Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Обоснование методики комплексного лечения рака легкого с использованием вихревого магнитного поля

005057045

На правах рукописи - <

БОДНЯ Вадим Николаевич

ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДИКИ КОМПЛЕКСНОГО ЛЕЧЕНИЯ РАКА ЛЁГКОГО С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВИХРЕВОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

1 3 ЛЕК 2012

Ростов-на-Дону -2012

005057045

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОСУДАРСТВЕННОМ БЮДЖЕТНОМ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ УЧРЕЖДЕНИИ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ (ректор университета - к.м.н. С.Н. Алексеенко)

Научные консультанты: д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН

Порханов Владимир Алексеевич

д.м.н., профессор

Бахмутский Николай Георгиевич

Официальные оппоненты: Джабаров Фархад Расимович

д.м.н., ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздравсоцразвития России, руководитель отделения лучевой диагностики и терапии

Решетов Игорь Владимирович

д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России, руководитель отделения микрохирургии

Стилиди Иван Сократович

д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» Минздравсоцразвития России, заведующий отделением абдоминальной онкологии

Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский

институт онкологии им. Н.Н.Петрова» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится _ /г 2012г. в часов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздравсоцразвития России (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздравсоцразвития России. Автореферат разослан » // 2012 года

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций д.м.н., профессор

Позднякова В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Рак легкого (PJI) - самое распространенное в мире онкологическое заболевание. За последние несколько десятилетий уровень заболеваемости РЛ вырос в десятки раз. Особенно это заметно в индустриально развитых странах, где эта патология занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости.

Среди злокачественных новообразований в России РЛ лидирует по распространённости и смертности. В нашей стране каждый год РЛ заболевает более 63000 человек. В России эта наиболее частая онкологическая патология встречается в 14% от всех злокачественных опухолей. Заболеваемость РЛ в нашей стране составляет 40,2 случаев на 100 тысяч населения в год. По смертности от злокачественных новообразований в России РЛ стоит на первом месте и составляет 36,5 на 100 тысяч населения в год (Порханов В.А., Барышев А.Г., Тесленко Л.Г. и соавт., 2010).

Лечение больных с нерезектабельным местно-распространённым немел-коклеточным раком лёгкого (НМРЛ) продолжает развиваться в течение последних двух десятилетий, но остаётся до настоящего времени недостаточно эффективным. Некоторые рандомизированные исследования представили результаты лечения пациентов с такой распространённостью процесса, в которых было отмечено, что при сопутствующей методике химиорадиотерапии наиболее высокая медиана выживаемости составляет от 16 до 17 месяцев (CurranWJ., Scott C.B., Langer C.J. et al., 2003, Zatloukal P.V., Pctruzelka L., Zcmanova M. et al., 2004). Таким образом, требуется новая стратегия подходов к лечению пациентов с НМРЛ, особенно с нерезектабельными опухолями (Huang С., Liu D., Masuya D., 2005, Cersosimo R.J., 2012).

Одной из попыток решения этой задачи является разработка в КубГМУ метода лечения злокачественных новообразований вихревым магнитным полем (ВМП), новизна которого заключается в одновременном и синхронном воздействии на все органы и системы больного вращающимся, плавно изменяющимся по амплитуде, магнитным полем. (Синицкий Д.А., 1982). Реализуется этот ме-

тод с помощью установки «Магнитотурботрон» (Синицкий Д.А., Синицкий С.Д., 1996).

Актуальную задачу для своих исследований мы видели в обосновании и оценке методики комплексного лечения именно HMPJI с включением в комплекс лечения, помимо традиционных методов, ВМП. Выполнение программы обоснования и оценки лечения возможны были только при проведении параллельно экспериментальных и клинических исследований.

Поэтому, мы решили в работе расширить исследования по изучению сфероидообразования, пролиферативной активности, апоптоза в клетках HMPJI, для теоретического обоснования возможности использования ВМП в клинике.

Так как в клинике планировались работы по изучению эффективности лечения в группах больных с распространённым НМРЛ, можно сказать генерализованным, встала актуальная проблема изучения влияния ВМП на процессы метастазирования в эксперименте и механизмы противоопухолевого влияния ВМП с учётом морфофункциональных изменений в периферических лимфоузлах (ЛУ) животного - опухоленосителя. Известно из литературы, что состояние регионарных к опухоли ЛУ часто оказывают решающее влияние на течение опухолевого процесса и во многом определяют 5-летнюю выживаемость онкологических больных (Цыплаков Д.Э., Петров C.B., 1997).

Оценка пролиферации стала популярной в онкологии и гистопатологии в последнее время, как средство предсказания биологического поведения опухоли, т.е. вероятности возникновения местного рецидива после проведения первичного лечения, метастатического потенциала новообразования и роста метастазов, и, самое главное, возможности прогнозирования выживаемости пациентов после того или другого метода лечения (Van Diest P.J, 2012). Кроме пролиферативной активности основным в прогнозе НМРЛ является экспрессия белков Ki-67 и р53 в опухоли. Показано, что индекс Ki-67 является независимым показателем при прогнозировании рецидивов и длительности жизни у больных раком лёгкого (Пожарисский K.M., Леенман Е.Е., 2000, Bai X.Z., Mas-

ters J.R., O'Donoghue N. et al, 1999, Jansen R.L., Hupperets P.S., Arends J.W. et al., 1998). Систематический обзор литературы убедительно показал, что мутация гена р53 и высокая экспрессия мутированного белка р53 в клетках рака лёгкого является плохим прогностическим фактором для выживаемости у пациентов с НМРЛ (Laudanski J., Niklinska W., Burzykowski Т., 2011).

Другим важным прогностическим фактором для НМРЛ является апоп-тоз. Можно ожидать менее агрессивное поведение опухоли с высокой скоростью апоптоза и, соответственно, больные должны прожить дольше те, у которых высокий уровень апоптоза в клетках опухоли. Но параллельно нужно ещё, чтобы у этих больных пролиферативная активность опухолевых клеток была низкой (Ghosh М„ Crocer J., Morris А., 2001, El-Deiry W. S., Kern S. Е.. Pietenpol J. A. et al., 2012).

В ранее проведенных исследованиях в ПНИЛ по использованию магнитных полей в онкологии КубГМУ, для оценки результатов лечения были использованы различные группы больных с генерализованными и локализованными формами злокачественных новообразований, такими как, рак молочной железы, меланома кожи, рак шейки матки, рак щитовидной железы и показана целесообразность использования ВМП в комплексном лечении этих новообразований (Бахмутский Н.Г., 2000, 2011, Лебедь Е.В., 2007).

Проведенные исследования позволяют расширить клинические изучения по противоопухолевой эффективности с включением других опухолей, например, РЛ (НМРЛ), где результаты лечения, пока ещё являются неутешительными.

Цель исследования

Улучшение результатов комплексного лечения нерезектабельного мест-но-распространённого немелкоклеточного рака лёгкого с использованием вихревого магнитного поля с теоретическим обоснованием такой методики лечения.

Задами исследования

1. Оценить в эксперименте, используя диффузионные камеры, сфс-

роидообразование клетками немелкоклеточного рака лёгкого;

2 Описать морфологическую картину роста клеток немелкоклеточного рака лёгкого в диффузионных камерах при воздействии вихревого магнитного поля с изучением их пролиферативной активности, апоптоза, фаз митозов, спектра патологических митозов;

3. Изучить влияние вихревого магнитного поля на кинетику роста перевиваемых опухолей РС-1 и карциносаркому Уокера;

4. Изучить сроки метастазирования опухоли в регионарные лимфатические узлы в эксперименте, используя морфологический метод верификации метастазов, на моделях лабораторных животных (РС-1 и карциносаркома Уокера);

5. Оценить морфофункциональные изменения в регионарных лимфоузлах при воздействии вихревого магнитного поля на перевиваемые опухоли в эксперименте (паракортикальная зона, синусы, посткапиллярные венулы, регенеративные центры);

6. Для прогностической оценки улучшения результатов лечения немелкоклеточного рака лёгкого с использованием вихревого магнитного поля оценить основные факторы, влияющие на выживаемость у этих больных - про-лиферативную активность с изучением фаз митозов, спектр митозов, уровень экспрессии антигена пролиферации Кл-67 и экспрессию антигена р53;

7. Изучить, как независимый прогностический фактор для выживаемости, апоптоз в клетках немелкоклеточного рака лёгкого пациентов, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля;

8. Оценить преимущества комплекса лечения больных нерезекта-бельным местно-распространенным немелкоклеточным раком лёгкого с включением вихревого магнитного поля по объективному эффекту лечения, токсичности, выживаемости в двух рандомизированных группах с использованием следующего дизайна исследования: группа А -химиолучевая терапия, группа В - с включением магнитотерапии.

Научная новизна исследования

Работа проводилась на основе научного открытия «Закономерность изменения пролиферативной активности опухолевых клеток под воздействием вихревого магнитного поля», зарегистрированного в 2007 году, (диплом №335), авторы: Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н.

В представленной диссертации:

- впервые показано, что при культивировании в диффузионных камерах клеток рака лёгкого суспензией или кусочком опухоли под воздействием ВМП отмечается снижение сфероидообразования;

- впервые выявлено подавление вихревым магнитным полем пролиферации с индукцией апоптоза в клетках рака лёгкого, культивируемых в диффузионных камерах;

- подтверждено, что вихревое магнитное поле угнетает рост некоторых солидных перевиваемых опухолей животных (карциносаркома Уокера, РС-1);

- впервые, моделированием опухолевого процесса у экспериментальных животных, установлено увеличение времени до появления метастазов, верифицированных морфологически, в регионарных лимфатических узлах при воздействии вихревого магнитного поля;

- впервые установлено, что вихревое магнитное поле влияет на морфо-функциональную перестройку периферических лимфоузлов животных, вызывая изменения в корковом и мозговом веществе узла, а также в паракортикаль-ной зоне, ассоциированные с благоприятным исходом при развитии опухоли;

- впервые выявлено, что при воздействии вихревого магнитного поля у животных-опухоленосителей в периферических лимфоузлах отмечаются мор-фофункциональные изменения, связанные с отсрочкой метастазирования в них, а именно: гиперплазия паракортикальной зоны, реакция первичных фолликулов коркового вещества с увеличением фолликулов со светлыми, герминативными центрами, увеличение площади посткапиллярных венул и синусовый гистиоци-тоз;

- впервые отмечено, что вихревое магнитное поле ингибирует пролифе-ративную активность и индуцирует апоптоз в опухолевых клетках пациентов с немелкоклеточным раком лёгкого, что является благоприятным прогностическим фактором для выживаемости;

- впервые, используя уровни экспрессии белков Ki-67 и р53, как независимые прогностические факторы, у больных немелкоклеточным раком лёгкого, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля, выявлено снижение их экспрессии, что благоприятно влияет на выживаемость;

- впервые отмечено улучшение объективного эффекта, снижение токсичности, увеличение выживаемости при комплексном лечении больных с не-резектабельным местно-распространённым немелкоклеточным раком лёгкого, с включением в комплекс, помимо лучевой и химиотерапии, вихревого магнитного поля.

Практическая значимость работы

Проведенные экспериментальные и клинические исследования позволяют рекомендовать включение вихревого магнитного поля в комплексный метод лечения нерезектабельного местно-распространённого немелкоклеточного рака лёгкого для использования в лечебных учреждениях с целью уменьшения токсичности и улучшения непосредственных и отдалённых результатов лечения.

Внедрение результатов исследования

Разработанный комплексный метод лечения нерезектабельного местно-распространённого HMPJ1 внедрён на краевом уровне и используется в Краевой клинической больнице №1 Краснодарского края, в ГБУЗ "Клинический онкологический диспансер №1" департамента здравоохранения Краснодарского края.

Основные положения, выносимые на защиту

- применение вихревого магнитного поля ингибирует пролиферативную активность опухолевых клеток и индуцирует апоптоз in vitro; в эксперименте вызывает угнетение роста перевиваемых опухолей с морфофункциональными из-

мснениями в периферических лимфоузлах, препятствующими раннему метаста-зированию;

- целесообразность использования вихревого магнитного поля в комплексе лечения немелкоклеточного рака лёгкого подтверждена улучшением результатов такой терапии - объективным эффектом, уменьшением токсичности, улучшению выживаемости, а также данными морфологических и иммуногисто-химических исследований.

Апробация диссертации состоялась 07 мая 2012 г. на заседании кафедры онкологии с курсом торакальной хирургии ФПК и ППС и отдела по использованию магнитных полей в онкологии ЦНИЛ ГБУ ВПО КубГМУ с участием сотрудников Краевой клинической больницы №1, сотрудников ГБУЗ "Клинический онкологический диспансер №1" департамента здравоохранения Краснодарского края.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: научно-практической конференции Южного Федерального округа «Актуальные проблемы клиники внутренних болезней», Владикавказ, 2007; на Международном конгрессе по онкохирургии, Краснодар, 2008; на Международном онкологическом научно-образовательном форуме ОНКОХИРУРГИЯ-2010, «В будущее через новые технологии», 31мая-02июня, 2010, Москва; на X Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении», 20-21 апреля 2011, Санкт-Петербург; на 34lh Annual Meeting of the Bioelectromagnetics Society, Brisbane, Australia, 17-22 June, 2012.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них 12 -в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 356 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований с заключениями по главам, практические рекомендации, выводы, указатель литературы,

включающий 111 отечественных и 354 зарубежных источников. Текст диссертации содержит 31 таблицу, 47 рисунков, 12 формул.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы в экспериментальных исследованиях.

Изучение влияния ВМП на опухолевые клетки PJI in vivo провели в 2-х экспериментах на крысах-самках линии Wistar. В 1-ом эксперименте использовали 10 животных, во П-ом - 12. Влияние ВМП на опухолевые клетки PJI человека изучали с помощью метода культивирования в диффузионных камерах

(ДК).

Культивирование клеток РЛ провели в 1-ом эксперименте суспензией клеток, во П-ом - кусочками опухоли. Все работы с опухолевой тканью проводили в стерильных условиях в ближайшие 3-4 часа после выделения кусочков опухоли из операционного материала или взятых во время бронхоскопии. Морфологической формой РЛ во всех экспериментах был немелкоклеточный рак лёгкого (плоскоклеточный) (НМРЛ).

Для изготовления ДК применяли мембранные фильтры «Миллипор» (производство США) с диаметром пор 0,22 мкм. Клеточную суспензию содержащую 106 опухолевых клеток в объеме до 0,1 мл, наносили с помощью микродозатора на большой фильтр. После этого монтировали собственно камеры.

Под гексеналовым наркозом (100 мг/кг массы животного, внутрибрю-шинно) осуществляли имплантацию камер в асептических условиях. Гексенал в указанной дозировке обеспечивал продолжительность наркоза около 15-20 мин. В брюшную полость крысы имплантировали до 5 ДК. Животных, носителей камер, содержали в виварии в клетках.

