Определение базовых прогностических маркеров рака молочной железы с использованием технологии тканевых матриц

Храмцов, Андрей Ильич

Диссертации по медицине → Патологическая анатомия

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Определение базовых прогностических маркеров рака молочной железы с использованием технологии тканевых матриц

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Храмцов, Андрей Ильич Санкт-Петербург 2011 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Определение базовых прогностических маркеров рака молочной железы с использованием технологии тканевых матриц

На правах рукописи

ХРАМЦОВ Андрей Ильич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАЗОВЫХ ПРОГНОСТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ ТКАНЕВЫХ МАТРИЦ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4847272 1 9 МАЙ 2011

Санкт-Петербург 2011

4847272

Работа выполнена в ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Хмельницкая Наталия Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

профессор Пожарисский Казимир Марианович

доктор медицинских наук

профессор Насыров Руслан Абдуллаевич

Ведущая организация: Государственное учреждение науки «Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 2011 года в^чяасов На

заседании диссертационного совета Д.208.089.04 при ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (191015, г. Санкт-Петербург, ул. Кирочная, Д.41)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 195196, г. Санкт-Петербург, Заневский пр., 1 /82

Автореферат разослан «_»__2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

М.А. Шевяков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди всех онкологических заболеваний у женщин. По данным Всемирной Организации здравоохранения (ВОЗ), в мире каждый год регистрируется 1,1 млн. новых случаев заболевания. Ежегодно от РМЖ погибает более 411 тысяч женщин (World Health Organization, 2008). РМЖ является гетерогенной группой опухолей с широкой вариацией в отношении клинических проявлений, прогноза и морфологического спектра (Головин Д.И., 1982; Нейштадт Э.Л., Воробьева O.A., 2003; Makretsov N.A. и соавт., 2004; Weigelt В. и соавт. 2008). Проблема морфологической неоднородности РМЖ давно уже признана гистопатологами, которые прилагают многолетние усилия в разработке классификационных систем, учитывающих разнообразие этого рака (Ермилова В.Д.. 2002; Geyer F.C. и соавт., 2009). Классификация опухолей молочной железы, опубликованная ВОЗ включает многочисленные гистологические формы. Однако эта классификация не отражает внугриопухолевую гетерогенность и биологическую комплексность опухолей молочной железы. В настоящее время, только морфологическая верификация патологического процесса как злокачественного новообразования, недостаточна для индивидуального прогноза РМЖ (Мацко Д.Е., Шелехова К.В., 2007; Филатов A.B., 2008; Семиглазов В.Ф., 2009). Определение молекулярно-биологических маркеров (МБМ) в ткани опухоли может дать дополнительную информацию о быстроте ее роста, способности к метастазированию, устойчивости к химиопрепаратам (Аничков U.M., Зиновьев А., 1993; Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., 2002; Ориновский М.Б., и соавт. 2006). Характеризуя биологические особенности каждой конкретной опухоли, они могут помочь в прогнозировании исхода заболевания и в индивидуализации лечения (Имянитов E.H., Князев П.Г., 1991; Семиглазов В.Ф., 2000). Для изучения биологических свойств опухолей молочной железы в настоящее время широко используют технологию микрочиповых матриц. Эта технология позволила определить, что каждая опухоль имеет свой уникальный профиль экспрессии генов. На основе генной экспрессии выявлено несколько подтипов РМЖ (Pérou С.М., и соавт., 2000; Sorlie Т., и соавт., 2001). Однако исследование с помощью микрочипов является дорогостоящим и трудоемким. В последние годы во всем мире применяют тканевые матрицы (ТМА), известные в англоязычной

литературе как tissue microarrays. Эта технология позволяет провести исследование множественных образцов тканей от разных пациентов с использованием одного парафинового блока. Срезы такого блока могут быть использованы в исследовании прогностических маркеров РМЖ с помощью иммуногистохимического анализа (ИГХ). Необходима разработка недорогих и более простых в использовании подходов, которые будут доступны в практике.

Все выше изложенное и определяет актуальность данного исследования.

Цель исследования

На основе изучения молекулярных подтипов РМЖ с использованием ТМА определить базовые прогностические маркеры РМЖ.

Задачи исследования

1.Изучить данные современной литературы о возможностях использования ТМА в научной и практической деятельности врача РФ с учетом достоинств и недостатков этой технологии.

2.Экономически обосновать необходимость использования ТМА технологии в современной морфологической диагностике РМЖ.

З.Исследовать экспрессию прогностически значимых и таргетных (прицельных для терапии) молекулярно-биолотческих маркеров: рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR), Human Epidemial Growth Factor Receptor 2 (HER2), маркера базальных/ миоэпителиальных клеток - цитокератинов 5/6 (СК 5/6), Epidemial Growth Factor Receptor (EGFR), а также дополнительных МБМ (/?-Catenin, aS-crystallin, CD44, CD24) в опухолях молочной железы, используя ТМА технологию.

4.0пределить, на основании полученных данных, доминирующие биологические подтипы рака молочной железы у исследуемой когорты пациентов, применив метод иерархического кластерного анализа.

Научная новизна

На основании проведенного исследования показана возможность и необходимость определения молекулярных подтипов рака молочной железы с помощью иммуногистохимического метода. Предложен комплексный подход: сочетание ИГХ и новой ТМА технологии, что позволяет изучать широкую панель МБМ с минимальными экономическими затратами.

Впервые изучена панель МБМ (^-Catenin, afi-crystallin, CD44, CD24), связанных с базальноподобным или тройным негативным (ТНРМЖ)

раком. Проанализированы особенности экспрессии и взаимного влияния этих протеинов на прогрессию РМЖ.

Изучено прогностическое значение определения молекулярных подтипов РМЖ для выживаемости.

Практическая значимость

Работа направлена на улучшение диагностики и индивидуализацию лечения пациентов. Для определения молекулярных РМЖ предложен альтернативный дорогостоящему методу микрочипов метод ИГХ в сочетании с ТМА. Полученные результаты могут использоваться для диагностики, планирования лечения и прогнозирования у пациентов с диагнозом РМЖ.

Основные положения, выносимые на защиту

1 .Многолетний опыт собственных исследований и анализ современной научной литературы позволяют рекомендовать использование ТМА технологии в сочетании с ИГХ для широкого использования в научной и практической деятельности врача-патологоанатома.

2.Проведенный нами сравнительный анализ стоимости услуг на иммуногистохимические исследования базовых молекулярно-биологических диагностических маркеров РМЖ при использовании обычных подходов и расчет затрат на исследование при использовании технологии ТМА показывает явную экономическую выгоду последних.

4.Прнменение дополнительных молекулярно-биологических маркеров /?-Catenin, аД-crystallin, CD44, CD24 является обоснованным при диагностике базальноподобного РМЖ, так как позволяет более точно прогнозировать исход заболевания и индивидуально подбирать терапию.

5.Для анализа данных ИГХ исследования множественных МБМ наиболее удобным является метод иерархического кластерного анализа. Он быстро и наглядно позволяет определить

доминирующие биологические подтипы рака молочной железы у исследуемой когорты пациентов.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Автором определены основные идеи, цели и задачи исследования. Самостоятельно выполнены сбор материала, построение ТМА, проведение ИГХ реакций, анализ полученных результатов и их статистическая обработка.

Внедрение результатов исследования в практику

Теоретические положения работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре патологической анатомии им. O.K. Хмельницкого ГОУ ДПО СПб МАЛО. Практические положения работы внедрены в диагностический процесс при постановке диагноза рака молочной железы в Ленинградском областном патологоанатомическом бюро.

Апробация материалов диссертации

Результаты и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию Российского общества патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2009); международном съезде Американской Ассоциации Исследования Рака (Вашингтон, США, 2010); международном съезде Американского Общества Клинической Онкологии (Чикаго, США, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 статьи - в журналах перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка используемой литературы, включающего 210 источников, в том числе 42 отечественных и 168 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для диссертационного исследования послужил архивный консультативный материал Ленинградского областного бюро патологической анатомии от 186 пациентов (оперированных по поводу РМЖ различных гистологических форм и степени злокачественности), представленный тканевыми образцами, фиксированными в 10% растворе нейтрального забуференного формалина и залитые в парафин. Медицинская документация: выписки из историй болезни и протоколов исследования операционного материала. Для экономических расчетов - прайс-листы на платные услуги различных медицинских учреждений, доступные пользователям сети Интернет.

Гистологическое исследование и построение тканевой матрицы

Из архивных парафиновых блоков были изготовлены гистологические препараты с окраской гематоксилином и эозином. Исследование препаратов осуществлялось с помощью светового микроскопа при различных увеличениях (объективы 1,25х, 4х, 10х, 20х). Области интереса (участки опухоли) обводили маркером на поверхности покровных стекол микропрепаратов и парафиновых блоков. Для изготовления тканевой матрицы отливали из парафина блок-реципиент. С помощью цилиндрической трубки в блоке-реципиенте вырезали отверстия глубиной 5-6 мм. Цилиндрической трубкой из донорского блока в выбранном участке вырезали цилиндрический столбик ткани высотой до 5 мм и вставляли в отверстие блока-реципиента. Блоки ТМА резали на ротационном микротоме. Один срез окрашивали гематоксилином и эозином, на остальных срезах выполняли иммуногнетохимические реакции.

