Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Обоснование применения фторхинолонов IV поколения при лечении больных парадонтитом

УДК 616.314.17.

На правах рукописи

- 008.1 - 085.281 - 085.33:579.8

Ипполитов Евгений Валерьевич

Обоснование применения фторхинолонов IV поколения при лечении больных пародонтитом

«14.00.21-Сгоматология» «03.00.07-Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

003476943

Работа выполнена в Государственном образовательном учреадении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Ушаков Рафаэль Васильевич доктор медицинских наук, профессор Царёв Виктор Николаевич

Официальные оппоненты:

Заслуженный врач РФ, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Максимовский Юрий Михайлович

Лауреат государственной премии РФ, д.м.н., профессор Пашков Евгений Петрович

Ведущая организация:

ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий»

Защита состоится « 2009 г. в часов

на заседании учёного совета Д.208.041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава по адресу: Москва, ул. Вучетича, д. 9а Почтовый адрес: Москва 127473, ул. Делегатская 20/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава по адресу: Москва 127206, ул. Вучетича, д. 10а

Автореферат разослан «

2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Ю.А. Гиоева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Обследования населения, проведённые в различных регионах нашей страны, свидетельствуют о высокой распространенности воспалительных заболеваний пародонта, которая существенно варьирует в зависимости от территориальных, возрастных, генетических, профессиональных и социальных факторов (B.C. Иванов, 2001; Л.Я. Плахтий, 2004; О.О. Янушевич, 2009).

В средней и старшей возрастных группах населения хронический генерализованный пародонтит (ХГП) является основной причиной потери зубов, что определяет повышенное внимание исследователей к вопросам этиологии, патогенеза, диагностики и лечения данного заболевания (Г.М. Барер, 1997, 2005; Ю.М. Максимовский, 2007, А.И. Грудянов, 1999, 2008; Э.М. Кузьмина с соавт., 2009).

Опыт исследования микробной флоры при ХГП, накопленный за последние десятилетия, свидетельствует, что патологический материал из пародонтальных карманов в подавляющем большинстве случаев (75-80%) содержит грамотрицательные анаэробные бактерии -бактероиды, фузобактерии и спирохеты (И.И. Олейник, 1991; В.В. Хазанова, 1996; H.A. Дмитриева, 2004; S.S. Socransky, 1998; A. Mombelli, 1996-2006). Особенно высокой является частота обнаружения представителей А. actinomycetemcommitans, Т. forsithia, P. gingivalis, P. intermedia, Т. denticola, которые относятся к пародонтопатогенным видам (В.Н. Царёв, 2009; E.H. Николаева, 2009; H.-P.Muller, 2004; F J. van Vinkelhoff, 2004). В связи с этим важное место в комплексном лечении пародонтита отводится антибактериальной терапии (Ю.М. Максимовский с соавт., 2000-2009; Л.А.Дмитриева, 2001-2007; В.Н.Царев, Р.В.Ушаков, 2004-2009). Поэтому, существует насущная потребность разработки новых методов контроля эффективности терапии, в частности, ускоренной идентификации возбудителей гингивита и пародонтита, определения стратегии их эрадикации в практической пародонтологии.

Особую проблему составляет внутриклеточная локализация возбудителей пародонтита, что делает их недоступными для большей части антибактериальных препаратов используемых как местно, так и системно. Этим объясняются неудачи лечения ХГП, возникновение быстро прогрессирующих форм пародонтита, отсутствие стойкой ремиссии у значительного числа пациентов после проведённого лечения (И.В. Безрукова, А.И. Грудянов, 2002; В.Н. Царёв, 2008). Вместе с тем, установлено, что эффективные внутриклеточные концентрации могут создавать только препараты групп тетрациклинов, макролидов, амфениколов и ФХ, однако, дозировки, кратность и продолжительность курсов при лечении ХГП, тактика их сочетания с мероприятиями профессиональной гигиены для эрадикации пародонтопатогенных бактерий разработаны недостаточно (A. Mombelli, 2006; FJ. Vinkelhoff, 2004,2005).

Решение указанных проблем поможет сформулировать новые принципы антимикробной химиотерапии в пародонтологии и предложить эффективные схемы применения антибиотиков и новых антимикробных химиопрепаратов из группы фторхинолонов IV поколения.

Цель исследования:

Повышение эффективности диагностики и антибактериальной терапии хронического генерализованного пародонтита на основе клинического, микробиологического, молекулярно-биологического мониторинга.

Задачи исследования:

1. Изучить возможность применения ФХ IV поколения в комплексном лечении ХГП с учётом данных мониторинга чувствительности выделенных штаммов и исследования спектра активности в отношении возбудителей.

2. Разработать методику ускоренной идентификации возбудителей, диагностические алгоритмы видовой и количественной характеристики микрофлоры поддесневой биоплёнки и пародонтального кармана до, во время и после проведения профессиональной гигиены в сочетании с антибактериальной терапией хронического генерализованного пародонтита.

4

3. Определить активность и минимальные подавляющие концентрации (МПК) препаратов группы ФХ II, III и IV поколений и антибиотиков, применяемых в стоматологической практике, в отношении пародонтопатогенных видов бактерий и микрофлоры полости рта.

4. Изучить частоту выявления и механизмы возникновения устойчивых штаммов пародонтопатогенных видов бактерий и представителей резидентной (стабилизирующей) микрофлоры полости рта.

5. Провести сравнительный анализ действия препаратов группы ФХ IV поколения на возбудителей и на клиническое течение ХГП, установить эффективность применения моксифлоксацина и гемифлоксацина при комплексном лечении заболевания в стадии обострения.

6. Апробировать и провести клинико-микробиологический контроль эффективности схемы применения моксифлоксацина ФХ IV поколения -гемифлоксацина и моксифлоксацина - для лечения ХГП.

Научная новизна

В настоящей работе впервые систематизированы данные о чувствительности штаммов пародонтопатогенных бактерий (выделенных при ХГП в г. Москве за 2005-2009 гг.) к ФХ и некоторым антибиотикам, применяемым в стоматологической практике. Определена антибактериальная активность и МПК ФХ IV поколения в отношении пародонтопатогенных бактерий и микрофлоры полости рта, изучена частота обнаружения устойчивых штаммов и выявлены плазмидные механизмы резистентности.

Впервые в мировой практике установлено наличие плазмид qnr, несущих гены устойчивости к фторхинолонам (qnr А, qnrB и qnrS), у представителей резидентной флоры полости рта и их отсутствие у исследованных пародонтопатогенных видов.

Впервые проведён сравнительный анализ действия препаратов группы ФХ II-III-IV поколений на возбудителей и на клиническое течение ХГП. Разработаны схемы и рекомендации по применению новых препаратов -гемифлоксацина и моксифлоксацина в комплексном лечении больных ХГП, а

также установлена высокая клиническая эффективность применения ФХ IV поколения при комплексном лечении заболевания в стадии обострения.

Впервые в России апробирован метод молекулярной протеомики -лазерная десорбционная масс-спектрометрия профилей 168-рибосомальных белков у штаммов анаэробных и пародонтопатогенных бактерий для ускоренной идентификации возбудителей пародонтита.

Практическая значимость

Разработан алгоритм этиологической диагностики пародонтита с использованием молекулярно-биологических методов исследования. Для ускоренного типирования облигатно-анаэробных и пародонтопатогенных бактерий предложено использовать масс-спектрометрию 168-рибосомальных белков. Идентификационные спектры белкового профиля выделенных штаммов переданы в международный банк данных.

Апробирована методика изучения генно-плазмидного профиля устойчивости к ФХ у выделенных клинических изолятов анаэробных бактерий полости рта с помощью отечественной системы для ПЦР.

Предложены схемы лечения ХГП в фазе обострения с использованием препаратов ФХ IV поколения моксифлоксацина, гемифлоксацина и критерии оценки эффективности лечения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Частота обнаружения чувствительных и устойчивых штаммов пародонтопатогенных видов бактерий к антибактериальным препаратам группы ФХ и антибиотикам, применяемым в стоматологической практике, существенно различается (по данным кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ по г. Москве за 2005-2009 гг.).

