Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Онкопротекторное действие некоторых антиоксидантов на модели экспериментального канцерогенеза

На правах рукописи

Харитонов Сергей Викторович

ОНКОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТОВ НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА

14.00.15. - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск и в НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ, г. Санкт - Петербург.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор H.A. Плотникова Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Ермилов

доктор медицинских наук, профессор И.С. Дерижанова

Ведущая организация - Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова.

Защита диссертации состоится «_»_2005г. в «_» часов

на заседании диссертационного совета Д.084.54.02 при Волгоградской государственной медицинской академии (400066, г. Волгоград, площадь Павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «_»_2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор

С.И. Зайченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К числу наиболее значимых направлений современной медицины относятся исследования закономерностей канцерогенеза и фармакологической коррекции развития злокачественных новообразований (Анисимов В.Н., 2000).

В настоящее время достаточно интересной и научно обоснованной является свободнорадикальная теория канцерогенеза, согласно которой при физиологических условиях синтез свободных радикалов отвечает требованиям метаболизма, обеспечивающего нормальную жизнедеятельность клеток. При избыточном образовании в организме свободных радикалов, не соответствующим физиологическим потребностям, реализуется их альтеративное воздействие (Бобырев В.Н.,1994). В клетке происходит нарушение регуляторных и защитных функций. Внедряясь в билипидный слой цитолеммы, свободные радикалы инициируют реакции перекисного окисления липидов, что приводит к повреждению мембран, нарушению их функций и к неопластической трансформации (Андарханов Б.В., 1988).

В организме существует многокомпонентная система, предотвращающая свободнорадикальные процессы и защищающая его от продуктов метаболизма в подобных реакциях (Гавриленко Г.А., 1991). Естественные антиоксиданты регулируют процессы перекисного окисления липидов и не дают свободным радикалам накапливаться в организме. Однако, естественная антиоксидантная система часто оказывается недостаточно эффективной, вследствие чего клетки подвергаются окислительному стрессу, что влечет за собой повышенный риск опухолевого роста (Анисимов В.Н., 2000).

Решить данную проблему помогает использование антиоксидантов экзогенного происхождения. Большое внимание в последнее время отводится производным 3-оксипиридина (мексидол, эмоксипин, проксипин). В основе их ан-тиоксидантного действия лежит способность ингибировать стадию инициации свободной радикальной реакции, тем самым снижая возможность неоплазии (Кольтовер В.К., 1998).

В частности, в доступной литературе сведения об онкопротекторном действии антиоксидантов при использовании препаратов с выраженным канцерогенным эффектом представлены не в полном объеме (Зиганшина Л.Е. 1992).

В связи с этим проблема коррекции антиоксидантами опухолевого роста в условиях экспериментального (уретановая модель) канцерогенеза приобретает особую актуальность.

Данная работа является разделом комплексного исследования, выполняемого в рамках Всероссийской программы «Изучение антиканцерогенного действия антиоксидантов. Использование антиоксидантов с целью лечения онкологических заболеваний и профилактики побочных эффектов химиотерапии злокачественных опухолей». Номер государственной регистрации 01200004102.

Цель работы - изучение онкопротекторного действия различных групп антиоксидантов на уретановой модели экспер еза.

Задачи исследования:

1. Теоретическое обоснование возможности использования антиокси-дантов в качестве онкопротекторов.

2. Оценка динамики биохимических показателей крови: эритроцитов и плазмы при использовании антиоксидантов на уретановой модели экспериментального канцерогенеза.

3. Морфологическое изучение антиканцерогенного действия естественного антиоксиданта а-токоферола и производных 3-оксипиридина - мекси-дола и эмоксипина.

4. Определение оптимальных доз препаратов для выявления наибольшего антиканцерогенного эффекта с учетом динамики изменений морфологических критериев.

Научная новизна.

В настоящей работе впервые проведено исследование антиканцерогенного действия естественного антиоксиданта а-токоферола и синтетических производных 3-оксипиридина - мексидола и эмоксипина на уретановой модели экспериментального канцерогенеза.

Показано достоверное снижение абсолютного числа новообразований (аденом) легких при использовании в эксперименте естественных и синтетических антиоксидантов.

Произведена сравнительная оценка антиканцерогенного эффекта естественных (а-токоферол) и синтетических (мексидол и эмоксипин) антиоксидантов на модели экспериментального канцерогенеза.

Представлена морфологическая характеристика изменений при использовании разных доз препаратов на уретановой модели аденом легкого.

В работе дана оценка динамики биохимических показателей эритроцитов и плазмы при использовании антиоксидантов в условиях экспериментального канцерогенеза.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные подтверждают онкопротекторный эффект антиоксидантов в условиях экспериментального канцерогенеза.

Результаты данной работы подтверждают целесообразность дальнейших клинических исследований в этой области с целью возможного использования естественных и синтетических антиоксидантов в профилактике и комплексном лечении неоплазий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Естественные и синтетические антиоксиданты обладают достоверным онкопротекторным действием в условиях экспериментального канцерогенеза.

2. Изученные антиоксиданты оказывают позитивное влияние на биохимические показатели перекисного окисления липидов.

и 4 , -у' ;

•- 2

б- .» - -

3. Применение антиоксидантов в качестве онкопротекторов сопровождается положительной динамикой морфологических критериев канцерогенного воздействия уретана.

4. Выраженность антиканцерогенного эффекта зависит от доз используемых препаратов.

Апробация работы.

Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва 2001г.), на Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы». (Москва, 2003г.), на 58 межрегиональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2003г.), на Международном экологическом Форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (С.-Петербург, 2003г.), на научной конференции, посвященной 50-летию Республиканской клинической больницы МЗ Татарстана (Казань, 2003г.), на XXXII научной конференции «Огаревские чтения» (Саранск 2004г.).

Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 в центральной печати.

Реализация и внедрение результатов исследования.

Работа выполнена в ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева», г. Саранск и в НИИ онкологии им проф. H.H. Петрова МЗ РФ, г. Санкт - Петербург.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедрах онкологии, фармакологии и курсе патологической анатомии Мордовского госуниверситета. Разработанные методики используются в ходе дальнейших научных исследований лаборатории экспериментального канцерогенеза (г. Саранск) в рамках комплексного изучения различных аспектов онкоморфологии.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего в себя 224 научных источника, в том числе 92 иностранных. Текст диссертации изложен на 114 страницах машинописного текста, документирован 4 таблицами, 4 диаграммами, иллюстрирован 38 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач были проведены экспериментальные исследования на 200 нелинейных белых мышах массой 18-20 граммов. Экспериментальные животные находились в стандартных условиях содержания в виварии.

Всего выполнено 10 серий опытов, в которых изучалось влияние антиок-сидантов на фоне уретановой модели экспериментального канцерогенеза. Группа интактных мышей составляла 40 особей. Исследуемые антиоксиданты вводились белым мышам внутримышечно ежедневно в течение 4 месяцев со дня начала эксперимента, дозы изучаемых антиоксидантов определены по принципу изоэффективности (Табл.1).

Таблица 1.

Характеристика экспериментальных исследований

Уретановая Вид живот- Доза вводи- Время экспозиции Кол-во жи-

модель ных мых препаратов (месяц) вотных

1 серия

Интактные Мыши - - 40

2 серия

Контроль (уретан) Мыши 1г/кг однократно 40

3-4 серии

Уретан + Мыши 50мг/кг 4 20

а-токоферол

Уретан + Мыши 25мг/кг 4 20

а-токоферол

5-7 серии

Уретан + Мыши 5мг/кг 4 13

эмоксипин

Уретан + Мыши 0,5мг/кг 4 13

эмоксипин

Уретан + Мыши 0,05мг/кг 4 14

эмоксипин

8-10 серии

Уретан+ Мыши 10мг/кг 4 13

мексидол

Уретан + Мыши 1мг/кг 4 13

мексидол

Уретан + Мыши 0,1мг/кг 4 14

мексидол

Всего животных 200

1-я серия представлена интактными мышами, которые находились в стандартных условиях содержания.

Во 2-й серии (контрольной) проводили моделирование опухолей легких на белых мышах путем однократного внутрибрюшинного введения уретана в дозе 1 г/кг.

В 3-4-й сериях изучали влияние а-токоферола в дозах 50мг/кг и 25мг/кг на инициированный уретаном процесс канцерогенеза.

В 5-7-й сериях исследовали влияние эмоксипина в дозах 5 мг/кг, 0,5 мг/кг и 0,05 мг/кг в условиях эксперимента.

В 8-10-й сериях изучали влияние мексидола в дозе 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг на уретановой модели канцерогенеза.

Материалом исследования являлись легкие и кровь белых мышей.

Ткань легкого фиксировали в жидкости Карнуа в течение 5 минут, затем в 10% растворе формалина в течение 5 суток. В ткани легких считали число аденом с помощью бинокулярной лупы МВ8-9 2x8, определяли средние размеры опухолевых узлов.

О состоянии перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по уровню МДА, Ре-МДА и активности каталазы в эритроцитах и плазме крови.

Оценка морфологических изменений производилась с применением традиционной световой микроскопии и иммуногистохимического методов исследования.

Содержание МДА в крови и плазме определяли по методу Конюховой С.Г. (1989). Метод определения МДА основан на его реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в кислой среде. К 0,8 мл воды добавляют 0,2 мл исследуемой среды и 1 мл 6% тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и помещают на 30 минут в водяную баню (температура 100°С). Затем охлаждают до приобретения раствором желто-розового цвета и добавляют 1 мл 5н №ОН и 2 мл изопропа-нола, закрывают пробкой и встряхивают. Центрифугируют 20 минут при 6-8 тыс. об/мин. Измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540-590 нм. Расчет ведут по формуле: МДА = (Е^«, - ЕяюЭхЮб + 0,81 (ммоль/л), где Е-10 - экстинкция пробы при длине волны 540 нм, Е590 - экстинкция пробы при длине волны 590 нм.

Содержание Ре-индуцированного МДА в плазме и эритроцитах определяли следующим образом. К 1 мл сульфата железа (46,3мг на 50 мл дистиллированной воды) добавляли 0,2 мл исследуемой среды и 0,2 мл аскорбиновой кислоты (3 мг на 1 мл физиологического раствора). После этого 1 час инкубировали и добавляли 1 мл 6% ТБК и помещали на 30 минут в водяную баню (температура 100°С), в дальнейшем методика аналогична методике определения МДА.

Активность каталазы в изучаемых средах определяли по методу М.А. Ко-ролюк (1988). Принцип метода основан на реакции перекиси водорода с мо-либденовокислым аммонием в неокрашенных или слабоокрашенных растворах. К 0,1 мл изучаемой среды добавляют 2 мл 0,03% раствора перекиси водорода и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 1 мл 4% молибдата аммония и встряхивают. Контроль готовят следующим образом: к 2 мл 0,03% раствора перекиси водорода добавляют 0,1 мл дистиллированной воды. Центрифугируют опытную пробу 15 минут при 8 тыс. оборотов, (контроль можно не центрифугировать). Измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 400 нм опытные и контрольные пробы.

