Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Обоснование применения мезенхимальных стволовых клеток, полученных in vitro у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями

На правах рукописи

OUJ'

УСТЮГОВ АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO У ДЕТЕЙ С ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМИ И ОНКОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

14.01.21-гематология и переливание крови 14.01.08- педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 ЯНВ *>nin

Москва 2009

003490742

Работа выполнена в ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Борис Владимирович Афанасьев Сергей Александрович Румянцев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Андрей Михайлович Тимаков Сергей Викторович Бельмер

Ведущее учреждение: ГУ Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится 29 января 2010 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д

208.050.01 в ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава по адресу 117997, Москва, Ленинский проспект, 117, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, и на сайте www.niidg.ru

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор В.М. Чернов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В настоящее время во всем мире активно изучаются возможности терапевтического применения различных клеточных популяций для лечения ряда заболеваний. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), которая применяется с конца 1960-х годов (Gatti R., 1968; Bach F., 1968) для лечения больных с различными заболеваниями системы крови, является в настоящее время одним из общепринятых методов лечения различных заболеваний (Афанасьев Е.В.1994; Румянцев А.Г 1996; Thomas ED., 2000).

Существование в костном мозге (КМ), наряду со стволовыми кроветворными клетками, стволовых клеток стромы, образующих в культуре колонии фибробластоподобных клеток, было впервые доказано в А.Я.Фриденштейном и соавт., 1970. Способность стволовых клеток стромы к самообновлению и дифференцировке в различные мезенхимальные элементы была подтверждена в многочисленных исследованиях (Фридешнгейн А.Я., 1970; Owen M., 1988; Владимирская Е.Б., 1990; Jones ЕА., 2002; Gronthos S., 2003).

В дальнейших исследованиях, в основном экспериментальных, была продемонстрирована зависимость кроветворения от стромального микроокружения (Фриденштейн А.Я., 1980; Owen M., 1988; К. Le Blanc., 2007). Продемонстрирована преимущественная связь отдельных элементов сгромы (жировые клетки и остеобласты) с ростками кроветворения (Pittenger M., 1999; Bianco P., 2000; Muraglia A., 2000).

На основании изучения возможностей влияния элементов стромы на кроветворение, трансплантация МСК рассматривается как один из возможных методов лечения гематологических и онкологических заболеваний. В основе этих работ лежит возможность МСК улучшать приживление трансплантата при ко-трансплантациях; снижать частоту и тяжесть иммунных реакций (РТПХ), особенно при неродственной трансплантации; замещать и восстанавливать функции поврежденных негсмопоэтических тканей. (Minguell J.J., 2000; Stenderup К. 2003; Miura M. 2005; К. Le Blanc. 2007; Alma J., 2007).

Однако, в связи с противоречивыми результатами исследований, трудностями оценки МСК, выращенных in vitro для клинических целей (Tai M.- H. 2004; Rubio D. 2005; Kassem M. 2005; Muirá М.ДЮ6), а также оценки терапевтического эффекта МСК (Brtholomew А. 2002, Zhang J.2005, Ball LM.2006£ Проблема использования МСК в клинической практике остается открытой. Изучение биологических свойств и возможностей трансплантации МСК полученных в результате длительного

культивирования у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями является актуальной для гематологи и педиатрии.

Цель работы:

Изучить биологические свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга in vitro в процессе длительного культивировании и обосновать возможности использования клеточных препаратов МСК для применения в клинической практике у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Отработать и внедрить методику получения достаточного количества МСК из КМ человека для трансплантации детям с гематологическими и онкологическими заболеваниями.

2. Оценить дифференцировачный потенциал МСК на ранних и поздних пассажах культивирования in vitro.

3. Разработать иммунофенотипическую панель для определения поверхностного иммунофенотипаМСК в трансплантационном материале.

4. Оценшъ динамику роста, изменение иммунофенотипа и генетическую стабильность МСК при культивировании in vitro на ранних и поздних пассажах.

5. Оценить инфузионную безопасность применения культивируемых МСК у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.

6. Изучить возможность определения донорского химеризма МСК в оценке приживления донорского МСК у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.

Научнав новизна

Полученные при помощи разработанной и хорошо воспроизводимой методики выделения и культивирования МСК КМ демонстрируют высокую функциональную активность и сохраняют способность к дифференцировке в адипоцшы и остеоциты. Показано, что при длительном культивировании in vitro МСК КМ человека клетки 3-4 пассажа обладают максимальной пролиферативной активностью, которая снижается при дальнейшем культивировании. Предложенная для оценки чистоты клеточного препарата иммунофенотипическая панель показала высокую чисппу МСК и отсутствие клеток с эндотелиальным и гемопоэтического рядов. Продемонстрирована генетическая

стабильность МСК. Впервые при оценке донорского химсризма была показана возможность приживления донорских МСК у детей.

Практическое значение Практическое значение работы заключается в том, что используемая нами методика легко воспроизводима, доступна и позволят получить достаточное для клинического применения количество хорошо охарактеризованных мезенхимальных стволовых клеток.

Предложенная система контроля биологической и бактериологической безопасности может быть использована при приготовлении клеточных препратов МСК для клинического использования у детей.