ИГХ исследование и критерии оценки экспрессии МБМ в РМЖ

Срезы ТМА обрабатывали по стандартным ИГХ методикам. Панель используемых в работе антител представлена в таблицах 1 и 2. Во время окрашивания применялись соответствующие положительные и отрицательные контроли (ткани миндалины, рака толстого отдела кишки, рака и нормального эпителия молочной железы человека). Молекулярные профили РМЖ определяли с помощью ИГХ метода на основе уровней экспрессии протеинов следующим образом: люминальный А (ER+ и/или PR+, HER2-), люминальный Б (ER+ и/или PR+, HER2+), с характеристиками базальных/миоэпителиальиых клеток (ER-, PR-, HER2-, СК5/6+

и/или EGFR+), HER2+/ER- подтип (HER2+, ER-, PR-), неклассифицированный (негативный в отношении всех пяти маркеров). Результаты и оценка ИГХ реакции производились по стандартам, разработанным для каждого маркера с учетом процента и интенсивности положительного окрашивания (табл.3). Анализ данных: создана база цифровых изображений и использовались программы: «Cluster», «TreeView», «Stata 9.2» (College Station, TX, USA).

Таблица /

Антитела, используемые в работе для исследования базовых

МБМ

Маркер Клон Разведение Фирма Метод восстановления антигенной имяунорсактпвиости Система детекции

ER SPI 1:50 Lab Vision/ Thermo Fisher (Fremont, CA) Демаски ровка антигенов в микроволновой печи в течение 30 минут, 10 мМ нитратный буфер (рН 6,0) EnVisiorr+ (Dako), ДАБ

PR SP2 1:50 Lab Vision/ Thermo Fisher Демаскировка антигенов в микроволновой печи в течение 30 минут, 10 мМ цитратный буфер (рИ 6,0) EnVisk>n+ (Dako), ДАБ

HER2 Her сер Test Подготовлено к применению фирмой Dako Демаскировка в микроволновой печи в течение 15 минут, Epitope retrieval solution (HercepTest № K5207) EnVision+ (Dako), ДАБ

EGFR 2-18C9 Подготовлено к применению фирмой Dako Обработка протеолитическим ферментом - протеина за К (Dako. PharmDX, JfeK.1494) EnVisk>ir+ (Dako), ДАБ

CK 5/6 D5/I6 B4 1:100 Dato Демаскировка антигенов в микроволновой печи в течение30 минут, 10 мМ цитратный буфер (рН 6,0) EnVis¡on+ (Dako), ДАБ

Таблица 2

Антитела, используемые в работе для исследования дополнительных МБМ

Маркер Клоп Рази сдеи не Фирма Метод восстапопления антигенной нммунореактиввосгн Система детекции

Vimentin V9 1:50 Dako Без обработки HnVision+ (Dako), ДАБ

/j-Catenin 14 1:200 Transduction Laboratories/ BD Biosciences (San Jose, CA) Демаскировка антигенов в микроволнопон печи в теч ение 30 минут, 10 м М цитрата ы И буфер (рН 6,0) HnVision+ (Dako), ДАБ

CD24 АЬ-2, SN3b 1:200 Lab VisiW Thermo Fisher Обработка в пароварке в течение 20 минут при температуре 95-98 °С, target retrieval solution (Dako, №S1699) Bond Polymer Refine Detection (Vision Biosystems/ Leica), ДАБ

CD44 АЬ-4, 156-3C1I 1:200 Lab Vision/ Thermo Fisher Обработка в пароварке в течение 20 минут при температуре 95-98 "С, target retrieval solution (Dako, JVsS ¡699) Bond Polymer AP Red Detection (Vision Biosystems/ Leica), Vulcan Fast Red Chromogen Kit 2 (№FR805H, Biocare Medical)

аВ- crystallin SPA-222 1:200 Stressgen Biotechnologies Демаскировка антигенов в микроволновой печи в течение 30 минут, ЮмМ цитратный буфер (рН 6,0) EnVision+ (Dako), ДА6

Таблица 3

Антитела н методы оценки шшуногнстохимического окрашивания

Маркер Оценка результатов окрашивания

ER Окрашивание ядерное: 0==>1%, 1=1-30%, 2=30-70%, 3=>70% (Reiner А и соавт., 1990). Оценка пороговых значений (ASCO/CAP, Hammond М.Е. и соавт., 2010).

PR Окрашивание ядерное: 0=>1%, 1=1-30%, 2=30-70%, 3=>70% (Reiner А и соавт., 1990). Оценка пороговых значений (ASCO/CAP, Hammond М.Е. и соавт., 2010).

HER2 Окрашивание мембранное: 0 - полное отсутствие или <10% клеток; (1+) - слабое, >10% клеток; (2+) - слабое или умеренное полное, >10% клеток, или окрашивание яркой интенсивности всей мембраны клетки <30% клеток; (3+) -окрашивание яркой интенсивности всей мембраны клетки >30% клеток (ASCO/CAP, Wolff АС и соавт., 2007).

EGFR Окрашивание мембранное: 0,I+,2+,3+ (Dako/ PharmDX); 0=0%; считается позитивным если присутствует любое окрашивание.

CK. 5/6 Окрашивание цитоплазматическое: 0=<5%, 1=6-30%, 2=31-60%, 3=>61% (Dabbs D.J. и соавт., 2006).

Vimentin Окрашивание цитоплазматическое. Оценивали антигенные свойства тканей (Battifora Н., 1991).

/?-Catenin Окрашивание ядерное, мембранное, цитоплазматическое: 0=<10%, 1=11-30%, 2=30-70%, 3=>70% (Reiner А. и соавт., 1990).

CD 24 Окрашивание цитоплазматическое: 0=0%, 1=1-10%, 2=11-50%, 3=51-75%, 4=76-100% ( Honeth G. и соавт., 2008).

CD44 Окрашивание цитоплазматическое: 0=0%, 1=1-10%, 2=11-50%, 3=51-75%, 4=76-100% ( Honeth G. и соавт., 2008).

aB- crystallin Окрашивание цитоплазматическое, мембранное: 0 - полное отсутствие продукта реакции; (1+) - слабое позитивное окрашивание (<30% клеток); (2+) сильное позитивное окрашивание (>30% клеток) (Moyano J.V. и соавт,, 2006).

Используемые средства: микроскоп «Leica» с цифровой камерой, компьютер IBM-PC, инструмент «TMAjr» («Pathology Devices, Inc.»),

программное обеспечение для работы с цифровыми и графическими данными («Image-ProExpress 6.3»).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании проведенного обзора современной литературы, анализа достоинств и недостатков метода тканевых матриц, а так же собственного опыта работы, были разработаны критерии для отбора материала, пригодного для построения ТМА блока и предложен наиболее оптимальный алгоритм-протокол его построения.

Протокол построения парафинового ТМА блока п инструкция по проведению процедур

1. Отбор текущего операционного и архивного материала, который будет использоваться для ТМА, производится в соответствии с требованиями этического комитета учреждения и с информированного добровольного согласия на исследования пациентов или их представителей.

2. Квалифицированный врач-патологоанатом исследует

гистологические препараты, выбирает наиболее представительные участки, которые отмечает на блоке с иомощыо цветного маркера. Одновременно он оценивает толщину блоков. Рекомендуется подбирать блоки толщиной не менее 2 мм (наиболее подходящие блоки толщиной 25 мм). Используется материал, фиксированный в 10% растворе нейтрального забуференного формалина и фиксированный в течение 6-48 часов (оптимальные условия для ИГХ).

3. В зависимости от цели проводимого исследования патологоанатом выбирает дизайн (тип) ТМА и создает ее карту. Рекомендуется делать это одновременно с просмотром стекол и разметкой блоков.

4. Приготовление блока-реципиента производится лаборантом-гистологом.

5. Построение ТМА-блока производится квалифицированным лаборатом, прошедшим курс обучения использования оборудования для построения ТМА. При использовании автоматизированного мехашпма персонал обязательно должен пройти тренировку по технике безопасности и правилам загрузки блоков и программирования машины.

6. Порезка блока и приготовления ТМА-ерезов производится квалифицированным лаборантом-гистологом. Процедура требует небольшого опыта работы с 'ША-блоком и не отличается от стандартной техники.

7. Для подтверждения изучаемых морфологических структур следует каждый 11-й серийный срез окрашивать гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическая окраска срезов производится ио стандартным

протоколам с использованием контролен для антител и условий иммуношстохимнческого окрашивания.

8. Оценка качества ТМА и нммуногистохнмическош окрашивания про|вводится наголо! ом.

9. Диализ экспрессии изучаемых протеинов производится квалифицированным патологом на основании применения стандартных современных систем оценки ИГХ окрашивания для каждого маркера. Системы иолуколичсственного анализа, как правило, основываются на оценке интенсивности ИГХ реакции и проценте (пропорции) положительно окрашенных клеток.

10. Полученные данные обрабатываются с помощью статистических программ.

Экономическое обоснование необходимости использования ТМА технологии в современной морфологической диагностике РМЖ

Проведен анализ стоимости услуг в различных диагностических центрах России на ИГХ исследование маркеров РМЖ (ЕИ, РЯ, НЕ112). По данным прайс-листов, доступных пользователям сети Интернет, произведен расчет затрат на ИГХ исследование ткани РМЖ десяти пациентов с использованием обычных подходов и расчет аналогичных затрат при использовании технологии ТМА. Стоимость услуг на исследование трех маркеров (ЕЯ, РЯ, НЕИ2) с использованием трех микропрепаратов по стандартной методике в среднем составляет 3990 руб. для одного пациента и 39 900 руб. для десяти пациентов. Стоимость услуги на исследование трех маркеров с использованием ТМА в среднем составляет 399 руб. для одного пациента и 3 990 руб. для десяти пациентов. Кроме того, метод ТМА позволяет рационально использовать помещения для хранения архивного материала в патологоанагомических отделениях.