2. Препараты группы ФХ IV поколения - моксифлоксацин, гемифлоксацин, гатифлоксацин - имеют широкий спектр активности в отношении пародонтопатогенных бактерий и смешанной флоры воспалительных очагов в полости рта. МПК препаратов составляет от 0,012 до 2 мкг/мл, что существенно ниже, чем у других средств из группы ФХ.

3. Для ускоренной идентификации пародонтопатогенных бактерий и выявления этиологии ХГП целесообразно проведение прямого профилирования белков 16Б-рибосом с помощью лазерной десорбционной масс-спектрометрии.

4. Антибактериальная этиотропная терапия с применением ФХ IV поколения является эффективной составляющей комплексного лечения ХГП, что подтверждается данными клинико-лабораторного и микробиологического исследования, выполненными в ближайшие и отделённые сроки после начала лечения (3-6-12 и более месяцев).

5. Для оценки эффективности антибактериальной терапии ХГП и решении вопроса её завершения необходимо проведение контроля эрадикации штаммов пародонтопатогенных бактерий с помощью ПЦР.

Внедрение результатов исследования

Результаты внедрены на кафедрах: госпитальной терапевтической стоматологии, пародонтологии и гериатрической стоматологии; стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО МГМСУ; кафедре стоматологии ГОУ ДПО РМАПО; кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова (в учебный процесс), в Клинико-диагностическом центре, стоматологических клиниках ГОУ ВПО МГМСУ и др. стоматологических клиниках г. Москвы (в лечебный процесс).

Личное участие автора

Автор лично проводил обследование и лечение пациентов, удовлетворяющих критериям включения в исследование, присутствовал на консультациях и операциях, производил забор материала для микробиологических исследований, самостоятельно проводил все виды лабораторных исследований, систематизацию и статистическую обработку полученных клинико-лабораторных данных и готовил публикации по теме диссертации.

Публикации

По материалам исследования опубликована 20 печатных работ, в том числе: 4 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и апробированы на:

• IV съезде Общества биотехнологов России (г. Пущино, 2006);

• VIII Международной конгресс MAKMAX/ASM (г. Москва, 2006);

• V Всероссийской конференциии общества биотехнологов России «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (г. Анапа, 2007);

• XXX итоговой конференции общества молодых учёных МГМСУ (2008);

• ХШ международном конгрессе по инфекционным болезням и антимикробной химиотерапии (г. Куала-Лумпур, 2008);

• V и VI Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» (г. Москва, 2008; 2009);

• совместном заседании кафедр: госпитальной терапевтической стоматологии, пародонтологии и гериатрической стоматологии; стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО МГМСУ, стоматологии ГОУ ДПО РМАПО, микробиологии с вирусологией и иммунологией ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского института НИМСИ при ГОУ ВПО МГМСУ (11 июня 2009 г.).

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из Введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», двух глав собственных результатов исследования, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Обзор литературы включает 218 источников, в том числе, 77 - отечественных и 14Г- иностранных авторов.

Диссертация изложена на 155 страницах компьютерного текста Times New Roman. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 30 рисунками и фотографиями.

Диссертационная работа выполнена в рамках научно-отраслевой программы: 30.03 «Вопросы этиологии, патогенеза, профилактики и лечения болезней пародонта и слизистой оболочки полости рта» и по проблеме 11.00 «Микробиология». Регистрационный номер 01200700512.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Проведено комплексное обследование и лечение 99 больных хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) в возрасте от 21 года до 56 лет (37 мужчин и 68 женщин) и давностью заболевания от 3 до 10 лет. Обследование проводилось на базах Клинико-диагностического центра, Лечебно-профилактического стоматологического центра ГОУ ВПО МГМСУ, стоматологических поликлиник г. Москвы.

На основании эпидемиологических, клинико-анамнестических. рентгенологических и лабораторных данных у пациентов выявляли степень тяжести заболевания. Критериями включения являлись: лёгкая и средняя степень тяжести заболевания при отсутствии острых или хронических соматических заболеваний в фазе обострения; а также при условии наличия полного комплекса данных клинико-лабораторного обследования, что позволило сформировать две следующие группы:

• больные ХГП с лёгкой степенью тяжести заболевания (48 человек),

• больные ХГП со средней степенью тяжести заболевания (51 человек).

Каждую группу подразделяли на две в зависимости от схемы лечения:

соответственно 1-я, 3-я группы пациентов получали системную терапию фторхинолонами IV поколения (моксифлоксацин или гемифлоксацин), а 2-я, 4-я - традиционное лечение с использованием линкомицина тидрохлорида -антибиотика, который наиболее часто применяют в пародонтологии (Р.В. Ушаков, С.Е. Бродский, 2005) (таблица 1).

Особое внимание обращали на перенесенные и сопутствующие заболевания, профессиональные вредности, вредные привычки и гигиенические навыки пациента, характер профессиональных вредностей (М.М. Пожарицкая., Т.Г. Симакова, 2004; A.M. Цепов, А.И. Николаев, 2003). Критериями исключения были: тяжёлая степень ХГП, применение для лечения других антибактериальных препаратов наличие хронических соматических заболеваний в стадии обострения или декомпенсации.

Таблица 1

Характеристика групп сравнения по основным параметрам

Группы Степень тяжести Количество пациентов Пол Возрастной диапазон

Мужской Женский от 21 до 40 от 41 до 56

I (мокси -флоксацин) II (линко -мицин) лёгкая 28 }48 20 19 29 31 17

III (мокси -или геми-флоксацин) IV(линко -мицин) средняя 30 >51 21 18 33 16 35

Итого 99 37 62 99

Всем пациентам проводили комплексное обследование:

1. Клинико-лабораторное исследование - определение гигиенического состояния полости рта по Ю.А. Федорову - В.В. Володкиной (1971) с использованием ревеляторов на основе эритрозина (Динал), определение папиллярно-маргинально-альвеолярного индекса в модификации Парма С. (1960); индекса кровоточивости десневой борозды (SBI) по Muhlemann и Son (1971) и сосочков (PBI) по Saxer и Muhlemann, глубины пародонтального кармана с помощью методики зондирования, степени подвижности зубов, пародонтального индекса (А. Rüssel, 1956).

2. Рентгенологическое исследование - ортопантомограммы до начала курса лечения, 6 и 12 месяцев после его завершения, а также внутриротовые рентгенограммы и компьютерную цифровую рентгенографию. Для объективизации интерпретации данных нами использовали индекс Fush (бальной оценкой нарушения структуры тканей альвеолярного отростка).

3. Бактериологическое исследование с применением техники анаэробного культивирования - после взятия материала подцесневой биоплёнки и пародонтального кармана с помощью абсорберов в транспортные

системы со средой Эймса, выполняли количественный посев на 5% кровяной гемин-агар с последующим подсчётом колоний на бинокулярном стереомикроскопе (Nicon, Япония) и их идентификацией по стандартному алгоритму (J. Engelkirk, 1992; В.Н. Царёв, 1992). Для определения чувствительности выделенных штаммов к антибактериальным препаратам применяли диско-диффузионный метод Кирби-Бауэра, а для определения активности и минимальной подавляющей концентрации (МПК) - кассетный микрометод (Р.В.Ушаков, В.Н. Царёв, 1992).

4. Молекулярно-биологические исследования включали проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления в материале маркерной ДНК пародонтопатогенных видов бактерий (А. actinomycetemcommitans, Т. forsithua, Р. gingivalis, Р. intermedia, Т. denticolä) с помощью набора реагентов МультиДент (ООО «НПФ ГенЛаб», Россия), а также выявления генов резистентности к фторхинолонам (плазмид qnr) с помощью набора реагентов НИИ физико-химической медицины Роздрава. Прямое белковое профилирование проводили методом лазерной десорбционной масс-спектрометрии на масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия).