Использованная при определении донорского химсризма методика продемонстрировала высокую эффективность при определении приживления МСК у детей при трансплантации костного мозга.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на научно-практическом симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, октябрь 2008 г.), на VI Международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкогемагологических заболеваний» (Москва, январь 2009 г). 35th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation ( Göteborg, Sweden, April 2009 )

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава , ГУЗ «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г.Москвы» и отделения трансплантации костного мозга Российской детской клинической больницы Росздрава Объем и структура работы: Материал диссертации изложен в одном томе на 100 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и проиллюстрирован 18 рисунками. Указатель литературы включает 12 источников отечественной и 212 зарубежной литературы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Рабата выполнена в ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ -член - корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев), лаборатории регуляции кроветворения (зав.-д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (руководитель-д.м.н. Румянцев С.А.), на базе клинического отделения

трансплантации костного мозга (зав.- д.м.н. Скоробогатова Е.В.) Российской детской

клинической больницы Росздрава (гл.врач - д.м.н., профессор Ваганов Н.Н.)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Материалом для исследования служили:

1. Костный мозг 62 здоровых родственных (п-22) и неродственных (п=40) доноров, полученных для аллогенной трансплантации детям с гематологическими заболеваниями, находившиеся на лечении в ФГУ ФНКЦ ДГОИ. У доноров клеточный состав КМ соответствовал возрастной норме. Из 62 образцов МСК КМ 6 образцов были использованы для улучшения приживления трансплантата ГСК: п=3 (неродственные) и п=3 (родственные) и 13 образцов для лечения РТПХ: п=6 (неродственные) и п=7 (родственные). Из оставшихся 49 образцов МСК КМ 5 образцов МСК КМ были утилизированы в связи с наличием бактериального роста в культуре. Оставшиеся 44 образца были заморожены с целью будущего использования в клинике

2. Костный мозг и периферическая кровь 6 детей в возрасте от 4 -12 лет, из них 4 мужского пола и 2 женского пола с установленными диагнозами: 2 ОЛЛ., АА., МДС., ОБЛ., Гемофагоцитарный Лимфогистиоцитоз, получавших МСК для ко-трансплантаций, (за 2-4 часа до миелоинфузии проводили инфузию МСК донора в средней дозе 2 х 10б кг ). Все дети в качестве основного лечения получили ТГСК: 3-родственные и 3 неродственные

3. Костный мозг и периферическая кровь 10 детей в возрасте от 1 -15 лет, из них 6 мужского пола и 4 женского с установленными диагнозами: 1 ЮММЛ., 3 АА., ОМЛ., ХМЛ., ОБЛ., ОЛЛ., Х-сцепленная адренолейкодистрофия, ТКИН, Х-сцепленная форма получавших МСК для лечения РТПХ, (МСК донора использовали в качестве 3-4 линии терапии, в средней дозе 2х 106 /кг массы тела (1,5 - 10х 106/кг массы тела)). Все дети в качестве основного лечения получили ТГСК: 7- родственные и 3 - неродственные.

4. Костный мозг 18 детей с ОЛЛ (п=4) и ОМЛ (п=14) на разных сроках наблюдения (от +26 дня до +302 дня) после проведения аллогенной трансплантации ГСК КМ. Количество наблюдений составляло от 3 до 9. Пациентам с ОМЛ (п=13) были проведены 11 родственных и 4 неродственных ТГСК, пациентам с ОЛЛ были проведены 1 родственных и 3 неродственных ТГСК.

Культивирование маснхимальных стволовых клеток

Культивирование МСК КМ проводили по методу, предложенному. АЯ.Фридснштсйном (А.Я.Фриденштейн и соавт. 1970). Для культивирования МСК производили забор КМ из материала КМ предназначенного для трансплантации, в стерильных условиях, не менее 20-40 мл. Забор проводили в стерильные мешки с антикоагулянтом. После подсчета количества миелокариоцитов КМ наслаивали на Фиколл ("Lympho separation medium", плотностью 1,077 г/мл ICN. США) и центрифугировали при скорости 1800 оборотов в минуту в течение 20 минут при 4°С на центрифуге Jouan (Франция). Икгерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки (МН), собирали и однократно отмывали средой ДМЕМ("Биолот", Россия). Подсчет клеток выполнялся в камере Горяева. Затем выделенные мононуклеарные клетки в концентрации 30-40 х10б/флакон высаживали в культуральные вентилируемые флаконыс площадью дна 75 cM2("Costar") в среде ДМЕМ ("Биолог", Россия) с низким содержанием глюкозы с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)С'Биолот", Россия). Культивирование проводили в стерильных закрытых флаконах при температуре 37°С в условиях абсолютной влажности и 5% СОг в воздухе. Через 24 часа удаляли жидкую фазу культуры с взвешенными в ней клетками. К прилипшей фракции клеток КМ добавляли новую полную питательную среду, через 14 дней инкубации жидкую фазу культур удаляли, поверхность клеточного роста промывали физиологическим раствором и снимали прилипшие клетки с пластика с помощью трипсина-ЭДТА (StemCell Tehnologies Inc). Инактивацию действия трипсина осуществлялась добавлением ЭТС и отмывкой открепившихся клеток в среде ДМЕМ путем центрифугирования 1200 об/мин в течение 20 мин.

Затем клетки высаживались в стерильные, вентилиусмые флаконы 75 CM2("Costar") в концентрации 0,5x106У и пассировались каждые 7 дней до окончания культивирования.

Культивирование МСК для клинического применения осуществлялось до 4 пассажа, дальнейшее культивирование МСК проводилось с научной целью. Дтя оценки наличия колониеобразующую способность (КОС) МСК на 10 сутки флакон фиксировали 96° этиловым спиртом в течение 30 минут, промывали и окрашивали краской Романовского в разведении 1:10 в течение 3040 минут. Подсчет колоний выполнялся в инвертированном микроскопе (40х).

Культивирование проводили в помещениях читсоты класс «С», при температуре 37°С в условиях абсолютной влажности и 5% СО2 в воздухе.

Изучение функциональных свойств МСК КМ получаемых в процессе культивирования

Индукцию остеогенной дифференцировки достигали добавлением в культуральную среду p-глицерофосфата 7х!0"3 М; дексаметазона lxlO"8 М; аскорбиновой кислоты 2x1 (Г1 М. Адипогенную дифференцировку стромальных предшественников индуцировали добавлением дексаметазона lxlO"7 М; инсулина lxlO"9 М. Для выявления остеогенных предшественников проводили реакцию на щелочную фосфатазу стандартной смесью реактивов Merk (ALPA). Для выявления адипогенных предшественников использовали Судан (черный или красный).