Через сутки после введения ДК животных подвергали действию ВМП, генерируемого установкой «Магнитотурботрон», продолжительность воздействия составляла 10 суток. Животных контрольной группы содержали в одинаковых условиях, но воздействию ВМП не подвергали. Для воздействия магнитное поле в эксперименте имело следующие параметры: индукция при максималь-

ном значении - 3 мТ, частота вращения - 6000 об/мин, длительность периода изменения индукции от нуля до максимума и обратно до нуля (1 цикл)= 120 сек. Продолжительность суточного воздействия составляла 180 мин (90 циклов).

На 11 сутки эксперимента животных забивали под эфирным наркозом, извлекали ДК, на фильтрах готовили тотальные цитологические препараты.

Кусочки опухолей PJ1 во втором эксперименте получали из биоптатов больных Краснодарской краевой больницы. Готовые камеры с фрагментами опухолей помещали в свежую порцию среды 199 с бычьей сывороткой, где они находились до момента имплантации животному - реципиенту.

Сформированные ДК имплантировали в брюшную полость так же, как описано выше для клеточных суспензий в 1-ом эксперименте и все мероприятия в дальнейшем были аналогичными.

Для оценки пролиферативной активности опухолевых клеток PJI, использовали такие критерии как индекс эффективности сфероидообразования (ИЭС) и митотический индекс (МИ), который определяли по количеству митозов на 100 клеток.

Расчет ИЭС, выраженного в процентах, осуществляли по формуле: ИЭС =[ (А-В): А] х100%

где А - среднее количество сфероидов в контрольной группе, В - среднее количество сфероидов в опытной группе.

МИ определяли путем подсчета числа делящихся клеток в 30 случайно выбранных полях зрения при 400 - кратном увеличении по отношению к общему числу проанализированных клеток и выражали в процентах. Считали общее число митозов, из которых затем выделяли нормальные и патологические формы. В нормальных митозах различали 4 фазы (профазу, метафазу, телофазу, анафазу). Патологические митозы были разбиты по спектру.

Клетки с признаками апоптоза определяли визуально под микроскопом. Подсчитывали среднее количество клеток, имеющих признаки апоптоза в 30

случайно выбранных полях зрения при 400 кратном увеличении. Апоптозный

индекс (АИ) рассчитывали по формуле:

,„ число апоптозныхклеток .

АИ =-X 100%

общее число опухолевых клеток

Экспериментальные исследования с перевиваемыми опухолями проводили на животных разведения питомников "Столбовая" и "Рапполово", использовали крыс линии \Vistar (самок весом 80-120 г), содержащихся в условиях вивария на обычном рационе. Было проведено 5 экспериментов. В каждом эксперименте методом рандомизации было сформировано по три группы, две опытные и одна контрольная по 20 животных в каждой.

Перевивку опухолей осуществляли с соблюдением правил асептики и антисептики. Для определения противоопухолевой активности ВМП использовали такие параметры, как: динамику изменения среднего объёма опухолей; изменения средних удельных скоростей роста опухолей и их обратные отношения; процент торможения роста опухоли; процент увеличения продолжительности жизни опытных животных; коэффициент активности торможения опухолевого роста.

В работе приведены данные по противоопухолевому влиянию ВМП на следующие виды перевиваемых опухолей - карциносаркому Уокера и РС-1.

Для лечебного воздействия магнитное поле имело следующие параметры: индукция при максимальном значении - ЗмТ, частота вращения - 6000 об/мин, длительность периода изменения индукции от нуля до максимума и обратно до нуля (1 цикл) - 120 сек. Продолжительность процедуры 50 мин (25 циклов). Для проведения процедуры группу животных-опухоленосителей помещали в пластиковых коробках в рабочую полость индуктора установки "Магнитотурботрон" при нулевой индукции ВМП. Контрольных животных содержали во время процедуры в таких же условиях, только в полости имитированного индуктора.

Морфологическое изучение периферических к опухоли ЛУ начинали с усыпления животного, затем вырезали опухоль и регионарные ЛУ (латеральные

и контрлатеральные). Полученный материал фиксировали в нейтральном 10% формалине. Фиксировали весь пояс лимфатического узла с окружающей тканью. Проводку материала после фиксации, а также приготовление гистологических препаратов проводили по общепринятой методике. Срезы толщиной 5-7 мк окрашивали согласно известным методикам.

Для количественной оценки клеточных и структурных элементов ЛУ использовали морфометрическую сетку Автандилова Г.Г. Исследованию было подвергнуто по 5 животных из каждой группы, у которых было взято по 5 ЛУ.

Материал и методы в клинических исследованиях Пациенты, опухолевый материал которых использовался в морфологических исследованиях. В исследование было включено 20 пациентов с нерезек-табельным местно-распространённым НМРЛ, с гистологическим диагнозом -плоскоклеточный рак. Пациентам провели 30 процедур ВМП на установке «Магнитотурботрон» при индукции поля в ЗмТ и частотой - 100 Гц. Все пациенты на момент магнитотерапии проходили дополнительные исследования или у них агрессивные методы лечения проводить было нельзя из-за сопутствующих заболеваний. Всем больным перед магнитотерапией и после неё выполняли фиброволоконную бронхоскопию с биопсией. На проведение таких мероприятий было дано устное согласие больного.

Методика изучения митотического режима опухолевых клеток. Про-лиферативная активность опухолевых клеток оценивалась по изучению митотического режима опухоли. При изучении митотического режима принимали во внимание совокупность количественных показателей, характеризующих мито-тическое деление клеток: а) показатель митотической активности, или МИ -число митозов на 100 клеток, выраженное в процентах; б) процентное соотношение делящихся клеток, находящихся на разных стадиях митоза; в) относительное число всех патологических митозов, выраженное в процентах к общему числу митозов; г) относительное количество отдельных разновидностей патологии митоза, выраженное в процентах к общему числу митозов.

Для изучения этих показателей использовали обычные гистологические парафиновые срезы кусочков опухолей толщиной 7-10 мкм, окрашенные гематоксилином-эозином или железным гематоксилином по Гейденгайну. Подсчёт митозов проводили с иммерсионным увеличением микроскопа, не менее чем в 100 полях зрения.

Методика выявления антигена Ki-67. Для оценки изменений, связанных с опухолевой клеточной пролиферацией, оценивали присутствие этого белка в злокачественных клетках иммуногистохимической (ИГХ) реакцией, которая является достаточно простой, может быть выполнена в большинстве лабораторий и описана в известных работах [Demarchi L.M., Reis М.М., Palomino S.A. et al., 2000].

Для Ki-67 опухолевые клетки считались положительными, если присутствовало какое-нибудь ядерное окрашивание.

Индекс Ki-67 был определён, как процент опухолевых клеток, воспроизводящих ядерную иммунореактивность и рассчитывался путём подсчёта в каждом срезе числа окрашенных клеток на ядерный Ki-67 в 1000 опухолевых клетках. Изучался один срез от каждой опухоли с увеличением хЮО, по крайней мере, в двух или трёх направлениях. Подсчёт клеток проводили при х400 не менее чем в семи полях зрения. Индекс >25% классифицировался как высокий [Scagliotti G.V., Micela M., Gubetta L. et al„ 1993].

Методика выявления антигена p53. ИГХ окрашивание было выполнено на фиксированных формалином и залитых в парафин образцах тканей плоскоклеточного PJI, используя авидин/биотиновый метод (ABC Kit Novocastra) с моноклональными антителами против р53 (clone DO-7, Novocastra Lab. Ltd, Newcastleupon-Tyne, UK, разбавленные 1:100) и стрептавидин/биотин комплектом (LSAB, DakoDenmark). Р53 антитела могут реагировать с дикими и мутант-ными типами белка р53.

Результаты ИГХ окрашивания были оценены при световой микроскопии, оценку вели путём подсчёта 1000 клеток в пяти случайно выбранных по-

лях опухоли (х400). Случай отмечался как положительный, если более 10% раковых клеток имели ядерное окрашивание белка р53.

Оценка апотпоза в опухолевых клетках. Изучение проводилось с использованием TUNEL - метода и параллельным подсчётом клеток с характерными признаками апоптоза в гематоксилин-эозин окрашенных стёклах.

Подсчёты клеток с признаками апоптоза вели в 10 полях зрения под масляной иммерсией. 10 полей зрения выбирали из разных частей опухоли, исключая области нормального эпителия, волокнистой стромы и некроза. АИ рассчитывался аналогично эксперименту.

Дизайн клинического исследования. Дизайн исследования представлен на рисунке 1. Пациенты с HMPJI (п = 102) были рандомизированы в 2 группы: А -контрольная (п = 52) и В - основная (п = 50).

р

Е

г и

с

т р

л Ц

и я

Стандартная химиолучевая терапия (п = 52)

Стандартная химиолучевая терапия + ВМП

(п = 50)

Паклитаксел 50 мг/м IV/ 1 час / неделю КарбоплатинАиС 2 IV / 30 мин / неделю ЛТ-СОД66 Гр

Тоже + ВМП за неделю до начала х/л лечения

во время всего курса х/л лечения неделя после х/л лечения Параметры воздействия ВМП: Индукция поля - ЗмТ, время - 45 мин, б дней в неделю

Рис 1. Дизайн исследования.

Почти по всем признакам больные в двух группах были равноценны. В основном группы изучения были представлены мужчинами. Так, в группе А, мужчины составляли 75%, в группе В - 67,3%. Средний возраст пациентов в обеих группах составлял 63 - 64 года, с разбросом от 37 до 71 года. Функциональный статус 0 или 1 был у 22-25 и 27-28 пациентов, соответственно. Потеря веса до лечения меньше, чем на 5% зарегистрирована у 30-33 пациентов, более 5% у 25-28 пациентов, соответственно, для двух групп. По распространённости

болезни группы были равноценны, так, в основной группе В больных с III "А" стадией было 24, с III "В" - 28, в контрольной группе А с III "А" стадией - 25 пациентов, с III "В" - 25.

Изучение проводилось с января 2005 года по декабрь 2007 года. Подходящие для исследования пациенты имели гистологическое или цитологическое заключение о наличии HMPJI (плоскоклеточный вариант). Больные, включённые в изучение, имели первичные нелеченные нерезектабельные или инопера-бельные опухоли в III стадии болезни. Пациентов с распространением N3 включали в исследование, если вся масса опухоли могла быть охвачена полем при радиологическом лечении. Больные с надключичными, скаленными или контрлатеральными воротными ЛУ, поражёнными метастазами, прямой инвазией в тело позвонков или с плевральными выпотами были исключены. Все пациенты имели измеряемые или подлежащие измерению опухоли. Другими дополнительными критериями исследования были: функциональный статус от 0 до 1, возраст от 18 лет и старше, отсутствие беременности. В дополнение, у больных объём форсированного выдоха за 1 секунду должен быть более 800 мл. Радиологические исследования включали компьютерную томографию (KT) или магнитно-резонансную томографию (МРТ) грудной клетки и верхней части живота, в том числе печени и надпочечников, а также сканирование костей, которые выполняли в течение 28 дней после регистрации. Каждый участник нашего исследования подписал протокол с информируемым согласием на участие в программе.

Для группы А пациенты получали еженедельно паклитаксел 50 мг/м2 в/в (1час) в течение 7 недель подряд, с карбоплатиной после введения паклитаксела по AUC из двух введений в/в (30 минут). Параллельно проводилась лучевая терапия до 66 Гр по пять фракций в неделю в течение 7 недель подряд по 2Гр на фракцию.

Для больных группы В параллельно схеме химиорадиотерапии, описанной выше, проводили магнитотерапию на установке «Магнитотурботрон». Магнитотерапию начинали за неделю до начала проведения химиолучевой те-

рапии, затем проводили её параллельно весь период химиолучевой терапии и далее ещё в течение недели после её окончания. Магнитотерапия проводилась при следующих параметрах поля: частоте - 100 Гц или вращении 6000 об/мин, индукции - ЗмТ и продолжительности процедуры - 50 минут.

Облучение грудной клетки начинали сразу же после рандомизации пациента в группе А, а в группе В после недельной магнитотсрапии. Лучевая терапия проводилась в условиях Краснодарского краевого онкологического диспансера на отечественных гамма-установках. Объём излучения, так называемый целевой, состоял из базового и повышенного объёма облучения.

Целевая доза для базового объёма была 44 Гр за 22 фракции по 2 Гр/на фракцию; целевая доза увеличенного объёма была 22 Гр за 11 фракций.

50% карбоплатина и паклитаксела вводились при количестве тромбоцитов от 50000 до 74999/|л.Ь или гранулоцитов от 1000 до 1499/цЬ в день планового лечения. Для тромбоцитов менее 50000/цЬ и гранулоцитов меньше, чем 1000/цЬ химиотерапия не проводилась.

При нейротоксичности 3 степени или более химиотерапия проводилась до изменения на степень 1 или меньше и возобновлялась на 75% от проводимой дозы. Для всех других токсичностсй 3 степени - исключая алопецию, тошноту, рвоту, усталость и потерю аппетита карбоплатин и паклитаксел был снижен на 25%.

Для эзофагита, мукозита, стоматита и дерматита 3 степени во время лучевой терапии паклитаксел вводился и карбоплатин тоже. Паклитаксел был возобновлён в 50% от дозы, как только токсичность решили оценивать как степень 2. Для токсичности 4 степени, весь протокол терапии был проведен и возобновлялся после разрешения токсичности до степени 2. Для пациентов со снижением функционального статуса до 3 или более лучевая терапия была завершена без дальнейшей химиотерапии.

Расчёт выживаемости проводился методом Каплана-Мейера. Статистическая обработка данных проводилась с помощью методов вариационной статистики, используя как параметрические критерии ^-критерий Стьюдента), так

и непараметрические (критерии Вилкоксона, Манна-Уитни). Использовали программу 81ай$1ка 6.0. Значимость различий при оценке выживаемости определяли по Ьо§Яапк тесту.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сфероидообразование, пролиферативная активность в клетках рака лёгкого, культивируемых в диффузионных камерах взвесью клеток.

В контроле на момент изучения (11 сутки культивирования) на поверхности миллипоровых фильтров было отмечено формирование многослойных колониеподобных структур - сфероидов, состоящих из округлых или удлиненных клеток, ориентированных по спирали вокруг центра такого образования.

Митозы чаще наблюдали в клетках внешних слоев опухолевых сфероидов, в отличие от клеток в центре сфероидов, в которых клетки НМРЛ имели мелкие ядра и темную цитоплазму. В монослое пролиферирующие клетки располагались довольно равномерно, в единичных клетках отмечался апоптоз.

