержания паратгормона и кальцитонина и снижение содержания остеокальцина.

Следует отметать, что выявленные изменения концентрации ММ-фрагмента паратиреоидного гормона носили однонаправленный характер. Содержание 11)1' у всех обследованных сохранялось на высоком уровне в течение всего периода постельного режима. В периоде восстановления высокая, по сравнению с фоном, концентрация гормона имела тенденцию к снижению только у 2-х обследуемых, причем даже в этом случае оставалась значительно выше фонового уровня.

Концентрация кальцитонина также имела пик в остром периоде адаптации на 1-е сутки. На 7-е сутки у двоих обследуемых выявлялось подавление секреции кальцитонина, выраженное в снижении его концентрации ниже исходного уровня, в то время как у четверых обследуемых данный показатель оставался значительно повышенным. Дальнейшее исследование показало, что концентрация кальцитонина сохранялась повышенной на 60-е и 100-е сутки, причем в периоде восстановления у троих обследуемых наблюдалась тенденция к дальнейшему повышению уровня гормона.

Уже в остром периоде на 1-е сутки гипокинезии в крови всех обследуемых, определялось снижение уровня остеокальцина. Концентрация данного полипептида в последующем имела тенденцию к росту и уже на 60-е сутки возвращалась к исходному уровню, сохраняясь близкой к фоновому уровню на 100-е сутки эксперимента. Анализ содержания остеокальцина в периоде восстановления показал, что после прекращения воздействия гипокинезии его концентрация продолжала расти (рис. 4). Эти результаты свидетельствуют о том, что в условиях, моделирующих физиологические эффекты невесомости, новообразование костной ткани после значимого подавления в остром периоде адаптации постепенно выходит на уровень, близкий к исходному. Тем не менее, вероятно, активность синтетических процессов значительно уступает резорбтивным, что: формирует новый уровень обменных процессов в кости адекватно условиям жизнедеятельности.

140 120 100

%%

80 60 40

1с 7с 60с 100с ПВ

Рис.4. Динамика концентрации остеокальцина в сыворотке крови в эксперименте со 120-суточной АНОГ (в %% к фоновому уровню).

Полученные результаты свидетельствуют, что пребывание в условиях длительной гипокинезии приводит к стойкому повышению содержания в крови паратиреоидного гормона, изменение кальштонина при этом носит фазный -характер. Уровень остеокальцина после резкого угнетения в остром периоде адаптации возвращается к норме и продолжает расти в периоде восстановления.

Наибольший интерес в этой серки представляют результаты гормональной реакции на введение лактата кальция. В условиях обычной двигательной активности эта нагрузочная проба приводила ^ повышению уровня общего и ионизированного кальция в крови и возрастанию' его экскреции с мочой, а также вызывала закономерные гормональные сдвиги: снижение концентрации в крови ПТГ и увеличение содержания кальцитонина на 63 и' 276% соответственно. Эта реакция' была направлена на нормализацию содержания кальция в крови за счет снижения всасывания кальция в кишечнике и угнетения его реабсорбции в канальцах почек. Нельзя также исключить такой эффект кальцитонина, как депонирование кальция в костной ткани.

В периоде гипокинезии исходная концентрация ПТГ была значительно выше, чем до эксперимента. После приема лактата кальция на 100-е сутки периода АНОГ направленность изменений кальцийтропных гормонов сохранилась, уровень ПТГ снижался, а кальцитонина - возрастал, хотя и в меньшей степени, чем до эксперимента. Однако даже на высоте нагрузочной пробы уровень ПТГ был значительно выше.

Несмотря на это, выведение кальция с мочой за время пробы превышало фоновые показатели.