Определение экспрессии молекулярно-бнологическнх маркеров в РМЖ с использованием ТМА

Для классификации РМЖ на подтипы и проведения исследования экспрессии МБМ в опухолях молочной железы былн построены и использованы шесть ТМА блоков. Тканевые матрицы содержали 782 тканевых образца РМЖ различных гистологических форм и степени злокачественности от 186 пациентов. Из них 60 наблюдений были представлены неинфильтрирующим протоковым » дольковым раком, 126 - иивазивным раком различных гистологических форм. Средний возраст пациентов с неинфильтрирующим РМЖ составил 55,1±13,0 лет, в то время как

средний возраст пациентов с инвазивной формой рака - 56,0±15,6 лет. На основании данных историй болезни и с учетом результатов гистологического исследования были установлены стадии онкологического заболевания, согласно Международной Классификации Опухолей (Greene F.L., и соавт., 2002; Tavassoli F.A., Devilee P., 2003). Рак молочной железы I стадии установлен у 30 пациенток, что составило 16,13% от всей группы наблюдения. Рак молочной железы стадии ПА был выявлен у 37 (19,90%) пациенток, стадии IIB - у 32 (17,20%), ША стадии - у 13 (6,98%), II1B - у 8 (4,30%). Рак молочной железы IV стадии был установлен в 6 случаях, что составило 3,23%. Неинвазивный рак (0 стадия) был выявлен у 60 пациенток (32,26%). Наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы обнаружено в 65 (35,0%) случаях. В основном имелось единичное метастазироваиие - 37 (19,89%) наблюдений; а наличие отдаленных метастазов выявлено у 7 (3,76%) пациенток. Морфологические формы опухоли РМЖ были определены при гистологическом исследовании и представлены в основном инвазивным протоковым раком - 104 (82,5%) наблюдения. Инвазивиый дольковый рак диагностирован в 13 (10,3%) случаях, другие формы РМЖ составили 9 (7,2%).

Определение н описание молекулярных подтипов РМЖ рационально выполнять по алгоритму. На необходимость развития алгоритмизации, как наиболее совершенного и правильного процесса диагностирования указывали O.K. Хмельницкий (1994) и A.B. Смольянников и соавт. (1995). В ходе проведенной работы предложен модифицированный алгоритм классификации РМЖ на молекулярные подтипы, который может быть использован в практической работе патоморфологами и врачами-онкологами (рис.1).

Рис. !. Блок-схема алгоритма определения молекулярных подтипов РМЖ.

На основании проведенного полуколичествеиного анализа было выявлено пять молекулярных подтипов опухолей, как в инвазивных, гак и в неинвазивных формах РМЖ: /номинальный тип А, люминальный тип Б, базальноподобный, НЕК2 ¡ /ПК-, и неклассифицированный. Все инвазмвные раки распределялись по подтипам: люминальный тип А - 81 (64,24%), люминальный тип Б -11 (8,73%), базальноподобный - 23 (18,25%), ПЕК2/ЕЯ- - 8 (6,4%), неклассифицированный - 3 (2,38%). Среди неинвазивных раков подтипы распределялись следующим образом: люминальный тип А -38 (63,33%), люминальный тип Ь - 6 (10%), базальноподобный - 8 (13,34%), НЕ 112 выявлен в 6 (10%), неклассифицированный - 2 (3,33%). В результате работы составлен иммуногистохимический портрет каждого подтипа.

Определение доминирующих молекулярных подтипов РМЖ у исследуемой когорты пациентов

С помощью компьютерных программ был проведен анализ данных ИГХ исследования: было получено 5 кластерных групп, каждая из которых имела свой индивидуальный ИГХ профиль или «портрет». Проведенный анализ показал, что доминирующим подтипом РМЖ является люминальный подтип А, на втором месте оказался базальноподобный тип, третье разделили люминальный тип Б и НКК2, на последнем месте оказался неклассифицированный.

Анализ так же показал, что молекулярные подтипы имели прямую связь с гистологической степенью злокачественности (р=0,0001).

Важнейшим критерием, характеризующим правильность диагностики и лечения, является показатель выживаемости. В работе проведён расчёт показателей болезнь-специфической 15-летней выживаемости (69 больных), для расчета показателей которой использован метод Каплан-Мейера. При данном анализе учитывали смертность только от рака молочной железы. Полученные нами результаты свидетельствуют, что пациенты, относящиеся к группе с фенотипом рака: НЕ112+/Е11- и базальноподобный, имеют наихудший прогноз.

Экспрессия белка /7-са1ешп в РМЖ

Для оценки экспрессии и локализации белка у?-са1епт было произведено ИГХ окрашивание ТМА стекол и выполнен анализ оценки экспрессии белка в мембране, цитоплазме и ядре клеток нормальной ткани молочной железы, неинвазивного и инвазивного РМЖ, метастазах в лимфатические узлы. Анализ показал, что пропорция опухолей, экспрессирующих белок /£-са1епт в цитоплазме и ядре в опухолях базальноподобной подгруппы РМЖ (рис.2) имеет высокую статистическую значимость, по сравнению с другими подгруппами. Ядерная экспрессия белка /?-са1епш так же обратно пропорционально коррелировала с Е11 (р<0,0001) и РЯ (р<0,0001) и прямо пропорционально с СК5/6 (р-0,0001) и ЕСРЯ (р=0,0001). Цитоплазматическая экспрессия белка напрямую коррелировала со степенью злокачественности РМЖ. Анализ экспрессии белка /?-са1ешп в молекулярных подгруппах неинвазивного РМЖ выявил отсутствие превалирования мембранной экспрессии в какой-либо подгруппе и показал явную цитоплазматическую и ядерную экспрессию в подгруппе базальноподобного РМЖ.

¡3-са1 епт, мембранное окрашивание 100-1

Люмшш;1ы1Ый А Люм инальный I» НН Базальноподобный I-1 ИНК2+/ЕК-

р-са1епи1, иитоплазма-тческое окрашивание

диЛШ

Люм инальный А /Тюминал ьный Б В^я Базалыюлодобный

р-са1ешп, ядерное окрашивание

Люмииальный А ХЬоминальиый Б Назалъноподобпый I I НКК2+/№-

Рис. 2. Изменение распределения белка р-са1егап в клетке в зависимости от принадлежности пациента к одной из молекулярных подгрупп РМЖ. По вертикали - процент пациентов, имеющих экспрессию. По горизонтали - оценка экспрессии протеина р-са1ешп по системе 0 (нет экспрессии), 1 (слабая экспрессия), 2 (умеренная экспрессия), 3 (выраженная экспрессия).

Экспрессия С044 и С024 в РМЖ

ИГХ анализ экспрессии С044 и СВ24 был проведен для определения популяции стволовых клеток, имеющих С044+/СЭ24-фенотип.

Проведенный полуколичественный анализ экспрессии маркеров СБ44 и С024 показал (рис.3), что С044+/СЭ24- фенотип ассоциируется прежде всего с РМЖ базапъноподобной подгруппы (р=0.0001). Важным на наш взгляд оказалось то, что окраска серийных срезов показала, что клетки, имеющие цитоплазматическую (р=0,0009) и ядерную (р<0,0001) локализации белка /?-са(епн1. имеют СМ4+/СВ24- фенотип и относятся к базальноподобному РМЖ. Клетки с преимущественно мембранной локализацией белка /3-са1еп'т имеют С044 /С024+ фенотип и относятся к люмииальному подтипу А.

Популяция опухолевых клеток РМЖ, имеющая С044+/СБ24-фенотип прямо пропорционально коррелировала с экспрессией СК5/6 (р=0,012) и ЕОРЯ (р=0,0046) и обратно пропорционально коррелировала с экспрессией ЕЯ (р=0,0022) и РЯ (р=0.0015). Не было выявлено корреляционной связи С044+/С024- с возрастом пациенток, размером опухоли и степенью злокачественности РМЖ. В неинвазивных РМЖ мы не выявили никакой корреляционной связи между экспрессией С044+/С024- и цитоплазматической или ядерной экспрессией белка /?-са{ешп (р=0,50 и р=0,57 соответственно).

Рис. 3. Распределение С044+/СБ24- популяции клеток в зависимости от принадлежности пациента к одной из молекулярных подгрупп РМЖ. По вертикали - процент пациентов, имеющих экспрессию. По горизонтали - оценка экспрессии СГ344+/С1324- по системе; О (нет экспрессии), I (слабая экспрессия), 2 (умеренная экспрессия), 3 (выраженная экспрессия), 4 (резко выраженная экспрессия).

СП44+/С1}24-

80-

1221 Лаоминальный А /Номинальный Б Базапьноподобыый

Экспрессия белка «Л-Crystallin

Экспрессию aB-Crystallin оценивали в нормальной ткани молочной железы, неинфильтрируклцих и инфильтрирующих формах РМЖ с учетом выделенных ранее подгрупп. В нормальном эпителии молочной железы aB-crystallin экспрессировался в 96% случаев в миоэпителиальном слое и в 1% случаев в эпителиальном. В 70% случаев неинвазивного и только в 14% случаев инвазивного РМЖ этот протеин экспресировался также в миоэпителиальном слое. В группе неинвазивных раков aB-Crystallin экспресировался в 60% случаев в базальноподобной подгруппе РМЖ и только в 5% случаев люминального подтипа А (р=0,001). В группе инвазивных раков aB-Crystallin экспрессировался в 81% случаев в базальноподобной подгруппе РМЖ и в 5% в люмннальиом подтипе А (р<0,001). Данные статистического анализа показали прямую корреляционную связь экспрессии протеина aB-Crystallin со степенью злокачественности (р=0,01) РМЖ. Полученные данные подтвердили тот факт, что экспрессия протеина aB-Crystallin наиболее выражена в инвазивных РМЖ подгруппы базальноподобных. Показано, что экспрессия этого протеина в раках in situ наиболее выражена в подгруппе базальноподобных. Полученные результаты позволяют считать, что aB-Crystallin может быть использован как прогностический маркер уже на ранних стадиях РМЖ, особенно у пациентов имеющих тройной негативный фенотип.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Роль врача-патологоанатома в постановке точного диагноза РМЖ остается ведущей. Более того, в эру индивидуализированной медицины и персонализированной терапии РМЖ диагностическое заключение патоморфолога определяет тактику, как хирурга, так и онколога. Современная высокопроизводительная технология анализа на тканевом уровне - технология ТМА позволяет российскому патологу получить информацию о нарушениях, лежащих в основе процессов развития и профессии опухоли. В представленной работе критически оценены современные данные о возможности применения ТМА метода в сочетании с ИГХ методом для более точной диагностики РМЖ. Разработаны практические рекомендации по улучшению качества изготовления ТМА блоков и срезов. Приведены экономические расчеты, показывающие преимущество использования данного метода. На основании применения данной