5. Статистический анализ данных включал методы вариационного и непараметрического анализа. Определяли вероятность различий Р сравниваемых величин (вероятность ошибки на уровне 5%), критерий Манна-Уитни-Вилкоксона X2 для непараметрического сравнения величин при относительно малой выборке.

Результаты исследования и их обсуждение

Всем 99 пациентам проводили этиологическую диагностику и

комплексное лечение, которое включало следующие мероприятия:

1. Получение данных о наличии и составе пародонтопатогенной флоры в поддесневой биоплёнке и пародонтальных карманах микробиологическими и молекулярно-биологическими методами. Определение чувствительности штаммов, выделенных у больных ХГП, к антибактериальным препаратам.

2. Антибактериальная этиотропная терапия. Для лечения пациентов применяли следующие антимикробные препараты (перорально): моксифлоксацин (Авелокс) - 400 мг I раз в сутки в течение 10 суток; гемифлоксацин (Фактив) - 300 мг 1 раз в сутки в течение 10 суток; линкомнцина гвдрохлорид (Лвнкоцнн) - 1 г 3 раза в сутки в теч. 10 суток.

3. Профессиональная гигиена полости рта (на фоне антибактериальной терапии): удаление зубных отложений с использованием аппарата «Пьезон-Мастер», с полировкой корней зубов, ирригационная терапия, обучение пациента гигиене полости рта.

4. Ортопедическое (шинирование, устранение травматической окклюзии) и хирургическое лечение пациентов (удаление зубов, кюретаж, лоскутные операции, корригирующие операции) выполняли по показаниям. Пациентам с ХГП средней степени тяжести проводили лоскутные операции: традиционная по Ремфьюрду (33 человека), мостовидная лоскутная операция по Ушакову Р.В. (11 человек).

5. Реабилитационные мероприятия (дентальная имплантация, протезирование) - по показаниям, 12 пациентам после проведённого лечения были установлены бюгельные или мостовидные протезы.

При микробиологической диагностике ХГП в стадии обострения у 99 пациентов выделено всего 608 штаммов, преимущественно анаэробных бактерий, которые были идентифицированы с помощью традиционных микробиологических методов, ПЦР и нового молекулярного метода протеомики - лазерной десорбционной спектрометрии для прямого белкового профилирования 16S - рибосом возбудителей пародонтита.

В результате были установлены спектры 16S - рибосомальных белков у 38 штаммов облигатно-анаэробных бактерий полости рта, относящихся к вирулентным видам пародонтопатогенной группы: P. gingivalis, P. intermedia, F. nucleatum, T. forsythia, S. intermedius, a также A. actinomycetemcomitans. Кроме того, получены белковые профили ряда резидентных представителей полости рта: P. oralis, S. sanguis, A. naeslurtdii, A. viscosus, V. parvula (рис. 1).

;itoom(ces3_GVT'isui Basiiine subt * > * ? ? ? ?

| 1 | 5 j I ' JuiJxijlLiji' i У ь iinoneiiapar.ulajif 0_E1'4-.lSUn. Eassiina sutt I

Рисунок 1. 16S рибосомальные белковые профили Actinomyces viscosum (вверху) и Veillonella parvula (внизу)

Рисунок 2. Актиномицеты Actinomyces naeslundii в мазке из чистой культуры. Окраска по Граму. Иммерсия, объектив 100х.

В качестве примера на рис. 2 представлена микроскопическая картина чистой культуры A. naeslundii.

Установлено, что различия массы основных белков 16S - рибосом бактериальных клеток, позволяющие проводить идентификацию до вида лежат преимущественно в пределах 1,8+0,53 тыс. дальтон (в среднем 1,5-2,1 тыс. дальтон). Совпадение результатов масс-спектрометрии и идентификации с помощью ПЦР получено в 92,4% случаев.

Белковые профили представлены в НИИ физико-химической медицины Росздрава, международную базу данных.

Таким образом, масс-спектрометрический анализ белков анаэробных бактерий позволяет проводить точную идентификацию микроорганизмов до вида по особенностям белкового профиля 16S-pn6ocoM, документировать информацию и использовать для создания стандартной базы данных.

Мониторинг устойчивости к антибиотикам и фтормшолоиам проведен по данным собственного материала, полученного на кафедре микробиологии МГМСУ, за период с 2005 по 2009 гг., а также при исследовании в эксперименте in vitro 37 штаммов (кассетный микрометод) и 58 штаммов (выявление плазмид резистентности qnr с помощью ПЦР).

Установлено, что к антибактериальным препаратам, которые в настоящее время наиболее часто применяются для лечения ХГП перорально -линкомицину, клиндамицину и метронидазолу - наблюдается наиболее высокая частота выявления резистентности (в пределах от 17,0 - 18,5 % - для линкомицина и клиндамицина до 39,5 % - для метронидазола). Устойчивость к хинолоном/ФХ различалась у препаратов разных поколений (табл. 2).

ФХ IV поколения характеризовались минимальным уровнем резистентности. Так, для моксифлоксацина этот показатель составил 5%, а для геми- и гатифлоксацина - 0,5%. По числу чувствительных штаммов моксифлоксацин (87%), гемифлоксацин (95,5%) и гатифлоксацин (98,5%) превосходили наиболее активные антибиотики, такие как рокситромицин (70%) и доксициклин (82%). Различия были достоверны (р=0,002).

Таблица 2

Частота выделения пародонтопатогенных видов бактерий с различной степенью чувствительности к антибиотикам п антибактериальным химиопрепаратам за 2005-2009 гг. (число тестированных штаммов и %)

Штаммы: п Чувствительные S Вариабельные V(I) Устойчивые R

Фармакологическа я группа и препарат

абс. % абс. % абс. %

1. Имидазолы

метронидазол 152 18 11,8 74 48,7 60 39,5

2. Лпнкозамиды

линкомицин 200 79 39,5 87 43,5 34 17,0

клиндамицин 200 77 38,5 86 43,0 37 18,5

3. Макролиды

рокситромицин 200 150 70,0 44 22,0 10 5,0

спирамицин 200 136 68,0 52 26,0 12 6,0

4. Тетрациклины

тетрациклин 138 51 37,0 43 31,2 44 31,9

доксициклин 200 164 82,0 25 12,5 11 5,5

5. Фторхинолоны

Налидикс.кислота * 100 5 5,0 45 45,0 50 50,0

офлоксацин** 110 50 45,4 27 24,6 33 30,0

ломефлоксацин** 130 76 58,5 23 17,7 31 23,9

норфлоксацин** 100 28 28,0 43 43,0 29 29,0

ципрофлоксацин ** 160 84 52,5 59 36,9 17 10,6

левофлоксацпн*** 100 78 78,0 15 15,0 7 7,0

с парфло ксацин*** 130 85 65,4 38 29,2 7 5,4

энрофлоксацин1'*-1'-* 130 105 80,8 17 13,1 8 6,2

моксифлоксацин1' 100 87 87,0 8 8,0 5 5,0

гемифлоксацин1'- •м-* 50 41 95,5 8 4,0 1 0,5

гатифлоксацин**** 50 47 98,5 2 1,0 1 0,5

Примечания:

* I поколение - хннолоны; ** [I поколение - «ранние» фторхинолоны (ФХ): *** III поколение-респираторные ФХ; **** IV поколение - п/анаэробные ФХ

При определении активности ФХ I-II-III-IV поколений гемифлоксацин был более активен в отношении большинства анаэробных культур (МПКу» 0,012-2,0 мкг/мл). Далее, по степени возрастания МПК следовали другие препараты IV поколения: моксифлоксацин - 0,02-2,0 мкг/мл и гатифлоксацин - 0,04-4,0 мкг/мл. Только единичные штаммы стабилизирующих видов P. oralis, S. sanguis, К. pneumoniae, но не пародонтопатогенные виды, отличались более высокими МПК в пределах до 2-4 мкг/мл (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный анализ активности фторхинолонов IV поколения по сравнению с налидиксовой кислотой и ципрофлоксацином (в мкг/мл)