В монослое и сфероидах клетки НМРЛ были полиморфными, в основном, крупными округлыми или веретенообразными, ядра нередко имели продолговатую форму, встречались двуядерные варианты и «голые ядра». Клетки были или со светлыми, бедными хроматином, или с резко гиперхромными ядрами, хроматин имел полиморфную структуру - нежную, петлисто-зернистую, крупноглыбчатую. Ядрышки - крупные, интенсивно окрашенные, их количество в некоторых клетках было увеличено - два, три и более. В монослое митозы в опухолевых клетках наблюдали относительно равномерно.

Было подсчитано, что клетки НМРЛ на 11-е сутки культивирования в ДК на фильтре образуют, в среднем, 30,15 + 7,12 сфероидов.

МИ в контрольной группе был высоким и в среднем по группе составил 17,24 ± 3,05%, патологические формы выявлены в 49,59 + 2,03%, нормальные -в 50,41 ± 1,27% от общего числа митозов.

Соотношение фаз митозов было представлено следующим образом: ме-тафазы преобладали над другими фазами митозов и составляли 67,48 ± 1,43 %,

профазы - 16,21 ± 2,01%, а анафазы и телофазы, соответственно, 7,89 ± 0,62% и 8,42 ± 0,32%.

Наиболее часто в спектре патологических форм митозов в контрольной группе встречались: рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе (25,8%); многополюсные митозы (18,4%); асимметричные митозы (15,3%); трехполюсные митозы (11,8%); отставание хромосом и их фрагментов в анафазе (8,2%); комковатая метафаза (9,4%).

Сферондообразование, пролиферативная активность, апоптоз клеток рака лёгкого, культивируемых суспензией в диффузионных камерах при воздействии вихревого магнитного поля.

При воздействии ВМП на опухолевые клетки суспензии НМРЛ, культивируемые в ДК общая морфологическая картина значительно отличалась.

Во-первых, изменения касались числа сфероидов на фильтре и их структуры. Число сфероидов снижалось, на некоторых фильтрах значительно. При их подсчете выявлено, что, в среднем, их количество было равно 12,32 ± 5,12 (р < 0,05) , таким образом, ИЭС при воздействии ВМП был равен 59,6%, что говорит об угнетении пролиферативной активности опухолевых клеток.

В структуре сфероидов отмечалось значительное обеднение их эпите-лиоцитами. В клетках часто наблюдали дистрофические изменения, чаще выявляли патологические митозы. Во многих клетках отмечали апоптоз. Из особенностей нужно отметить появление гигантских клеток с резко выраженной ги-перхромией ядра. Фибробласты активно делились, в них не было дистрофических изменений и патологических митозов.

В опыте МИ был достоверно ниже контрольного и составлял 10,06 + 2,32% (р < 0,05).

Нормальные митозы отмечены в 27,84 + 1,73% от общего числа митозов. Среди фаз митозов намного преобладали метафазные пластинки и составляли 74,46 ± 1,22%. Профазы в исследуемом материале встречались значительно ре-

же - в 11,59 ± 0,05%, анафазы составляли 7,52 + 0,28% в исследуемом материале, а телофазы - 6,43 ± 1,25%.

Патологические митозы составляли 72,16 ± 0,07% от общего числа митозов. Формы патологических митозов распределялись следующим образом: рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе - 33,7%; многополюсные митозы - 21,1%; комковатая метафаза - 15,6%; асимметричные митозы - 7,9%; мосты - 6,9%; отставание хромосом и их фрагментов в анафазе - 5,6%.

При изучении апоптоза клеток НМРЛ, культивируемых в ДК в виде суспензии установлено, что ИА в контроле ниже, чем в клетках, подвергавшихся воздействию ВМП (5,17 ± 0,60% - в опыте, 2,03 + 0,64% - в контроле, р < 0,05).

Сфероидообразование, пролиферативнсы активность клеток рака лёгкого, культивируемых в диффузионных камерах кусочками опухоли.

В контроле НМРЛ, культивируемого кусочком ткани в ДК, на 11-е сутки эксплантации среди многочисленных лимфоцитоподобных клеток и макрофагов по краям эксплантата наблюдались значительные разрастания эпителио-подобных элементов в виде участков монослоя и отдельных колоний и образования множества сфероидов различной величины.

Эпителиальные клетки были преимущественно крупными, но встречались также клетки среднего и мелкого размеров. Форма клеток рака легкого была самой разнообразной - полигональной, вытянутой, лентовидной. Ядра в клетках крупные, чаще гиперхромные, но встречались и светлые. Иногда ядра имели неровные контуры и были разнообразны по форме - округлые, палочковидные. Хроматин в ядрах был распределен неравномерно, ядрышки немногочисленны, размеры их варьировали от мелких до очень крупных, часто необычной уродливой формы. Иногда пласты эпителиальных клеток были довольно обширными, как в центре, так и по периферии фильтра. Митозы в эпителиальных клетках монослоя распределялись довольно равномерно, как в эпителиальных скоплениях, так и в сфероидах. Митозы чаще регистрировались в клетках, располагающихся на периферии этих образований.

Рост фибробластоподобных клеток наблюдался преимущественно в центре фильтра в виде монослоя, где фибробласты образовывали небольшие островки или тяжи между эпителиальными разрастаниями и участвовали в формировании сфероидов. Сфероиды представляли собой многослойные колониепо-добные структуры, состоящие преимущественно из эпителиальных клеток, ориентированных по спирали вокруг центра такой структуры. Границы этих организованных клеточных скоплений обычно были четко очерчены.

Спектр патологических митозов в клетках РЛ в контрольной группе в порядке убывания процентного соотношения был представлен следующим образом: многополюсныс митозы составляли 29,07%; рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе - 18,47%; асимметричный митоз - 17,94%; трех-групповая метафаза - 14,09%; комковатая метафаза - 10,12% и т.д.

Сфероидообразование, пролиферативная активность, апоптоз в клетках рака лёгкого, культивируемых в диффузионных камерах кусочками опухоли при воздействии вихревого магнитного поля.

Воздействие ВМП значительно меняло морфологическую картину культивируемых эксплантатов плоскоклеточного РЛ на фильтре ДК.

Подсчет числа сфероидов на фильтре и его среднее значение было меньше, чем в контроле. Если среднее значение числа сфероидов в контроле было равно - 26,17 ± 0,42, то в опыте достоверно снижалось до 11,42 ± 0,21 (р < 0,05), а индекс эффективности сфероидообразования был равен 56,4%, что соответствовало ингибиции образования сфероидов.

В опыте изменения касались и структуры самих сфероидов. Наблюдалось значительное обеднение их эпителиальными клетками, замещение фиб-робластами, что соответствовало так называемой фибробластной селекции. Во многих участках сфероидов эпителиальные клетки были в состоянии дистрофии, митотическая активность снижалась, чаще выявляли патологические митозы. Иногда можно было наблюдать полную деструкцию сфероидов.

В монослое эпителиальные клетки по своей форме не отличались от контроля, но их скомпонованность была меньшей, часто наблюдали клетки с

дистрофическими изменениями. Дистрофические изменения в клетках оценивали по разрежению структуры хроматина интерфазных ядер, уплотнению, из-резанности контуров ядерной мембраны и фрагментации ядер, уменьшению количества ядрышек в ядрах. Встречались клетки с гиперхромными ядрами, наблюдали гигантские формы раковых клеток. В некоторых клетках хроматин был сконцентрирован на ядерной оболочке в виде глыбок. Митозы в эпителиальных клетках монослоя встречались нечасто, в основном они были представлены патологическими формами.

В некоторых препаратах зона роста эпителиальных клеток вокруг трансплантата вовсе отсутствовала. Что касается роста фибробластов в зоне трансплантата, то они образовывали разрастания, состоящие из крупных клеток с длинными переплетающимися отростками. Далее по фильтру они располагались довольно равномерно, с концентрацией вокруг сфероидов. В фибробла-стах наблюдали митозы, патологических не встречали.

Установлено, что МИ клеток РЛ достоверно снижается при воздействии ВМП. Так, в клетках РЛ, подвергавшихся воздействию на 11-ые сутки культивирования он был равен 19,68 ± 2,59%, при его значении в 24,31 ± 3,97% - в контроле (р < 0,05). Отмечено увеличение процентного содержания патологических митозов в опыте. Так при воздействии ВМП нормальные митозы составляли 8,03 ± 0,32%, в контроле - 22,08 ± 1,09%. Патологические митозы, соответственно, встречались чаще в опыте и были отмечены в 91,97 ± 0,32%, при 77,92 ± 1,09% - в контроле.

В клетках, подвергавшихся воздействию, отмечено преобладание мета-фаз над профазами и другими формами митозов. Так в контрольной группе профазы составляли 25,66 ± 1,23%, в опыте отмечалось их снижение до 11,12 + 1,14%, при нарастании процентного содержания в опыте метафаз (метафазы в контроле - 38,18 ± 4,11%, в опыте - 62,03 + 7,23%). Соответственно, снижалось процентное содержание анафаз и телофаз в опытной группе.

Было отмечено, что при воздействии ВМП спектр патологических митозов менялся, и преобладала патология митоза, связанная с повреждением мито-

тического аппарата. Поэтому спектр патологических митозов в опыте выглядел так: многополюсные митозы составляли 27,37%;рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе - 26,21%; комковатая метафаза - 19,54% и т.д.

При изучении апоптоза в опухолевых клетках было отмечено, что клетки в состоянии апоптоза встречались как в опытной группе, так и в контрольной, но число этих клеток было значительно больше в опыте. Так, ИА в контроле был равен 0,78 + 0,11%, а в опыте достоверно увеличивался до 4,97 ± 0,47% (р< 0,05).

Кинетика роста перевиваемых опухолей РС-1 и карциносаркомы Уокера и морфофункционалъные изменения в лимфоузлах, регионарных к перевиваемым опухолям у крыс при воздействии вихревого магнитного поля.

В контрольной группе А (без опухоли и без воздействия В МП) по отношению к площади среза ЛУ структурные элементы составляли: паракортикаль-ная зона от 6,34±0,86% до 7,09±0,46% от всего среза ЛУ на определенные сроки эксперимента (без достоверных различий); посткапиллярные венулы от 1,86±0,24% до 2,14±0,35% (без достоверных различий); фолликулы с реактивными светлыми центрами от 1,84±0,11% до 2,12±0,52% (без достоверных различий); синусы от 12,32±1,42% до 11,70±1,65% (без достоверных различий). Морфометрические исследования показали, что число лимфоидных фолликулов, в среднем по группе, составляло от 3,30+0,15 до 3,22+0,15, а со светлым центром от 0,87+0,11 до 0,83+0,9.

В контрольной группе В (без опухоли, воздействие В МП 3 мТ), начиная с 15 и до 30 дня, в параузловой жировой клетчатке ЛУ формировалось большое число приводящих лимфатических сосудов. Эндотелиальные клетки, выстилающие внутреннюю поверхность лимфатических сосудов, были крупными, имели светлое бобовидное ядро и располагались в два, три ряда. В некоторых препаратах определяли эндотелиальные клетки в состоянии митоза. В просвете этих сосудов можно было видеть клетки лимфоидного ряда.

Паракортикальная зона была гиперплазированной. По площади, она на всех этапах воздействия, достоверно была больше, чем её площадь в контроле

А (15 день - 9,12±0,62, контроль А - 7,09±0,4б, р < 0,05) и эта тенденция сохранялась до 40 дня - 9,05±0,24 (контроль А - 6,78±0,84, р < 0,05). В ней, в отличие от контроля А, можно было наблюдать большее число посткапиллярных венул с высоким эндотелием. Площадь посткаппилярных венул на всех этапах воздействия была больше, чем в контроле А.

Морфометрические исследования указали на отсутствие статистически достоверного отличия от контроля А величин, характеризующих число лимфо-идных фолликулов, однако число фолликулов со светлым центром было статистически достоверно выше после 15, 20, 25, 30, 35, 40-й процедуры соответственно 2,59±0,16 (контроль 0,83+0,10, 1=9,39), 2,26±0,17 (контроль 0,83±0,09, 1=7,41), 2,57±0,14 (контроль 0,85±0,11, 1=9,84), 2,50+0,17 (контроль 0,87±0,11, 1=7,97), 2,32±0,14 (контроль 0,74±0,18, 1=9,50), 2,20±0,12 (контроль 0,78±0,13, 1=9,32).

Если говорить о площади лимфоидных фолликулов, то она также значительно превосходила таковую в контроле А на всех этапах воздействия (на 15 -6,03±0,54, в контроле А - 2,01+0,02, на 40 - 5,74±0,32, в контроле А - 2,08±0,12, в обоих случаях р < 0,05).

Отмечался также синусовый гастиоцитоз.

В контрольной группе С (без опухоли, воздействии ВМП15 мТ) паракор-тикальная зона по площади достоверно была больше контроля А на 15, 30, 45 сутки воздействия, но она была не столь гиперплазирована, как в контроле В. Через нее проходили посткапиллярные венулы различного калибра и по площади они мало отличались от контроля В, различия с контролем А были также существенными.

Морфометрические исследования указали на наличие статистически достоверного отличия от контроля А величин, характеризующих число лимфоидных фолликулов после 15, 20, 25,30, 35 и 40-ой процедуры соответственно, 4,09±0,20 (контроль 3,26+0,12, 1=3,57), 5,37±0,28 (контроль 3,22+0,15, 1=6,88), 6,52+0,27 (контроль 3,24±0,16, 1=10,58), 5,37+0,28 (контроль 3,30+0,15, 1=6,61), 4,62+0,32 (контроль 3,12+0,17, 1=3,9), 4,32+0,24 (контроль 3,05+0,24, 1=0,98).

Число фолликулов со светлыми центрами было также статистически достоверно выше контрольных А после 15, 20, 25, 30, 35, 40-ой процедуры, соответственно, 3,15±0,18 (контроль 0,8310,10, 1=11,51), 4,5710,25 (контроль 0,8310,09, 1=14,16), 4,74+0,27 (контроль 0,85+0,11,1=13,52), 4,57+0,25 (контроль 0,87+0,11, 1=13,64), 4,30±0,15 (контроль 0,74±0,18,1=12,32), 4,12+0,18 (контроль 0,78±0,13, 1=11,40).

Если сравнивать две группы по индукции воздействия, т.е. контроль В и С, то повышение индукции ВМП до 15 мТ свидетельствовало о том, что данная индукция поля больше стимулирует такие изменения, как площадь синусов, синусовый гистиоцитоз, но менее гиперплазию паракортикальной зоны, что имеет значение не только для Т-клеточного, но и В-клеточного иммунитета.