технологии исследована экспрессия молекулярно-биологических маркеров ER, PR, HER2, СК5/6, EGFR в РМЖ и проведена классификация всех исследованных РМЖ на молекулярные подтипы. В данной работе впервые сделана попытка изучить панель МБМ (/?-catenin, CD44,CD24, afí-crystallin) и их связь с молекулярными подтипами РМЖ. Особое внимание в работе уделено особенности экспрессии МБМ в базальноподобных раках. Полученные в ходе работы результаты показывают, что молекулярная подгруппа базальноподобного рака обогащена тетками с фенотипом CD44+/CD24-. Эти данные согласуются с данными литературы (Honeth G. и соавт., 2008) и могут свидетельствовать о происхождении раков этой группы из клеток ранних предшественников. Полученные данные свидетельствуют так же о том, что РМЖ, относящиеся к базалыюподобной подгруппе явно демонстрируют активацию Wnt//?-catenin сигнального пути. Цитоплазчатическая п ядерная аккумуляция белка /?-catenin в наших исследованиях наблюдалась более часто как в инвазивных, так и в неинвазивных раках, относящихся к подгруппе базальноподобных раков по сравнению со всеми другими молекулярными подгруппами. Более того, цитоплазматическая и ядерная аккумуляция белка /?-catenin показала прямую корреляционную связь с экспрессией других МБМ: ER-, PR~, EGFR+, СК5/6+. В инвазивных раках мололочной железы экспрессия белка P-catenin коррелировала с наличием клеток, имеющих CD44+/CD24- фенотип. Полученные нами данные согласуются с данными литературы (Woodward W.A. и соавт., 2005) о том, что активация Wnt//?-catenin сигнального пути является одним из ведущих механизмов в поддержании популяции стволовых опухолевых клеток в РМЖ. Данные по экспрессии белка aS-crystallin могут служить подтверждением того, что его повышенная экспрессия ведет к апоптотической резистентности и, как следствие, вносит немаловажный вклад в агрессивность раков базалыюподобной подгруппы.

Полученные в ходе работы результаты позволяют считать, что иммуногистохимическое определение МБМ с применением ТМА срезов может стать основополагающим в прогнозировании течения РМЖ и эффективности противораковой терапии. Только комплексный и экономически доступный подход может дать возможность по-новому решать проблему индивидуального лечения больных с РМЖ.

выводы

1. Активное внедрение в практику метода тканевых матриц в сочетании с методом иммуногистохимического исследования повышает качество диагностики рака молочной железы и улучшает качество лечения. Приведенные в работе экономические расчеты показывают возможность внедрения технологии тканевых матриц в современной морфологической диагностике рака молочной железы.

2. Предложенный стандартный протокол для обработки материала позволяет устранить существующие недостатки технологии тканевых матриц и уменьшить потерю тканевых образцов во время резки парафинового блока или обработки микропрепарата.

3. На основе иммуногистохимического анализа рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR), Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2), маркера базальных/миоэпителиальных клеток -цитокератинов 5/6 (СК 5/6), Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) выделены несколько подтипов РМЖ: люминальный тип А, люминальный тип Б, базалъноподобный тип, тип HER2+/ER-, неклассифицированный. Необходимость такой градации диктуется современным развитием молекулярной биологии и является необходимой при подборе индивидуальной терапии у пациентов с раком молочной железы. Повышение точности диагностики и понимание генеза тройных негативных (базальноподобных) раков молочной железы опухолей может быть достигнуто путем изучения экспрессии молекулярно-биологических маркеров: /?-catenin, аВ-crystallin, CD44, CD24.

4. Иерархический кластерный анализ удобен для использования при исследовании множественных биомаркеров и позволяет определить подтипы рака молочной железы при исследовании большой когорты пациентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки экспрессии множественных молекулярно-биологических маркеров в РМЖ необходимо использовать ИГХ в сочетании с ТМА технологией.

2. Для ИГХ определения молекулярных подтипов РМЖ необходимо учитывать экспрессию пяти молекулярно-биологических маркеров: ER, PR, HER2, EGFR, СК5/6.

3. При выявлении базальноподобного или тройного негативного рака целесообразно выполнение ИГХ теста с дополнительными МБМ: Д-Catenin, «В-crystallin, CD44, CD24.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Криволапое Ю.А., Храмцов А.И. Применение тканевых матриц в иммуногистохимии // Архив патологии. - 2005. -Т.67, №2. - С. 4850.

2. Храмцов А.И. Исянов Н.Н., Хоржевский В.А. Веб-кольцо патолого-анатомическнх сайтов в Интернете: компьютерно-опосредованная коммуникационная среда патоморфологов. // Архив патологии. - 2009. - Т. 71, №1. - С. 40-42.

3. Храмцов А.И., Храмцова Г.Ф. Применение тканевых матриц в исследовании молекулярных профилей рака молочной железы. 100-летие Российского общества патологоанатомов: Материалы Всероссийской конференции с международным участием (09-10 октября 2009 г.). - СПб, 2009. - С. 330-331.

4. Храмцов А.И., Храмцова Г.Ф., Хмельницкая Н.М. Технология тканевых матриц в современном диагностическом и научном исследовании. // Вопросы онкологии. - 2010. - Т.56, №2. - С. 240244.

5. Herschkowitz J.I., Simin К., Weigman V.J., Mikaelian I., Usary J., Hu Z., Rasmussen K.E., Jones L.P., Assefnfa S., Chandrasekharan S., Backlund M.G., Yin Y., Khramtsov A.I., Bastein R., Quackenbush J., Glazer R.I., Brown P.H., Green J.E., Kopelovich L., Furth P.A., Palazzo J.P., Olopade O.I., Bernard P.S., Churchill G.A., Van Dyke Т., Perou C.M. Identification of conserved gene expression features between murine mammary carcinoma models and human breast tumors. // Genome Biology. - 2007. - Vol.8 (5). - P.76.

6. Prosperi J.R., Valancius-Mangel V., Khramtsov A. I., Olopade O.I., Goss K.H. Modulation of the Wnt/p-calenin pathway is associated with the basal-like breast cancer phenotype. // Cancer Research. - 2009. - Vol. 69 (2 Supplement). - P. 4066.

7. Lubin G.P., Khramtsov A., Khramtsova G., Walmy Sveen E., Perou C.M., Huo D., Olopade O.I. aB-Crystallin expression across different

stages and subtypes of breast cancer analyzed using tissue microaxrays // Cancer Research. -2010. Vol. 70 (8 Supplement). - P. 1176. 8. Adeniji K.A., Huo D., Khramtsov A., Zhang C., Olopade O.I. Molecular profiles of breast cancer in Ilorin, Nigeria. // Journal of Clinical Oncology (Meeting Abstracts). - 2010. - Vol. 28. - P. 1602.

Список сокращений*

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ИГХ - иммуиогистохимическое исследование

МБМ - молекулярно-биологические маркеры

РМЖ - рак молочной железы

ТМА - тканевые матрицы

ТНРМЖ - тройной негативный РМЖ

ASCO - Американское общество клинической онкологии

САР - Коллегия американских патологов

С024-гликопротенн (белок клеточной адгезии)

CD44- гликопротеин (межклеточные взаимодействия, клеточная

адгезия)

EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, HERI) - рецептор

эпидермального фактора роста

ER - рецепторы эстрогена альфа (Estrogen receptor)

HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) - рецептор

эпидермального фактора роста 2

Vimentin - виментин (белок промежуточных филаментов мезодермального происхождения)

aB-crystallin - аЯ-кристаллин (протеин из семейства белков стресса) /?-Catenin - р-катении (белок входящий в комплекс клеточной адгезии)

PR-рецепторы прогестерона (Progesterone receptor)

СК-5/6 - цитокератины 5/6 (белки промежуточных филаментов

цитоскелета эпителиальных клеток)

*Для избежания неправильной трактовки и ошибок в интерпретации, названия протеинов, антител, инструментов и фирм производителей приведены как в русском, так и в их оригинальном англоязычном варианте.

Автор считает своим долгом выразить признательность вдохновителям работы к.м.н. Храмцовой Г.Ф., д.м.н., профессору Горделадзе A.C., д.м.н., профессору Смирнову O.A.; научному руководителю д.м.н., профессору Хмельницкой Н.М.; всем учреждениям, предоставившим возможность провести данное исследование и персонально - доктору, профессору Olufunmilayo I. Olopade, доктору, профессору Goss К.Н., доктору, профессору Pérou С.М., к.м.н. Чибисову В.Н. и д.м.н., профессору Криволапову Ю.А., к.б.н. Аникеевой Н.В.

Подписано в печать «25 » апреля 2011 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 73

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петерб>рг, Восстания, 1.

Оглавление диссертации Храмцов, Андрей Ильич :: 2011 :: Санкт-Петербург

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Краткая характеристика некоторых молекулярно- биологических маркеров, используемых в определении молекулярных подтипов рака молочной железы.

1.1.1. Рецепторы стероидных гормонов.