Определение изменений поверхностных маркеров при длительном культивировании

В зависимости от срока культивирования мы разделили каждый образец на 3 группы. В первую группу вошли инициальные образцы костного мозга, во вторую вошли культуры на сроке 3-4 пассаж (ранние) и в третью - 10-12 пассаж (поздние). Каждая группа была иммунофенотипически проанализирована по следующей панели антител: мезенхимальные клетки CD90, CD105, CD166, CD44, CD73, CD13 и CD29, гемопоэтические клетки CD34+ ,CD45+, CD133+, моноциты/макрофаги CD45+, CD14+, эндотелиальные клетки CD45-CD31+, CD34+CD45-, лимфоциты CD3+, CD19+.CD25+, CD38+, CD106+.CD69+.

Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре Calibur ("Becton Dickinson", USA) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Обработку полученных данных производили при помощи программы CellQuest

Изучение динамики роста МСК при длительном культивировании

С этой целью рассчитывали кратность прироста клеток как отношение количества клеток, полученное с данного пассажа к количеству клеток, полученному на предыдущем пассаже.

Определение зависимости содержания стромальных клеток в культуре от времени доставки образца костного мозга в лабораторию.

Все образцы костного мозга, доставляемые в лабораторию разделили на две группы: образцы, доставленные в течение 6 часов и образцы, доставленные после 6 часов. Затем сравнили эти группы по количеству стромальных клеток после первого пассажа в культуре на 1 мл начального образца КМ.

Исследование генетической стабильности культивируемых МСК костного мозга проводили с помощью анализа метафазных хромосом (кариотипировшш) и аиализа частоты анеуплоидии МСК

Анализ метафазных хромосом (кариотипирование) МСК

Проводился в два этапа

1.Приготовление шггогенетических препаратов проходило по следующей методике. Колхицин в стандартной конечной концентрации (0,5 мкг/мл) добовляли в культуральные флаконы за 1,5 часа до начала фиксации. После обработки колхицином клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора трипсин-ЭДТА. Гипотонизацию проводили 0,55% раствором KCl (8 мин при 37°С), перед центрифугированием добавляли 3-5 капель фиксатора для остановки гипотонизации. Фиксацию проводили смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1) стандартным способом, с использованием 3-х смен фиксатора. Клеточные суспешии раскапывали на охлажденные влажные стекла.

2.3агем щггогенетическии дифференциально окрашенные методом G-окраски препараты МСК (окрашенные хромосомы) анализировали под световым микроскопом. Для каждой культуры МСК анализировали не менее 15 метафаз. Анализ препаратов проводили согласно международной цитогснетической классификации и номенклатуре «An International System for Human Cytogenetic Nomenclature» S. Karger AG. Isen 2009.

Анализ частоты анеуплоидии в МСК

Применяли метод шперфазного FISH-анализа.

Для этого использовали центромер-специфичные ДНК-зонды на хромосомы X, Y, 6, 8, 11 (Vysis, Inc). Денатурацию, гибридизацию и отмывку проводили по стандартному протоколу. Для контрастной окраски ядер использовали DAPI. FISH-препараты, анализировали под микроскопом Axiolmager с комплектом интерференционных фильтров с помощью программного обеспечения FISH-анализа (Fish View System, Applied Spectral Imaging, GmbH). В каждой культуре анализировали не менее 1000 ингерфазных ядер. Использование метода многоцветного интерфазного FISH-анализа позволило исключить из анализа ядра с нерезультативной гибридизацией.

Каждый образец культуры МСК, перед применением в клинической практике, подвергался бактериологическому исследованию и определению ДНК цигомегаловируса человека (CMV).

Бактериологическое исследование МСК

Среды после культивирования МСК исследовали для обнаружения следующих микроорганизмов: а) Стафилококки: стафилококк золотистый (патогенный), стафилококк

эпидермальный (условно-патогенный) б) Стрептококки: р -гемолитический (патогенный), £-гемолигический (условно-патогенный) в) Грибковая микрофлора.

Среду рассеивали во флаконы с аэробными и анаэробными условиями, затем инкубировали в анализаторе 7 суток, после чего, в случае наличия микробной микрофлоры, выделяли чистую культуру для изучения морфологических и биохимических свойств.

Определение ДНК цитомегаловируса человека (СМУ).

Исследование проводили с применением набора реагентов «АмплиСенс СМУ-скрин-титр-Ро> для выявления и количественного определения ДНК цитомегаловируса человека (СМУ) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Для определения количества копий ДНК СМУ в стандартном количестве клеток использовали количественный калибратор, позволяющий определить число копий ДНК СМУ и ДНК р-глобина в реакционной пробирке.

Клиническое применение культивируемых МСКу детей

Для оценки клинического применения исследовалась группа из 16 детей, из них 6 детей для ко-трансплантации получали инфузию МСК в средней дозе 2 х 106 кг массы тела и 10 детей для конгороля РТПХ, использовали МСК в качестве 3-4 линии терапии, в средней дозе 2х 106 кг массы тела. Для оценки трансфузионной безопасности МСК использовались следующие клинические критерии:

- острые реакции, развившиеся в течение трансфузии или в течение 1-2 ч после нее. (фебрильные, в т.ч. инфекционные, токсические, аллергические, острое поражение легких) часть из них была обусловлена токсичностью криопротекгора ДМСО (тошнота, рвота, нестабильность гемодинамики).

- отсроченные реакции, проявляющиеся в течение нескольких дней или месяцев, (реакция «трансплантат против хозяина», инфекции, вторичные неоплазии).