Клшшческ. штаммы пародонтопатоген-ных бактерий (п) МПК стандартного раствора препарата

Налидик-совая к-та Ципро-флоксаиин Мокси-флоксацин Гати-флоксацин Геми-флоксацин

P. gingivalis (5) 2,5-8,0 0,8-8,0 0,4-2,0 0,4-4,0 0,04-1,0

P. intermedia (6) 1,0-4,0 0,4-4,0 0,04-2,0 0,8-1,0 0,012-0,8

P. oralis (9) 4,0-16,0 0,12-12,0 0,12-4,0 0,12-4,0 0,012-2,0

F. nucleatum (7) 1,0-4,0 0,04-2,0 0,02-0,4 0,04-0,4 0,012-0,4

S. intermedins (5) 8,0 0,04-2,0 0,02-1,0 0,04-2,0 0,012-0,8

S. sanguis (12) 16,0 0,04-4,0 0,02-2,0 0,04-4,0 0,04-2,0

К. pneumoniae (9) 4,0-32,0 0,8-16,0 0,4-4,0 0,8-4,0 0,2-4,0

S. aureus P20 9(1) 32,0 0,8 0,2 0,4 0,1

Следует подчеркнуть, что МПК, выявленные в отношении возбудителей ХГП были в несколько раз ниже концентраций, создаваемых данными препаратами в крови и тканях при приёме в терапевтических дозах (более 5,0 -для гемифлоксацина и более 3,0 г/л - для гати - и моксифлоксацина), то есть данные возбудители чувствительны к препаратам и в организме.

Таким образом, было обосновано, что ФХ IV поколения могут применяться для системной антибактериальной монотерапии ХГП. Они имеют весьма значительный запас «прочности», который обеспечивается фармакологической концентрацией, создаваемой в организме и перекрывающей МПК, установленные в нашей работе для большинства штаммов пародонтопатогенных бактерий. Однако выявленные устойчивые штаммы были подвергнуты специальному исследованию с помощью ПЦР.

Молекулярно-генетическне исследования плазмидного профили были проведены у 58 устойчивых штаммов резидентных (стабилизирующих) бактерий полости рта: у 2-х изолятов P. oralis из 16 (12,5 %), 1 изолята V. parvula из 11 (9,1 %), 3-х изолятов К. pneumoniae из 19 (15,8 %) с помощью ПЦР определены генетические маркеры типа qnrB. При этом в плазмидах цпгВ

были выявлены кодоны 5'-GGTGAGAAAATTGAAAATAG и 51-AACGATGCCTGGTAGTTGTC с размером продукта амплификации 560/560 п.н. Последний более, чем на 90% был гомологичен кодону qnrB, описанному А. Robicsek et al. (2006).

Одновременно у двух изолятов К. pneumoniae и одного изолята P. oralis (6,25 %) выявлены плазмиды qnrA. У одного штамма S. sanguis из 12 (8,3 %) и двух штаммов К. pneumoniae из 19 (10,5%) выявлены плазмиды qnr S (согласно с данными «GenBank»). Однако, при молекулярно-генетическом исследовании плазмидного профиля 37 штаммов пароЬонтопатогенных бактерий: 15 клинических изолятов S. intermedius, 9 - P. gingivalis, 7 - Р. intermedia, 6 -F. nucleatum - ни у одного не были обнаружены плазмиды qnr.

Вместе с тем, в чистых культурах мы выделили несколько ФХ-устойчивых штаммов бактерий пародонтопатогенных видов, которые, как оказалось при сравнительном анализе, обладали множественной устойчивостью к другим антибиотикам. Так, все ФХ-устойчивые штаммы Р. gingivalis, Р. intermedia, Р. oralis и F. nucleatum оказались также устойчивыми к гентамицину и маркеру наличия ß-лактамаз широкого спектра - цефтазидиму. Причём, наличие ß-лактамаз можно предположить также и у ФХ-устойчивых штаммов S. intermedins, S. sanguis и К. pneumoniae (МПК>16 мкг/мл), которые одновременно проявляли устойчивость к тетрациклину (МПК от 16,0 до 64,0 мкг/мл). Низкоуровневая устойчивость к тетрациклину выявлена у некоторых штаммов S. intermedius и P. gingivalis (МПК от 2,0 до 8,0 мкг/мл). Напротив, большинство ФХ-устойчивых штаммов P. intermedia, P. oralis и F. nucleatum были чувствительны к тетрациклину, а практически все штаммы, устойчивые к налидиксовой кислоте (в том числе, и устойчивые к ципрофлоксацину), напротив, были чувствительны к моксифлоксацину.

Следовательно, штаммы, обладающие множественной устойчивостью к антибиотикам, налидиксовой кислоте и ФХ II-III поколений (ципро-, спар- и левофлоксацину) оказались чувствительны к моксифлоксацину.

Таким образом, результаты наших микробиологических исследований о высокой чувствительности представителей выделенных ассоциаций к новым препаратам из группы фторхинолонов IV поколения - моксифлоксацину и гемифлоксацину были подтверждены данными об отсутствии плазмид резистентности <?иг, что явилось важным аргументом в пользу применения этих препаратов для этиотропного лечения больных ХГП в фазе обострения.

Клиническая оценка эффективности применения ФХ IV поколения проведена нами при лечении 99 больных ХГП лёгкой и средней степени тяжести в стадии обострения. Состояние гигиены полости рта и пародонта у обследованных оценивали до лечения, через 7 и 14 дней, а также и после проведения комплекса лечебных мероприятий в отдалённые сроки - через 3, 6 и 12 месяцев (табл. 4).

При лечении больных ХГП лёгкой степени установлено, что при применении моксифлоксацина (гр. 1) наблюдалось существенное улучшение гигиенического состояния полости рта на 7-й и 14-й дни лечения. Через 3 месяца после проведенного лечения уровень гигиены полости рта оставался удовлетворительным - ИГ составил 0,3 балла вместо 1,34 балла до начала профессиональных гигиенических мероприятий (Р<0,05). Индекс ПМА, и глубина ПК также были достоверно ниже исходных значений - 7,4 вместо 34,0 и 3,2 вместо 3,8 мм до лечения (Р<0,05). Кровоточивости дёсен и выделения экссудата не выявляли ни у одного пациента. Пародонтальный индекс составлял 0,83±0,1.

Таблица 4

Сравнительная характеристика клинических параметров у больных ХГП

легкой степени

Группа 1грз гппа (Моксифлоксацин) 2 группа (Линкомицин)

Сроки /параметр до лечения 7 дней 14 дней 3 мес. до лечения 7 дней 14 дней 3 мес.

ИГ, балл 1,3±0,1 0,4±0,1* 0,2±0,Г 0,3±0,1' 1,3±0,15 1,1±о,Г 0,8±0,1 * 0,9±0,Г

ПМА 34±2,4 15,8±2,3' 5,3±0,7* 7,4±0,Г 30,2±3,4 20,6±2,Г 16,3±2,4* 13,6±2,5'

ПК, мм 3,8±0,2 - - 3,2±0,Г 3,6±0,2 - - 3,4±0,2

ИК,% 28,6 10,7 0 0 25,0 15,0 10,0 15,0

Экссуд.,% 28,6 3,5 0 0 25,0 15,0 10,0 10,0

Обозначения: * достоверные отличия с данными до лечения, Р<0,05

Микробиологическое исследование выявляло эрадикацию пародонтопатогенных видов и снижение выделения грибов рода Candida. Уровень обсеменённости поддесневой биоплёнки представителями резидентных (стабилизирующих) видов оставался стабильным в пределах 5,46,5, что соответствует существующим нормам для здорового пародонта.