Расчет производится по формуле: А = (Ест - Еоп)х1,33 (мкКат/л), где А - активность каталазы в микрокаталах на 1 литр, ЕС| - экстинкция стандарта, Еоп - экстинкция опыта.

Оценка морфологических изменений ткани легкого производилась традиционным светооптическим методом. Ткань легкого фиксировали в жидкости Карнуа в течение 5 минут, затем в 10% растворе формалина в течение 5 суток. Фиксированные образцы после промывки в проточной воде, подвергались обезвоживанию путем помещения исследуемого материала в спирты возрастающей концентрации. После дегидратации материал по общепринятой методике заливали в парафин, а затем на санном микротоме получали срезы, окрашивали их гематоксилином и эозином. Гистологические препараты исследовали в световом микроскопе. Результаты биохимических и морфологических исследований обрабатывали статистически на компьютере Pentium ГУ с помощью программы "Биостат". Достоверность различий величин оценивали, используя t-критерий Стьюдента. Обработка микрофотографий осуществлялась с помощью программы Adobe Photoshop 7.0.

Иммуиогистохимическое исследование производилось авидин-биотиновым методом. Методика приготовления срезов из парафинового блока для иммуногистохимии аналогична традиционному их изготовлению для гистологической окраски. Производилось депарафинирование срезов. Гистологические препараты помещали в 3% водный раствор перекиси водорода на 20 мин. для угнетения собственной пероксидазы. Кипятили срезы в цитратном буфере в течение 40 мин. и промывали в 2 сменах дистиллированной воды, и в 2 сменах трис NaCl- буфера по 5 мин.

Инкубировали с первичными антителами (мульти-цитокератин, цитоке-ратин № 8, ЭМА) 1ч. в термостате при 37°С. Промывали в 2 сменах трис NaCl буфера по 5 мин. Инкубировали со вторыми (биотинилированными) антителами 30 мин. Промывали в 2 сменах трис NaCl буфера по 5 мин. Инкубировали с авидин (стрептавидин) - биотин-пероксидазным комплексом ЗОмин. Промывали в 2 сменах трис NaCl буфера и в 2 сменах дистиллированной воды по 5 мин. Проводили реакцию с ДАБ. Докрашивали гематоксилином Майера 1мин. Промывали водой и производили дегидратацию со спиртами возрастающей крепости. Просветление срезов осуществляли в органических растворителях (карбо-ле, скипидаре). Срезы заключали в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе проведенных исследований оценивали динамику биохимических показателей крови и морфологических изменений легочной ткани во всех группах экспериментальных животных

Одним из механизмов реализации канцерогенного эффекта уретана являются показатели перекисного окисления липидов. В эксперименте была исследована динамика активности ПОЛ при использовании различных доз антиокси-дантов.

Оценку проводили по содержанию в плазме крови и эритроцитах одного из конечных продуктов свободнорадикальной реакции липопереокисления -малонового диальдегида (Лобаков А.И. и др., 1995), уровень которого используется для определения тяжести патологических изменений (Рослый И.М., 1994; Сюрин С.А., 1997). Дополнительно изучали показатели одного из промежуточных продуктов перекисного окисления липидов - Ре-индуцированного МДА (Рис 1), а также активность каталазы, как показателя протекторных свойств клетки.

Результаты исследования биохимических показателей представлены в таблицах 2,3.

Таблица 2.

Показатели МДА и Бе МДА в плазме и эритроцитах крови белых мышей при использовании антиоксидантов в разных дозах (М±т)

Группа МДА Ре-МДА

плазма М±т эритроциты М±ш плазма М±ш эритроциты М±ш

Интактные жи- 1,44+0,02 12,82+0,17 3,90±0,05 20,62±1,6

вотные

Контрольная уре-тановая группа 1г/кг 4,7±0,02 р<0,05 18,3±0,12 р,<0,05 7.6±0,21 р(<0,05 22,1 ±1,92 р,>0,05

Уретан+ а- 3,15±0,15 12,6±0,26 6,26±0,07 21,7±3,3

токоферол в дозе 50мг/кг Р1<0,05 Р1<0,05 р(>0,05 р1>0,05

Уретан+ а- 2,75±0,03 12,51 ±0,23 5,85±0,61 19,3+0,87

токоферол в дозе 25мг/кг. Р1<0,05 р1<0,05 р,>0,05 Р1>0,05

Уретан+ Эмокси- 3,1 ±0,03 12,42±0,19 5,25±0,05 19,0±2,3

пин 5,0мг/кг. Р1<0,05 Р|<0,05 Р1<0,05 Р1>0,05

Уретан+ Эмокси- 2,8±0,02 12,37±0,21 5,7±0,07 19,3±0,69

пин 0,5мг/кг. р,<0,05 Р|<0,05 р,>0,05 Р1>0,05

Уретан+ Эмокси- 1,46±0,14 12,01 ±0,07 5,81 ±0,09 18,9±0,97

пин 0,05мг/кг. Р1<0,05 р,<0,05 р,>0,05 Р1>0,05

Уретан+ Мекси- 2,95±0,02 12,30*0,21 5,49±0,04 19,2±0,91

дол 10,0мг/кг. р1<0,05 р1<0,05 Р| <0,05 р,>0,05

Уретан+ Мекси- 2,1+0,01 12,27±0,19 5,73±0,07 19,1 ±0,84

дол 1,0мг/кг. р,<0,05 Р) <0,05 Р1>0,05 Р1>0,05

Уретан+ Мекси- 1,32±0,04 11,91±0,06 5,86±0,06 17,2±0,92

дол 0,1мг/кг. р,<0,05 Р1<0,05 р,>0,05 Р1>0,05

Р- достоверность по отношению к группе интактных животных р<0,05. Рг достоверность по отношению к контролю р<0,05.