1.1.2. Рецепторы эпидермального фактора роста

1.1.3. Цитокератины.

1.2. Тканевые матрицы.

1.3. Анализ данных, полученных с применением ТМА.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Общая характеристика исследуемого материала.

2.2. Методика изготовления тканевых матриц.

2.2.1. Подготовка парафиновых блоков-доноров и соответствующих гистологических препаратов.

2.2.2. Планирование типа тканевой матрицы.

2.2.3. Создание карты расположения тканевых образцов с использованием программы Microsoft Excel.

2.2.4. Подготовка незаполненного блока-реципиента.

2.2.5. Построение тканевой матрицы.

2.2.6. Построение тканевой матрицы с применением инструмента TMAjr - Manual tissue arrayer.

2.2.7. Микротомия ТМА и прикрепление парафиновых срезов на предметные стекла.

2.3. Иммуногистохимическое исследование.

2.3.1. Двойное иммунное окрашивание.

2.3.2. Определение молекулярных подтипов рака молочной железы с использованием иммуногистохимического метода.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Изготовление ТМА.

3.1.1. Протокол построения парафинового ТМА блока и инструкция по проведению процедур.

Введение диссертации по теме "Патологическая анатомия", Храмцов, Андрей Ильич, автореферат

Актуальность темы исследования. Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди всех онкологических заболеваний у женщин и является одной из главных причин женской смертности во всем мире. По данным Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ), в мире каждый год регистрируется 1,1 млн. новых случаев заболевания. Ежегодно от РМЖ погибают более 411 тысяч женщин [61, 194]. Несмотря на активную разработку методов профилактики, диагностики и лечения, в структуре онкологической заболеваемости в России, РМЖ прочно удерживает первое место среди всех злокачественных новообразований. Статистические данные последних лет свидетельствуют о нарастающем темпе роста заболеваемости РМЖ и характеризуется большим разнообразием клинического течения: от агрессивного с бурным ростом, ранним и множественным метастазированием до относительно доброкачественного, с медленным ростом и поздним и редким метастазированием. Более того, инвазивный РМЖ является гетерогенной группой опухолей с широкой вариацией в отношении клинических проявлений, прогноза и морфологического спектра [8, 25, 201]. Проблема морфологической неоднородности РМЖ давно уже признана гистопатологами, которые прилагают многолетние усилия в разработке классификационных систем, учитывающих разнообразие этого рака [10, 95]. Классификация опухолей молочной железы, опубликованная ВОЗ, включает многочисленные гистологические формы. Большинство РМЖ представлено инвазивным протоковым раком, без дополнительных уточнений и составляет около 50-80% [193]. Около 25% инвазивных РМЖ представлены другими особыми гистологическими формами. Опухоли этой группы не всегда распознаются при гистологическом исследовании и могут быть ошибочно отнесены к группе инвазивного протокового рака. В настоящей системе гистологической классификации критерии определения степени злокачественности РМЖ несколько субъективны, результаты исследования не всегда воспроизводимы разными патоморфологами. Кроме того, классификация -не отражает внутриопухолевую гетерогенность и биологическую комплексность опухолей молочной железы. В настоящее время только морфологическая верификация патологического процесса, как злокачественного новообразования, недостаточна для индивидуального прогноза РМЖ [24, 38, 34]. Сегодня исследования в биохимии и молекулярной биологии открывают новые пути диагностики и терапии рака молочной железы. Определение молекулярно-биологических маркеров (МБМ) в ткани опухоли может дать дополнительную информацию о быстроте ее роста, способности к метастазированию, устойчивости к химиопрепаратам [2,7,21,26]. Характеризуя биологические особенности каждой конкретной опухоли, они могут помочь в прогнозировании исхода заболевания и в индивидуализации лечения [16,32]. Для изучения биологических свойств опухолей молочной железы в настоящее время широко используют технологию микрочиповых матриц. Благодаря этой технологии исследователи могут анализировать и сравнивать степень выраженности экспрессии генов в различных тканях. Эта технология позволила определить, что каждая опухоль имеет свой уникальный профиль экспрессии генов. С. Pérou и соавторы (2000) на основе генной экспрессии с использованием технологии микрочипов выявили несколько подтипов РМЖ: люминальный тип (А и Б), базальный тип, тип HER2+/ER—, тип с экспрессией нормального генного профиля [161, 188]. Количество показателей, рассматриваемых в качестве потенциальных МБМ при РМЖ, стремительно увеличивается, отражая достижения в области изучения механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки опухолевых клеток. Однако исследование профиля экспрессии с помощью микрочипов, содержащих пробы на тысячи и десятки тысяч генов, является дорогостоящим и трудоемким. Для широкого практического использования нужен наиболее простой и доступный метод определения МБМ. Таким методом может быть комбинация уже широко применяемого метода иммуногистохимии (ИГХ) в сочетании с новым методом тканевых матриц (ТМА). ИГХ, хотя и носит относительно субъективный полуколичественный характер, имеет важное достоинство, заключающееся в том, что при окрашивании срезов можно четко определить принадлежность МБМ к опухолевым клеткам, что практически невозможно при использовании других методов. Более того, этот метод позволяет проводить ретроспективные исследования и работать с архивным материалом - парафиновыми блоками, что делает его единственно возможным вариантом в тех случаях, когда необходимость исследования МБМ возникла или была осознана через длительное время после операции. Определение МБМ при РМЖ имеет два практических результата: выявление группы риска, требующей дополнительного лечения или более тщательного наблюдения среди больных ранними стадиями, либо оценка чувствительности к определенным видам терапии и индивидуализации схем лечения больных распространенным процессом. Изучение МБМ может быть использовано при разработке новых препаратов, направленно воздействующих на эти молекулы и блокирующих регулируемые ими процессы [7,22,23,33,35]. В настоящее время только три стандартных биомаркера используются в иммуногистохимической диагностике РМЖ: рецепторы эстрогена (ER) и прогестерона (PR), эпидермального фактора роста - Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) [6,12,13,14]. Однако большинство исследователей, занимающихся изучением РМЖ, на сегодняшний день сходятся во мнении, что для более точной постановки диагноза и подбора оптимального метода лечения этих данных недостаточно. В некоторых случаях опухоль негативна по всем трем маркерам, в связи, с чем данный подтип рака часто называют «трижды негативным» или тройным негативным РМЖ (ТНРМЖ) [129,180]. В последние годы данная группа опухолей молочной железы представляет интерес и вызывает ряд вопросов, поскольку является агрессивной по своим биологическим свойствам, характеризуюется высоким уровнем метастазирования и низкой выживаемостью по сравнению с другими подтипами РМЖ. В отношении тройного негативного фенотипа РМЖ не существует единого стандарта лечения [37]. Несмотря на плохой прогноз, ТНРМЖ чувствителен к стандартным химиотерапевтическим схемам, включая антрациклин и таксансодержащие схемы, однако некоторые опухоли у пациенток не отвечают на стандартную терапию. В настоящее время изучаются альтернативные химиотерапевтические препараты, такие как соединения платины, ингибиторы топоизомеразы, антиангиогенные и другие в неоадъювантном, адъювантном и лечебном режимах [35]. Взяв, за основу генетический экспрессионный профиль предложенный С. Pérou и соавторами (2000), группа североамериканских исследователей провела ИГХ анализ опухолей молочной железы используя панель из четырех антител: ER, HERI, HER2, и cytokeratin 5/6 и показала сильную прямую корреляционную связь между данными ИГХ и данными полученными при анализе экспрессии генов [153, 161]. Полученные ими результаты позволили рекомендовать эти маркеры для определения так называемой базальноподобной группы опухолей. Этими авторами было также показано, что для определения базальноподобной группы опухолей, кроме специфического СК5/6 маркера необходимо использовать также HERI (EGFR) поскольку этот биомаркер в большинстве случаев тройной негативной формы РМЖ является положительным и может использоваться в качестве мишени для таргетной терапии. Другими исследователями было показано, что примененная ими панель из пяти МБМ является более точной в отношении прогнозирования и диагностики, чем панель только из трех биомаркеров, применяемых в диагностике РМЖ [69].

Иммуногистохимическая панель, предложенная этими авторами включает следующие МБМ: ER, PR, HER2, EGFR, СК5/6. Добавленные два маркера ЕОРЯ и СК5/6 позволили авторам среди группы негативных по трем маркерам пациентов выделить группу пациентов имеющих наихудший прогноз и требующих поиска специфического лечения (БОБЯ и СК5/6 позитивные). В настоящее время, большинство исследователей отмечает, что хотя большинство ТНРМЖ являются базальноподобными [17,54,168,169,172] и большинство опухолей экспрессирующих базальные маркеры — трижды негативны [58,69,153,170,171], существует значительное количество тройных негативных раков, которые не экспрессируют базальных маркеров и небольшая, но статистически значимая группа базальноподобных раков, которая экспрессирует или гормональные рецепторы или НЕЯ2 [58,65,117,168,170,171,176].

Сегодня активно предпринимаются попытки определить молекулярный тип РМЖ с помощью ИГХ метода путем расширения панели МБМ [95], однако единый диагностический стандарт пока не разработан. Большинство проводящихся в настоящее время научных изысканий направлено на определение клеточного происхождения (из дифференцированных, менее дифференцированных, стволовых клеток) того или иного подтипа РМЖ [166]. В настоящей работе сделана попытка обобщить имеющиеся данные литературы по этой тематике и на основании собственных исследований предложить наиболее оптимальные методы решения данной проблемы.

Все выше изложенное и определяет актуальность данного исследования.

Цель исследования

Задачи исследования

1. Изучить данные современной литературы о возможностях использования ТМА в научной и практической деятельности врача РФ с учетом достоинств и недостатков этой технологии.