На данный момент не представляется возможным с достаточной доказательностью описать иммуносупрессивный эффект у пациентов получавших МСК для контроля РТПХ. Связано это, прежде всего с тем что, МСК применяются на фоне комбинированной иммуносупрессивной терапии, эффективность которой трудно оценить однозначно.

Оценка химериша МСК у детей

Для демонстрации возможности приживления МСК у детей использовали образцы КМ, полученные в результате пункционной биопсии на разных сроках наблюдения (от

+26 дня до +302 дня) после проведения аллогенной трансплантации ГСК КМ у детей с установленными диагнозами ОЛЛ (п=13) и ОМЛ (п=5). Количество наблюдений составляло от 3 до 9.

Определение химеризма проводилось в три этапа:

1. Производили забор КМ у детей и выделение ДНК исследуемых лиц.

При помощи локус-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) производили искусственное увеличение копий аллелей анализируемых локусов в сотни миллионов раз (амплификация аллелей).

2. Приготовление амплификационной среды для проведения ПЦР.

Состав общей смеси для проведения ПЦР по семи праймерам, используемым для определения донорского химеризма и смешанного химеризма: (1) для донора, (2) больной до трансплантации ,(3) больного после трансплантации ,(4)отрицательный контроль. Праймеры: 0354545, РХУТЕТЯО, 0751843, У\УА, УКШ+УКПи, 170иР4+1701Л>5, Б381358.

3. Учет результатов.

Продукт амплификации наносили на электрофорез, 8%-ный полиакриламидный гель с соотношением акриламида и бисакриламида 29:1,3, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете после окрашивания в растворе бромистого этидия в течение 10 минут. Электрофоретическое разделение фрагментов проводили при напряженности поля 16 в/см примерно в течение 2.5-3.0 часов После проведения электрофореза гель окрашивали, и различные аллели проявлялись в виде различных полос на геле. Наличие одной полосы говорит о том, что больной человек является гомозиготой по данному локусу, наличие двух полос соответствует гетерозиготе (Рис. I).

„ ч реципиент

донор

я

___/

Донорские долган МСК

Рисунок I .Определение донорского химеризма МСК у реципиента.

Методика определения линейного химеризма реципиента.

Параллельно с исследованиями донорского химеризма МСК у детей было проведено исследование линейного химеризма, с целью оценки приживления гемопоэтическихз стволовых клеток. Образцы костного мозга разделили на фракции методом иммуномагнитной сепарации с использованием реактивов характерных для CD3, CDI4, CD15, CD 16, CD56, CD34, CD29 и оборудования производства Biotec. Дальнейшее тестирование образцов проводили набором для определения донорского химеризма производства ООО «Центр молекулярной генетики» Россия в соответствии с инструкцией производителя.

Статистическая обработка результатов исследования

Для статистической обработки данных использовали методы описательной статистики (средняя, стандартная ошибка среднего, медиана, верхний и нижний квартили). Количественные данные проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. При сравнении данных с нормальным распределением использовали параметрическую статистику с вычислением t-кригерия Стьюдента. В случае сравнения данных с распределением отличным от нормального использовали непараметрическую статистику с определением критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с помощью критерия Спирмена. Для статистической обработки данных использовали программный пакет Statistica 7.0 (StatSoft, Inc).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В нашей работе был использован метод, предложенный А.Я.Фриденштейном в модификации Е.Е.Владимирской. При использовании данного метода, начиная с 3-го пассажа, морфология культуры не менялась, МСК имели мономорфный вид и состояли из клеток веретенообразной формы, что соответствует гистологическому описанию МСК.

Оценивая дифференцировочные потенции клеток культуры МСК получаемых в процессе процессе длительного культивирования, ми определили что способность клеток монослойнон культуры к дифференцировке в адипоциты и остеоциты на ранних и поздних пассажах сохраняется, что является характерным свойством МСК.

Таким образом, мы стремились гистологически подтвердить, что в данной культуральной системе, при использовании нами методики выделения и культивирования МСК костного мозга in vitro, поддерживается рост МСК, а также сохраняются характерные свойства МСК к дифференцировке в адипоциты и остеоциты на ранних и поздних пассажах.

По светооптическим характеристикам МСК, как на ранних, так и на поздних пассажах представляли собой гомогенную популяцию крупных по размеру клеток, отличающуюся от гемопоэтических клеток.

В связи с отсутствием специфических маркеров для точной идентификации МСК, принято идентифицировать МСК в культуре по определенной совокупности маркеров. Используя полученные данные при оценке экспрессии маркеров характерных для гемопоэтических, энодетелиальных и мезенхимальных предшественников на ранних и поздних пассажах культивирования МСК, было показано, что при длительном культивировании МСК костного мозга на 3-4 пассаже наблюдалась высокая экспрессия маркеров, характерных для МСК: CD90, CD105, CD166, CD73. Стромальные клетки костного мозга не несли маркеры CD45, CD34, CD133, CD3, CD 19, CD25, CD38, CD45, CD106, CD31 (% положительных клеток <5%). С увеличением количества пассажей МСК из культур исчезают примеси гемопоэтических клеток (CD45+,CD34+,CD133+). При увеличении срока культивирования МСК до 10-12 пассажа снижалось количество клеток, экспрессирующих CD90, CD105 и CD166.

Динамика изменения экспрессии маркеров характерных для гемопоэтических предшественников и МСК представлена на следующих рисунках, (рис 2-5).

40

30

$ 20 Г*

ю о

42.9

р=0,77 р=0,77 р=0,ШИ5

в,в 0,6« 2-07 в,5в г,8

|р инициально (п=17) и после 4 пассажа <'п-12Г]

Рисунок 2. Динамика изменения маркеров характерных для гемопоэтических предшественников в процессе культивирования между инициальными показателями и 4-м пассажем.