По сравнению с интактными в группе контрольных животных отмечалось достоверное увеличение содержания МДА с 1,44±0,02 мкмоль/л до 4,7±0,02 мкмоль/л (р<0,05) в плазме крови и с 12,82±0,17 мкмоль/л до 18,3±0,12 мкмоль/л (р<0,05) в эритроцитах.

При использовании естественного антиоксиданта а-токоферола динамика показателей МДА в плазме изменялась в зависимости от применяемых доз. В дозе 50 мг/кг наблюдали менее значительное снижение показателей - 3,15±0,15 мкмоль/л (р<0,05); в дозе 25 мг/кг происходило снижение содержания МДА в плазме до 2,75±0,03 мкмоль/л (р <0,05) по сравнению с контрольной группой.

Антиоксидантное действие (инактивация свободных радикалов) а-токоферола в большей степени реализуется в плазме крови. В связи с этим наиболее достоверные изменения биохимических показателей ПОЛ отмечались при исследовании плазмы крови экспериментальных животных.

Применение эмоксипина в качестве онкопротектора способствовало положительной динамике показателей МДА в плазме крови. В дозе 5,0 мг/кг выявлено снижение уровня МДА до 3,1±0,03 мкмоль/л (р<0,05); в дозах 0,5 и 0,05 мг/кг - до 2,8±0,02 мкмоль/л и 1,46±0,14 мкмоль/л соответственно (р<0,05).

При коррекции канцерогенного эффекта уретана мексидолом в разных дозах наблюдали достоверную зависимость снижения уровня МДА в плазме в зависимости от величины дозы применяемого антиоксиданта. Так, при использовании мексидола в дозе 10,0 мг/кг отмечено уменьшение показателей МДА до 2,95±0,02 мкмоль/л (р<0,05); в дозе 1,0 мг/кг - до 2,1±0,01 мкмоль/л (р<0,05); наиболее существенное снижение МДА выявлено при введении данного препарата в дозе 0,1 мг/кг - 1,32 ±0,04 мкмоль/л (р<0,05).

■ МДА (плазма) ■ Ре-МДА(плазма)

Рис. 1. Показатели динамики МДА и Ре-МДА плазмы в эксперименте

При биохимическом исследовании в эритроцитах контрольной группы отмечали высокие показатели МДА - 18,3±0,12 мкмоль/л (р<0,05) по сравнению с группой интактных животных - 12,82 ±0,17 мкмоль/л.

Изменения содержания МДА в эритроцитах при коррекции антиоксидан-тами уровня ПОЛ не являлись статистически достоверными.

Исследования биохимических показателей Ре-МДА в плазме крови экспериментальных животных показало значительное повышение содержания продукта в группе индуцированного канцерогенеза - 7,6±0,21 мкмоль/л (р<0,05) по сравнению с интактными - 3,9±0,05 мкмоль/л (р<0,05).

Коррекция активности ПОЛ антиоксидантами в разных дозах не приводила к статистически значимому изменению уровня содержания Ре-МДА по сравнению с контрольной группой, но при этом отмечали некоторое повышение показателей при снижении доз применяемых препаратов. Подобный эффект, возможно, обусловлен тем, что в больших дозах антиоксиданты способны проявлять прооксидантные свойства.

Изменения динамики уровня Ре-МДА в эритроцитах при коррекции антиоксидантами экспериментального канцерогенеза не являлись статистически достоверными. (Рис 2.)

,моль,л ■ МДА (эритроциты) ■ Ре -МДА(эритроциты)

25 л - - ---------

Рис. 2 Показатели динамики МДА и Ре-МДА эритроцитов в эксперименте.

В контрольной (уретановой) группе уровень каталазы в плазме крови был несколько выше по сравнению с интактными животными: 0,9±0,02 мккат/л

(р>0,05) и 0,73±0,4 мккат/л соответственно.

Изучение уровня каталазы плазмы в крови с применением антиоксидан-тов выявило наиболее достоверное снижение показателей при использовании мексидола в дозе 0,1 мг/кг 0,57±0,23 мккат/л (р<0,05) (в контроле - 0,9±0,02 мккат/л (р>0,05)).

В контрольной (уретановой) группе уровень каталазы в плазме крови был несколько выше по сравнению с интактными животными: 0,9±0,02 мккат/л (р>0,05) и 0,73±0,4 мккат/л соответственно.

Биохимическое исследование эритроцитов экспериментальных животных показало повышение содержания каталазы в контроле относительно группы интактных: 5,3±0,21 мккат/л (р>0,05) и 3,9±0,03 мккат/л соответственно.

Достоверное снижение уровня каталазы в эритроцитах при антиокси-дантной коррекции отмечалось при использовании меньших доз мексидола (0,1 мг/кг) и эмоксипина (0,05 мг/кг) - 3,3±0,41 мккат/л (р>0,05) и 4,03±0,08 мккат/л (р>0,05) соответственно по сравнению с показателями животных контрольной группы. (Рис. 3).

мккат/л ■ Каталаза (плазма) ■ Каталаза (эритроциты)

Рис. 3 Показатели изменения уровня каталазы в плазме крови и эритроцитах.

Таблица 3.