2. Экономически обосновать необходимость использования ТМА технологии в современной морфологической диагностике РМЖ.

3. Исследовать экспрессию прогностически значимых и таргетных (прицельных для терапии) молекулярно-биологических маркеров: рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR), Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2), маркера базальных/миоэпителиальных клеток — цитокератинов 5/6 (СК 5/6), Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), а также дополнительных МБМ (/?-Catenin, a¿?-crystallin, CD44, CD24) в опухолях молочной железы, используя ТМА технологию.

4. Определить, на основании полученных данных, доминирующие биологические подтипы рака молочной железы у исследуемой когорты пациентов, применив метод иерархического кластерного анализа.

Научная новизна

Впервые изучена панель МБМ (/?-Catcnin, aS-crystallin, CD44, CD24), связанных с базальноподобным или тройным негативным (ТНРМЖ) раком.

Проанализированы особенности экспрессии и взаимного влияния этих протеинов на прогрессию РМЖ.

Изучено прогностическое значение определения молекулярных подтипов РМЖ для выживаемости.

Практическая значимость

Основные положения, выносимые на защиту

1. Многолетний опыт собственных исследований и анализ современной научной литературы позволяют рекомендовать использование ТМА технологии в сочетании с ИГХ для широкого использования в научной и практической деятельности врача-патологоанатома.

2. Проведенный нами сравнительный анализ стоимости услуг на иммуногистохимические исследования базовых молекулярно-биологических диагностических маркеров РМЖ при использовании обычных подходов и расчет затрат на исследование при использовании технологии ТМА показывает явную экономическую выгоду последних.

4. Применение дополнительных молекулярно-биологических маркеров /?-Catenin, a5-crystallin, CD44, CD24 является обоснованным при диагностике базальноподобного РМЖ, так как позволяет более точно прогнозировать исход заболевания и индивидуально подбирать терапию.

5. Для анализа данных ИГХ исследования множественных МБМ наиболее удобным является метод иерархического кластерного анализа. Он быстро и наглядно позволяет определить доминирующие биологические подтипы рака молочной железы у исследуемой когорты пациентов.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Внедрение результатов исследования в практику

Теоретические положения работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре патологической анатомии им. O.K. Хмельницкого ГОУ ДПО СПб МАПО. Практические положения работы внедрены в диагностический процесс при постановке диагноза рака молочной железы в Ленинградском областном патологоанатомическом бюро.

Апробация материалов диссертации

Публикации

Структура и объем диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Определение базовых прогностических маркеров рака молочной железы с использованием технологии тканевых матриц"

выводы

3. На основе иммуногистохимического анализа рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR), Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2), маркера базальных/миоэпителиальных клеток - цитокератинов 5/6 (CK 5/6), Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) выделены несколько подтипов РМЖ: люминальный тип А, люминальный тип Б, базальноподобный тип, тип HER2+/ER-, неклассифицированный. Необходимость такой градации диктуется современным развитием молекулярной биологии и является необходимой при подборе индивидуальной терапии у пациентов с раком молочной железы. Повышение точности диагностики и понимание генеза тройных негативных (базальноподобных) раков молочной железы опухолей может быть достигнуто путем изучения экспрессии молекулярно-биологических маркеров: /?-catenin, aZ?-crystallin, CD44, CD24.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

2. Для ИГХ определения молекулярных подтипов РМЖ необходимо учитывать экспрессию пяти молекулярно-биологических маркеров: ЕЯ, РЛ, НЕЯ2, БвРЯ, СК5/6.

3. При выявлении базальноподобного или тройного негативного рака целесообразно выполнение ИГХ теста с дополнительными МБМ: /?-Са1епт, ссЯ-сгузЫНп, СВ44, СВ24.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Храмцов, Андрей Ильич

1. Аникеева Н.В. Роль рецепторов эстрогенов, прогестерона, андрогенов, онкобелка HER-2, антигена Ki-67 в прогнозе рака молочной железы: Дис. канд. биол. наук. СПб., 2006. - 138 с.

2. Аничков Н.М., Зиновьев А. Морфологические маркёры в диагностике опухолей. Новосибирск: Издательство Новосибирского унивеоситета, 1993. 132 с.

3. Берштейн Л.М., Ковалевский А.Ю., Ларионов A.A., Максимов С.Я., Волков О.Н. Ароматаза в нормальном и малигнизированном эндометрии // Акушерство и гинекология. 2001.- № 4. -С. 9-11.

4. Берштейн Л.М. Гормональный канцерогенез. СПб.: Наука, 2000. -199 с.

5. Берштейн Л.М. Онкоэндокринология: Традиции, современность и перспективы. СПб.: Наука, 2004.-343 с.

6. Вторушин В. Особенности экспрессии рецепторов половых гормонов при инфильтрирующем протоковом раке молочной железы: Автореф. дисс. канд. мед. наук. Томск. 2006. 23 с.

7. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы // Практическая онкология. 2002. -Т.З. -№1.- 39-40.

8. Головин Д.И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей. Ленинград: Медицина, 1982. - С. 186 -202.

9. Дугина В. Б., Ермилова В. Д., Чемерис Г. Ю., Чипышева Т. А. Актины и кератины в диагностике базальноподобного рака молочной железы человека//Архив патологии. -2010. Т.72, №2. - С. 12-15.

10. Ю.Ермилова В.Д. Роль современной патоморфологии в характеристике рака молочной железы // Практическая онкология. 2002. - Т.З, №1. - С. 15-20.

11. Иванов В.Г., Семиглазов В.Ф., Донских Р.В. Таргетная (целевая) терапия рака молочной железы. Миф или реальность. // Русский медицинский журнал.-2007. Т 15. № 14.- С. 1118-1122.

12. Имянитов E.H., Князев П.Г. Активация онкогена CERB-b-2 и прогноз течения рака молочной железы у человека // Вопросы онкологии. 1991.-Т.37. - № 5.- С. 527-534.

13. Карселадзе Д.А., Поддубная И.В., Карселадзе А.И. Морфология тройного негативного рака молочной железы // Архив патологии. 2010. - Т. 72, №2. -С.8-12.

14. Копнин Б.П. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров. Обзор. Электронный ресурс.: Российский Онкологический Портал. -2009. Режим доступа: http://www.rosoncoweb.rU/library/oncogene/01 .htm

15. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия.2000. Т.65,№1.-С.5-33.

16. Криволапов Ю.А., Храмцов А.И. Применение тканевых матриц в иммуногистохимии // Архив патологии. 2005. Т.61, №2. - С. 48-50.

17. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Современные возможности молекулярно-биохимических методов оценки биологического «поведения» рака молочной железы // Вестник РАМН. 2001.- №9.- С.65-70.

18. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., Любимова Н В. Биологические маркеры опухолей: методические аспекты и клиническое применение // Вестник Московского онкологического общества. — 2007. №1. С. 5-7.

19. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С., Овчинникова Л.К., Дигаева М.А., Воротников И.К., Давыдов М.И. Биологические маркеры опухолей в клинике достижения, проблемы, перспективы // Российский биотерапевтический журнал. -2009. Т. 8. № 3. - С. 95-102.

20. Мацко Д.Е., Шелихова К.В. Современные методы в практической онкоморфологии // Практическая онкология. 2007. Т.8, N 3. 1- С. 82-187.

21. Петров С.В., Мачадо И., Булычева И.В., Ногуэра Р., Пеллин А., Баччини П., Бертони Ф., Лломбарт-Бош А. Новые подходы в диагностике мелко-круглоклеточных опухолей костей и мягких тканей // Архив патологии. -2009. Т. 71, №1.- С. 34-40.

22. Рожкова Е.Б. Онкомаркеры папиллярного рака щитовидной железы. Автореф. дис. . канд. мед. наук. -М., 2007. 24 с.

23. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Прогностическое и предсказательное значение иммуногистохимических маркеров / Пожарисский K.M., Леенман Е.Е. / Под ред. Петрова C.B., Райхлина Н.Т.- Казань, 2004.- С. 310-329.

24. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Ермилова В.Д / Под ред. Петрова СВ., Райхлина Н.Т.- Казань. 2000. — С. 180-188.

25. Семиглазов В.Ф. Значение прогностических и предсказывающих факторов при выборе лечения у больных метастатическим раком молочной железы // Практическая онкология- 2000.- № 2,- 26-30.

26. Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Криворотько П.В.,Малодушева A.A., Коларькова В.В., Кочетов И.А., Шамина Е.А., Иванов В.Г.Биологически направленная (таргетная) терапия рака молочной железы // Русский медицинский журнал. 2007.-№25.-С.1912-1914.

27. Смольянников A.B., Хмельницкий O.K., Петленко В.П. Теоретические основы морфологического диагноза. Санкт-Петербург: СПбМАПО, 1995. -237 с.

28. Стенина М., Фролова М., Скрыпникова М., Тюляндин С. Базальноподобный (тройной негативный) рак молочной железы: молекулярные особенности, течение и возможные терапевтические подходы // Врач, 2010.-N 3.-С.24-28.

29. Филатов A.B. Гистологическая и цитологическая диагностика степени злокачественности различных вариантов рака молочной железы. Автореф. дис. .канд. мед. наук. -М., 2008. 24 с.

30. Хмельницкий O.K. Патоморф о логическая диагностика гинекологических заболеваний. Санкт-Петербург: СОТИС, 1994. - 477 с.

31. Хмельницкий O.K., Белянин B.JI. Возможности дифференциальной диагностики заболеваний шейки матки и влагалища на основе алгоритмизации гистологического исследования // Арх. патологии.-1981,T.XLIII, вып. 11,- С. 81-85.