У пациентов получавших линкомицин (гр. 2), на 7-й день лечения средние значения индекса гигиены оставались выше - 1,1±0,1, хотя индекс ПМА снизился на 1/3 и составил 20,6±2,1 (Р<0,05). Отмечена тенденция к снижению кровоточивости десен и выделению экссудата из пародонтальных карманов (сохранялись у 15,0 % пациентов). К 14 дню отмечали достоверное снижение индекса гигиены до 0,8 балла и дальнейшее достоверное снижение ПМА до 16,3±2,4. Выделение экссудата и кровоточивость оставались у 10,0 % пациентов. Наблюдения через 3, 6 и 12 месяцев свидетельствуют о недостаточной эффективности применения линкомицина. Так, через 3 месяца гигиенический индекс оставался 0,9±0,1, а средние значения индекса ПМА через 3 месяца так и не нормализовались (13,6±2,5). В эти сроки у 3-х пациентов наблюдали обострение ХГП, что составило 15%, что согласовывалось с данными о персистенции пародонтопатогенной флоры в течение всего периода наблюдения.

У больных ХГП средней степени 20 человек получали моксифлоксацин, 10 - гемифлоксацин (табл. 5).

Таблица S

Сравнительная характеристика клинических параметров у больных XI11

средней степени тяжести

Группа 3 группа (Моксифлоксацин) 4 группа (Линкомицин)

Сроки /параметр до лечения 7 дней 14 дней 3 мес. до лечения 7 дней 14 дней 3 мес.

ИГ, балл 2,7±0,25 1,2±0,1" 1,1±0,2" 0,7±0,2* 2,8±0,25 1,3±0,Г 0,8±0,2" 1,1±0,Г

ПМА 46,3±4,5 20,0±3,1" 6,6±1,4* 1,8±1,Г 47,6±3,6 19,1±1,2* 4,8±1,1" 3,7±1,5'

ПК, мм 5,3±0,2 - - 3,4±0,4" 5,4±0,3 - - 4Д±0,2'

ИК,% 86,7 26,7 3,3 0 85,7 28,5 19,1 4,8

Экссуд.,% 93,3 6,6 0 0 90,5 19,1 0 4,8

Обозначения: * достоверные отличия с данными до лечения, Р<0,05

У пациентов данной группы при рентгенологическом обследовании выявляли признаки резорбции смешанного типа, что обусловливало подвижность зубов I-II степени и развитие травматической окклюзии (индекс по Fuch 2,89±0,1 балла). Пародонтальный индекс составлял 3,45±0,1 балла.

На 14-й день выделения экссудата из ПК не отмечено, а кровоточивость дёсен сохранялась только у 2-х пациентов (6,6%). Среднее значение ИГ стабильно оставалось на низком уровне (1,1 ±0,17 балла), а индекс ПМА также резко снижался - 6,6±1,4 (Р<0,05). При рентгенологическом контроле отмечали четко выраженную тенденцию к восстановлению тканей пародонта и альвеолярной кости, за исключением 3-х человек. У этих пациентов наблюдали в последующем (на 6-й месяц) наблюдали признаки обострения и при посеве выявлены пародонтопатогенные бактерии S. irttermedius, а при проведении ПЦР - генетичекие маркеры Р. gingivalis (у 2-х пациентов) и Т. forsithia (у одного). В качественном отношении состав микробиоценоза поддесневой биоплёнки и ПК нормализовался и оставался стабильным на протяжении всего периода наблюдения до 1,5 лет.

Иная картина получена при традиционном лечении с применением линкомицина (гр. 4). На 7-й день на фоне проведения профессиональной гигиены и применения линкомицина, также отмечали благоприятные клинические результаты - индекс гигиены и ПМА достоверно снижались (ИГ с 2,8+0,25 до 1,3+0,1; ПМА с 47,0+3,6 до 19,05±1,2; Р<0,05). Частота выявления кровоточивости и выделения экссудата из ПК уменьшались в 3 и 4 раза соответственно. На 14-е сутки большинство клинических параметров соответствовало норме, но кровоточивость выявлена у 19,1 %, а экссудации не отмечали. Однако, уже через 3 месяца индексы ИГ и ПМА несколько увеличились по сравнению с данными на 14-й день, то есть непосредственно после применения линкомицина. При рентгенологическом контроле у 16 пациентов (76,1 %) отмечалась тенденция к восстановлению тканей пародонта, у 5 пациентов (23,8 %) признаков восстановления не было. Кроме того, мы обратили внимание на увеличение количества обострений ХГП в данной группе при контрольных

исследованиях в отдалённые сроки. Так, на 3-й месяц выявлено обострение с кровоточивостью дёсен и выделением серозного экссудата у 1 пациента (4,8 %); на 6-й месяц - у 3-х, на 12-й - у 5 пациентов (23,8 %). В более отдаленные сроки после лечения через 1,5-2 года рецидивы воспалительного процесса наблюдались уже у 7 пациентов данной группы (33,3 %). Столь большая частота выявления рецидивов, по-видимому, связана с сохраняющейся персистенцией основных пародонтопатогенных видов при лечении линкомицином, который не обладает способностью к бактерицидному действию на внутриклеточные бактериальные патогены.

Таким образом, анализ данных клинических, рентгенологических и микробиологических исследований показал стабильную эффективность лечения с применением мокси- и гемифлоксацина. При применении линкомицина, напротив, качество санации пародонтального кармана было достоверно ниже по всем контролируемым параметрам и отмечалась высокая частота рецидивов в отдалённые сроки. Сочетанное применение методов профессиональной гигиены и системного применения ФХ IV поколения обеспечивают полноценную санацию пародонтального очага инфекции и профилактику осложнений в период лечения и после его завершения.

ВЫВОДЫ

1. Проведённый мониторинг устойчивости штаммов пародонтопатогенных бактерий и представителей микрофлоры полости рта к антибактериальным препаратам (за период с 2005-2009 гг.) показал низкую частоту выявления устойчивых штаммов к фторхинолонам IV поколения (0,5 - 5 %) по сравнению традиционно применяемыми в стоматологии метронидазолом, линкомицином и клиндамицином (39,5 % и 17,0 - 18,5 % соответственно). Полученные данные о высокой чувствительности возбудителей и спектре активности ФХ IV поколения позволяют обосновать их применение для лечения ХГП.

2. Молекулярные маркеры бактерий, выделенных из пародонтального кармана больных ХГП, - белковые профили 16821

рибосом, при сопоставлении с данными традиционной идентификации возбудителей и ПЦР показали высокую чувствительность лазерной масс-спектрометрии (92,4 %) и могут быть включены в алгоритмы точной этиологической диагностики заболевания и контроля эффективности профессиональной гигиены в сочетании с антибактериальной терапией.

3. Моксифлоксацин, гемифлоксацин и гатифлоксацин по своей активности в отношении пародонтопатогенных бактерий и микрофлоры поддесневой биоплёнки (МПК90 составляет от 0,012 до 2,0 мкг/мл), существенно превосходят другие препараты из группы фторхинолонов и антибиотики, традиционно используемые в стоматологии.

4. Молекулярноые маркеры резистентности к фторхинолонам -плазмиды qnrA, qnrB и qnrS определяют устойчивость штаммов некоторых стабилизирующих, но не пародонтопатогенных видов, к налидиксовой кислоте и ципрофлоксацину (8 -15 % клинических изолятов К. pneumoniae, Р. oralis, V. parvula), при сохранении чувствительности к моксифлоксацину.

5. Клиническая эффективность применения моксифлоксацина и гемифлоксацина, подтверждённая результатами ПЦР-диагностики, позволяет рекомендовать препараты IV поколения для антибактериальной монотерапии в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита.