Различий в экспрессии С0133 (р=0,77) и С034 (р=0,77) между инициальным образцом и 4-м пассажем не найдено. Наблюдается резкое уменьшение экспрессии СБ45 в 4-м пассаже (р=0,0015).

10

рвф.63

р=0,22

р=О,041

о,68

О,К 0.64

□ после 4 пассажа (гр12) ■ после 10 пассажа (п=6

Рисунок 3. Динамика изменения маркеров характерных для гемопоэтических предшественников в процессе культивирования между 4-м и 10-м пассажами.

Различий в экспрессии С0133 (р=0,68) и СР34 (р=0,22) между 4-м и 10-м пассажем не найдено. Отмечается дальнейшее уменьшение экспрессии С1545 в 10-м пассаже (р=0,05). Следовательно, содержание гемопоэтических предшественников в результате культивирования не нарастает, а снижается по результатом, за счет экспрессии С045.

СОвО СОЮ5 СР166 С073

¡□инициально (п=17) я после 4 пассажа (п-12)

Рисунок 4. Динамика изменения маркеров характерных для МСК в процессе культивирования между инициальными показателями и 4-м пассажем.

Отмечается значительный рост экспрессии маркеров дифференцировки С090 (р=0,0015), СО 105 (р=0,0015), С0166 (р=0,009), СР73 (р=0,008) характерных для фибробластов, в 4-м пассаже по сравнению с инициальными значениями.

С090 С0105 С0166 С073

: а посггет л пассажа (п=12) а после 10 пассажа (п-в) |

Рисунок 5. Динамика изменения маркеров характерных для МСК в процессе культивирования между 4-м и 10-м пассажами.

При сравнении экспрессии маркеров дифференцировки фибробластов, между 4-м и 10-м пассажем, для большинства из них. отмечается снижение С090 (р=0,04), СШ05 (р=0,04), С0166 (р=0,02), СО73 не изменялся.

' При анализе интенсивность экспрессии, характерных для МСК антигенов на ранних

и поздних пассажах наблюдалось что при увеличении срока культивирования МСК до 10-

I 15

12 пассажа, несмотря на снижение количества CD9CH- и CD 105+ клеток, интенсивность экспрессии этих а!ггигенов повышалась.

По остальным другим антигенам не выявлено достоверных изменений интенсивности экспрессии на поверхности МСК при экспансии in vitro (Табл. 4).

Таблица 4. Интенсивность экспрессии, характерных для МСК антигенов при культивировании.

Поверхностный маркер Антитело Интенсивность экспрессии Достоверность различий

МСК 3-4 пассаж ;п»32), медиана МСК 10-12 пассаж (п-30), медиана

Маркер миелоидных клеток CD13 422 547 р=1,0

В-1 интетрин CD29 400 727 р=0.89

НСАМ-1 CD44 5309 4725 р=0.34

БНЗ CD73 2577 1538 р=0.74

ГЬу-1 CD90 496 703 р=0.047*

Эндоглин, БШ CD105 1507 2060 р-0.038*

Маркер стволовых клеток CD133 13 20 р=0.64

5В Ю/АЬКАМ CD166 354 374 р=0.26

Оценивая динамику роста клеточной популяции, используя данные по количеству МСК полученных нами на разных пассажах, мы пришли к выводу, что при длительном культивировании in vitro МСК КМ человека 3-4 пассажа обладали значительно более высокой пролиферативной активностью по сравнению с культурами после 10-12 пассажа. Кратность прироста клеток составила 5,4 и 2,1 соответственно. Скорость увеличения клеточной популяции была максимальна на 3-4 пассаже, несколько снижалась к 5-6 пассажу и достоверно уменьшалась на поздних (10-12) пассажах. Так же в части образцов МСК КМ начиная с 7 пассажа отмечалось отсутствие роста клеточной популяции (Табл.5).

Таблица 5. Динамика прироста МСК при длительном культивировании in vitro.

№ пассажа 3,4 5,6 7,8,9 10,11,12

Кратность прироста МСК 5,88+0,84 п=32 4,81+0,33 п=32 2,63+0,11 п=32 2,03+0,08 п=25

Величина р РЭ,4-!0,| 1,12=0.01

При оценке влияния времени доставки материала для выделения и культивирования МСК показано, что наибольшее содержание МСК после первого пассажа отмечалось в образцах доставленных в течение 6 часов, по сравнению с образцами, доставленными после 6 часов и более (Табл. 6).

Таблица 6. Зависимость содержания МСК в расчете на 1 мл начального образца КМ.

Время доставки (часов) <6 часов >6 часов

Количество образцов 18 40

Медиана 0,06 0,03

Величина р р=0,2

В связи с тем, что при длительном культивировании МСК in vitro возможна спонтанная трансформация, был проведен генетический анализ культивируемых нами МСК на ранних и поздних пассажах с целью оценки генетической безопасности МСК. Кариотипирование МСК в 9-ти культурах, на ранних и поздних пассажах, показало, что во всех случаях хромосомный набор культур МСК соответствовал нормальному - 46,XY или 46,XX и не менялся в процессе культивирования. При анализе частоты анеуплоидии в культурах МСК на ранних и поздних пассажах, было проанализировано около 25 ООО ядер. Число нормальных клеток с одной хромосомой X составило 99,4% на ранних и 99,5% на поздних пассажах. Частота ядер с двумя хромосомами X варьировала от 0,1 до 1,07%, в среднем составляя 0,52% и 0,46% соответственно. Нулисомия по хромосоме X зафиксировано как крайне редкое явление. Такие клетки могут быть выявлены благодаря чувствительности метода FISH на интерфазных ядрах и, скорее всего, для них уже запущен механизм апоптоза, так как нулисомия по хромосоме X не совместима с выживанием клетки (Табл. 7). На ранних и поздних пассажах были зафиксированы ядра, нулисомные по хромосоме Y. Спонтанная частота потери хромосомы Y в культурах МСК варьировала от 0% до 0,87% на разных пассажах. Частота гиперплоидии (дисомия) составила 0,19±0,10% как на ранних, так и на поздних пассажах (Табл. 8). Таким образом, частота анеуплоидии по половым хромосомам не менялась в процессе культивирования. Тем не менее, в одной культуре МСК выявлен клеточный клон с трисомией по хромосоме 8. Клон выявлялся уже на 4-ом пассаже и составлял 24% от общего числа проанализированных клеток, на 6-ом пассаже выявлено уже 34% ядер с трисомией по хромосоме 8. Однако к 12-му пассажу наблюдали только 16% трисомных клеток в этой культуре. Условия культивирования и пересевов клеточных культур были стандартными,