Очевидно, что изменения уровней кальцийрегулирующих гормонов являлись вторичными по отношению к отклонению регулируемой величины и были направлены на поддержание постоянства гомеостагической константы крови. В целом, результаты, полученные в эксперименте со 120-суточной антиортостатической гипокинезией, свидетельствуют, что изменения обмена кальция и систем его регуляции адекватны снижению опорно-функциональной нагрузки на костно-мьппечную систему, и, несмотря на измененный гормональный фон, сохраняется закономерная реакция эндокринных желез во время пробы с кальциевой нагрузкой, направленная на предотвращение чрезмерного увеличения уровня ионизированного кальция в крови. Данные исследования кинетики кальция позволили уточнить механизмы формирования его отрицательного баланса, развивающиеся за счет снижения кишечной абсорбции. Сохранение повышенной активности ионов кальция в сыворотке крови в течение всего периода постельного режима и увеличение его экскреции с мочой свидетельствует о преобладании мобилизации кальция из костного депо.

Исследования кальцийсвязывающей способности белков сыворотки крови

в условиях обычной двигательной активности и антиортостаза.

Исследование всех кальцийсодержагцих фракций крови имеет самостоятельное значение для выявления их обратимой способности связывать свободный (ионизированный) кальций, являющейся механизмом контроля его концентрации. Кроме определения показателей концентраций СаРг и СаЬ, техника ультрафильтрации позволяет также определять уровень ультрафильтруемого кальция (СаШ), исключительно важного компонента интерстициальной жидкости, который более верно, чем показатель общего кальция крови, отражает состояние кальциевого гомеостаза.

В условиях обычной двигательной активности были проанализированы концентрации в крови кальцийсодержащих фракций, полученные методом повторных определений у 25 здоровых добровольцев. Наименее вариабельными оказались уровень общего кальция, пересчитанный на 1 литр воды плазмы (СаТНгО), и содержание ионизированного кальция, стандартизированного при рН 7.4 (Са"1+7.4). Концентрация кальция, связанного с белком (СаРг), варьировала у большинства обследованных в диапазоне от 0.92 до 1.181 ммоль/л. Вариации кальция, связанного с низкомолекулярными

компонентами плазмы (CaL), были наиболее значимы, однако следует отметить, что и в этом случае они были меньшими (от О.ОО до 0.45 ммоль/л), чем в исследованиях других авторов /Григорьев А.И., 1994, Raman А., 1972/.

Исследование кальцийсвязывающей способности белков крови в условия*

24-х часового антиортостаза.

После окончания АНОГ в среднем по группе не выявлено значимых изменений общего кальция и остальных регистрируемых показателей кальциевого гомеостаза. Однако следует отметить тенденцию к повышению ионизированного кальция (Т=1,62) у шести обследуемых из семи. Концентрация кальция, связанного с белком, в среднем по группе снизилась на 8,3%, концентрация CaL оказалась повышенной на 10,7 % (рис. 5).

12% | 10%-

I

' I

6 ' !

А%- i

2%- 1—

-2%- 1

•4е. t

-в'/ -8' ¿П.--.

v

/

>

*

<?<■ ч

О О

cF

Рис. 5. Изменение кальцийсвязывающих фракций в крови после 24-пасовой антиортостатической гипокинезии.

Таким образом, после суточной АНОГ выявлено незначительное повышение ультрафильтруемого кальция, за счет увеличения фракции Са++ и незначительного увеличения фракции CaL. В связи с увеличением фракции ультрафильтруемого кальция после АНОГ при одном и том же потреблении кальция, очевидно, произошло перераспределение фракций кальция. И поскольку произошло снижение концентрации

фракции СаРг, а содержание альбумина в плазме крови не изменилось, то величины удельной концентрации СаРг оказались сниженными.

Корреляционный анализ выявил отсутствие взаимосвязи между концентрациями СаТ и СаРг после АНОГ, тогда как до АНОГ наблюдалась тесная корреляционная зависимость между этими параметрами.

После 24-часового пребывания обследуемых в условиях антиортостатической гипокинезии наблюдалось изменение физико-химических свойств буферов крови в отношении способности связывать кальций. Это проявлялось в снижении фракции СаРг при сохранении на постоянном уровне как Са^, так и СаРг, при тенденции к увеличению Са++.