В контрольной группе О (опухоль РС-1, без воздействия ВМП) с 25 суток после перевивки опухоли при изучении кинетических показателей отмечено увеличение удельной скорости роста опухоли до 40 суток, затем снижение (0,236 см3/сутки, 0,501 см3/сутки, 0,304 см3/сутки). Этому соответствовало и увеличение среднего объёма опухоли с 0,29+0,09 см3 (25 сутки) до 22,75 см3 (40 сутки). Метастазы в паховых ЛУ животных морфологически были отмечены на 30 сутки от момента перевивки опухоли (табл. 1).

Что касается структурных элементов ЛУ, то они реагировали на развитие опухоли следующим образом. С 15 на 20 сутки наблюдали развитие гиперплазии паракортикальной зоны (с 10,21+0,91% до 22,08+1,04%), затем этот процесс к 25 суткам стабилизировался (20,05+1,32%). Далее, на 30 сутки площадь паркортикальной зоны стала уменьшаться, а на 35-40 сутки резко (до 2,01+0,24%). Параллельно такие же изменения площадей наблюдали и для по-сткаппилярных венул (5,24+0,82% на 20 сутки и 1,98+0,47% на 40-ые) (табл. 1).

В корковом веществе ЛУ отмечали морфофункциональные изменения в процессе роста опухоли. Число первичных лифоидных фолликулов коркового вещества к 20-25 суткам возрастало более чем в два раза (с 4,23+0,68 на 15 сутки и 11,32+0,98 на 25 сутки), затем до 30 суток держалось на высоком уровне и затем начинало снижаться при их отсутствии на 40 сутки. Что касается фолли-

кулов со светлыми центрами, то эта же тенденция наблюдалась и для них. На 20-25 сутки их число резко возрастало (с 1,02±0,12 до 9,32±0,64), затем снижалось, и они не определялись на 40 сутки роста опухоли. Площадь фолликулов со светлыми центрами по отношению ко всей площади ЛУ ведёт себя также, увеличиваясь и уменьшаясь на эти же периоды времени.

Площадь синусов на 20 день резко увеличивалась (с 15,01 ±1,04% до 25,67±1,83%), затем к 25 суткам оставалась почти на том же уровне и затем медленно стала уменьшаться (на 40 сутки - 10,21±0,15%). Всё это сопровождалось выраженным синусовым гистиоцитозом (табл. 1).

В опытной группе (опухоль РС-1, индукции ВМП 3 мТ) паракортикальная зона уже с 15 суток от момента перевивки опухоли была по площади достоверно больше, чем в контроле, а с 20 суток по 35 значительно больше (20 сутки : контроль - 22,08±1,04%, опыт - 25,14±1,32, р<0,05; 35 сутки: контроль -8,05±0,34% , опыт - 14,02±0,86, р<0,05) и занимала большую часть ЛУ, уступая по площади лишь синусам (табл. 1). Кроме этого, в отличие от контроля, в ЛУ можно было наблюдать большое число посткапиллярных венул с высоким эндотелием, которые имели вокруг себя муфту из лимфоцитов с более гипер-хромным ядром. В просвете этих венул были видны эритроциты и клетки лим-фоидного ряда. Венулы имели различный диаметр и были полнокровны. Площадь посткапиллярных венул с 20 суток после перевивки опухоли достоверно превосходило площадь таковых в контроле до 40 суток.

В корковом веществе ЛУ происходили интересные изменения. Так, число первичных фолликулов в опытной группе на 15, 20, 25, 30 сутки не отличались от контроля. С 35 суток по 40 отмечалась статистически достоверное увеличение их числа в опытной группе по сравнению с контрольной (35 сутки: контроль - 3,12±0,28, опыт - 6,32±0,27, р<0,05; 40 сутки: контроль - 0, опыт 5,40±0,27, р<0,05). Такая же тенденция отмечена и для фолликулов со светлыми центрами (соответственно, 2,05±0,14 и 4,26±0,26; 0 и 4,56±0,25). Но фолликулы со светлыми центрами занимали достоверно большую площадь по сравнению с

их площадью в контрольной группе с 15 суток по 40, что говорит об их значительной гиперплазии.

На фоне выраженного синусового гистиоцитоза, площади синусов значительно превосходили таковые в контрольной группе, особенно с 20 по 35 сутки ( 20 сутки: контроль - 25,67±1,83%, опыт - 27,32±1,14%, р<0,05; 25 сутки: контроль - 22,61±0,49%, опыт - 27,24±1,12%, р<0,05; 30 сутки: контроль: 15,41±0,89%, опыт - 19,28±1,04%, р<0,05) (табл. 1).

С 25 суток после перевивки опухоли при изучении кинетических показателей роста отмечено увеличение удельной скорости роста опухоли до 40 суток, но она была несколько меньше, чем в контроле (0,192 см3/сутки, 0,416 см3/сутки, 0,360 см3/сутки), затем снижение на 40 сутки до 0,166 см3/сутки. Средний объём опухоли достоверно был меньше контрольного при воздействии ВМП на всех этапах его регистрации (например, 25 сутки: контроль 0,29±0,09 см3, опыт - 0,10±0,04 см3, р<0,05; 40 сутки: контроль - 22,75±3,21 см3, опыт -11,05±1,45 см3, р<0,05). Этому соответствовал процент торможения роста опухоли, являющийся основным показателем эффективности воздействия (25 сутки - 65,5±18,57%, 30 - 77,5±15,01%, 35 - 70,2±17,27%, 40 - 51,4±22,04%). На всех этапах воздействия он превышал 50%, что соответствует высоким показателям эффективности в экспериментальной онкологии. Метастазы в паховых ЛУ животных морфологически были отмечены только лишь на 40 сутки эксперимента, в отличие от контроля, где они регистрировались на 30 сутки от момента перевивки опухоли. Таким образом, ВМП задерживало метастазирование на 10 суток (табл. 1).

В опытной группе (опухоль РС-1, индукция ВМП 15 мТ) столь не выражена реакция в виде гиперплазии паракортикальной зоны. Так, если в группе с индукцией ВМП 3 мТ на 25 сутки её площадь составляла 28,05±1,85%, то в группе с индукцией в 15 мТ она была равна 21,34±1,42% при площади в 20,05±1,32% в контрольной группе. Так же реагировали посткапиллярные ве-нулы, их площадь мало отличалась от площади посткапиллярных венул в контроле.

Что касается коркового вещества ЛУ, то здесь изменения были выра-женнее, чем в группе с индукцией ВМП в 3 мТ. Так число первичны хлимфо-идных фолликулов статистически достоверно отличалась от контроля, начиная с 20 суток, и оставалась на тех же высоких уровнях, по сравнению с контролем, до конца эксперимента (например, на 20 сутки: контроль - 10,12±1,05, опыт -13,24±1,31, р<0,05; на 40 сутки: контроль - 0, опыт - 6,28±0,55). Так же себя вели и фолликулы со светлыми центрами (20 сутки: контроль - 8,62±0,72, опыт - 11,41±1,28, р<0,05; 40 сутки: контроль - 0, опыт - 5,38±0,64, р<0,05). Отмечался выраженный синусовый гистиоцитоз, особенно на 20-30 сутки эксперимента.

Изучая кинетику роста опухоли РС-1 при воздействии ВМП индукцией 15 мТ, можно отметить, что удельная скорость роста опухоли увеличивалась с 25 по 30 сутки (0,125 см3/сутки, 0,677 см3/сутки), затем стала снижаться (0,477 см3/сутки, 0,023 см3/сутки). Средний объём опухолей был значительно меньше, чем в контроле на всех этапах эксперимента (на 30 сутки: контроль - 3,55±1,05 см3, опыт - 0,59±0,19 см3, р<0,05; на 40 сутки: контроль - 22,75±3,21 см3, опыт 7,18±2,11 см3, р<0,05). Процент торможения роста опухоли был значительным и составлял от 60,5±19,88% до 93,1±8,30% на разных этапах эксперимента.

Метастазы в ЛУ стали определяться в этой группе в тот же срок, что и в группе с индукцией ВМП в 3 мТ, т.е. на 40 сутки, следовательно, ВМП задержало рост метастазов в ЛУ на 10 суток.

В контрольной группе В1 (опухоль карциносаркома Уокера, без воздействия ВМП) удельная скорость роста опухоли несколько падала, начиная с 25 дня роста опухоли до 30 суток эксперимента (0,09 см3/сутки, 0,05 см3/сутки, 0,02 см3/сутки), затем к концу эксперимента несколько выросла (0,06 см3/сутки). Средний объём опухоли возрастал и к 35 суткам после перевивки достиг 22,48±6,24 см3. Метастазы в периферических ЛУ стали верифицироваться морфологически на 25 сутки от момента перевивки опухоли (табл. 2).

Паракортикальная зона ЛУ реагировала на рост опухоли карциносарко-мы Уокера аналогично эксперименту с РС-1, отличие в том, что опухоль карци-

носаркома Уокера отличается более быстрым ростом и во времени эти изменения происходили быстрее. Поэтому гиперплазия отмечалась на 20 сутки от момента перевивки и площадь паракортикальной зоны на этот период была 14,05±0,37%, затем площадь стала медленно уменьшаться и на 40 сутки составляла всего лишь 1,22±0,10%. Посткапиллярные венулы паракортикальной зоны реагировали так же с максимальной площадью на 20 и 25 сутки (3,82±0,34% и 4,25±0,72%) и дальнейшим её снижением до 0,67±0,03% на 40 сутки (табл. 2). Число первичных лимфоидных фолликулов коркового вещества к 20-25суткам достоверно возрастало (с 4,48±0,52 на 15 сутки и 6,82±0,32 на 25 сутки), затем до 30 суток держалось на этом же уровне и затем начинало снижаться при их отсутствии на 40 сутки. Что касается фолликулов со светлыми центрами, то эта же тенденция наблюдалась и для них. На 20-25 сутки резко возрастало их число (с 1,43±0,28 до 6,07±0,32), затем снижалось и они не определялись на 40 сутки роста опухоли. Площадь фолликулов со светлыми центрами по отношению ко всей площади ЛУ вела себя также, увеличиваясь и уменьшаясь на эти же периоды времени (табл. 2).

Мозговое вещество состояло из мякотных тяжей и системы мозговых и промежуточных синусов. Мякотные тяжи были узкими и состояли из малых и средних лимфоидных клеток. Площадь синусов на 20 день увеличивалась значительно (с 14,05±0,73% до 23,21±1,52%), затем к 25 суткам оставалась почти на том же уровне и затем медленно стала уменьшаться (на 40 сутки -7,28±0,68%). Всё это сопровождалось выраженным синусовым гистиоцитозом (табл. 2).

В опытной группе (опухоль карциносаркома Уокера, индукция ВМП ЗмТ) паракортикальная зона уже с 15 суток от момента перевивки опухоли была по площади достоверно больше, чем в контроле (20 сутки : контроль -14,05±0,37%, опыт - 20,28±1,24%, р<0,05; 35 сутки: контроль - 4,07±0,25%, опыт - 7,09±0,54%, р<0,05), занимала большую часть ЛУ, уступая по площади лишь синусам. Площадь посткапиллярных венул с 20 суток после перевивки

Структурные элементы лимфатического узла крысы (паракортикальная зона, фолликулы с реактивными центрами, посткапиллярные венулы, синусы - %), кинетические показатели роста опухоли (ср. объём - см3, ироц. торм. роста опухоли - %, уд.скорость роста - см3/сутки), наличие метастазов в л/у - +,-. Опухоль РС-1, индукция поля -ЗмТ, *-статистически достоверные значения.

Структурные компоненты л/узла крысы Время после перевивки опухоли

15 суток 20 сугок 25 суток 30 суток 35 суток 40 суток

Паракортикальная зона (опыт) 12,28±1,02 25,14±1,32 28,05±1,85* 20,08±1,34* 14,02±0,86* 5,32±0,74*

Контроль О 10,21±0,91 22,08±1,04 20,05±1,32 12,04±1,24 8,05±0,34 2,01±0,24

Фолликулы с реактивными центрами (опыт) 5,04±0,42 24,18±1,25 25,22±1,82* 1б,32±1,24* 7,28±0,52* 4,52±0,15

Контроль В 2,23±0,52 20,07±1,24 20,92±1,32 12,51±0,16 1,84±0,12 0

Посткапиллярные венулы (опыт) 2,84±0,56 7,08±0,62 7,24±0,82* 6,32±0,13* 4,92±0,28 2,98±0,24*

Контроль О 2,46±0,85 5,24±0,82 5.02±0,62 4,85±0,36 3,25±0,32 1,98±0,47

Синусы (опыт) 16,08±1,23 27,32±1,14 27,24±1,12* 19,28±1,04* 15,32±0,68* 11,08±0,18

Контроль Э 15,01±1,04 25,67±1,83 22,61±0,49 15,41 ±0,89 12,21±0,32 10,21±0,15

Средний объем опухоли в опыте 0,1±0,04 0,80±0,17* 4,83±1,08* 11,05±1,45*

Контроль 0,29±0,09 3,55±1,05 16,20±3,37 22,75±3,21

Процент торм. роста опухоли (опыт) 65,5±18,57 77,5±15,01 70,2±17,27 51,4±22,04

Удельная скорость роста опухоли в опыте 0,192 0,416 0,360 0,166

Контроль 0,236 0,501 0,304 0,068

Наличие метастазов в л/узлах в опыте - - - - - +

Контроль Б - - - + + +

опухоли достоверно превосходило площадь таковых в контроле до 40 суток (табл. 2).

Число первичных фолликулов в опытной группе на 15 сутки не отличалось от контроля, на 20, 25, 30, 35, 40 сутки было достоверно больше (25 сутки: контроль — 6,82±0,32, опыт - 9,38±0,62, р<0,05; 40 сутки: контроль - 0, опыт 0,93±0,02, р<0,05). Такая же тенденция отмечена и для фолликулов со светлыми центрами (соответственно, 5,80±0,78 и 8,02±0,52; 0 и 0). Но фолликулы со светлыми центрами занимали достоверно большую площадь по сравнению с их площадью в контрольной группе с 15 суток по 40, что говорит об их значительной гиперплазии.

Определялся выраженный синусовый гистиоцитоз. По площади синусы значительно превосходили таковые в контрольной группе, особенно с 20 по 35 сутки (20 сутки: контроль - 23,21±1,52%, опыт - 27,05±1,68%, р<0,05; 25 сутки: контроль - 20,15±1,27%, опыт - 25,34±1,07%, р<0,05; 30 сутки: контроль: 12,24±0,87%, опыт - 15,64±0,68%, р<0,05) (табл. 2).