Показатели каталазы в плазме и эритроцитах крови белых мышей при использовании антиоксидантов в разных дозах (М±т)

Группы Каталаза

плазма эритроциты

Интактные животные. 0,73±0,4 3,9±0,03

М±м М±м

Контрольная уретановая 0,9±0,02 5,3±0,21

группа 1г/кг. р>0,05 р>0,05

Уреган+ а-токоферол в дозе 0,68±0,02 2,б±0Д

50мг/кг. Р|<0,05 Р|<0,05

Уретан+ а-токоферол в дозе 0,74±0,03 4,7±0,03

25мг/кг. р,>0,05 р,>0,05

Уретан+эмоксипин 5,0мг/кг. 0,47±0,02 4,51 ±0,02

Р1<0,05 р,>0,05

Уретан+эмоксипин 0,5мг/кг. 0,68±0,03 4,49±0,07

Р1<0,05 Р|>0,05

Уретан+эмоксипин 0,05мг/кг. 0,51±0,02 4,03+0,08

Р1<0,05 Р1>0,05

Уретан+мексидол 10,0мг/кг. 0,68±0,02 4,5 ±0,01

Р1>0,05 р1>0,05

Уретан+мексидол 1,0мг/кг. 0,63±0,01 4,3±0,26

р1<0,05 р1>0,05

Уретан+мексидол 0,1 мг/кг. 0,57±0,23 3,3±0,41

Р,<0,05 р(>0,05

Р - достоверность по отношению к интактной серии р<0,05 Рг достоверность по отношению к контролю р<0,05.

Анализ полученных результатов и сравнение их с показателями контрольной группы (индуцированный канцерогенез) позволяет предположить, что производные 3-оксипиридина (мексидол, эмоксипин) оказывали более выраженный коррегирующий эффект на реакции пероксидации в сравнении с естественным антиоксидантом - а-токоферолом. Установлено, что антиоксидантная активность проявляется в большей степени, чем у эмоксипина.

Выявлено, что при уменьшении доз используемых синтетических антиок-сидантов определяется достоверная положительная динамика показателей ПОЛ.

Полученные нами данные позволяют предположить, что малые дозы ан-тиоксидантов не только элиминируют свободные радикалы но и стимулируют собственную антиоксидантную систему организма.

Патоморфологическая характеристика ткани легкого при уретаповой модели канцерогенеза

На фоне введения уретана в дозе 1г/кг у мышей контрольной группы в 100% случаев возникали множественные мультицентричные аденомы легкого, что подтверждается литературными данными (Шабад Л.М., 1972).

Среднее количество аденом в тотальном препарате у одного животного составило 22,0±3,2.

Аденомы представляли мелкие (до 2 мм в диаметре), серые полупрозрачные узелки округло-овальной формы. Несмотря на отсутствие в них капсулы, новообразования были довольно четко ограничены от окружающей легочной ткани, слегка приподнимали плевру.

При микроскопическом исследовании легких мышей контрольной группы новообразования характеризовались разнообразием и неоднородностью строения. Опухолевая ткань была представлена железистыми, трабекулярными, сосочковыми, микрокистозньтми, солидными и альвеолярными структурами, состоящими из клеток различных размеров и формы. В аденомах с железистой дифференцировкой преобладали мономорфные клетки кубической формы, с небольшим количеством цитоплазмы и округлыми ядрами.

В отдельных очагах выявлялись правильно сформированные железистые трубки и цилиндрические ходы, выстланные опухолевыми клетками цилиндрической формы.

Некоторые опухолевые узлы были представлены трабекулами, тяжами, солидными скоплениями из клеток призматической формы с овальными ядрами, занимающими большую часть цитоплазмы.

Значительная часть аденом характеризовалась мономорфностью строения. В данных новообразованиях опухолевые клетки формировали тубулярные структуры. В ряде опухолевых узлов наблюдалось формирование папилярных структур и кистозных полостей, выстланных клетками уплощенной формы. В отдельных аденомах тубулярного строения клетки приобретали призматическую форму и образовывали цилиндрические ходы. Подобная железистая диф-ференцировка выявлялась преимущественно в центральной части новообразования, на периферии опухолевые клетки более однородны.

Стромальный компонент в опухолевых узлах выражен слабо. В ряде случаев обнаруживали структуры с папиллярной дифференцировкой и наличием кистозных полостей.

Таким образом, общее микроскопическое строение экспериментальных аденом легких, индуцированных уретаном, у мышей может быть охарактеризовано как папиллярно-аденоматозное.

Наличие папиллярных структур в составе новообразований свидетельствует о высокой пролиферативной активности опухолевых клеток, что является прогностически неблагоприятным признаком.

При иммуногистохимическом исследовании опухолевой ткани легких животных контрольной группы в клетках аденом выявлялась позитивная цито-плазматическая реакция на цитокератин № 8, мульти-цитокератин и экспрессия эпителиального мембранного антигена (ЭМА), что подтверждает эпителиальный генез новообразований. Проведенное иммуногистохимическое исследование позволило дифференцировать опухолевый рост от неспецифических реактивных воспалительных инфильтратов.

Влияние а-токоферола на морфологическую картину легкого при экспериментальном канцерогенезе.

Для коррекции канцерогенного эффекта уретана экспериментальным животным вводили естественный антиоксидант а-токоферол в дозах 50 мг/кг и 25 мг/кг, а также синтетические антиоксиданты - производные 3 - оксипиридина - мексидол в дозах 10 мг/кг, 1,0 мг/кг, 0,1 мг/кг и эмоксипин в дозах 5,0 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,05 мг/кг. Оценивали сравнительную динамику макро - и микроскопических изменений в ткани легкого.