поэтому появление аномальных клонов клеток можно объяснить их селективным преимуществом в размножении.

Изменение размера клона может свидетельствовать о разной скорости его деления в процессе культивирования. Возможно, что процессы пролиферации и старения в анеуплоидных клетках протекают быстрее, чем в нормальных. В таблицах 7 и 8 представлены результаты исследования частоты анеуплоидии по хромосомам X и У в культурах мужчин - доноров костного мозга на ранних и поздних пассажах.

Таблица 7. Частота анеуплоидии по хромосоме X в МСК из костного мозга (донор - ХУ)

№ Номер культуры по протоколу Число клеток Нулисомия(%) Моносомия (%) Цисомия(%)

Ранние пассажи

1 2* 1002 0 99,20 0,80

2 4 1009 0 99,31 0,69

3 5 1278 0 99,84 0,16

4 6 1007 0 99,90 0,10

5 8 1083 0 98,98 1,02

6 10 1005 0 99,70 0,30

7 12 1033 0,29 98,94 0,77

8 13 1018 0,1 99,51 0,39

9 15 1046 0,29 99,24 0,48

Среднее 9481 0,0810,04 99,4010,12 0,52Ю,10

Поздние пассажи

1 2 1006 0 99,90 0,10

2 4 730 0 99,59 0,41

3 5 542 0 99,82 0,18

4 8 1004 0 99,60 0,40

5 12 1030 0 98,93 1,07

6 13 1016 0 99,41 0,59

Среднее 5328 0 99,5410,14 0,46Ю,14

Таблица 8. Частота анеуплоидни по хромосоме Y в МСК из костного мозга (донор - ХУ)

№ (Номер культуры по протоколу Число клеток [Нулисомия (%) Моносомия (%) Дисомия (%)

Ранние пассажи '• •. -

1 V 1002 03 99,40 0,1

2 4 1009 м 99,80 0

3 5 1278 0,39 99,61 0

4 6 1007 ОД 99,40 0,10

S 8 1083 9,55 99,26 9,18

6 10 1005 0,20 99,80 0

7 12 1033 9,87 98,26 9,87

8 13 1018 0 99,71 0,29

Среднее 8435 9,40±0,09 99,4110,18 0,19±0,10

Поздние пассажи

1 2 1006 0,40 99,50 0,10

2 4 730 0 100 0

3 5 542 0 99,82 0,18

4 S 1004 0,40 99,60 0

5 12 1030 8,19 99,13 9,68

6 13 1016 9 99,80 оао

Среднее 5328 9,17±0,08 99,64±0,13 0,1910,10

Применение препаратов МСК в клинической практике.

Применение МСК исследовали у 16 детей, в том числе у 6 детей для ко-трансплантаций, 10 детей для контроля РТПХ. Для ко-трансплантаций, проводили инфузию мезенхимальных клеток донора в средней дозе 2 х 106 кг, для контроля РТПХ, МСК донора использовали в качестве 3-4 линии терапии, в средней дозе 2х 10® /кг массы тела Все полученные in vitro образцы МСК были тестированы на предмет бактериологической и вирусологической безопасности. По нашим данным среды, в которых выращивались образцы МСК, не были контаминированны исследованными микроорганизмами. Также отсутствовала ДНК CMV.

При дальнейшем исследовании перед нами стояла задача оценить инфузионную безопасность культивируемых нами МСК у детей. С этой целью мы оценивали две группы детей: дети, получившие МСК для ко-трансплантаций (Табл. 9) и дети, получившие МСК для лечения РТПХ (Табл. 10). Полученные нами данные оценки трансфузионной

безопасности у детей позволяют предположить, об отсутствие ранних трансфузионных осложнений при применении культивируемых нами МСК у детей. Тем не мение у двух детей получавших МСК не совместимых по главному комплексу гистосовместимосш отмечалось ухудшение течения заболевания после трансфузии МСК.

Таблица 9. Трансфузпонные осложнения при ко-траисплантациях МСК.

Диагноз Донор Осложнения

Острые Отсроченные

олл Неродств Отр Оф

АА ?одсгв Отр Оф

ОЛЛ Неродств Отр Отр

МДС Родсг Отр Оф

ОБЛ Родств Отр Оф

Гемофагоцигарный лимфогистиоцитоз Неродств Отр Оф

Таблица 10. Трансфузпонные осложнения при введение МСК для лечения РТПХ.

Диагноз Донор Осложнения

Острые Отсроченные

юммл Неродств Оф Оф

омл Родсге Отр Отр

ОБЛ Родств Оф Отр

Х-сцепленная адренолейкодистрофия Неродств Отр Оф

ТКИН Неродств Отр Отр

АА Родств Отр Отр

ОЛЛ Неродств Отр Оф

ХМЛ Родств Отр Оф

АА Родств Отр Оф

АА Неродств Отр Оф

У первого ребенка на второй день от трансфузии МСК в дозе 2х106/кг.,в качестве лечения РТПХ отмечалось ухудшение состояния в виде: повышения температуры, диарейного синдрома, макуло-папулезной сыпи. В связи с ухудшением состояния назначили Энбрел и Селсепт. Состояние улучшилось.

