Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Новые синтетические аналоги эстрогенов и антиэстрогенов; молекулярные механизмы действия

РГЗ од

На правах рукописи

Соловьева Елена Викторовна

Новые синтетические аналоги эстрогенов и антиэстрогенов; молекулярные механизмы действия.

14.00.25. — фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1996 г.

Работа выполнена на кафедре молекулярной фармакологии с курсом радиобиологии медико-биологического факультета Российского государственного медицинского университета

Научные руководители:

Академик РАМН, докюр медицинских на\к . профессор Сергеев II.В.

Кандидат медицинских наук Карева Г.Н.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук. [Увари Г'.Я.

Доктор медицинских наук. Бледное Ю. А

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия им.И.М.Сеченова

Зашита состоится _1996 I о да

в_ часов на заседании диссертационного совета Д.001.25.01.

НИИ Фармакологии РАМН (г.Москва, ул.Балтийская. 8).

Автореферат разослан _ 1996 года

Ученый секретарь Совета кандидат медицинских наук

Вальдман Е.А.

Актуальность исследования. Эстрогенергнческим соединениям присуши эсфогенная. аншэстрогенная. антнокислнгельная. гиполпиидемическая актнвмосгь и др. В современной медицинском практике необходимы соединения, обладающие одним и; перечисленных эффектов при минимальном выраженности опальных.

Эстрогены. исполы\емые в заместительной терапии, эффективно устраняют неб.ки оирия шые симшомы перименопачзально! о периода, а также снижаю! смертность от пшемической болезни сердца, часютх инфаркта миокарда и мопового инсульта. что свяшно с их антиатерогенными эффектами (пшохолестерипемнческпп. антиокпсди-тельным) [Samsioe G.. 1993: Sullivan .1.. et al.. 1994: Wiseman H.. 1994]. Однако использование в заместительном гераппп \ женщин в перименопауэалыюм периоде, наряду с эстрогенами, прогестинов. для снижения риска развития вьнывае.мои эстрогенами гиперплазии и рака эндометрия, значительно снижает антиатерогенные эффекты эстрогенов [Miller V.. Muesing R.. LaRosa J. et al. 1991: Heckbert S. et al.. 1993].

Представляется актуальным поиск соединении с низкой эстрогенном и высокой антматерогенной активностями. Использование таких соединений в заместительной терапии у женщин в перименопаузальном периоде будет целесообразнее, существующей в настоящее время комбинированной эстроген-гесгагенной терапии.

Основным направлением совершенствования современных оральных контрацептивных средств является использование в качестве эстрогенного компонента высокоактивных синтетических эстрогенов [Прилепская В.Н., 1994]. В настоящее время ведется поиск соединений с высокой эстрогенной активностью в рядах: окисленных по кольцу С эстрогенов, металло-содержащих эстрогенов [ Bednarski P., Gust R., et al. 1997; Ржезников В.M., Иваненко Т.Н. и др.,1986]. Использование таких соединений позволяет снизить эффективную дозу эстрогенного компонента, а следовательно и степень выраженности обусловленных им побочных эффектов.

Антиэстрогены применяют в клинической практике при гипофункции яичников, дисфункциональных метроррагпях. андрогенной недоста-точностп у мужчин, а также в качестве противоопухолевых средств при раке молочной железы и эндометрия [Wiseman Н.. 1994].

Известные антпэстротены проявляю!, наряду с атшпстрогенной. и эстро!енную активность т.е. являются частичными агонистахш эстрадиола [Сергеев II.В.. Минеева

H.H.. 1990]. Наличие неблатпрнятныч побочных эффектов антиэстрогенов - развшпе гиперпластпческих процессов в эндометрии связывают с их эстрогенной активностью [Савельева Г.М.. Сергеев II.В. и соав.. 1995]. чю свидетельствует о перспективности синтеза антиэстрогенов. обладающих низкой эстрогенной и высокой антиэстрогенной активностью. Одни из наиболее эффективных нестероидных антиэстрогенов получены в ряду производных трифеннлэтнлена [Yertosick F.el al.. 1992].

В т1астоящей работе проведен анализ активности новых синтетических эстрогенов -аналогов 8-изоэстрогенов. высокоактивного эстрогена, одного из представителей ряда окисленных по кольцу С эстрогенов - 1 Iß- нитроокси-9а-гпдроокси-этинпл)страдпола-днацетата (ннстранола) и - новых синтетических антиэстрогенов - производных трифеннлэтнлена (КЛ11-418 (цис- и транс- изомеры), КЛП-423).

Анализ активности гормональных соединений на молекулярном уровне в комплексе с другими биологическими методами может быть успешно использован для отбора соединений с требуемыми свойствами.