6. Клиническое применение моксифлоксацина в течение 10 дней для лечения больных ХГП лёгкой степени обеспечивает регресс клинической картины заболевания, полную нормализацию клинико-лабораторных параметров и эрадикацию пародонтопатогенных бактерий (А. actinomycetemcomitans, T.forsithia, Р. gingivalis, Р. intermedia, Т. denticola),

7. Клиническое применение гемифлоксацина или моксифлоксацина в течение 10 дней для лечения больных ХГП средней степени тяжести способствует нормализации клинической картины, обеспечивает длительную ремиссию, стойкое снижение частоты выявления Т. forsithia, Р. gingivalis (до единичных находок) и эрадикацию остальных пародонтопатогенных видов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В комплексном лечении больных ХГП легкой и средней степени тяжести рекомендуется проведение антимикробной химиотерапии с использованием препаратов фторхинолонов IV поколения (моксифлоксацин 400 мг, гемифлоксацин 300 мг) перорально в течение 10 суток, в сочетании с профессиональной гигиеной полости рта и традиционным пародонтологическим лечением.

2. Для контроля эффективности комплексного лечения ХГП показано применение мультиплексной полимеразной цепной реакции, позволяющей выявить генетические маркеры пародонтопатогенных бактерий 5 видов: А. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T.forsithia, Т. denticola.

3. Для ускоренной идентификации облигатно-анаэробных и пародонтопатогенных бактерий возможно применение лазерно-десорбционной масс-спектрометрии 168-рибосомальных белков.

4. При необходимости для определения механизмов резистентности микроорганизмов полости рта - возбудителей пародонтита целесообразно определение генно-плазмидного профиля возбудителей с помощью отечественной ПЦР-системы и чувствительности к антибиотикам in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Царев B.H. Ушаков Р.В., Ипполнтов Е.В., Бродский С.Е. «Перспективы применения фторхинолонов для антибактериальной терапии инфекционных процессов в стоматологии» // Стоматология для всех -2006. - № 4. - С.14-19.

2. Николаева E.H., Царев В.Н., Ипполитов Е.В., Горбачева Е.А. «Выявление резистентных штаммов анаэробных бактерий с помощью ПЦР в стоматологической практике» / Тезисы VIII международного конгресса MAKMAX/ASM по антимикробной терапии. - Москва. - 2006. - С. 29-30.

3. Николаева E.H., Царев В.Н., Ипполитов Е.В., Плахтий Л.Я., Валиева М.А. «Сравнительные результаты выявления резистентных штаммов анаэробных

бактерий в Москве и Владикавказе с помощью молекулярно-генетического метода» / Материалы IV съезда биотехнологов России - Пущино, 2006.-С.181-182.

4. Царев В.Н., Ушаков Р.В., Ипполитов Е.В., Царева Т.В. «Микробиологический мониторинг антибиотико-резистентности штаммов пародонтопатогенных анаэробных бактерий за 20 лет (1985-2005гг.)» / Материалы IV съезда биотехнологов России. - Пущино, 2006. - С.279-280.

5. Николаева E.H., Царев В.Н., Горбачева Е.А., Ипполитов Е.В., Логунов Н.А Полиморфизм генов HLA П класса в норме н у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта (ЧЛ) // Институт стоматологии. - 2006. - № 4 (33). - С.58 - 60.

6. Николаева E.H., Царев ВЛ., Горбачева Е.А., Ипполитов ЕЛ., Логунов H.A. Полиморфизм генов HLA П класса в норме и у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта (Ч.П) //Институт стоматологии - 2007. - № 3 (36). - С.110 -111.

7. Царев В.Н., Николаева EJL, Горбачева Е.А., Ипполитов Е.В. Полиморфизм генов HLA П класса у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом, ассоциированным с вирусами семейства Herpesviridae // Cathedra.- 2007.- № 1 (6). - С.50 - 53.

8. Ушаков Р.В., Царев В.Н., Ипполитов Е.В., Бродский С.Е. Бурдавицына М.В., Ушаков А.И. «Профилактика инфекционно-воспалительных послеоперационных осложнений в стоматологии» / Учебное пособие - Москва. УМО. - 2007,- 30с.

9. Шишкина И.М., Ипполитов Е.В., Чиркова Т.Д., Николаева E.H. Значение пародонтопатогенной и стрептококковой флоры в развитии хронического катарального гингивита // Образование, наука и практика в стоматологии: Сб. Трудов IV Всерос. научно-практич. конф. 6-9 февраля 2007 г. - Москва, 2007. -С. 219-221.

10. Ипполитов Е.В. «Результаты определения чувствительности анаэробных бактерий к фторхинолонам и перспективы их применения в стоматологии» /

Сборник трудов V Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии». - Москва - 2008. -С. 115-117.

11. Царев В.Н., Николаева E.H., Ипполитов Е.В. «Технологии генодиагностики в отечественной стоматологии: выявление пародонтопатогенных анаэробов, хламидий, герпес-вирусов и грибов» / Сборник трудов V Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии». -Москва - 2008. - С. 152-154.

12. Шишкина И.М., Ипполитов Е.В., Горбачева Е.А «Методы лабораторной диагностики хронического катарального гингивита» / Сборник трудов V Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии» - Москва - 2008.- С. 154-156.

13. Ипполитов Е.В. «Характеристика резистентности пародонтопатогенных бактерий к фторхинолонам и перспективы их применения в стоматологии» / Труды конференции. XXX (юбилейная) итоговая конференция молодых ученых МГМСУ. - Москва-2008.-С. 115-117.

14. Барер Г.М., Янушевич О.О., Царев В.Н., Парунова С.Н., Горбачева Е.А., Ипполитов Е.В. «Клинический и микробиологический контроль эффективности консервативного лечения воспаления пародонта у больных сахарным диабетом I типа»// «Стоматолог». - 2008,- № 5. - С.19-25.

15. Покровский В.Н., Николаева E.H., Горелова JI.A., Ипполитов Е.В. «Основы генетики микробов: бактерий и вирусов» / Учебное пособие. Москва. УМО. -2008. - 75с.

16. Царев В.Н., Плахтий Л.Я, Давыдова М.М., Николаева E.H., Валиева М.В, Горбачева Е.А., Ипполитов Е.В., Хубецова Н.О., Цховребов А.Ч. «Клинические, бактериологические, лабораторные методы исследования и стратегия антибактериальной терапии генерализованного пародонтита» / Учебное пособие. - Москва. УМО. - 2008. - 73 с.

25

17. Царёв В.Н., Быков A.C., Давыдова М.М., Ипполитов Е.В. и соавт. «Практикум лабораторных работ с иллюстрированными ситуационными заданиями по микробиологии, иммунологии и вирусологии» // под ред. A.A. Воробьёва, В.Н. Царёва. - М: МИА. - 2008. - 313с.

18. V. Tsarev, V. Chuvilkin, Е. Ippolitov. Susceptibility of Oral Anaerobic Bacteria to Fluoroquinolones of Various Generations and Molecular Characterization of Resistant Strains // International Journal of Infectious Diseases. - 2008. -Vol. 12. -№1. - P. 399.

19. Ипполитов E.B., Царев B.H. «Экспериментальное и клиническое обоснование применения фторхинолонов 4 поколения при комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита» / Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Обезболивание в стоматологии» Москва. - 2009.- С. 192-194.

20. Царев В.Н., Воложин А.И., Ильин В.К., Абрамова И.В., Ипполитов Е.В., Горбачева Е.А. «Перспективы применения пробиотиков из вейллонелл и стрептококков полости рта для повышения колонизационной резистентности тканей при комплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта (экспериментальное исследование)» / «Российская стоматология»- 2009.- Т.1. -№ 1. - С. 15-20.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ:

МПКзд - минимальная подавляющая концентрация для 90% штаммов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХГП - хронический генерализованный пародонтит

ФХ - фторхинолоны

ESI - электроспрейная ионизация (Electrospray Ionisation) MALDI - лазерная десорбционная ионизация в присутствии матрицы PMQR - плазмиды резистентности к фторхинолонам qnr - гены (плазмиды), кодирующие резистентность к ФХ Qnr - белки - продукты генов, кодирующих резистентность к ФХ

26

Подписано в печать 31.08.2009г. Тираж 100 экз. Заказ № 218. Отпечатано на ризографе в ООО «Профпринт». 107076,Москва,ул.Стромынка,д.18 т.(495)974-60-11 www.ccopy.ru

Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

Воспалительные заболевания пародонта представляют одну из наиболее актуальных проблем стоматологии. Обследования населения различных регионов нашей страны, проведённые в разных возрастных группах, свидетельствуют о крайне высокой распространенности воспалительных заболеваний пародонта. Установлено, что на уровень заболеваемости влияют возраст, территориальные особенности, сопутствующие заболевания, вредные привычки, профессиональные, социальные, генетические и другие факторы (Иванов B.C., 1989; 1993; Максимовский Ю.М., 1998; 2003; Кузьмина Э.М., 2009; Янушевич О.О., 2009). Аналогичные тенденции выявлены в работах • зарубежных исследователей. (Craig R.G. et al., 2003; Darby I.B. et al., 2005).