Полученные результаты свидетельствуют о вовлеченности физико-химических механизмов в поддержание гомеостаза кальция на ранних этапах адаптации к условиям антиортостатической гипокинезии, при этом уже в этом периоде факторы, моделирующие гемодинамические сдвиги в условиях невесомости, могут оказывать влияние на содержание двухвалентных ионов в крови.

Использование фармакологических средств профилактики в экспериментах на

животных.

Целью данного эксперимента было исследование эффективности лодроната при иммобилизационном остеопорозе. Исследование содержания общего и ионизированного кальция в сыворотке крови животных не выявило существенных различий между экспериментальными группами (рис. 6). Содержание неорганического фосфора в крови животных было достоверно ниже в контрольных группах с введением лодроната по первой и третьей схеме (КЛ1 и КЛЗ).

В грушах с вывешиванием с введением лодроната по 3-й и 4-й схемам удельная плотность как целой бедренной кости, так и обоих ее фрагментов была существенно выше при сравнении с ВК. За исключением ВК, содержание кальция в костной ткани дистального эпифиза было практически одинаковым во всех экспериментальных группах (рис. 6).

При исследовании прочностных свойств образцов костной ткани выявлено, что пребывание в условиях вывешивания приводит к значительному снижению предела пропорциональности механического напряжения — основного параметра, характеризующего прочность костной ткани как материала в области физиологических

нагрузок. В группах с непрерывным введением лодроната, также как и в ВК, наблюдалось снижение предела пропорциональности, хотя и в меньшей степени. Циклическое введение препарата сохраняло данный показатель практически таким же как в контрольной группе с введением "плацебо".

Концентрация общего кальция в крови (ммоль/л)

Содержание фосфора в крови (ммоль/л)

Концентарция ионизированного кальция в крови (ммоль/л)

Содержание кальция в кости (мг/г)

Рис.б. Влияние лодроната на минеральный обмен и прочностные характеристики кости Прим: [3 - К, §Ц - ПС, Ц - ГЛ1, Щ - ГЛ2, Ц - ГЛЗ; *» - р < 0,05

В группах с введением лодроната по схемам 3 и 4 предел прочности несколько повышался, при этом в ВЛ4 данный параметр был достоверно выше, чем в К (рис. б). При анализе другого параметра, характеризующего прочностные свойства костной ткани, предела пропорциональности относительной деформации, было выявлено, что данный показатель повышался у вывешенных животных в грушах с введением лодроната по схемам 3 и 4.

Гистоморфометрический анализ большеберцовых костей у крыс, вывешенных в течение 40 суток в ангиортостатическом положении, показал, что у животных развивается остеопороз. На что указывает 40% уменьшение объемной плотности вторичной спонгиозы, происходящее в основном за счет снижения числа костных трабекул /Дурнова Г.Н. с соавт., 1993/.

Введение вывешенным крысам лодроната предотвращало развитие у них остеопороза (независимо от схемы введения препарата), о чем свидетельствует отсутствие изменений в объемной плотности вторичной спонгиозы по сравнению с интактным контролем; более того, у вывешенных крыс 3-й группы, получавших лодронат циклами, количество костной ткани во вторичной спонгиозе даже превосходило таковое в контроле. Что касается первичной спонгиозы, то она не только не уменьшалась, что характерно для вывешивания, но ее ширина значительно превосходила таковую у интактных животных и приближалась к ширине этой зоны у контрольных животных, получавших лодронат. Наибольшей величины ширина зоны первичной спонгиозы достигала у животных ВЛЗ /ДурноваГ.Н. с соавт., 1993/.

Таким образом, прочностные свойства костной ткани как материала определяются комплексом факторов, в том числе минеральной насыщенностью, соотношением минерального и органического компонента, состоянием кристаллической решетки, включая как особенности состава и формы кристаллов, так и адгезивных связей между кристаллами и органическим матриксом. Механические свойства кости как конструкции, кроме прочностных характеристик костной ткани как материала, зависят также от структуры трабекулярной кости (количества, толщины и пространственной ориентации трабекул), соотношением компактного и губчатого вещества, геометрии кости.