32. Храмцов А.И. Исянов H.H., Хоржевский В.А. Веб-кольцо патолого-анатомических сайтов в интернете: компьютерно-опосредованная коммуникационная среда патоморфологов. // Архив патологии. 2009. -Т. 71, №1.-С. 40-42.

33. Abd El-Rehim D.M., Pinder S.E., Paish C.E., Bell J., Blarney R.W., Robertson J.F., Nicholson R.I., Ellis LO. Expression of luminal and basal cytokeratins in human breast carcinoma // The Journal of Pathology. 2004. - Vol. 203 (2). -P. 661-671.

34. Ahr A., Holtrich U., Solbach C., Scharl A., Strebhardt К., Karn Т., Kaufmann М. Molecular classification of breast cancer patients by gene expression profiling // The Journal of Pathology.- 2001. Vol. 195 (3). - P. 312-320.

35. Allred D.C., Harvey J.M., Berardo M., Clark G.M. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis // Modern Pathology.-1998.-Vol. 11 (2).-P. 155-168.

36. Aoyama A., Steiger R.H., Fröhli E., Schäfer R., von Deimling A., Wiestler O.D., Kiemenz R. Expression of alpha B-crystallin in human brain tumors // International Journal of Cancer. 1993. - Vol. 55 (5). - P. 760-764.

37. Babiker F.A., De Windt L.J., van Eickels M., Grohe C., Meyer R., Doevendans P.A. Estrogenic hormone action in the heart: regulatory network and function // Cardiovascular Research. 2002. - Vol. 53 (3). - P. 709-719.

38. Banerjee S., Reis-Filho J.S., Ashley S., Steele D., Ashworth A., Lakhani S.R., Smith I.E. Basal-like breast carcinomas: clinical outcome and response to chemotherapy // Journal of Clinical Pathology. 2006. - Vol. 59 (7). - P. 729735.

39. Battifora H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. // American Journal of Clinical Pathology. 1991.-Vol. 96 (5).-P. 669-671.

40. Battifora H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing // Laboratory Investigation. 1986. -Vol. 55 (2).-P. 244-248.

41. Bertucci F., Finetti P., Cervera N., Esterni B., Hermitte F., Viens P., Birnbaum D. How basal are triple-negative breast cancers? // International Journal of Cancer. 2008. - Vol. 123 (1). - P. 236-240.

42. Boecker W., Buerger H. Evidence of progenitor cells of glandular and myoepithelial cell lineages in the human adult female breast epithelium: a new progenitor (adult stem) cell concept // Cell Proliferation. 2003. - Vol. 36. -P.73-84.

43. Boyle P., Levin B. World Cancer Report. Lyon, France: IARC Press, 2008. -260 p.

44. Bravo R., Burckhardt J., Muller R. Persistence of the competent state in mouse fibroblasts is independent of c-fos and c-myc expression. // Experimental Cell Research. - 1985. - Vol.160. - P. 540-543.

45. Callagy G., Cattaneo E., Daigo Y., Happerfield L., Bobrow L.G., Pharoah P.D., Caldas C. Molecular classification of breast carcinomas using tissue microarrays // Diagnostic Molecular Pathology. 2003. - Vol. 12 (1). - P. 2734.

46. Camp R.L., Neumeister V., Rimm D.L. A decade of tissue microarrays: progress in the discovery and validation of cancer biomarkers // Journal of Clinical Oncology. 2008. - Vol. 26 (34). - P. 5630-5637.

47. Cheang M.C., van de Rijn M., Nielsen T.O. Gene expression profiling of breast cancer // The Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. -2008.-Vol.3.-P. 67-97.

48. Chelouche-Lev D., Kluger H.M., Berger A.J., Rimm D.L., Price J.E. alphaB-crystallin as a marker of lymph node involvement in breast carcinoma // Cancer. 2004. - Vol. 100 (12). - P. 2543-2548.

49. Chen W., Foran D.J. Advances in cancer tissue microarray technology: Towards improved understanding and diagnostics // Analytica Chimica Acta. 2006. - Vol. 564 (1). - P. 74-81.

50. Cui X., Schiff R., Arpino G., Osborne C.K., Lee A.V. Biology of progesterone receptor loss in breast cancer and its implications for endocrine therapy // Journal of Clinical Oncology. 2005. - Vol. 23 (30). - P. 7721-7735.

51. Cuzick J., Powles T., Veronesi U., Forbes J., Edwards R., Ashley S., Boyle P. Overview of the main outcomes in breast-cancer prevention trials // Lancet. -2003. Vol. 361 (9354). - P. 296-300.

52. Dabbs D.J., Chivukula M., Carter G., Bhargava R. Basal phenotype of ductal carcinoma in situ: recognition and immunohistologic profile // Modern Pathology.- 2006. Vol. 19 (11). - P. 1506-1511.

53. Datta S., Datta S. Comparisons and validation of statistical clustering techniques for microarray gene expression data // Bioinformatics. 2003. -Vol. 19 (4).-P. 459-466.

54. Datta S., Datta S. Evaluation of clustering algorithms for gene expression data // BMC Bioinformatics. 2006. - Vol. 7. - P. 1-9.

55. Dhir R. Tissue microarrays: an overview // Methods in Molecular Biology. -2008.-Vol. 441.-P. 91-103.

56. Dick J.E. Human stem cell assays in immune-deficient mice // Current Opinion in Hematology. 1996. - Vol. 3 (6). - P. 405-409.

57. DiVito K.A., Charette L.A., Rimm D.L., Camp R.L. Long-term preservation of antigenicity on tissue microarrays // Laboratory Investigation. 2004. -Vol. 84 (8).-P. 1071-1078.

58. Djabali K., de Nechaud B., Landon F., Portier M.M. AlphaB-crystallin interacts with intermediate filaments in response to stress // Journal of Cell Science. 1997. - Vol. 110. - Pt. 21. - P. 2759-2769.

59. Downward J., Parker P., Waterfield M.D. Autophosphorylation sites on the epidermal growth factor receptor // Nature. 1984. - Vol. 311. - P. 483-485.

60. Egervari K., Szollosi Z., Nemes Z. Tissue microarray technology in breastcancer HER2 diagnostics // Pathology Research and Practice. 2007. - Vol. 203 (3).-P. 169-177.

61. Eisen M.B., Spellman P.T., Brown P.O., Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -1998. Vol. 95 (25). -P. 14863-14868.

62. Elston C.W. The assessment of histological differentiation in breast cancer // Australian and New Zealand Journal of Surgery.-1984. Vol. 54.- P. 11-15.

63. Elston C.W., Ellis I.O. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up // Histopathology. 2002. - Vol. 41 (3A). - P. 154-161.

64. Gadkar-Sable S., Shah C., Rosario G., Sachdeva G., Puri C. Progesterone receptors: various forms and functions in reproductive tissues // Frontiers in Bioscience. 2005. - Vol. 10. - P. 2118-2130.

65. Geyer F.C., Marchio C., Reis-Filho J.S. The role of molecular analysis in breast cancer // Pathology. 2009. -Vol. 41 (1). - P. 77-88.

66. Gillett C.E., Springall R.J., Barnes D.M., Hanby A.M. Multiple tissue core arrays in histopathology research: a validation study // The Journal of Pathology. 2000. - Vol. 192 (4). - P. 549-553.

67. Graus-Porta D., Beerli R.R., Daly J.M., Hynes N.E. ErbB-2, the preferred heterodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling // The European Molecular Biology Organization EMBO Journal. -1997.-Vol. 16 (7).-P. 1647-1655.

68. Gullick W.J., Srinivasan R. The type 1 growth factor receptor family: new ligands and receptors and their role in breast cancer // Breast Cancer Research and Treatment. 1998. - Vol. 52 (1-3). - P. 43-53.

69. Gulmann C., Loring P., O'Grady A., Kay E. Miniature tissue microarrays for HercepTest standardisation and analysis // Journal of Clinical Pathology. -2004.-Vol. 57 (11).-P. 1229-1231.

70. Hartigan J.A. Clustering Algorithms, New York: John Wiley & Sons, Inc., 1975.- 351 p.

71. Henson D.E. Loss of p53-immunostaining intensity in breast cancer // Journal of the National Cancer Institute. 1996. - Vol. 88 (15). - P. 10151016.

72. Hewitt S.M. Design, construction, and use of tissue microarrays. Methods in Molecular Biology. 2004. - Vol. 264. - P. 61-72.

73. Hidalgo A., Pina P., Guerrero G., Lazos M., Salcedo M. A simple method for the construction of small format tissue arrays // Journal of Clinical Pathology. 2003. - Vol. 56 (2). - P. 144-146.

74. Honeth G., Bendahl P.O., Ringner M., Saal L.H., Gruvberger-Saal S.K., Lovgren K., Grabau D., Ferno M., Borg A., Hegardt C. The CD44+/CD24-phenotype is enriched in basal-like breast tumors // Breast Cancer Research. — 2008.-Vol.10 (3),R53.-P. 1-12.

75. Hoos A., Cordon-Cardo C. Tissue microarray profiling of cancer specimens and cell lines: opportunities and limitations // Laboratory Investigation. -2001.-Vol. 81 (10).-P. 1331-1338.

76. Huo D., Ikpatt F., Khramtsov A., Dangou J.M., Nanda R., Dignam J., Zhang B., Grushko T., Zhang C., Oluwasola O., Malaka D., Malami S., Odetunde A.,

77. Iwao K., Matoba R., Ueno N., Ando A., Miyoshi Y., Matsubara K., Noguchi S., Kato K. Molecular classification of primary breast tumors possessing distinct prognostic properties // Human Molecular Genetics. — 2002. Vol. 112..-P. 199-206.

78. Jarasch E.D., Nagle R.B., Kaufmann M., Maurer C., Bocker W.J. Differential diagnosis of benign epithelial proliferations and carcinomas of the breast using antibodies to cytokeratins // Human Pathology. 1988. - Vol. 193.. P. 276-289.