Ранние проявления в виде гингивита регистрируется уже в возрасте от 10-16 лет, а выраженные деструктивные изменения в пародонте с вовлечением в процесс костной ткани чаще выявляются у лиц старше 40 лет (Кузьмина Э.М., 2001; 2009; Dye В.A., Selwitz R.H., 2005).

Хронический генерализованный пародонтит (ХГП) является основной причиной потери зубов в средней и старшей возрастных группах населения, что определяет повышенное внимание исследователей к вопросам этиологии, патогенеза, диагностики и лечения данного заболевания (Барер Г.М., Лемецкая Т.И., 1996; 2002; 2008; Боровский Е.В., Иванов B.C., Максимовский Ю.М., Максимовская JT.H., 1998; 2005; Белоусов Н.Н., 2005; Дмитриева Л.А., 2007; 2009; Page R.S., Kornman K.S. 1997; Schroeder H.E., 1997; Dixon D. et al., 2004).

Многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов (Воложин А.И., 2002; Грудянов А.И., 1998; 2002; Максимовский Ю.М., 1998; 2003; Царёв В.Н. с соавт., 1996; 1997; 2001; Николаева Е.Н. с соавт., 2004; 2009; Плахтий Л .Я. с соавт., 2002; Socransky S.S. е.а., 2000; 2004; Mombelli А., 2001; 2002; Muller Н.Р.; 1997; 2004; Paster B.J. е.а., 2001; 2006), позволили выделить 3 основных группы этиологических факторов пародонтита:

1. инфицирование слизистой оболочки полости рта и колонизация дёсен пародонтопатогенными микробами (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Treponema denticola и некоторые другие анаэробные виды бактерий);

2. генетическая предрасположенность (анатомические особенности жевательной мускулатуры, нарушения прикуса, тип реактивности, первичный иммунодефицит, генетический полиморфизм по ИЛ-1, HLA DR , DQ и другим аллелям);

3. негативный экологический и социальный фон (курение, характер питания, профессиональная интоксикация, снижение жевательной нагрузки).

Микрофлора полости рта представляет собой многокомпонентную и многоуровневую систему, находящуюся в сложных метаболических и биохимических отношениях между собой и с макроорганизмом. Между отдельными видами бактерий, грибов и другими представителями микромира, населяющими полость рта, существуют многогранные отношения взаиморегуляции, которые основаны на явлениях микробного синергизма и антагонизма (Олейник И.И., 1991; Царев В.Н. с соавт., 1996; Aas J.A., Paster В J., 2005).

Накопленный за последние двадцать лет опыт исследования микрофлоры при воспалительных заболеваниях челюстно-лицевой области (ЧЛО), в том числе, пародонта, свидетельствует, что материал, взятый у таких больных, в подавляющем большинстве случаев (60-70 %, а иногда - до 90 %) содержит анаэробные бактерии определённых таксономических групп (Олейник И.И. с соавт., 1992; Кузнецов Е.А. с соавт., 1996; Царев В.Н. с соавт., 1997; 2001; 2009; Плахтий Л.Я., 2002).

В частности, рядом авторов получены убедительные данные о высокой частоте обнаружения при пародонтитах грамотрицательных анаэробных бактерий группы бактероидов, фузобактерий и спирохет, относящихся к определённым видам (Хазанова В.В. с соавт., 1996;

Дмитриева Н.А., Грудянов А.И., Овчинникова В.В., 2004; 2008; Дунязина Т.М., Bauermeister C.D., 2001; Царев В.Н., Николаева Е.Н., Максимовский Ю.М., с соавт., 2002; Zambon J J., 1996; Zhou Q., 2005).

Учитывая значительные сложности дифференцировки этих видов от представителей нормальной микробной флоры полости рта, в последние годы назрела потребность разработки новых методов экспресс-идентификации возбудителей гингивита и пародонтита, выявления генетической предрасположенности больных, биохимических и иммунных дефектов и, соответственно, определения стратегии их коррекции в практической пародонтологии (Царев В.Н. с соавт., 2005, 2007; Николаева Е.Н. с соавт., 2004; 2008; Янушевич О.О. с соавт., 2004; 2009; Мюллер Х.-П., 2004; Ньюман М., Винкельхофф А., 2004).

В связи с новыми данными о разнообразных механизмах резистентности к антибактериальым препаратам, выявленных в последние годы у анаэробных бактерий, особое значение для практики, несомненно, имеет проведение мониторинга чувствительности возбудителей пародонтита к используемым антибактериальным препаратам, изучение механизмов действия последних и генетического контроля резистентности у пародонтопатогенных микробов. Исследователи данной проблемы считают, что результаты внедрения методов молекулярной биологии и протеомики помогут сформулировать новую стратегию диагностики и антимикробной химиотерапии в практической пародонтологии, предложить эффективные схемы применения антибиотиков и других антимикробных химиопрепаратов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Повышение эффективности диагностики и антибактериальной терапии хронического генерализованного пародонтита на основе клинического, микробиологического, молекулярно-биологического мониторинга.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить возможность применения ФХ IV поколения в комплексном лечении ХГП с учётом данных мониторинга чувствительности выделенных штаммов и исследования спектра активности в отношении возбудителей.

2. Разработать методику ускоренной идентификации возбудителей, диагностические алгоритмы видовой и количественной характеристики микрофлоры поддесневой биоплёнки и пародонтального кармана до, во время и после проведения профессиональной гигиены в сочетании с антибактериальной терапией хронического генерализованного пародонтита.

3. Определить активность и минимальные подавляющие концентрации (МПК) препаратов группы ФХ II, III и IV поколений и антибиотиков, применяемых в стоматологической практике, в отношении пародонтопатогенных видов бактерий и микрофлоры полости рта.

4. Изучить частоту выявления и механизмы возникновения устойчивых штаммов пародонтопатогенных видов бактерий и представителей резидентной (стабилизирующей) микрофлоры полости рта.

5. Провести сравнительный анализ действия препаратов группы ФХ IV поколения на возбудителей и на клиническое течение ХГП, установить эффективность применения моксифлоксацина и гемифлоксацина при комплексном лечении заболевания в стадии обострения.

6. Апробировать и провести клинико-микробиологический контроль эффективности схемы применения моксифлоксацина ФХ IV поколения -гемифлоксацина и моксифлоксацина - для лечения ХГП.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В настоящей работе впервые систематизированы данные о чувствительности штаммов пародонтопатогенных бактерий (выделенных при ХГП в г. Москве за 2005-2009 гг.) к ФХ и некоторым антибиотикам, применяемым в стоматологической практике. Определена антибактериальная активность и МПК ФХ IV поколения в отношении пародонтопатогенных бактерий и микрофлоры полости рта, изучена частота обнаружения устойчивых штаммов и выявлены плазмидные механизмы резистентности.

Впервые в мировой практике установлено наличие плазмид qnr, несущих гены устойчивости к фторхинолонам {qnr A, qnrB и qnrS), у представителей резидентной флоры полости рта и их отсутствие у исследованных пародонтопатогенных видов.