Суммируя эффекты лодроната в условиях вывешивания на механические и физико-химические свойства образцов костной ткани можно заключить, что более предпочтительно выглядят группы с введением лодроната с перерывами в 10 суток,

причем наименьшие отклонения от контрольного уровня по всем параметрам наблюдалось у животных, получавших лодронат по четвертой схеме.

Таким образом, можно заключить, что введение лодроната оказало выраженный эффект на ремоделирование и метаболизм костной ткани в условиях вывешивания, при этом прочностные свойства костной ткани практически не изменялись при умеренном снижении упругих свойств. Оптимизация дозировки препарата и схем его применения могут быть предметом дальнейших исследований для профилактики неблагоприятных эффектов микрогравитации у человека.

ВЫВОДЫ.

1. Отрицательный баланс кальция в длительных космических полетах и в наземных модельных экспериментах формируется, в большей степени, вследствие снижения его абсорбции в желудочно-кишечном тракте. Увеличение экскреции кальция почками в этих условиях отражает негативный баланс кальция в костной ткани.

2. Потери кальция в послеполетном периоде сохраняются, при этом выведение кальция с мочой нормализуется быстрее, чем1 его повышенная экскреция кишечником. Изменения уровня параггормона в послеполетном периоде в большей степени отражают его метаболизм, чем его секрецию, динамика уровня остеокальцина связана со стимуляцией остеогенеза.

3. В остром периоде адаптации к условиям антиортостатической гипокинезии в регуляции обмена кальция играют роль физико-химические механизмы, при этом повышение активности ионизированного кальция в крови обусловлено перераспределением между фракциями, связывающими кальций в крови.

4. В условиях АНОГ при пробе с нагрузкой лактатом кальция, несмотря на измененный гормональный фон, сохраняется адекватная реакция почек и кальцийрегулирующей эндокринной системы, направленная на нормализацию чрезмерного повышения ионизированного кальция в крови.

5. В условиях вывешивания у крыс снижение прочностных свойств костной ткани обусловлено изменением ее минерального состава, а также перестройкой структуры. Применение бисфосфонатов (лодронат) по циклической схеме в сочетании с превентивным введением наиболее эффективно для

предотвращения нарушения обмена кальция и изменения состояния костной ткани в этих условиях.

Практические рекомендации:

1. Методика исследования кинетики кальция с использованием стабильного изотопа Са44 может быть использована в условиях космического полета и послеполетном периоде при исследовании механизмов нарушения обмена кальция, а также для оценки эффективности профилактических и реабилитационных мероприятий.

2. Препарат группы бисфосфонатов лодронат может быть использован в условиях космического полета и в наземных модельных экспериментах для профилактики нарушения обмена кальция в костной ткани.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Study of calcium homeostasis regulating mechanisms in acute period of adaptation to bed rest. — XXXIII International Congress of Physiological Sciences, StPerersburg, June 30-July 5 1997, Abstarcts P100.20. (Совместно с Моруковым Б.В. и Лариной И.М.)

2. Влияние длительной невесомости и гипокинезии на метаболизм кальция. В кн.: Медико-биологические исследования по программе "Наука-НАСА" (Третий российско-американский симпозиум, Тезисы докладов), Хантсвилл, Алабама, США, 10-13 ноября 1997 г., стр.48 (Совместно с Моруковым Б.В., Лариной И.М.).

3. Методологические подходы в изучении метаболизма кальция в условиях невесомости и гипокинезии. Авиакосмич. и экологич. медицина. - 1997, №6, стр.74.

4. Метаболизм кальция и его регуляция в эксперименте со 120-суточной антиортостатической гипокинезией. Авиакосмич. и экологич. медицина. -1998, №4, стр.56-57.

5. Influence of bisphosphonates on calcium metabolism and bone tissue during simulation of the physiological effects of microgravity. Journal of Gravitational Physiology (Совместно с Григорьевым А.И., Моруковым Б.В. и Ступаковым ГЛ.). - 1998, vol. 5,Р - 69-70.