79. Karimi-Busheri F., Rasouli-Nia A., Mackey J.R., Weinfeld M. Senescence evasion by MCF-7 human breast tumor-initiating cells // Breast Cancer Research.-2010.-Vol. 12 (3), R31 -P. 1-16.

80. Kraaz W., Risberg B., Hussein A. Multiblock: an aid in diagnostic immunohistochemistry // Journal of Clinical Pathology. 1988. - Vol. 41 (12).-P. 1337.

81. Lerma E., Barnadas A., Prat J. Triple negative breast carcinomas: similarities and differences with basal like carcinomas // Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 2009. - Vol. 17 (6). - P. 483-494.

82. Li C., Heidt D.G., Dalerba P., Burant C.F., Zhang L., Adsay V., Wicha M., Clarke M.F., Simeone D.M. Identification of pancreatic cancer stem cells // Cancer Research. 2007. - Vol. 67 (3). - P. 1030-1037.

83. Mao Y.W., Liu J.P., Xiang H., Li D.W. Human alphaA- and alphaB-crystallins bind to Bax and Bcl-X(S) to sequester their translocation during staurosporine-induced apoptosis // Cell Death & Differentiation. 2004. -Vol. 11 (5).-P. 512-526.

84. Montgomery K., Zhao S., van de Rijn M., Natkunam Y. A novel method for making "tissue" microarrays from small numbers of suspension cells //

85. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 2005. - Vol. 13 (1).-P. 80-84.

86. Moskaluk C.A., Stoler M.H. Agarose mold embedding of cultured cells for tissue microarrays // Diagnostic Molecular Pathology. 2002. - Vol. 11 (4). — P. 234-238.

87. Packeisen J., Buerger H., Krech R., Boecker W. Tissue microarrays: a new approach for quality control in immunohistochemistry // Journal of Clinical Pathology. -2002. Vol. 55 (8). - P. 613-615.

88. Parcellier A., Schmitt E., Brunei M., Hammann A., Solary E., Garrido C. Small heat shock proteins HSP27 and alphaB-crystallin: cytoprotective and oncogenic functions // Antioxidants & Redox Signaling. — 2005. — Vol. 7 (3-4).-P. 404-413.

89. Pechoux C., Gudjonsson T., Ronnov-Jessen L., Bissell M.J., Petersen O.W. Human mammary luminal epithelial cells contain progenitors to myoepithelial cells // Deveopmental Biology. 1999. - Vol. 206 (1). - P. 88-99.

90. Pedersen K.B., Nesland J.M., Fodstad 0., Maelandsmo G.M. Expression of S100A4, E-cadherin, alpha- and beta-catenin in breast cancer biopsies // British Journal of Cancer.- 2002. -Vol. 87 (11).-P. 1281-1286.

91. Petrosyan K., Press M.F. Multispecimen tissue blocks in pathology: an improved technique of preparation // Laboratory Investigation. 1997. - Vol. 77 (5).-P. 541-542.

92. Pettersson K., Gustafsson J.A. Role of estrogen receptor beta in estrogen action // Annual Review of Physiology. 2001. - Vol 63. - P. 165-192.

93. Phillips T.M., McBride W.H., Pajonk F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation // Journal of the National Cancer Institute. 2006. - Vol. 98 (24). - P. 1777-1785.

94. Prat A., Perou C.M. Mammary development meets cancer genomics // Nature Medicine. 2009. - Vol. 15 (8). - P. 842-844.

95. Radhakrishnan R., Solomon M., Satyamoorthy K., Martin L.E., Lingen

96. M.W. Tissue microarray a high-throughput molecular analysis in head and neck cancer. Journal of Oral Pathology & Medicine. - 2008. - Vol. 37 (3). -P. 166-176.

97. Rakha E.A., El-Sayed M.E., Green A.R., Lee A.H., Robertson J.F., Ellis I.O. Prognostic markers in triple-negative breast cancer // Cancer. 2007. - Vol. 109(1).-P. 25-32.

98. Rakha E.A., Reis-Filho J.S., Ellis I.O. Basal-like breast cancer: a critical review // Journal of Clinical Oncology. 2008. - Vol. 26 (15). - P. 25682581.

99. Rakha E.A., Reis-Filho J.S., Ellis I.O. Impact of basal-like breast carcinoma determination for a more specific therapy // Pathobiology. 2008. - Vol. 75 (2).-P. 95-103.

100. Rakha E.A., Tan D.S., Foulkes W.D., Ellis I.O., Tutt A., Nielsen T.O., Reis-Filho J.S. Are triple-negative tumours and basal-like breast cancer synonymous? // Breast Cancer Research. 2007. - Vol. 9 (6). - P. 404.

101. Reiner A., Neumeister B., Spona J., Reiner G., Schemper M., Jakesz R. Immunocytochemical localization of estrogen and progesterone receptor and prognosis in human primary breast cancer // Cancer Research. 1990. - Vol. 50 (21).-P. 7057-7061.

102. Reya T., Morrison S.J., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells // Nature. 2001. - Vol. 414 (6859). - P. 105-111.

103. Ross J.S. Multigene classifiers, prognostic factors, and predictors of breast cancer clinical outcome // Advances in Anatomic Pathology. 2009. - Vol. 16 (4).-P. 204-215.

104. Saldanha A.J. Java Treeview-extensible visualization of microarray data // Bioinformatics. 2004. - Vol. 20 (17). - P. 3246-3248.

105. Saunders P.T. Oestrogen receptor beta (ER beta) // Reviews of Reproduction. 1998. - Vol. 3 (3). - P. 164-171.

106. Schneider B.P., Winer E.P., Foulkes W.D., Garber J., Perou C.M., Richardson A., Sledge G.W., Carey L.A. Triple-negative breast cancer: riskfactors to potential targets // Clinical Cancer Research. 2008. - Vol. 14 (24). -P. 8010-8018.

107. Schoenberg Fejzo M., Slamon D.J. Frozen tumor tissue microarrayitechnology for analysis of tumor RNA, DNA, and proteins // The American Journal of Pathology. 2001. - Vol. 159 (5). - P. 1645-1650.

108. Schweizer M.S., Schumacher L., Rubin M.A. Constructing tissue microarrays for research use // Current Protocols in Human Genetics. 2004. Chapter 10: Unit 10.7.

109. Simon R., Sauter G. Tissue microarrays for miniaturized high-throughput molecular profiling of tumors // Experimental Hematology. 2002. - Vol. 30 (12).-P. 1365-1372.

110. Simpson E.R. Aromatization of androgens in women: current concepts and findings // Fertility and Sterility. 2002. - Vol. 77. - P. 6-10.

111. Speroff L., Glass R.H., Kase N-.G. Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility. Baltimore.: Lippincott, Williams & Wilkins, 1999. P. 425-426

112. Takashi M., Katsuno S., Sakata T., Ohshima S., Kato K. Different concentrations of two small stress proteins, alphaB crystallin and HSP27 in human urological tumor tissues // Urological Research. 1998. - Vol. 26 (6). -P. 395-399.

113. Tavassoli F.A., Devilee P. Pathology and Genetics Tumours of the Breast and Female Genital Organs: IARC Press- Lyon. 2003. - P. 9-110;

114. The global burden of disease: 2004 update. Geneva. : World Health Organization, 2008.- 150 p.195. van de Rijn M., Perou C.M., Tibshirani R., Haas P., Kallioniemi O., Kononen J., Torhorst J., Sauter G., Zuber M., Kochli O.R., Mross F., Dieterich

115. Wan W.H., Fortuna M.B., Furmanski P. A rapid and efficient method for testing immunohistochemical reactivity of monoclonal antibodies against multiple tissue samples simultaneously // Journal of Immunological Methods. -1987.-Vol. 103 (l).-P. 121-129.

116. Wang H., Wang H., Zhang W., Fuller G.N. Tissue microarrays: applications in neuropathology research, diagnosis, and education // Brain Pathology. -2002. Vol. 12 (1). - P. 95-107.

117. Witton C.J., Reeves J.R., Going JJ, Cooke TG, Bartlett JM. Expression of the HER1-4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer // The Journal of Pathology. 2003. - Vol. 200 (3). - P.290-297.

118. Wong S.C., Lo S.F., Lee K.C., Yam J.W., Chan J.K., Wendy Hsiao W.L. Expression of frizzled-related protein and Wnt-signalling molecules in invasive human breast tumours // The Journal of Pathology. 2002. - Vol. 196 (2).-P. 145-153.

119. Woodward W.A., Chen M.S., Behbod F., Rosen J.M. On mammary stem cells // Journal of Cell Science. 2005. - Vol. 118. - Pt 16. - P. 3585-3594.

120. Yaghmaie F., Saeed O., Garan S.A., Voelker M.A., Sternberg H., Timiras P.S. Estrogen receptor-alpha immunoreactivity in the arcuate hypothalamus of young and middle-aged female mice // Neuroendocrinology Letters. 2010. -Vol.31 (1).-P. 15.

121. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2001. - Vol. 2. - P. 127-137

122. Zhang Z., Stiegler A.L., Boggon T.J., Kobayashi S., Halmos B. EGFR-mutated lung cancer: a paradigm of molecular oncology // Oncotarget. 2010. -Vol. 1 (7).-P. 497-514.

Автореферат диссертации по медицине на тему Определение базовых прогностических маркеров рака молочной железы с использованием технологии тканевых матриц

Оглавление диссертации Храмцов, Андрей Ильич :: 2011 :: Санкт-Петербург

Введение диссертации по теме "Патологическая анатомия", Храмцов, Андрей Ильич, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Храмцов, Андрей Ильич

Похожие научные работы

Каталог диссертаций