Как показали наши исследования, при использовании а-токоферола макроскопически отмечалось достоверное снижение количества и размеров аденом. Так, введение в дозе 50мг/кг приводило к уменьшению среднего количества опухолевых узлов до 14±1,2 (т.е. на 37% по отношению к контролю). Размеры узлов в среднем достигали 0,5-0,7 мм. Более значимые изменения выявлены при введении а-токоферола в дозе 25 мг/кг. При этом среднее количество аденом уменьшалось до 9±0,5 (на 60% по отношению к контролю).

При микроскопическом исследовании ткани легкого на фоне введения а-токоферола в дозе 50 мг/кг опухолевые узлы четко отграничены от окружающей ткани и представлены компактно расположенными мономорфными опухолевыми клетками.

Отдельные новообразования были представлены трабекулярными аденомами, опухолевые клетки формировали тяжи, разделенные тонкими прослойками соединительной ткани. Клетки опухолевой ткани имели цилиндрическую форму и образовывали железистые ходы. Капсула у опухолевых узлов отсутствовала.

На фоне введения а-токоферола в дозе 25 мг/кг достоверно снижалось количество опухолевых узлов в ткани легкого. Гистологически узлы имели нечеткие контуры, находились преимущественно перибронхиально. Опухолевые клетки в узлах располагались рыхло.

При использовании в эксперименте различных доз препарата выявлен более выраженный терапевтический эффект а-токоферола проявляется пир применении в меньшей дозе.

При использовании синтетических антиоксидантов - производных 3 -оксипиридина наблюдалась достоверная зависимость морфологических изменений от дозы применяемых препаратов.

Влияние эмоксипина на морфологическую картину легкого при экспериментальном канцерогенезе.

При применении эмоксипина в дозе 5 мг/кг происходило достоверное снижение среднего числа аденом легких - 9,3±1,3 (на 56,4% по сравнению с контролем). При микроскопическом исследовании выявляли опухолевые узлы округло-овальной формы, с четкими границами. Новообразования состояли из компактно расположенных опухолевых клеток, организованных в виде тяжей, между которыми находились тонкие прослойки соединительной ткани.

При введении эмоксипина в дозе 0,5 мг/кг на фоне введенного уретана среднее число аденом у одного животного составило 8,8±1,145 (на 58,7% по сравнению с контрольной серией).

Отмечалось значительное количество перибронхиально и периваскулярно расположенных аденом. Опухолевые узлы состояли из однородных, тесно прилегающих друг к другу клеток со светлой протоплазмой и округлыми ядрами. Аденомы четко отграничены от окружающей легочной ткани, несмотря на отсутствие капсулы. Количество соединительной ткани в аденомах невелико.

При введении эмоксипина в дозе 0,05 мг/кг среднее число аденом у одного животного статистически значимо снизилось до 7,364±1,173 (на 65,5% по отношению к контролю). Микроскопически обнаружены опухолевые узлы округлой формы, локализующиеся преимущественно субплеврально. Опухолевые клетки в узлах располагались рыхло, теряли контакты между собой. Границы опухолевых узлов становились менее заметными.

Полученные нами данные свидетельствуют о более выраженном корригирующем клиническом эффекте при использовании эмоксипина в малых дозах.

Морфологическая картина легкого при воздействии мексидола.

У животных, которым вводили мексидол в дозе 10 мг/кг происходило достоверное снижение среднего числа аденом легких, что составило 11,5±2,75 (на 47,7% меньше по сравнению с контролем).

При этом морфологическая структура опухолевых узлов существенно не отличалась от строения аденом легких у животных контрольной группы. Аденомы с папиллярной дифференцировкой встречались в единичных случаях.

При использовании мексидола в дозе 1,0 мг/кг на фоне введенного уретана среднее число аденом у одного животного составило 10,68±1,425 (на 51,4% меньше по сравнению с контрольной серией). При микроскопическом исследовании узлы новообразований заметно уменьшались в размерах, терялась однородность структуры на периферии аденом, а в центральной части появлялись кистозные полости. Нарушалось трабекулярное строение опухолевых узлов, клетки располагались хаотично.

Наиболее выраженная положительная динамика морфологических изменений прослеживалась при применении мексидола в минимальных дозах (0,1 мг/кг). Достоверно уменьшалось количество новообразований в легочной ткани до 8,7±1,57 (на 60,4% по отношению к контролю). Динамика изменений представлена на рис. 4.

Микроскопически аденомы имели нечеткие, размытые контуры. Опухолевые узлы состояли из отдельных рассеянных опухолевых клеток, которые имели округлую и цилиндрическую форму. Строма новообразований представлена молодой соединительной тканью с выраженной васкуляризацией.

Анализ полученных нами экспериментальных данных показывает большую антиканцерогенную активность синтетических препаратов по сравнению с естественным антиоксидантом а-токоферолом. Наибольший терапевтический эффект отмечен при применении эмоксипина и мексидола в дозах 0,05мг/кг и 0,1 мг/кг соответственно.

Морфологическое исследование подтвердило, что онкопротекторная активность мексидола достоверно выше, чем у эмоксипина. При использовании мексидола в условиях экспериментального уретанового канцерогенеза среднее количество аденом легкого меньше по сравнению с таковым при использовании эмоксипина. При микроскопическом исследовании в контроле и экспериментальных сериях с применением а-токоферола аденомы имели преимущественно трабекулярное и папиллярное строение. При воздействии мексидола и эмоксипина опухолевые узлы с папиллярной дифференцировкой встречались в единичных случаях, что свидетельствует о снижении пролиферативных процессов в опухолевой ткани и подтверждает больший онкопротекторный эффект синтетических производных 3-оксипиридина по сравнению с естественными.

Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что в условиях моделирования уретанового канцерогенеза легких мышей, наиболее выраженным онко-протекторным действием среди использованных нами антиоксидантов обладал мексидол. В изученных дозах мексидол оказался эффективнее препаратов сравнения (а-токоферол и эмоксипин). При этом больший терапевтический эффект проявляется при использовании малых доз препаратов, что подверждается литературными данными (Анисимов В.Н., 2003). Известно, что большинство ан-

Рис.4. Среднее количество узлов в ткани легкого в эксперименте.

тиоксидантов характеризуются двухфазным действием, т.е. антиоксидантный эффект при превышении некоторой пороговой величины сменяется проокси-дантным.

ВЫВОДЫ

1. При изучении действия антиоксидантов в условиях уретанового канцерогенеза у экспериментальных животных выявлена положительная динамика биохимических показателей крови, отражающих процессы ПОЛ.

2. Исследуемые препараты (а-токоферол, мексидол, эмоксипин) оказывают онкопротекторное действие. В экспериментальных сериях достоверно снижается среднее количество опухолевых узлов в легких.

3. Динамика изменений морфологических критериев указывает на выраженность положительного терапевтического воздействия в зависимости от дозы применяемого антиоксиданта. Оптимальный эффект наблюдается при использовании малых доз.

4. Более выраженное антиканцерогенное воздействие проявляется при использовании синтетических производных 3-оксипиридина, по сравнению с естественным антиоксидантом - а-токоферолом.

5. Онкопротекторное действие исследуемых групп препаратов подтверждается положительной динамикой морфологических изменений в ткани легких экспериментальных животных.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Онкопротекторное действие мексидола на уретановой модели рака легкого. // Сборник: Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы. Материалы всероссийской науч. конф.: - Москва, 2003. - С. 252-254. (соавт. Плотникова H.A., Харитонова Т.В., Кемайкин С.П.).

2. Возрастные аспекты заболеваемости раком легких, трахеи и бронхов в Республике Мордовия. // Материалы научной конференции посвященной 50-летию Республиканской клинической больницы МЗ Татарстана. - Казань, 2003. - С. 120-122. (соавт. Плотникова Н.А, Демидова Т.В., Кемайкин С.П.).

3. Канцерогенез в возрастном аспекте. // Естественно - научные исследования: теория, методы, практика. Сб. науч. тр. - Саранск, 2003. - С. 183-185. (соавт. Ануфриева В.Г., Плотникова H.A., Кемайкин С.П.).

4. Влияние мексидола в разных дозах на процесс канцерогенеза. // Сб. науч. тр. - С. Петербург. 2003. - С. 174-175. (соавт. Плотникова H.A.).

5. Онкопротекторное действие антиоксидантов в условиях экспериментального канцерогенеза. // XXXII Огаревские чтения Материалы научной конференции. Часть 2. - Саранск, 2004. - С. 47-48. (соавт. Веснушкин Г.М.).

6. Онкопротекторное действие эмоксипина на модели экспериментального канцерогенеза. // Альманах «Геронтология и гериатрия» Вып. 3. - Москва, 2004. -С. 258-261. (соавт. Плотникова H.A., Коваленко А.Н., Веснушкин Г.М., Харитонова Т.В., Кемайкин С.П.).

7. Влияние эмоксипина в разных дозах на морфогенез экспериментальных опухолей легких у мышей индуцированных уретаном. // Межрегиональный сб. науч. трудов «Диагностика и лечение больных онкологического профиля». Изд-во «Узорочье». - Саранск, 2004. - С. 146-149. (соавт. Плотникова H.A., Коваленко А.Н., Веснушкин Г.М., Бегоулов И.В.).

8. Сравнительная характеристика антиканцерогенного действия некоторых производных 3-оксипиридина. // Материалы XI научной конференции молодых ученых. Сб. науч. тр. - Саранск, 2004. - С. 14-17. (соавт. Веснушкин Г.М.).

9. Динамика изменений морфологических и биохимических показателей при коррекции индуцированного опухолевого роста антиоксидантами. // Вестник Волгоградского гос. мед. ун-та. - 2005. -№ 1 (13). - С. 20-22. (соавт. Плотникова H.A., Кемайкин С.П.).

i

Подписано в печать 11.01.05. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 14.

Типография Издательства Мордовского университета 430000, г. Саранск, ул. Советская, 24

! i

i j

i Í

i %

I I

-161 ti'

РНБ Русский фонд

2005-4 48625

Актуальность темы. К числу наиболее значимых направлений современной медицины относятся исследования закономерностей канцерогенеза и фармакологической коррекции развития злокачественных новообразований (Анисимов В.Н., 2000г.).

В настоящее время достаточно интересной и научно обоснованной является свободнорадикальная теория канцерогенеза, согласно которой при физиологических условиях синтез свободных радикалов отвечает требованиям клеточного метаболизма, обеспечивающим нормальную жизнедеятельность клеток. При избыточном образовании в организме свободных радикалов, не соответствующим физиологическим потребностям, реализуется их альтера-тивное воздействие (Бобырев В.Н.,1994). В клетках происходит нарушение регуляторных и защитных функций. Внедряясь в билипидный слой цитолем-мы, свободные радикалы инициируют реакции перекисного окисления липи-дов, что приводит к повреждению мембран, нарушению их функций и к возможной неопластической трансформации (Брюгер А.Ф.,1986).

В организме существует многокомпонентная система, предотвращающая свободнорадикальные процессы и защищающая организм от продуктов метаболизма в подобных реакциях (Гавриленко Г.А., 1991). Естественные ан-тиоксидангы инактивируют перекисное окисление липидов и не дают свободным радикалам накапливаться в организме. Однако, естественная антиок-сидантная система организма часто оказывается перегруженной и бывает не в состоянии инактивировать огромное количество свободных радикалов, что влечет за собой повышенный риск опухолевого роста (Волконский В.А, 1990).