У второго ребенка на 3 день от трансфузии МСК в дозе 2х106/кг., в качестве лечения РТПХ отмечалось снижение сатурации кислорода в связи, с чем потребовалось: спонтанное дыхание под положительным постоянным давлением с помощью аппарата Bipap.ii уселения иммуносупрессивной терапии. Состояние ребенка улучшилось. Через 2 недели ребенок получил повторную трансфузия МСК в дозе 2х106/кг. В первый после трансфузии так же отмечалось снижение сатурации кислорода, ухудшение легочной симптоматики. В связи, с чем потребовалось усиление иммуносупрессивной терапии

Оценивая возможность определения донорского химеризма МСК было выявлено, что в 89% (16 детей) случаев при трансплантации гемопозтических предшественников отмечался 98% реципиентский химеризм МСК вне зависимости от основного диагноза, режима кондиционирования, источника используемого трансплантата, объема трансплантата, качественного его состава (содержание нуклеарных и С034+ клеток), времени прошедшего после проведения трансплантации и тяжести клинического состояния. В 11% случаев (2 детей с диагнозами ОМЛ) отмечался временный донорский химеризм МСК. У первого ребенка донорский химеризм на +52 день составлял 27 % и резко снижался к +58 дню до 6%. У второго ребенка на 33 день химеризм по МСК составлял 24% и более плавно снижался, в отличие от первого случая, к +81 день на 17 %. В дальнейших образцах костного мозга у этих детей наблюдался 98% реципиентский химеризм по МСК. Для косвенного подтверждения результатов химеризма МСК и снижения вероятности ошибки в проведении исследования, использовали результаты линейного и общего химеризма. В 96% случаев у всех детей (п=18) наблюдались аллели донора по информативным маркерам не менее 98%.

Таким образом, мы продемонстрировали возможность приживления МСК изначально присутствующих в трансплантате костного мозга у детей, перенесших трансплантацию гемопозтических предшественников в динамике, а также информативность и достоверность используемых нами методик для определения химеризма МСК у детей после аллогенной трансплантации гемопозтических предшественников.

Выводы

1. Полученные при помощи усовершенствованной методики культивирования in vitro МСК КМ показали возможность приживления при трансплантациях у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.

2. МСК, полученные в результате усовершенствованной методики культивирования in vitro, сохраняют полноценную функциональную активность, способность к дифференцировке в адипоциты и остеоциты.

3. Для стандартной оценки МСК в трансплантационном материале предложена следующая иммунофенотипическая панель: CD105, CD166, CD44, CD73, CD13, CD29, CD90.

4. При длительном культивировании in vitro МСК КМ человека 3-4 пассажа обладают высокой пролиферативной активностью, которая снижается при дальнейшем культивировании и становится минимальной к 10-12 пассажу.

5. После 3 пассажа в клеточной популяции отсутствовали клетки с гемопоэтическим и эндотелиальном фенотипом (CD45, CD34, CD133, CD3, CD19, CD25, CD38, CD45, CD 106, CD31). Наблюдалась высокая экспрессия маркеров МСК KM (CD90, CD 105, CD 166, CD44, CD73, промежуточная CD13 и Ш29.).При увеличении срока культивирования МСК до 10-12 пассажа снижается количество клеток, экспрессирующих CD90, CD105 и CD166. Наблюдается тенденция к снижению CD29, CD13, а также исчезают примеси гемопоэтических клеток (CD45+), эндотелиальных клеток (CD31+) и моноцитов (CD14+)

6. В результате длительного культивирования у МСК КМ на ранних и поздних пассажах хромосомный набор не менялся (46,XY или 46,XX) и отсутствовали анеуплоидии.

7. Полученные нами данные оценки трансфузионной безопасности у детей позволяют предположить, об отсутствии ранних трансфузионных осложнений при применении приготовленных in vitro МСК у детей.

8. Используемый метод ПЦР определения химеризма МСК КМ продемонстрировал достаточную информативность и может применяться для оценки приживления МСК у детей с гематолотическими и онкологическими заболеваниями.

Практические рекомендации

1. Метод может быть рекомендован для экспансии ex vivo МСК КМ в клинических целях

2. Для культивирования МСК in vitro рекомендованы образцы костного мозга, время у которых от момента забора костного мозга донора до начала выделения и культивирования прошло не более 6 часов.

3. Для оценки иммунсфенотипа МСК в трансплантационном материале рекомендуется использовать панель, состоящую из характерных для МСК маркеров (CD90, CD105, CD166, CD44, CD73, CD13, CD29), так и маркеров, специфичных для гемопоэтических клеток (CD3, CD14, CD19, CD25, CD29, CD31, CD34, CD38, CD45, CD106, HLA-DR).

4. Для клинических целей рекомендовано применять МСК 3-4 пассажа.

5. В случае необходимости использования в терапевтических целях МСК более поздних сроков культивирования необходим строгий контроль поверхностного фенотипа и генетической стабильности клеточных трансплантатов.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Осипова Е.Ю., Никитина В.А., Астрелина Т.А., Устюгов А.Ю. Дмитриева Е.В., Пурбуева Б.Б., Скоробогатова Е.В., Шаманская Т.В., Дышлевая З.М., С.А Румянцев, О.А Майорова, Л.Д Катосова, Н.П Бочков. «Динамика скорости роста, иммунофенотипа и генетическая стабильность мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека на ранних и поздних пассажах при культивировании ех vivo.» «Онкогематология», 2009, №1, стр. 44-50

2. Осипова Е.Ю., Никитина В.А., Устюгов А.Ю., Румянцев С.А., Майорова O.A. «Динамика пролиферации, иммунофенотипа и генетической стабильности мезенхимальных стволовых клеток человека при культивировании ex vivo.» Материалы III Конгресс с международным участием «Российский медицинский форум», Сборник V Международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность», 2008, стр. 32.