С 20 суток после перевивки опухоли при изучении кинетических показателей роста отмечено резкое уменьшение удельной скорости роста опухоли, с 25 суток по 35, она становится отрицательной, что говорит о высокой эффективности ВМП для этой опухоли при этих режимах (0,2 см3/сутки, -0,12 см3/сутки, -0,02 см3/сутки, -0,59 см3/сутки). Средний объём опухоли достоверно был меньше контрольного при воздействии ВМП на всех этапах его регистрации (например, 25 сутки: контроль 15,44±3,92 см3, опыт - 1,27±0,86 см3, р<0,05; 35 сутки: контроль - 22,48±6,24 см3, опыт - 0,06±0,05 см3, р<0,05). Этому соответствовал процент торможения роста опухоли, являющийся основным показателем эффективности воздействия (25 сутки - 91,77±8,28%, 30 - 93,18±7,54%, 35 - 99,73±1,49%). На всех этапах воздействия он превышал 50%, что соответствует высоким показателям эффективности в экспериментальной онкологии.

Метастазы в паховых ЛУ животных морфологически были отмечены только лишь на 35 сутки эксперимента, в отличие от контроля, где они регист-

рировались на 25 сутки от момента перевивки опухоли. Таким образом, ВМП задерживало метастазирование на 10 суток (табл. 2).

В опытной группе (карциносаркома Уокера, индукция ВМП 15 мТ) мор-фофункциональные изменения аналогичны эксперименту с опухолью РС-1. Так, если в группе с индукцией ВМП 3 мТ на 25 сутки площадь кортикальной составляла 19,32±0,85%, то в группе с индукцией в 15 мТ она была равна 15,24±0,72% при площади в 12,35±0,44% в контрольной группе. Так же реагировали посткапиллярные венулы, их площадь мало отличалась от площади посткапиллярных венул в контроле.

Что касается коркового вещества ЛУ, то здесь изменения были выра-женнее, чем в группе с индукцией ВМП в 3 мТ. Так, число первичных лимфо-идных фолликулов статистически достоверно отличалась от контроля, начиная с 15 суток, и оставалась на тех же высоких уровнях, по сравнению с контролем, до конца эксперимента (например, на 20 сутки: контроль - 7,05±0,72, опыт -14,98±1,33, р<0,05; на 35 сутки: контроль - 1,52±0,08, опыт - 3,72±0,08). Так же себя вели и фолликулы со светлыми центрами (20 сутки: контроль - 6,07±0,32, опыт - 13,24±1,08, р<0,05; 35 сутки: контроль - 0,08±0,01, опыт - 2,31±0,44, р<0,05). Отмечался выраженный синусовый гистиоцитоз, особенно на 20-30 сутки эксперимента.

Изучая кинетику роста опухоли карциносаркомы Уокера при воздействии ВМП индукцией 15 мТ, можно отметить, что удельная скорость роста опухоли резко уменьшилась с 20 по 25 (0,42 см3/сутки, 0,04 см3/сутки), затем стала отрицательной на 30 и 35 сутки (-0,05 см3/сутки, -0,08 см3/сутки). Средний объём опухолей был значительно меньше, чем в контроле на всех этапах эксперимента (на 25 сутки: контроль - 15,44±3,92 см3, опыт — 7,20±3,42 см3, р<0,05; на 35 сутки: контроль - 17,01±4,18 см3, опыт 5,85±2,89 см3, р<0,05). Процент торможения роста опухоли был значительным и составлял от 49,15±20,59% до 88,14±11,85% на разных этапах эксперимента.

Метастазы в ЛУ стали определяться в этой группе на 35 сутки, следовательно, ВМП задержало рост метастазов в ЛУ на 10 суток, по сравнению с контрольной группой.

Митотическая активность у больных с плоскоклеточньш раком лёгкого при воздействии ВМП.

МИ НМРЛ (плоскоклеточный вариант) до воздействия ВМП в среднем составлял 20,4 ± 2,3%. Нормальные митозы от общего числа составляли - 46,8 ± 3,3%, патологические - 53,2 ± 4,3%. Фазы митозов распределялись следующим образом: профаза от общего числа митозов составляла -9,8%, метафаза - 75,9 ± 4,5%, анафаза - 6,4%, телофаза - 7,9% .

После воздействия ВМП морфологическая картина плоскоклеточного рака лёгкого значительно менялась. Это касалось достоверного снижения МИ (р<0,05) в сравнении с контрольной группой, а также значительного нарастания патологических митозов, с преобладанием метафаз. Так, МИ был равен 14,1 ± 0,04%, нормальные митозы составляли 27,6 ± 2,6%, патологические - 72,4 ± 3,7%. Соотношение фаз митозов распределилось следующим образом: профаза составляла 4,2%, метафаза - 87,2 ± 2,7%, анафаза - 3,5%, телофаза - 5,1%.

При изучении спектра патологических митозов в контрольной группе отмечено следующее. Процент различных форм в порядке убывания представлен следующим образом: рассеивание хромосом и их фрагментов - 14,1%; комковатая метафаза - 13,8%; отставание хромосом и их фрагментов в метафазе -12,7%; многополюсный митоз - 3,7%; отставание хромосом и их фрагментов в ана-, телофазе - 2,6%. Другие формы, встречались значительно реже и составляли от 0,2% до 1,8% (мосты, трёх-групповая метафаза, полая метафаза, асси-метричный митоз и прочие).

Спектр патологических митозов после воздействия ВМП отличался от контрольной группы и формы патологических митозов распределились в порядке возрастания так: комковатая метафаза - 21,1%; рассеивание хромосом и их фрагментов - 19,2%; отставание хромосом и их фрагментов в метафазе -17,2%; полая метафаза - 2,8%; отставание хромосом и их фрагментов в ана-, те-

Структурные элементы лимфатического узла крысы (паракортикальная зона, фолликулы с реактивными центрами, посткапиллярные венулы, синусы - %), кинетические показатели роста опухоли (ср. объём - см3, проц. торм. роста опухоли - %, уд. скорость роста - см3/сутки), наличие метастазов в л/у +-,-. Опухоль КУ, индукция поля - ЗмТ, * - статистически достоверные отличия.

Структурные компоненты л/узла крысы Время после перевивки опухоли

15 суток 20 суток 25 суток 30 суток 35 суток 40 суток

Паракортикальная зона (опыт) 10,37±0,82 20,28±),24* 19,32±0,85* 15,32±0,68* 7,09±0,54* 2,62±0,43*

Контроль 8,12±0,52 14,05±0,37 12,35±0,44 7,28±0,34 4,07±0,25 1,22±0,Ю

Фолликулы с реактивными центрами (опыт) 4,67±0,53 15,72±0,92* 16,36±1,08* 9,32±0,52* 2,27±0,32* 0

Контроль 2,31±0,18 12,24±0,64 11,17±0,56 4,52±0,37 1,18±0,09 0

Постканиллярные венулы (опыт) 2,50±0,37 5,27±0,63 6,28±0,74* 5,36±0,58* 3,51±0,43 0,90±0,07

Контроль 01 2,01±0,20 3,82±0,34 4,25±0,72 3,46±0,42 2,18±0,38 0,67±0,03

Синусы (опыт) 15,27±1,08 27,05±1,68* 25,34±1,07* 15,64±0,68* 11,32±0,62 8,32±0,74

Контроль 01 14,05±0,73 23,21±1,52 20,15±1,27 12,24±0,87 10,34±0,54 7,28±0,68

Средний объём опухоли в опыте 2,32±1,05* 1,27±0,86* 1,16±1,09* 0,06±0,05*

Контроль 11,76±1,89 15,44±3,92 17,01±4,18 22,48±6,24

Процент торм. роста опухоли в опыте 80,27±12,82 91,77±8,28 93,18±7,54 99,73±1,49

Удельная скорость роста опухоли в опыте 0,2 -0,12 -0,02 -0,59

Контроль Э 0,09 0,05 0,02 0,06

Наличие метастазов в л/узлах в опыте - - - - + +

Контроль Б1 - - + + + +

лофазе - 4,2%; полая метафаза - 2,4%; моноцентрический митоз - 2,2%; трёх-групповая метафаза - 1,9%; многополюсный митоз - 1,9%; ассиметричный митоз - 1,7%; мосты - 0,6%.

Ш-67 у больных плоскоклеточным раком лёгкого при воздействии ВАШ. При изучении уровня экспрессии КА-67 в плоскоклеточном раке лёгкого до воздействия отмечено, что экспрессия этого антигена была равна 48,4 ± 16,7%, а после воздействия в опухолях пациентов с НМРЛ отмечено её уменьшение до 32,8 ±11,5% (р< 0,05).

р 53 при воздействии ВМПу больных плоскоклеточным раком лёгкого.

При анализе уровней экспрессии р53 было выявлены следующие цифры: для опухолей перед началом воздействия ВМП уровень экспрессии был равен 41,5 ± 12,1%, после воздействия отмечалось снижение его показателей до 29,7 ± 10,3 (р< 0,05).

Апоптоз в клетках немелкоклеточногорака лёгких при воздействии

ВМП.

При изучении абсолютного числа опухолевых клеток в состоянии апоп-тоза и апоптозных телец выявлено преобладание последних, а их общее число без воздействия ВМП было равно 4,62 ± 0,69, а после воздействия возрастало статистически значимо (р < 0,05) и составляло - 7,92 ± 0,49 (соответственно, апоптозные клетки до воздействия - 1,47 ± 0,20, после 2,78 ±0,17; апоптозные тельца, до - 3,15 ± 0,49, после - 5,14 ± 0,32).

АИ для плоскоклеточного рака лёгкого без воздействия ВМП был равен 1,20 ± 0,19%, при воздействии увеличивался до 2,64 ± 0,23%, при расчёте на апоптозные клетки он соответственно был равен до воздействия — 0,38 ± 0,05%, после - 0,92 ± 0,07%. При расчёте на апоптозные тельца без воздействия АИ был равен - 0,81 ± 0,14%, с воздействием - 1,72 ± 0,16%.

Непосредственные результаты лечения в двух группах больных. При изучении объективного ответа в двух рандомизированных группах получены следующие результаты. В группе А (контрольная группа) полная регрессия опухоли была зарегистрирована у 2 больных (4,0%), частичная у 26 (52,0%),

стабилизация у 16 (32,0%), прогрессирование у 6 (10,0%). В группе В результаты были намного лучше. Объективный эффект отмечен у 51 больного (99%), в виде полной регрессии у 8 (15,4%) пациентов, частичной у 34 (65,4%), стабилизации у 9 (17,3%) и прогрессирование отмечено только у 1 больного. В группе В, (основная) в основном, у больных в процессе лечения отмечена полная и частичная регрессия опухоли. Таким образом, можно констатировать лучший объективный эффект лечения НМРЛ, используя комплекс лучевой терапии и химиотерапии с ВМП (табл. 3).

Таблица 3

Непосредственные результаты лечения в двух группах больных

Ответ Группа А (п, %) Группа В (п, %)

Полная регрессия 2 (4,0%) 8 (15,4%)

Частичная регрессия 26 (52,0%) 34 (65,4%)

Стабилизация 16 (32,0%) 9 (17,3%)

Прогрессирование 6 (10,0%) 1 (1,9%)

Итого 50 (100%) 52 (100%)

Токсичность при проведении комплексной терапии.

Показатели токсичности после проведения химиотерапии представлены в таблице 4. В основной группе В, в которой в комплекс лечения входило ВМП показатели по токсичности терапии были намного лучше. Все осложнения были 3-ей степени, за исключением только лимфопении и анорексии. В этой группе не было пациентов с развившейся фебрильной нейтропенией. Нейтропения отмечалась только у 3 больных, по сравнению с группой А. Больных с лейкопенией было также в два раза меньше, а пациентов с лимфопенией было 24, в отличие от группы А, где их было 43 (р<0,05). Далее в группе В слабость отмечалась у 8 больных (в группе А - 20, р<0,05), анорексия у 7 (в группе А - 20, р<0,05), дисфагия, эзофагит у 14 (в группе А - 32, р<0,05), одышка у 7 (в группе А - 14, р<0,05), пневмонит у 2 (в группе А - 4, р<0,05), тошнота, рвота у 15 (в группе А - 24, р<0,05) (табл. 4).

Токсичность при проведении лечения в 2-х группах больных

Группа Л Группа В

3 степень 4 степень 3 степень 4 степень

(Grade 3) (Grade 4) (Grade 3) (Grade4)

(%) (%) (%) (%)

Нейтропения 11 4 3* 0

Лейкопения 32 4 15* 0

Снижение гемоглобина 5 0 2 0

Лимфопения 35 8 20* 4

Фебрильная нейтропения 2 0 0 0

Слабость 19 1 8* 0

Анорексия 15 5 5* 2

Дисфагия, эзофагит 30 2 14* 0

Одышка 11 3 7* 0

Пневмонит 3 1 2* 0

Максимальная токсичность 58 26 30 11

Тошнота, рвота 24 15*

Примечание: * - различия в двух группах статистически достоверны.

Основной токсичностью при проведении лечения в группе А была лейкопения и лимфопения, в группе В наиболее часто встречались эти же осложнения, но здесь продолжительность лейкопении и лимфопении была короткой и легко управляемой. Частое осложнение - эзофагит в группе В протекал также намного мягче и тяжёлая 4 степень не наблюдалась.

Выживаемость больных в двух группах лечения В группе А (контрольная, без магнитотерапии) показатели выживаемости были следующими. Трёхлетняя выживаемость по всей группе составила 79,22% (ш=9,29) при средней продолжительность жизни в 21,23 месяца (ст = 2,89).

В основной группе В показатели лечения были намного лучше, так, трёхлетняя выживаемость составила уже 87,70 (ш=5,26). Средняя продолжительность жизни увеличилась до 31,93 месяца (ст = 2,33). Здесь же отмечается статистически достоверное увеличение выживаемости (р=0,04). 5 пациентов из этой группы пережили 5 лет. Возраст у этих больных от 43 до 68 лет, средний 58 лет, 4-е пациента - мужчины, 1 - женщина. У них не отмечено тяжёлого функционального статуса по ECOG. У 3-х пациентов была III "В" стадия HMPJI, у 2-х - III "А" стадия. Следует отметить, что у одного пациента были

2 ............~——________

X V =г 1 ........_ " "-***»««»«»»».,

а с. о —-—------_____ Л

20 « 28 —т-^--- 44 56 ьь 59 65

Месяцы

Группа В (основная, в комплексе с магнитотерапией)

Рис 2. Выживаемость в двух группах больных надключичные метастазы. У всех больных морфологическим диагнозом был НМРЛ (плоскоклеточный). Только один пациент не получил последнего курса химиотерапии, у всех остальных был выполнен весь план лечения (рис. 2).

ВЫВОДЫ

1. Клетки немелкоклеточного рака лёгкого при культивировании в диффузионных камерах, как суспензией клеток, так и кусочками опухолей, активно формируют сфероиды. Их число составило 30,15 + 7,12 при культивировании клеток суспензией и 26,17 ± 0,42 - кусочком. После воздействия вихревого магнитного поля число сфероидов уменьшается и, соответственно, составляет 12,32 ± 5,12 и 11.42 ± 0,21 (р<0,05), а индекс эффективности сфероидообразо-вания имеет для обоих экспериментов положительные значения от 56,4% до

59,6%. Это свидетельствует об иигибирующем действии вихревого магнитного поля на процессы сфероидообразования клетками немелкоклеточного рака лёгкого.