Целью настоящего исследования явился поиск эстрогенергических соединений с низкой и высокой эстрогенной, антиэстрогенной и антиатерогенной активностями среди новых синтетических аналогов эстрогенов и антиэстрогенов. Задачи исследования:

I. Анализ влияния аналогов 8-изоэстрогенов - 8-изоэстрадиола, 8-изоэстрона. 8-изоместранола и метилового эфира 8-изоэстрона на связывание 3Н-эстрадиола (3Н-Е:) с

Е;-рецепторамп в цитозольной фракции тканей матки крыс in \itro (относительная конкурентная способность связываться с Е:-рецептора\ш . ОКС) и in \i\o.

2. Оценка влияния аналогов 8-нзоктрогенов на содержание липидов в плазме крови и плазматических мембранах г канем матки овариэктомпрованных крыс.

3. Определение ангиокислительнои актнвносш 8-inoaiia.ioi ов эстрогенов.

4. Пзччение ктрогенной активности 1 ф-нптрооксп-Ча-гидроокси-линнлкградпол-лиацета1 (нистраиола).

5. Аналт влияния нистранола на связывание -:Н-Е; с Н:-рецепторамн ¡n \i\o и способности конкурировать с Л!-Е_- ¡а свяшваниес Г;-реце1порамп in \itro.

6 Изучение jcrpoi еннои и антиэстрогелнон активностей лис- и транс-шомеров 1-бен-зилокси-4-( 1.2-дифенил-2-хлор)гинил (бензола (КЛ11-418). ¡.2-0ис(4-бензнлоксифе-нпл)-1.2-дпфенплэтплена (КЛИ-423) и [амоксифена.

7. Анализ влияния цне- и транс-изомеров КЛИ-418. КЛ11-423 и тамоксифена на связывание "Н-Е; с Е;-Е2-ренепторами в нптозольноЛ фракции тканей матки крыс in \itro и in \i\o.

8. Оценка способности цис- п транс-изомеров КЛН-418. КЛИ-423 и тамоксифена конкурировать с Л 1-Е; за связывание с Е;-рецепторами в цптозольной фракции фракции нормальной и патологически измененной ткани матки человека in vitro.

9. Оценка острой токсичности выбранных аналогов 8-изоэстрогенов, нистранола и производных трпфенплэтплена.

Научная новизна и практическая значимость. Установлено, что аналоги метилового эфира 8-изоэстрона и 8-изоместранола обладают значительно меньшей, по сравнению с эстроном, утеротропной активностью. При этом обнаружено, что через 24 часа после их однократного введения снижается содержание триглицеридов и холестерина в плазме крови овариэктомированных крыс . Наиболее выраженная гиполипидемическая активность обнаружена у метилового эфира б-окса-О-гомо-8-

изоэстрона. Отсутствие у него токсических эффектов в диапазоне доз, значительно превышающем широту терапевтического действия препарата, позволяет говорить о целесообразности его дальнейшею доклинического исследования .хтя выяснения возможности эффективного использования в заместительной терапии пациенток клпчактерическо! о периода.

Сравнительный анализ эстрогенергпческон и антифертильной активностей широко применяемою в современных оральных контрацептивах эпшплэсградиола и ею нптрооксипронзводного - ннстранола показал превосходство нового эстрогена по данным показателям. Использование в оральных контрацептивах вмес то классическою эстрогена - этнннлэстраднола нового высокоактивною эстрогена-нистранола позволит снизить дозу эстрогенного компонента, и. следовательно выраженность побочных эффектов этих препаратов.

Оценена способность производных трифенилэтилена - цис- и транс-изомеров I-бензилокси-4-( 1.2-дифенил-2-хлорэтинил)бензола( КЛ И-418). 1.2-бис(4-бензилокснфенил) -1.2-днфенилэтилена (КЛИ-423) и тамокенфена влиять на связывание -'Н-Е: и -;H-Pj с рецепторами эстрадиола (РЕ) и прогестерона (РГ1) в условиях in uvo. а также конкурировать с Н1-Е: за связывание с Е:- рецепторами в цитозольной фракции тканей матки крыс, нормального и патологически измененного миометрня и эндометрия человека в условиях in vitro. Показано, что изученные производные трифенилэтилена обладают относительной конкурентной способностью связываться с РЕ в цитозольной фракции как гистологически неизмененной, так н опухолевой ткани миометрня. Относительноая конкурентная способность (за исключением цис-изомера КЛИ-418) связываться с РЕ в цитозольной фракции ткани миомы значительно превышает таковое в гистологически неизмененном миометрии, что может являться основой успешной терапии данного заболевания (после дополнительных доклинических исследований).