Решить данную проблему помогает использование антиоксидантов экзогенного происхождения. Большое внимание в последнее время отводится производным 3-оксипиридина (мексидол, эмоксипин, проксипип). В основе их аитиоксидантного действия лежит способность ингибировать стадию инициации свободной радикальной реакции, тем самым снижая возможность неоплазии (Деремедведь Л.В., 1998).

В частности, в доступной литературе данные об онкопротекторном действии антиоксидантов в условиях использования препаратов с выраженным канцерогенным эффектом представлены не в полном объеме (Зигапши-наЛ.Е. 1992).

В связи с этим проблема коррекции антиоксид антам и опухолевого роста на уретановой модели канцерогенеза приобретает особую актуальность.

Данная работа является разделом комплексного исследования, выпол-ниная в рамках Всероссийской программы «Изучение антиканцерогенного действия антиоксидантов. Использование антиоксидантов с целью лечения онкологических заболеваний и профилактики побочных эффектов химиотерапии злокачественных опухолей».

Номер государственной регистрации 01200004102.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось морфофункцио-нальное изучение онкопротекторного действия антиоксидантов на уретановой модели экспериментального канцерогенеза.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Теоретическое обоснование возможности использования антиоксидантов в качестве онкопротекторов.

2. Оценка динамики биохимических показателей периферической крови: эритроцитов и плазмы при использовании антиоксидантов на уретановой модели экспериментального канцерогенеза.

3. Морфологическое изучение антиканцерогенного действия естественного антиоксиданта а-токоферола и производных 3-оксипиридина -мекспдола и эмоксипина.

4. Определение оптимальных доз препаратов для выявления наибольшего антиканцерогенного эффекта с учетом динамики изменении морфологических критериев.

Научная новизца. В настоящей работе впервые проведено исследование антиканцерогенного действия естественного антиоксиданта а-токоферола и синтетических производных 3-оксипиридина - мексидола и эмоксипина на уретановой модели экспериментального канцерогенеза.

Показано достоверное снижение абсолютного числа новообразований (аденом) легких при использовании в эксперименте естественных и синтетических антиоксидантов.

Произведена сравнительная оценка антиканцерогенного эффекта естественных (се-токоферол) и синтетических (мексидол и эмоксипин) антиоксидантов на модели экспериментального канцерогенеза.

Представлена морфологическая характеристика изменений при применении разных доз препаратов на уретановой модели аденом легкого.

В работе дана оценка динамики биохимических показателей эритроцитов и плазмы крови при использовании антиоксидантов в условиях экспериментального канцерогенеза.

Научно-практическая ценность работы. Полученные данные отражают онкопротекторный эффект антиоксидантов в условиях экспериментального канцерогенеза.

Результаты данной работы подтверждают целесообразность дальнейших клинических исследований в этой области с целью возможного использования естественных и синтетических антиоксидантов в профилактике и комплексном лечении неоплазий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Естественные и синтетические антиоксиданты обладают достоверным онкопротекторным действием в условиях экспериментального канцерогенеза.

2. Изученные антиоксиданты оказывают позитивное влияние на биохимические показатели перекисного окисления липидов.

3. Применение антиоксидантов в качестве онкопротекторов сопровождается положительной динамикой морфологических критериев канцерогенного воздействия уретана.

4. Выраженность антиканцерогенного эффекта зависит от доз используемых препаратов.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные пауки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001г.), на Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы». (Москва, 2003г.), на 58 межрегиональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2003г.), на Международном экологическом Форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (С.-Петербург, 2003г.), на научной конференции, посвященной 50-летию Республиканской клинической больницы МЗ Татарстана (Казань, 2003г.), на XXXII научной конференции «Огаревские чтения» (Саранск, 2004г.).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ в центральной и местной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего в себя 224 научных источника, в том числе 92 иностранных. Материал диссертации изложен на 114 страницах компьютерного текста, документирован 4 таблицами, 4 диаграммами, иллюстрирован 40 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. При изучении действия антиоксидантов в условиях уретанового канцерогенеза у экспериментальных животных выявлена положительная динамика биохимических показателей крови, отражающих процессы ПОЛ.

2. Исследуемые препараты («-токоферол, мексидол, эмоксипин) оказывают онкопротекторное действие. В экспериментальных сериях достоверно снижается среднее количество опухолевых узлов в легких.

3. Динамика изменений морфологических критериев указывает на выраженность положительного терапевтического воздействия в зависимости от дозы применяемого антиоксиданта. Оптимальный эффект наблюдается при использовании малых доз.

4. Более выраженное антиканцерогенное воздействие проявляется при использовании синтетических производных 3-оксипиридина, по сравнению с естественным антиоксидантом - «-токоферолом.

5. Онкопротекторное действие исследуемых групп препаратов подтверждается положительной динамикой морфологических изменений в ткани легких экспериментальных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные позволяют предположить целесообразность дальнейшего экспериментального исследования влияния естественных (а-токоферол) и синтетических препаратов - производных 3-оксипиридина (мексидол, эмоксипин) в условиях экспериментального канцерогенеза, с целью выбора оптимальных доз для получения онкопротекторного эффекта при лечении опухолей.

В комплексном лечении неоплазий с использованием препаратов анти-оксидантного типа действия в лечебных и профилактических целях необходимо производить оценку активности ПОЛ по содержанию МДА, Ре-МДА и активности каталазы в периферической крови.