2. Вихревое магнитное поле индуцирует апоптоз в клетках немелкоклеточного рака лёгкого, культивируемых в диффузионных камерах. Индукция апоптоза проходит параллельно с ингибицисй пролиферативной активности и значительно выше в клетках, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля. Индекс апоптоза соответствует в двух сериях экспериментов для немелкоклеточного рака лёгкого - 4,97 + 0,47% - в опыте при 0,78 ± 0,11% - в контроле, р<0,05 и 5,17 ± 0,60% - в опыте при 2,03 ± 0,64% - в контроле, р<0,05.

3. Получены данные о снижении митотического индекса при воздействии вихревого магнитного поля на культивируемые клетки немелкоклеточного рака лёгкого, как показателя пролиферации. Так митотический индекс в двух экспериментах с использованием клеточных культур рака легкого для 1-го эксперимента в контроле был равен 17,24 ± 3,05%, при его значении в опыте - 10, 06 ± 2,32% (р<0,05) и для П-го - 24,31 ± 3,97%, при его значении в 19,68 ± 2.59% в опыте (р<0,05).При изучении фаз митозов в опухолевых клетках отмечено преобладание метафазы. Для клеток немелкоклеточного рака лёгкого, культивируемых суспензией в диффузионных камерах, преобладание метафаз выглядело следующим образом: в контроле 67,48 ± 1,43, в опыте - 74,46 ± 1,22, (р<0,05), для клеток, культивируемых кусочком: в контроле - 38,18 ± 4,11%, в опыте - 62,03 ± 7,23%, (р<0,05).

4. При воздействии вихревого магнитного поля на клетки немелкоклеточного рака лёгкого, культивируемые в диффузионных камерах отмечено увеличение процентного содержания патологических митозов. Если в клетках рака легкого, не подвергавшихся воздействию, процент патологических митозов составлял от 49,59 + 2,03%) (культивирование суспензией клеток) до 77,92 ± 1,09% (культивирование кусочком опухоли), то в опыте их процент нарастал от 72,16 ± 0,07% (культивирование суспензией клеток) до 91,97 ± 0,32% (культивирова-

ние кусочком опухоли), (р<0,05). В спектре патологических митозов клеток, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля, преобладала патология митоза, связанная с повреждением митотического аппарата (рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе, многополюсные митозы, комковатая ме-тафаза, ассиметричные митозы).

5. Выявленные морфофункциональные изменения в периферических лимфатических узлах экспериментальных животных (крыс) при воздействии вихревого магнитного поля могут ассоциироваться с благоприятным прогнозом при развитии опухоли - это и гиперплазия паракортикальной зоны (например, при индукции вихревого магнитного поля в ЗмТ, площадь на 40-й день исследования составляет 9,05±0,24, в контроле - 6,78±0,84, р<0,05); синусовый гистиоцитоз; увеличение фолликулов со светлым центром (например, при индукции вихревого магнитного поля в 15мТ, число на 40-й день исследования составляет 4,12±0,18, в контроле 0,78±0,13, р<0,05) и увеличение объёма посткапиллярных венул, в сравнении с интактными животными. Отмечено, что увеличение индукции вихревого магнитного поля усиливает больше гуморальные иммунные реакции, чем клеточные.

6. Вихревое магнитное поле индукцией ЗмТ и 15мТ ингибирует рост перевиваемых опухолей РС-1 (медленнорастущей опухоли) и карциносаркомы Уокера (быстрорастущей опухоли). При изучении кинетики роста РС-1 и кар-ционосаркомы Уокера можно отметить, что при воздействии статистически достоверно уменьшается средний объём опухолей на всех этапах воздействия (например, объём опухоли РС-1 при воздействии вихревого магнитного поля в ЗмТ на 35 сутки от перевивки составляет 4,83±1,08 см3, без воздействия 16,20±3,37 см3, р<0,05) Удельная скорость роста опухолей на отдельных этапах роста замедляется и даже может принимать отрицательные значения (например, для опухоли карциносаркомы Уокера удельная скорость на 35 сутки от момента перевивки составляет -0,59 см3/сутки). Все эти показатели свидетельствуют о высокой противоопухолевой эффективности вихревого магнитного поля в эксперименте. Таким образом, можно думать, что используя вихревое

магнитное поле в клинике, например, при лечении рака лёгкого, можно достичь лучшего локального контроля опухоли при его использовании в комплексе лечебных мероприятий.

7. При моделировании метастазирования в регионарные лимфатические узлы, используя перевиваемые опухоли РС-1 и карциносаркому Уокера, получены данные о морфофункциональных изменениях в лимфатических узлах при воздействии вихревого магнитного поля, которые приводят к задерживанию метастазирования в лимфатические узлы, с морфологической их верификацией, во всех экспериментах на 10 суток, по сравнению с контролем. Теоретически можно предположить, что используя вихревое магнитное поле в клинике, например при комплексном лечении рака лёгкого, можно с его помощью улучшить системный контроль опухоли.

8. Выявлено, что вихревое магнитное поле ингибирует пролифератив-ную активность в клетках больных немелкоклеточным раком лёгкого, что в плане выживаемости является хорошим прогностическим признаком. Так ми-тотический индекс достоверно снижается (без воздействия - 20,4 ± 2,3%, после воздействия 14,1 ± 0,04%, р < 0,05). Отмечено также увеличение числа патологических митозов (без воздействия - 53,2 ± 4,3%, после воздействия - 72,4 ± 3,7%, р < 0,05) с превалированием метафазы (без воздействия - 75,9 ± 4,5%, после воздействия - 87,2 ± 2,7%, р < 0,05) в опухолях. В спектре митозов преобладают грубые формы, которые приводят клетку к гибели (комковатая метафаза, рассеивание хромосом и их фрагментов и т.д.) и её элиминации из опухоли. Степень снижения митотической активности и нарастание относительной частоты комковатых метафаз, а также и других грубых форм патологии митоза служит одним из объективных критериев степени повреждения опухоли. Вихревое магнитное поле снижает экспрессию маркера пролиферации Ki-67 в опухолях больных немелкоклеточным раком лёгкого. При изучении уровня экспрессии Ki-67 в опухолях до воздействия отмечено, что экспрессия этого антигена в клетках опухолей была равна 48,4 ± 16,7%, а после воздействия отмечено её уменьшение до 32,8 ±11,5% (р< 0,05).

9. Получены достоверные данные о снижении экспрессии белка р53 в опухолях, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля. При анализе уровней экспрессии р53 было выявлены следующие цифры: для опухолей перед началом воздействия вихревого магнитного поле уровень экспрессии был равен 41,5 ± 12,1%, после воздействия отмечалось снижение его показателей до 29,7 ± 10,3 (р < 0,05). Эти данные ассоциируются с хорошим прогнозом у больных раком легким , если в комплексной терапии использовать вихревое магнитное поле. Вихревое магнитное поле индуцирует апоптоз в клетках больных немелкоклеточным раком лёгкого. Апоптозный индекс для немелкоклеточного рака лёгкого без воздействия вихревого магнитного поля был равен 1,20 ± 0,19%, при воздействии увеличивался до 2,64 ± 0,23% (р < 0,05), что является также благоприятным прогностическим фактором.

10. При регистрации объективного ответа в двух рандомизированных группах больных местно-распространённым нерезектабельным немелкоклеточным раком лёгкого при лечении химиолучевой терапией (контрольная группа) и химиолучевой терапией вместе с вихревым магнитным полем (основная группа) получено, что в контрольной группе он отмечен в 90%, в основной -98,1% (р<0,05). При этом в основной группе чаще отмечена полная регрессия -15,4% (в контрольной - 4,0%), частичная - 65,4% (в контрольной - 52,0%).

12. Используя комплексное лечение больных немелкоклеточным раком лёгкого с включением вихревого магнитного поля (основная группа) было отмечено снижение регистрации токсических проявлений по сравнению с контрольной группой, таких как нейтропения (в основной у 3 больных, в контрольной - у15,р<0,05), лейкопения (в основной - у 15, в контрольной - у 36, р<0,05), а также лимфопении, снижения уровня гемоглобина, слабости, анорексии, дис-фагии, эзофагита, одышки, тошноты, рвоты, пневмонита.

13. В основной группе показатели лечения были лучше, так трёхлетняя выживаемость составила 87,70% (т=5,26) при 79,22% (т=9,29) в контрольной группе. Средняя продолжительность жизни в основной группе статистически

достоверно увеличилась до 31,93 месяца (а контрольной, (р=0,04).

= 2,33) при 21,23 месяца (а = 2,89) в

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При комплексной терапии местно-распространённого нерезектабельного немелкоклеточного рака лёгкого с целью снижения токсических проявлений, а также с целью улучшения непосредственных (объективный эффект) и отдалённых результатов (наблюдаемая и безрецидивная выживаемость) рекомендуется использовать вихревое магнитное поле наряду с традиционными методиками.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голубцов В.И., Бахмутский Н.Г., Мороз А.Н., Бодня В.Н. Изучение влияния вихревого магнитного поля на клетки рака лёгкого // Фундаментальные исследования. - 2004. - №1. - С. 46.

2. Бахмутский Н.Г., Мороз А.Н., Голубцов В.И., Бодня В.Н. Проли-феративная активность и аноптоз клеток некоторых опухолей, культивируемых в диффузионных камерах in vivo при воздействии вихревого магнитного поля // Кубанский научный медицинский вестник. - 2005. - №1-2. -С. 155-158.

3. Бодня В.Н., Бахмутский Н.Г., Мороз А.Н. Апоптоз клеток рака лёгкого при воздействии вихревого магнитного поля // «Актуальные проблемы клиники внутренних болезней». Материалы Международной научно-практической конференции Южного Федерального округа. - Владикавказ, 2007.-С. 17-18.

4. Бодня В.Н., Бахмутский Н.Г., Мороз А.Н. Пролиферативная активность клеток рака лёгкого при воздействии вихревого магнитного поля //«Актуальные проблемы клиники внутренних болезней». Материалы Международной научно-практической конференции Южного Федерального округа. — Владикавказ, 2007. - С. 18-20.

5. Бодня В.Н., Бахмутский Н.Г. Вихревое магнитное поле и пролифера-тивная активность клеток рака лёгкого // Онкохирургия. - 2008. - №1. - С. 128.

6. Бодня В.Н., Бахмутский Н.Г. Апоптоз клеток рака лёгкого при воздействии вихревого магнитного поля // Онкохирургия. - 2008. - №1. - С. 129.

7. Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н. Кинетика роста и мета-стазирование карциносаркомы Уокера (КУ) при воздействии вихревого магнитного поля (ВМП) // Онкохирургия. -2010. - Приложение№1. - С. 189.

8. Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н. Морфофункциональная картина регионарных лимфоузлов и метастазирование при воздействии вихревого магнитного поля // Онкохирургия. - 2010. - Приложение№1. - С. 189.

9. Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н. Закономерность угнетения пролиферативной активности опухолевых клеток. Научное открытие (диплом №335) // Научные открытия, идеи, гипотезы (1992 - 2007): инф. - аналит. обзор. - М., 2007. - С. 316.

10. Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н., Рипа И.М. Рост и метастазирование карциносаркомы Уокера (КУ) при воздействии вихревого магнитного поля // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2011. -№1(33). - С. 355.

11. Бодня В.Н., Бахмутский Н.Г., Рипа И.М. Регионарные лимфоузлы и метастазирование при воздействии вихревого магнитного ноля (ВМП) в эксперименте // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2011. - №1(33). - С. 355.

12. Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н., Поляков И.С. Влияние вихревого магнитного поля па клетки рака лёгкого in vitro // Фундаментальные исследования. -2011. - №11(Часть 2). - С. 350-353.

13. Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н. Влияние вихревого магнитного поля на кинетику роста перевиваемых опухолей РС-1 и карциносаркомы Уокера // Волгоградский научно-медицинский журнал. - 2011. - №3. - С. 48-51.

14. Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н. Влияние вихревого маг нитного поля на периферические лимфатические узлы в эксперименте // Медицинская физика. - 2011. - №4(52). - С. 50-57.

15. Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н., Поляков И.С. Сфе-роидообразование, пролиферативная активность, апоптоз клеток рака лёгкого при воздействии вихревого магнитного поля in vitro.// Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. - 2012. - №1. - С. 126-130.

16. Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н. Оценка противоопухолевой эффективности вихревого магнитного поля в эксперименте // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2012. - Том 10, выпуск 3. - С. 35-41.

17. Порханов В.А., Бахмутский Н.Г. Бодня В.Н. Пролиферативная активность немелкоклеточного рака лёгких как фактор прогноза при воздействии вихревого магнитного поля // «Достижения онкологической службы Краснодарского края». Материалы краевой научно-практической конференции. - Краснодар, 2012.-С. 208-211.

18. Бахмутский Н.Г., Порханов В.А., Бодня В.Н. Кинетика роста некоторых перевиваемых опухолей при воздействии вихревого магнитного поля // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - №2 (131). - С. 33-37.

19. Бахмутский Н.Г., Порханов В.А., Бодня В.Н. Экспрессия белков Ki-67 и р53 как независимый фактор прогноза для немелкоклеточного рака лёгкого при воздействии вихревого магнитного поля // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - №3 (132). - С. 25-29.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АИ - апоптозный индекс;

ВМП — вихревое магнитное поле;

ДК - диффузионные камеры;

ИГХ - иммуногистохимия

МИ - митотический индекс;

НМРЛ - немелкоклеточный рак лёгкого;

РЛ — рак лёгкого

Подписано к печати 09.11.2012 г. Тираж 100 экз. Заказ № 526

Отпечатано е «Цифровой типографии ЮгПринт» г. Краснодар, ул. Коммунаров, 31

Актуальность работы.

Рак легкого - самое распространенное в мире онкологическое заболевание. За последние несколько десятилетий уровень заболеваемости раком лёгкого вырос в десятки раз. Особенно это заметно в индустриально развитых странах, где эта патология занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости.

В структуре злокачественных новообразований в России лидирует по распространённости и смертности рак лёгкого. В нашей стране каждый год раком легкого заболевает более 63000 человек. В России эта наиболее частая онкологическая патология составляет 14% от всех злокачественных опухолей. Мужчины болеют в несколько раз чаще, чем женщины. Заболеваемость раком легкого в нашей стране составляет 40,2 случаев на 100 тысяч населения в год. По смертности от злокачественных новообразований в России рак лёгкого стоит на первом месте и составляет 36,5 на 100 тысяч населения в год (Порханов В.А., Барышев А.Г., Тесленко Л.Г. и др., 2009). Кроме этого отмечается тенденция к увеличению числа случаев поздней диагностики рака лёгкого.