3. Osipova E.U., Astrelina Т.А., Purbueva В.В., Skorobogatova E.V., Dishlevaya Z.M., Roumiantsev S.A., Mayorova O.A., Ustyugov A.Y.,.Yakovleva M.V. «Dynamics of immunphenotype of human bone marrow MSCs on early and late passages during ex vivo expansion.» 35th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, 2009, P.265.

4. Устюгов А.Ю., Гук Л.В., Дышлевая 3.M., Осипова Е.Ю., Скоробогатова Е.В., Румянцев С.А. «Возможность приживления мезнхимальных стволовых клеток у пациентов подвергшихся аллогенной трансплантации гемопоэтических предшественников. » Материалы VI симпозиума. «Биологические основы терапии

онкологических и гематологических заболеваний». «Онкогемагология», 2008, №4, стр. 78.

5. Осипова Е.Ю., Астрелина Т.А., Устюгов А.Ю., Пурбуева Б.Б., Скоробогатова Е.В., Шаманская Т.В., Дышлевая З.М., Яковлева М.В., Майорова O.A., Румянцев С.А. «Динамика скорости роста и иммунофенотипа мезенхимальных стволовых клгеток костного мозга человека на ранних и поздних пассажах при культивировании ех vivo.» Материалы VI симпозиума. «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний». «Онкогемагология», 2008, №4, сгр. 62.

6. Осипова Е.Ю., Никитина ВА., Астрелина Т.А., Успогов А.Ю., Дмитриева Е.В., Пурбуева Б.Б., Скоробогатова Е.В., Шаманская Т.В., Дышлевая З.М., Яковлева М.В., Майорова O.A., Катосова Л.Д., Румянцев С.А., Бочков Н.П.«Генетаческая стабильность мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека на ранних и поздних пассажах при культивировании ex vivo.»Материалы VI симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний». «Онкогемагология», 2008, №4, стр. 63.

Список сокращений

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка ГСК — гемопоэтические стволовые клетки МСК - мезенхимальные, стволовые клетки CMV - цитомегаловируса человека КМ - костный мозг

СКПК - стволовые клетки периферической крови

ОЛЛ - острый лимфобластаый лейкоз

OMJI - острый миелобластный лейкоз

РТПХ - реакция трансплантат против хозяина

АА - апластическая анемия

ЮММЛ - ювенильный миеломоноцитарный лейкоз

ОБЛ - острый бифенотипический лейкоз

Аденлейкод-я-Х - сцепленная адренолейкодистрофия

ТКИН - Тяжелая комбинированная иммунная недостаточность

Подписано в печать: 25.12.2009

Заказ № 3233 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (4991 788-78-56 www.autoreferat.ru

Выводы

1. Полученные при помощи усовершенствованной методики культивирования in vitro МСК КМ показали возможность приживления при трансплантациях у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.

2. МСК, полученные в результате усовершенствованной методики культивирования in vitro, сохраняют полноценную функциональную активность, способность к дифференцировке в адипоциты и остеоциты.

3. Для стандартной оценки МСК в трансплантационном материале предложена следующая иммунофенотипическая панель: CD105, CD166, CD44, CD73, CD13, CD29, CD90.

4. При длительном культивировании in vitro МСК КМ человека 3-4 пассажа обладают высокой пролиферативной активностью, которая снижается при дальнейшем культивировании и становится минимальной к 10-12 пассажу.

5. После 3 пассажа в клеточной популяции отсутствовали клетки с гемопоэтическим и эндотелиальном фенотипом (CD45, CD34, CD 133, CD3, CD 19, CD25, CD38, CD45, CD106, CD31). Наблюдалась высокая экспрессия маркеров МСК KM (CD90, CD 105, CD 166, CD44, CD73, промежуточная CD 13 и СТ)29.).При увеличении срока культивирования МСК до 10-12 пассажа снижается количество клеток, экспрессирующих CD90, CD 105 и CD166. Наблюдается тенденция к снижению CD29, CD13, а также исчезают примеси гемопоэтических клеток (CD45+), эндотелиальных клеток (CD31+) и моноцитов (CD 14+)

6. В результате длительного культивирования у МСК КМ на ранних и поздних пассажах хромосомный набор не менялся (46,XY или 46,XX) и отсутствовали анеуплоидии.

7. Полученные нами данные оценки трансфузионной безопасности у детей позволяют предположить, об отсутствии ранних трансфузионных осложнений при применении приготовленных in vitro МСК у детей.

8. Используемый метод ПЦР определения химеризма МСК КМ продемонстрировал достаточную информативность и может применяться для оценки приживления МСК у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями.

Практические рекомендации

1. Метод может быть рекомендован для экспансии ex vivo МСК КМ в клинических целях

2. Для культивирования МСК in vitro рекомендованы образцы костного мозга, время у которых от момента забора костного мозга донора до начала выделения и культивирования прошло не более 6 часов.

3. Для оценки иммунофенотипа МСК в трансплантационном материале рекомендуется использовать панель, состоящую из характерных для МСК маркеров (CD90, CD105, CD166, CD44, CD73, CD13, CD29), так и маркеров, специфичных для гемопоэтических клеток (CD3, CD14, CD 19, CD25, CD29, CD31, CD34, CD38, CD45, CD 106, HLA-DR).

4. Для клинических целей рекомендовано применять МСК 3-4 пассажа.

5. В случае необходимости использования в терапевтических целях МСК более поздних сроков культивирования необходим строгий контроль поверхностного фенотипа и генетической стабильности клеточных трансплантатов.