Впервые проведён сравнительный анализ действия препаратов группы ФХ II-III-IV поколений на возбудителей и на клиническое течение ХГП. Разработаны схемы и рекомендации по применению новых препаратов — гемифлоксацина и моксифлоксацина в комплексном лечении больных ХГП, а также установлена высокая клиническая эффективность применения ФХ IV поколения при комплексном лечении заболевания в стадии обострения.

Впервые в России апробирован метод молекулярной протеомики -лазерная десорбционная масс-спектрометрия профилей 168-рибосомальных белков у штаммов анаэробных и пародонтопатогенных бактерий для ускоренной идентификации возбудителей пародонтита.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработан алгоритм этиологической диагностики пародонтита с использованием молекулярно-биологических методов исследования. Для ускоренного типирования облигатно-анаэробных и пародонтопатогенных бактерий предложено использовать масс-спектрометрию 16S-рибосомальных белков. Идентификационные спектры белкового профиля выделенных штаммов переданы в международный банк данных.

Апробирована методика изучения генно-плазмидного профиля устойчивости к ФХ у выделенных клинических изолятов анаэробных бактерий полости рта с помощью отечественной системы для ПЦР.

Предложены схемы лечения ХГП в фазе обострения с использованием препаратов ФХ IV поколения моксифлоксацина, гемифлоксацина и критерии оценки эффективности лечения.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Частота обнаружения чувствительных и устойчивых штаммов пародонтопатогенных видов бактерий к антибактериальным препаратам группы фторхинолонов и антибиотикам, применяемым в стоматологической практике, существенно различается (по данным кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ по г. Москве за 2005-2009 гг.).

2. Препараты группы фторхинолонов IV поколения — моксифлоксацин, гемифлоксацин, гатифлоксацин - имеют широкий спектр активности в отношении пародонтопатогенных бактерий и смешанной флоры воспалительных очагов в полости рта. МПК препаратов составляет от 0,012 до 2 мкг/мл, что существенно ниже, чем у других средств из группы фторхинолонов.

3. Для ускоренной идентификации пародонтопатогенных бактерий и выявления этиологии хронического генерализованного пародонтита целесообразно проведение прямого профилирования белков 168-рибосом с помощью лазерной десорбционной масс-спектрометрии.

4. Антибактериальная этиотропная терапия с применением фторхинолонов IV поколения является эффективной составляющей комплексного лечения хронического генерализованного пародонтита, что подтверждается данными клинико-лабораторного и микробиологического исследования, выполненными в ближайшие и отделённые сроки после начала лечения (3-6-12 и более месяцев).

5. Для оценки эффективности антибактериальной терапии хронического генерализованного пародонтита и решении вопроса её завершения необходимо проведение контроля эрадикации штаммов пародонтопатогенных бактерий с помощью ПЦР.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре госпитальной терапевтической стоматологии, пародонтологии и гериатрической стоматологии, кафедре стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО МГМСУ, кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, кафедре стоматологии ГОУ ДПО РМАПО, а также внедрены в лечебный процесс в Клинико-диагностическом центре, стоматологических клиниках ГОУ ВПО МГМСУ и других стоматологических поликлиниках г. Москвы.

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА

Автор лично проводил обследование и лечение пациентов, удовлетворяющих критериям включения в исследование, присутствовал на консультациях и операциях, производил забор материала для микробиологических исследований, самостоятельно проводил все виды лабораторных исследований, систематизацию и статистическую обработку полученных клинико-лабораторных данных и готовил публикации по теме диссертации.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам исследования опубликована 20 печатных работ, в том числе: 4 — в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения работы доложены и апробированы на:

• IV съезде Общества биотехнологов России (г. Пущино, 2006);

• VIII Международной конгресс MAKMAX/ASM (г. Москва, 2006);

• V Всероссийской конференциии общества биотехнологов России «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (г. Анапа, 2007);

• XXX итоговой конференции общества молодых учёных МГМСУ (2008);

• ХШ международном конгрессе по инфекционным болезням и антимикробной химиотерапии (г. Куала-Лумпур, 2008);

• V и VI Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» (г. Москва, 2008; 2009);

• совместном заседании кафедр: госпитальной терапевтической стоматологии, пародонтологии и гериатрической стоматологии; стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО МГМСУ, стоматологии ГОУ ДПО РМАПО, микробиологии с вирусологией и иммунологией ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского института НИМСИ при ГОУ ВПО МГМСУ (11 июня 2009 г.).

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

ВЫВОДЫ

1. Проведённый мониторинг устойчивости штаммов пародонтопатогенных бактерий и представителей микрофлоры полости рта к антибактериальным препаратам (за период с 2005-2009 гг.) показал низкую частоту выявления устойчивых штаммов к фторхинолонам IV поколения (0,5 - 5 %) по сравнению традиционно применяемыми в стоматологии метронидазолом, линкомицином и клиндамицином (39,5 % и 17,0 - 18,5 % соответственно). Полученные данные о высокой чувствительности возбудителей и спектре активности ФХ IV поколения позволяют обосновать их применение для лечения ХГП.

2. Молекулярные маркеры бактерий, выделенных из пародонтального кармана больных ХГП, - белковые профили 16S-рибосом, при сопоставлении с данными традиционной идентификации возбудителей и ПЦР показали высокую чувствительность лазерной масс-спектрометрии (92,4 %) и могут быть включены в алгоритмы точной этиологической диагностики заболевания и контроля эффективности профессиональной гигиены в сочетании с антибактериальной терапией.

3. Моксифлоксацин, гемифлоксацин и гатифлоксацин по своей активности в отношении пародонтопатогенных бактерий и микрофлоры поддесневой биоплёнки (МПК90 составляет от 0,012 до 2,0 мкг/мл), существенно превосходят другие препараты из группы фторхинолонов и антибиотики, традиционно используемые в стоматологии.

4. Молекулярноые маркеры резистентности к фторхинолонам -плазмиды qnrA, qnrB и qnrS определяют устойчивость штаммов некоторых стабилизирующих, но не пародонтопатогенных видов, к налидиксовой кислоте и ципрофлоксацину (8 - 15 % клинических изолятов К. pneumoniae, P. oralis, V. parvula), при сохранении чувствительности к моксифлоксацину.

5. Клиническая эффективность применения моксифлоксацина и гемифлоксацина, подтвёрждённая результатами ПЦР-диагностики, позволяет рекомендовать препараты IV поколения для антибактериальной монотерапии в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита.

6. Клиническое применение моксифлоксацина в течение 10 дней для лечения больных ХГП лёгкой степени обеспечивает регресс клинической картины заболевания, полную нормализацию клинико-лабораторных параметров и эрадикацию пародонтопатогенных бактерий (А. actinomycetemcomitans, T.forsithia, P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola).

7. Клиническое применение гемифлоксацина или моксифлоксацина в течение 10 дней для лечения больных ХГП средней степени тяжести способствует нормализации клинической картины, обеспечивает длительную ремиссию, стойкое снижение частоты выявления Т. forsithia, P. gingivalis (до единичных находок) и эрадикацию остальных пародонтопатогенных видов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В комплексном лечении больных ХГП легкой и средней степени тяжести рекомендуется проведение антимикробной химиотерапии с использованием препаратов фторхинолонов IV поколения (моксифлоксацин 400 мг, гемифлоксацин 300 мг) перорально в течение 10 суток, в сочетании с профессиональной гигиеной полости рта и традиционным пародонтологическим лечением.

2. Для контроля эффективности комплексного лечения ХГП показано применение мультиплексной полимеразной цепной реакции, позволяющей выявить генетические маркеры пародонтопатогенных бактерий 5 видов: А. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, Т. forsithia, Т. denticola.

3. Для ускоренной идентификации облигатно-анаэробных и пародонтопатогенных бактерий возможно применение лазерно-десорбционной масс-спектрометрии 168-рибосомальных белков.

4. При необходимости для определения механизмов резистентности микроорганизмов полости рта - возбудителей пародонтита целесообразно определение генно-плазмидного профиля возбудителей с помощью отечественной ПЦР-системы и чувствительности к антибиотикам in vitro.