Немелкоклеточный рак лёгкого (НМРЛ) одна из наиболее распространённых злокачественных новообразований с плохим прогнозом. Хирургические резекции играют главную роль в лечении пациентов с I и II стадиями опухоли, но не всегда могут быть использованы для пациентов с III стадией НМРЛ (Cersosimo R.J., 2002). Для улучшения результатов лечения НМРЛ используются различные комбинации химиотерапии и лучевой терапии (Arriagada R., Bergman В., Dunant A. et al., 2004, Machtay M., Lee J.H., Stevenson J.P. et al., 2004). Однако, 3-летняя выживаемость при II стадии НМРЛ составляет 35-55%, а 3-х летняя выживаемость резектабельных опухолей III стадии - 28% (Martin J., Ginsberg R.J., Venkatraman E.S. et al., 2002).

Лечение больных с нерезектабельным местно-распространённым НМРЛ продолжает развиваться в течение последних двух десятилетий, но остаётся до настоящего времени недостаточно эффективным. Некоторые рандомизированные исследования представили результаты лечения пациентов с такой распространённостью процесса, в которых было отмечено, что при сопутствующей методике химиорадиотерапии наиболее высокая медиана выживаемости составляет от 16 до 17 месяцев (Curran W.J., Scott C.B., Langer C.J. et al., 2003, Zatloukal P.V., Petruzelka L., Zemanova M. et al., 2004). Таким образом, требуется новая стратегия подходов к лечению пациентов с НМРЛ, особенно с нерезектабельными опухолями (Huang С., Liu D., Masuya D., 2005).

Одной из попыток решения этой задачи является разработка в КГМУ метода лечения злокачественных новообразований вихревым магнитным полем (ВМП), новизна которого заключается в одновременном и синхронном воздействии на все органы и системы больного вращающимся, плавно изменяющимся по амплитуде, магнитным полем. (Синицкий Д.А., 1982). Реализуется этот метод с помощью установки «Магнитотурботрон» (Синицкий Д.А., Синицкий С.Д., 1996).

Метод лечения злокачественных опухолей ВМП кроме клинических испытаний, проведенных в КГМУ, прошёл независимую клиническую апробацию в РОНЦ РАМН, Рентгенорадиологическом институте МЗ России, Беларусском НИ институте онкологии и радиологии, Главном военном клиническом госпитале им. Н.Н.Бурденко. На основании клинических испытаний комиссия комитета по новой медицинской технике Минздрава России (протокол №5 от 03.11.94) разрешила серийное производство установки «Магнитотурботрон» и применение нового метода лечения в медицинской практике (приказ №311 от 15.11.95).

Актуальную задачу для своих исследований мы видели в обосновании и оценке методики комплексного лечения именно НМРЛ с включением в комплекс лечения, помимо традиционных методов, ВМП. Выполнение программы обоснования и оценки лечения возможны были только при проведении параллельно экспериментальных и клинических исследований.

Экспериментальное. Изучая, морфологию трансплантантов перевиваемой опухоли С-45 в диффузионных камерах установлено, что при воздействии ВМП число сфероидов снижается (число сфероидов в контроле -28,25 ± 3,18, в опыте - 13,38 ± 1,54, р<0,05). Индекс сфероидообразования был равен 52,6%. При этом пролиферативная активность клеток саркомы-45 снижается, о чём свидетельствует уменьшение митотического индекса (МИ: контроль - 29,53 ± 2,73, опыт — 14,11 ± 1,82%, р<0,05), при этом нарастает число патологических митозов, а в их спектре преобладает патология митоза, связанная с повреждением митотического аппарата (рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе, многополюсные митозы, комковатая метафаза, ассиметричные митозы). На фоне снижения митотического индекса нарастает апоптозный индекс (контроль - 1,51 ± 0,33%, опыт - 3,28 ± 0,43%, р<0,05) (Бахмутский Н.Г., Голубцов В.И., Мороз А.Н., 2003).

Поэтому мы решили в работе расширить эти исследования по изучению уже сфероидообразования, пролиферативной активности, апоптоза в клетках НМРЛ, для теоретического обоснования возможности использования ВМП в клинике.

До настоящего времени в КубГМУ проведены экспериментальные исследования влияния ВМП на довольно широком спектре перевиваемых опухолей ^-256, РС-1, ЛИСИ, ЬЬ, Ь-1210, Р-388, Ьа). Показано, что ВМП индукцией 3-15 мТ оказывает ингибирующее действие на рост солидных перевиваемых опухолей. Так процент торможения роста для РС-1 превышает 50%) и может достигать 90% (Бахмутский Н.Г., Пылева Т.А., Фролов В.Е., 1991].

При воздействии ВМП на рост карциносаркомы Уокера ^-256) при определённых условиях отмечается полная регрессия с увеличением продолжительности жизни животных-опухоленосителей до 61% (Бахмутский Н.Г., Пылева Т.А., Фролов В.Е., 1991).

Для асцитных опухолей установлено, что противоопухолевое действие ВМП реализуется при увеличении экспозиции (продолжительность жизни для Г.-1210 составляет 76%о) (Бахмутский Н.Г., 2000).

Так как в клинике планировались работы по изучению эффективности лечения в группах больных с распространённым HMPJ1, можно сказать генерализованным, встала актуальная проблема изучения влияния ВМП на процессы метастазирования в эксперименте и механизмы противоопухолевого влияния ВМП с учётом морфо-функциональных изменений в периферических лимфоузлах (ЛУ) животного-опухоленосителя в эксперименте. Известно из литературы, что состояние регионарных к опухоли ЛУ часто оказывают решающее влияние на течение опухолевого процесса и во многом определяют 5-летнюю выживаемость онкологических больных (Циплаков Д.Э., Петров C.B., 1997).

Морфологическое. Проведенные ранее в ПНИЛ по использованию магнитных полей в онкологии КубГМУ морфологические исследования по влиянию ВМП на некоторые опухоли в клинике, показали, что основным механизмом противоопухолевого действия является угнетение пролиферативной активности и индукция апоптоза в опухолевых клетках.

Изучая морфологически опухоли, подвергавшиеся воздействию ВМП у больных раком молочной железы II-III "А" стадии с предоперационной магнитотерапией установлено, что ВМП вызывает морфологические изменения, характерные для терапевтического патоморфоза. Это проявляется дистрофией различной степени, как цитоплазмы, так и ядра опухолевых клеток. Исходом таких изменений является диффузный, очаговый или обширный некроз паренхимы опухоли. В строме опухоли отмечается выраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация. Морфометрические исследования некротического и паренхиматозного компонентов опухоли показали уменьшение паренхимы после воздействия ВМП до 23,7% (контроль - 45,7%) за счёт возрастания площади некротического компонента до 18,8% (контроль -0,02%). Отмечено также угнетение ВМП пролиферативной активности опухолевых клеток. Митотический индекс в опухолях, подвергавшихся воздействию ВМП ниже контроля в два раза (Кижаев Е.И., Муфазалов Ф.Ф., Бахмутский П.Г., 2003).

Таким образом, сделан вывод, что при воздействии на некоторые опухоли в клинике ВМП угнетает пролиферативную активность опухолевых клеток, с индукцией апоптоза в ней, что является благоприятным прогностическими факторами. Оценка пролиферации стала популярной в онкологии и гистопатологии в последнее время, как средство предсказания биологического поведения опухоли, т.е. вероятности возникновения местного рецидива после проведения первичного лечения, метастатического потенциала новообразования и роста метастазов, и самое главное возможности прогнозирования выживаемости пациентов после того или другого метода лечения (Van Diest P.J, 2002). Кроме пролиферативной активности основными в прогнозе HMPJI являются экспрессия белков Ki-67 и р53 в опухоли.

Показано, что индекс Ki-67 является независимым показателем при прогнозировании рецидивов и длительности жизни у больных раком лёгкого (Пожарисский K.M., Леенман Е.Е., 2000, Bai X.Z., Masters J.R., 0,Donoghue N. et al, 1999, Jansen R.L., Hupperets P.S., Arends J.W. et al., 1998).

Систематический обзор литературы убедительно показал, что мутация гена р53 и высокая экспрессия мутированного белка р53 в клетках рака лёгкого является плохим прогностическим фактором для выживаемости у пациентов с НМРЛ ( Laudanski J., Niklinska W., Burzykowski T., 2001).

Другим важным прогностическим фактором для НМРЛ является апоптоз. Можно ожидать менее агрессивное поведение опухоли с высокой скоростью апоптоза и, соответственно, больные должны прожить дольше те, у которых высокий уровень апоптоза в клетках опухоли. Но параллельно нужно ещё, чтобы у этих больных пролиферативная активность опухолевых клеток была низкой (Ghosh M., Crocer J., Morris A., 2001).

Клиническое. В ранее проведенных исследованиях в ПНИЛ по использованию магнитных полей в онкологии КГМУ, для оценки результатов лечения были использованы различные группы больных с генерализованными и локализованными формами злокачественных новообразований.

В группе больных с метастазирующим раком молочной железы изучение выживаемости показало следующее. Трёхлетняя выживаемость по всей группе составила 52,7% (ш = 0,01), а у больных, леченных с эффектом - 58,9% (т = 0,01). Трёхлетняя выживаемость для больных, леченных с полной регрессией, частичной регрессией, стабилизацией, соответственно, составила - 53,6% (ш = 25,2), 49,2% (ш = 9,8), 32,0% (ш = 11,2). Ремиссия в течение 3-х лет отмечена у 29,2% (т = 9,4) больных, а у пациенток, леченных с полной, частичной регрессией, стабилизацией, соответственно, составила - 26,8% (ш = 22,8), 22,2% (ш = 10,9), 17,0% (ш = 9,0). Средняя продолжительность ремиссии составила 37,3 месяцев (о = 12,2). Средняя продолжительность жизни больных по всей группе была равна 42,0 месяца (а = 9,8) (Бахмутский Н.Г., 2000).

Изучение выживаемости в группе больных генерализованной меланомой кожи после лечения ВМП показало следующее. Трёхлетняя выживаемость по всей группе составила 34,3% (ш = 7,5). Среди больных, у которых был отмечен эффект от лечения, 3-летняя выживаемость составляла 42,0 (ш = 9,2), а у пациентов с полной, частичной регрессией и стабилизацией она, соответственно, была равна 60,0% (ш = 21,6), 14,4% (ш = 13,2) и 28,0% (т = 15,7). Длительность ремиссии в 3 года среди больных, леченных с эффектом, отмечена в 33,6% (т = 10,1). Среди больных, леченных с эффектом, средняя продолжительность ремиссии была равна 36,7 месяцев (а = 8,7). Средняя продолжительность жизни по всей группе составила 37,2 месяца (а = 8,3) (Бахмутский Н.Г., 2000).

После изучения противоопухолевого эффекта на больных с генерализованной формой рака молочной железы была сформирована группа пациенток с локализованным раком молочной железы (Т2,3) без определяемых клинически регионарных метастазов (N0). Лечение данной категории женщин включало предоперационную магнитотерапию с последующей радикальной мастэктомией. Данное исследование позволило, кроме оценки выживаемости, изучить морфологические изменения в опухолях молочной железы после воздействия ВМП, о чём сказано выше.

В первой группе больных (Т2) наблюдаемая 5-летняя выживаемость была равна 90,8% (ш = 4,40), во второй группе (ТЗ) - 75,2% (ш = 12,6). Средняя продолжительность жизни, рассчитанная по наблюдаемой выживаемости соответствовала для первой группы 8,2 лет (о = 0,3), для второй - 6,7 лет (о = 0,8). Скорректированная 5-летняя выживаемость для первой группы (Т2) была равна 95,4% (ш = 3,2),для второй (ТЗ) - 92,3% (ш = 7,4). Средняя продолжительность жизни в этих группах соответствовала 8,8 годам (о = 0,16) и 7,9 годам (о = 0,55) (Бахмутский Н.Г., 2000).

Для оценки возможного улучшения результатов комплексного лечения рака молочной железы ТЗЫ1М0, Т1-ЗЫ2М0 с использованием магнитотерапии методом рандомизации было сформировано две группы больных, в первой группе в комплекс лечебных мероприятий помимо лучевой терапии, радикальной операции и последующей химиогормонотерапии была включена магнитотерапия в пред- и послеоперационном периоде, во второй группе в комплексе лечебных мероприятий магнитотерапии не было (Лебедь Е.В., 2007).

Результаты комплексного лечения рака молочной железы в группе без магнитотерапии были следующими. 5-летняя выживаемость в целом по группе составила 52,03 ± 7,07%. Средняя продолжительность жизни в группе составила 3,87 года (о = 0,29), средняя длительность безрецидивного периода была равна 3,46 года (о = 0,37). При комплексном лечении рака молочной железы в группе больных с включением магнитотерапии 5-летняя выживаемость составила 69,87 ± 6,48%, безрецидивная - 67,95 ± 6,59%. Средняя продолжительность жизни была равна 4,80 годам (а = 0,26), а средняя длительность безрецидивного периода - 4,41 года (о = 0,34). Таким образом, выживаемость увеличивается, по нашим данным, на 18% (р<0,001), безрецидивная выживаемость - на 18% (р<0,001). При этом достоверно увеличивается также средняя продолжительность жизни (Лебедь Е.В., 2007).

Проведенные исследования позволяют расширить клинические изучения по противоопухолевой эффективности с включением других опухолей, например, опухолей лёгкого, где результаты лечения, пока ещё являются неутешительными.

Цели и задачи исследования:

Цель: Улучшение результатов комплексного лечения нерезектабельного местно-распространённого НМРЛ с использованием ВМП с теоретическим обоснованием такой методики.

Задачи:

1. Оценить в эксперименте, используя диффузионные камеры, сфероидообразование клетками НМРЛ;

2. Описать морфологическую картину роста клеток НМРЛ в диффузионных камерах при воздействии ВМП с изучением их пролиферативной активности, апоптоза, фаз митозов, спектра патологических митозов;

3. Изучить влияние ВМП на кинетику роста перевиваемых опухолей РС-1 и карциносаркому Уокера;

4. Изучить сроки метастазирования в регионарные лимфатические узлы в эксперименте, используя морфологический метод верификации метастазов, на моделях лабораторных животных (РС-1 и карциносаркома Уокера);

5. Оценить морфофункциональные изменения в регионарных лимфоузлах при воздействии ВМП на перевиваемые опухоли в эксперименте, (паракортикальная зона, синусы, посткапиллярные венулы, регенеративные центры);

6. Для прогностической оценки улучшения результатов лечения НМРЛ с использованием ВМП оценить основные факторы, влияющие на выживаемость у этих больных - пролиферативную активность с изучением фаз митозов, спектр митозов, уровень экспрессии антигена пролиферации Кл-67 и экспрессию антигена р53;

7. Изучить, как независимый прогностический фактор для выживаемости, апоптоз в клетках НМРЛ пациентов, подвергавшихся воздействию ВМП;

8. Оценить преимущества комплекса лечении больных нерезектабельным местно-распространенным НМРЛ с включением ВМП по объективному эффекту лечения, токсичности, выживаемости в двух рандомизированных группах с использованием следующего дизайна исследования: группа А - химиолучевая терапия, группа В - с включением магнитотерапии.

Научная новизна исследования:

Работа проводилась на основе научного открытия «Закономерность изменения пролиферативной активности опухолевых клеток под воздействием вихревого магнитного поля», зарегистрированного в 2007 году, (диплом №335), авторы: Порханов В.А., Бахмутский Н.Г., Бодня В.Н.

В представленной диссертации:

- впервые показано, что при культивировании в диффузионных камерах клеток рака лёгкого суспензией или кусочком опухоли под воздействием ВМП отмечается снижение сфероидообразования;

- впервые выявлено подавление ВМП пролиферации с индукцией апоптоза в клетках рака лёгкого, культивируемых в диффузионных камерах;

- подтверждено, что ВМП угнетает рост некоторых солидных перевиваемых опухолей животных (карциносарома Уокера, РС-1);

- впервые, моделированием опухолевого процесса у экспериментальных животных, установлено увеличение времени до появления метастазов, верифицированных морфологически, в регионарных лимфатических узлах при воздействии ВМП;

- впервые установлено, что ВМП влияет на морфофункциональную перестройку периферических лимфоузлов животных, вызывая изменения в корковом и мозговом веществе узла, а также в паракортикальной зоне, ассоциированные с благоприятным исходом при развитии опухоли; впервые выявлено, что при воздействии ВМП у животных-опухоленосителей в периферических лимфоузлах отмечаются морфофункциональные изменения, связанные с отсрочкой метастазирования в них, а именно: гиперплазия паракортикальной зоны, реакция первичных фолликулов коркового вещества с увеличением фолликулов со светлыми, герминативными центрами, увеличение площади посткапиллярных венул и синусовый гистиоцитоз;

- впервые отмечено, что ВМП ингибирует пролиферативную активность и индуцирует апоптоз в опухолевых клетках пациентов с НМРЛ, что является благоприятным прогностическим фактором для выживаемости;

- впервые, используя уровени экспрессии белков Кл-67 и р53, как независимые прогностические факторы, у больных НМРЛ, подвергавшихся воздействию ВМП, выявлено снижение их экспрессии, что благоприятно влияет на выживаемость;

- впервые отмечено улучшение объективного эффекта, снижение токсичности, увеличение выживаемости при комплексном лечении больных с нерезектабельным местно-распространённым НМРЛ, с включением в комплекс, помимо лучевой и химиотерапии, ВМП.

Практическая значимость работы.

Проведенные экспериментальные и клинические исследования позволяют рекомендовать включение ВМП в комплексный метод лечения нерезектабельного местно-распространённого НМРЛ для использования в лечебных учреждениях с целью уменьшения токсичности и улучшения непосредственных и отдалённых результатов лечения.

Внедрение результатов исследования.

Разработанный комплексный метод лечения нерезектабельного местно-распространённого НМРЛ внедрён на краевом уровне и используется в Краевой клинической больнице №1 Краснодарского края, в ГБУЗ "Клинический онкологический диспансер №1" департамента здравоохранения Краснодарского края.

Основные положения, выносимые на защиту.

- применение ВМП ингибирует пролиферативную активность опухолевых клеток и индуцирует апоптоз in vitro, в эксперименте вызывает угнетение роста перевиваемых опухолей с морфофункциональными изменениями в периферических лимфоузлах, препятствующими раннему метастазированию;

- целесообразность использования ВМП в комплексе лечения HMPJI подтверждена улучшением результатов такой терапии - объективным эффектом, уменьшением токсичности, улучшением выживаемости, а также данными морфологических и иммунногистохимических исследований.

Апробация диссертации состоялась 07 мая 2012 г. на заседании кафедры онкологии с курсом торакальной хирургии ФПК и ППС и отдела по использованию магнитных полей в онкологии ЦНИЛ ГБУ ВПО КубГМУ с участием сотрудников Краевой клинической больницы №1, сотрудников ГБУЗ "Клинический онкологический диспансер №1" департамента здравоохранения Краснодарского края.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: научно-практической конференции Южного Федерального округа «Актуальные проблемы клиники внутренних болезней», Владикавказ, 2007; на Международном конгрессе по онкохирургии, Краснодар, 2008; на Международном онкологическом научно-образовательном форуме ОНКОХИРУРГИЯ-2010, «В будущее через новые технологии», 31мая-02июня, 2010, Москва; на X Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении», 20-21 апреля 2011, Санкт-Петербург; на 34 Annual Meeting of the Bioelectromagnetics Society, Brisbane, Australia, 17-22 June, 2012.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 19 работ, из них 12 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы. Работа изложена на 356 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований с заключениями по главам, практические рекомендации, выводы, указатель литературы, включающий 111 отечественных и 354 зарубежных источников. Текст диссертации содержит 31 таблицу, 47 рисунков, 12 формул.

ВЫВОДЫ

1. Клетки немелкоклеточного рака лёгкого при культивировании в диффузионных камерах, как суспензией клеток, так и кусочками опухолей, активно формируют сфероиды. Их число составило 30,15 ± 7,12 при культивировании клеток суспензией и 26,17 ± 0,42 - кусочком. После воздействия вихревого магнитного поля число сфероидов уменьшается и, соответственно, составляет 12,32 ± 5,12 и 11.42 ± 0,21 (р<0,05), а индекс эффективности сфероидообразования имеет для обоих экспериментов положительные значения от 56,4% до 59,6%. Это свидетельствует об ингибируюгцем действии вихревого магнитного поля на процессы сфероидообразования клетками немелкоклеточного рака лёгкого.

2. Вихревое магнитное поле индуцирует апоптоз в клетках немелкоклеточного рака лёгкого, культивируемых в диффузионных камерах. Индукция апоптоза проходит параллельно с ингибицией пролиферативной активности и значительно выше в клетках, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля. Индекс апоптоза соответствует в двух сериях экспериментов для немелкоклеточного рака лёгкого - 4,97 ± 0,47% - в опыте при 0,78 ± 0,11% - в контроле, р<0,05 и 5,17 ± 0,60% - в опыте при 2,03 ± 0,64%о - в контроле, р<0,05.

3. Получены данные о снижении митотического индекса при воздействии вихревого магнитного поля на культивируемые клетки немелкоклеточного рака лёгкого, как показателя пролиферации. Так митотический индекс в двух экспериментах с использованием клеточных культур рака легкого для 1-го эксперимента в контроле был равен 17,24 ± 3,05%), при его значении в опыте - 10, 06 ± 2,32% (р<0,05) и для П-го - 24,31 ± 3,97%о, при его значении в 19,68 ± 2.59% в опыте (р<0,05).При изучении фаз митозов в опухолевых клетках отмечено преобладание метафазы. Для клеток немелкоклеточного рака лёгкого, культивируемых суспензией в диффузионных камерах, преобладание метафаз выглядело следующим образом: в контроле 67,48 ± 1,43, в опыте - 74,46 ± 1,22, (р<0,05), для клеток, культивируемых кусочком: в контроле - 38,18 ± 4,11%, в опыте - 62,03 ± 7,23%, (р<0,05).

4. При воздействии вихревого магнитного поля на клетки немелкоклеточного рака лёгкого, культивируемые в диффузионных камерах отмечено увеличение процентного содержания патологических митозов. Если в клетках рака легкого, не подвергавшихся воздействию, процент патологических митозов составлял от 49,59 ± 2,03% (культивирование суспензией клеток) до 77,92 ± 1,09% (культивирование кусочком опухоли), то в опыте их процент7 нарастал от 72,16 ± 0,07% (культивирование суспензией клеток) до 91,97 ± 0,32% (культивирование кусочком опухоли), (р<0,05). В спектре патологических митозов клеток, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля, преобладала патология митоза, связанная с повреждением митотического аппарата (рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе, многополюсные митозы, комковатая метафаза, ассиметричные митозы).

5. Выявленные морфофункциональные изменения в периферических лимфатических узлах экспериментальных животных (крыс) при воздействии вихревого магнитного поля могут ассоциироваться с благоприятным прогнозом при развитии опухоли - это и гиперплазия паракортикальной зоны (например, при индукции вихревого магнитного поля в ЗмТ, площадь на 40-й день исследования составляет 9,05±0,24, в контроле - 6,78±0,84, р<0,05); синусовый гистиоцитоз; увеличение фолликулов со светлым центром (например,при индукции вихревого магнитного поля в 15мТ, число на 40-й день исследования составляет 4,12±0,18, в контроле 0,78±0,13, р<0,05) и увеличение объёма посткапиллярных венул, в сравнении с интактными животными. Отмечено, что увеличение индукции вихревого магнитного поля усиливает больше гуморальные иммунные реакции, чем клеточные.

6.Вихревое магнитное поле индукцией ЗмТ и 15мТ ингибирует рост перевиваемых опухолей РС-1 (медленнорастущей опухоли) и карциносаркомы Уокера (быстрорастущей опухоли). При изучении кинетики роста РС-1 и карционосаркомы Уокера можно отметить, что при воздействии статистически достоверно уменьшается средний объём опухолей на всех этапах воздействия (например, объём опухоли РС-1 при воздействии вихревого магнитного поля в ЗмТ на 35 сутки от перевивки составляет

3 3

4,83±1,08 см , без воздействия 16,20±3,37 см , р<0,05). Удельная скорость роста опухолей на отдельных этапах роста замедляется и даже может принимать отрицательные значения (например, для опухоли карциносаркомы Уокера удельная скорость на 35 сутки от момента перевивки составляет -0,59 см /сутки). Все эти показатели свидетельствуют о высокой противоопухолевой эффективности вихревого магнитного поля в эксперименте. Таким образом, можно думать, что используя вихревое магнитное поле в клинике, например, при лечении рака лёгкого, можно достичь лучшего локального контроля опухоли при его использовании в комплексе лечебных мероприятий.

7. При моделировании метастазирования в регионарные лимфатические узлы, используя перевиваемые опухоли РС-1 и карциносаркому Уокера, получены данные о морфофункциональных изменениях в лимфатических узлах при воздействии вихревого магнитного поля, которые приводят к задерживанию метастазирования в лимфатические узлы, с морфологической их верификацией, во всех экспериментах на 10 суток, по сравнению с контролем. Теоретически можно предположить, что используя вихревое магнитное поле в клинике, например при комплексном лечении рака лёгкого, можно с его помощью улучшить системный контроль опухоли.

8. Выявлено, что вихревое магнитное поле ингибирует пролиферативную активность в клетках больных немелкоклеточным раком лёгкого, что в плане выживаемости является хорошим прогностическим признаком. Так митотический индекс достоверно снижается (без воздействия - 20,4 ± 2,3%, после воздействия 14,1 ± 0,04%, р < 0,05). Отмечено также увеличение числа патологических митозов (без воздействия - 5 3,2 ± 4,3%, после воздействия - 72,4 ± 3,7%, р < 0,05) с превалированием метафазы (без воздействия - 75,9 ± 4,5%, после воздействия - 87,2 ± 2,7%, р < 0,05) в опухолях. В спектре митозов преобладают грубые формы, которые приводят клетку к гибели (комковатая метафаза, рассеивание хромосом и их фрагментов и т.д.) и её элиминации из опухоли. Степень снижения митотической активности и нарастание относительной частоты комковатых метафаз, а также и других грубых форм патологии митоза служит одним из объективных критериев степени повреждения опухоли. Вихревое магнитное поле снижает экспрессию маркера пролиферации Кл-67 в опухолях больных немелкоклеточным раком лёгкого. При изучении уровня экспрессии Кл-67 в опухолях до воздействия отмечено, что экспрессия этого антигена в клетках опухолей была равна 48,4 ± 16,7%, а после воздействия отмечено её уменьшение до 32,8 ± 11,5% (р< 0,05).

9. Получены достоверные данные о снижении экспрессии белка р53 в опухолях, подвергавшихся воздействию вихревого магнитного поля. При анализе уровней экспрессии р53 было выявлены следующие цифры: для опухолей перед началом воздействия вихревого магнитного поле уровень экспрессии был равен 41,5 ± 12,1%, после воздействия отмечалось снижение его показателей до 29,7 ± 10,3 (р < 0,05). Эти данные ассоциируются с хорошим прогнозом у больных раком легким , если в комплексной терапии использовать вихревое магнитное поле. Вихревое магнитное поле индуцирует апоптоз в клетках больных немелкоклеточным раком лёг кого. Апоптозный индекс для немелкоклеточного рака лёгкого без воздействия вихревого магнитного поля был равен 1,20 ± 0,19%, при воздействии увеличивался до 2,64 ± 0,23% (р < 0,05), что также является благоприятным прогностическим фактором.

10. При регистрации объективного ответа в двух рандомизированных группах больных местно-распространённым нерезектабельным немелкоклеточным раком лёгкого при лечении химиолучевой терапией (контрольная группа) и химиолучевой терапией вместе с вихревым магнитным полем (основная группа) получено, что в контрольной группе он отмечен в 90%, в основной - 98,1%) (р<0,05). При этом в основной группе чаще отмечена полная регрессия - 15,4% (в контрольной - 4,0%), частичная - 65,4% (в контрольной - 52,0%).

12. Используя комплексное лечение больных немелкоклеточным раком лёгкого с включением вихревого маг нитного поля ( основная группа) было отмечено снижение регистрации токсических проявлений по сравнению с контрольной группой, таких как нейтропения (в основной у 3 больных, в контрольной - у15,р<0,05), лейкопения (в основной - у 15, в контрольной - у 36, р<0,05), а также лимфопении, снижения уровня гемоглобина, слабости, анорексии, дисфагии, эзофагита, одышки, тошноты, рвоты, пневмонита.

13. В основной группе показатели лечения были лучше, так трёхлетняя выживаемость составила 87,70% (т=5,26) при 79,22% (т=9,29) в контрольной группе. Средняя продолжительность жизни в основной группе статистически достоверно увеличилась до 31,93 месяца (о = 2,33) при 21,23 месяца (о = 2,89) в контрольной, (р=0,04).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

При комплексной терапии местнораспространённого нерезектабельного НМРЛ с целью снижения токсических проявлений, а также с целью улучшения непосредственных (объективный эффект) и отдалённых результатов (наблюдаемая и безрецидивная выживаемость) рекомендуется использовать ВМП наряду с традиционными методиками.