Анализ эстрогенергической активности производных трифенилэтилена и результаты, полученные другими исследователями [Clark .1. et al. 1981; Цолеинова E.H.. Кадатскнй P.M.. Грпненко Г.С. и др.. 1984] позволили нам сделать вывод о том, что поиск соединений с антизетрогенной активностью целесообразнее вест среди гранс-и гомеров производных трифенилэтилена.

Апробация работы. Резулыаты исследования докладывались на Втором Российском национальном кош рессе "Человек и лекарство". 1995: на совместных нау чных конференциях кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии МВФ. НИ.] молекулярной фармаколог ни и H ИЛ метабол и гма лекаре г венных средств. РГМ> .

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ. Обьем и структура работы. Диссертация представлена на I 20 страницах. Состой г из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения. выводов и библиографического указателя. Иллюстративный материал представлен рисунками (4). таблицами (20). фотографиями (6).

.Материалы и методы исследования. В экспериментах использованы соединения, синтезированные на кафедре химии природных соединений Санкт-Петербургского университета (завкафедрой. проф.ШавваА.Г.) - аналоги 8-изоэстрогеиов (8-нзо-эстрадиола, 8-изоэстрона, 8-изоместранола, метилового эфира 8-изоэстрона): из ряда высокоактивных, окисленных по кольцу С эстрогенов, синтезированных в ЭНЦ РАМН (рук.груп синтеза стероидных соединений, в.н.с.Ржезников ВМ.) - 1 ф-нитроокси-9а-гидрооксиэтинилэстрадиол-диацетат (ннстранол); производные трифенилэтилена, синтезированные в лаборатории химии стероидных соединений ВНИХФИ ЦХЛС (зав.лаб.. проф. Г.С.Грпненко). В качестве экспериментальных животных использовали неполовозрелых мышей-самок весом 10-12 г. и овариэктомированных белых крыс-самок весом 130-160 г.. Овариэктомию проводили по методу Киршенбладта Я.Д. [1969].

Изучаемые соединения вводили внутрибрюшинно в виде маслянных растворов на 4-ые сутки после операции. В экспериментальной части работы были использованы ткани маток белых беспородных крыс (150 животных), ткани эндометрия, полученные при гистероскопии н диагностическом выскабливании (20 образцов), миометрия и яичников человека, получение при гистер- и овариектомпм. Клинический материал был любезно предоставлен профессором В.Г.Бреусенко (кафедра акушерства и гинекологии педиатрическою факулыета РГМУ - зав. академик РАМН Г.М.Савельева). Во spue! обследованных больных с патологией эндометрия п женщин контрольной группы колебался oi 54 до 79 лсч. длительность постменопаузы от 5 до 12 .lei. В ходе работы были исследованы следующие виды патологии эндометрия человека: железисто-фиброзные полипы; железпсто-кистозные полипы: аденокарциномы. Возраст больных с миомой матки и женщин соответствующей контрольной группы колебался от 34 до 52 лет м в среднем составил 41 год. Для анализа характеристик миометрия в норме и при патологии были исследованы следующие образцы ткани: миоматозный узел и гистологически неизмененная ткань миометрия. Полученный биологический материал исследовали сразу или после хранения в низкотемпературном шкафу (t= -25 С0) не более 3-х суток. В образцах плазмы крови определяли спектр липидов и фосфолипидов по методам, описанным Кенте М. [1975]. В цпгозольных фракциях тканей матки определяли содержание белка, связывание эстрадиола (Е;) и прогестерона (Pj) рецепторами Е: (РЕ) и Pj (РП) , соответственно по общепринятой методике EORTC Breast Cancer Group [1982]. Фракцию плазматических мембран (ПМ) получали методом дифференциального центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы с последовательными отмывками по Lintner М. [1985]. Анализ чистоты полученной фракции ПМ определяли согласно методу, описанному в работе Арчакова А.И. [1978]. Относительную конкурентную способность аналогов 8-изоэстрогенов , нистранола и производных трифенилэтилена связываться с РЕ (относительная конкурентная

способность. ОКС) в тканях матки крыс и человека оценивали по методу Schneider М. [1972]. Экстракцию липидов из фракции плазматических мембран проводили по методу Кейтс М.[1968]. Экстракцию лшшдов из плазмы крови проводили по методу ßligh E.G et а1.[1959]. Качественно и количественно лппидные фракции оценивали с помощью юнкослонноп хроматографии на пластинах Silufol l'Y-254. ленситометрирования (денситометр EGR-65). Для построения калибровочных кривых использовали коммерческие препараты липидов фирмы "Sigma" (холестерин, свободные жирные кислоты, триглицериды. фосфатидплхолин. фосфашднлэтанолачин. фосфатидилсерии. сфннгомиелпн). В опьпах in м\о исследовали утеротронную Острогенную, оцениваемую по отношению массы матки к массе тела животного и антиэстрогенную. оцениваемую по тому же параметру, но на фоне введения препарата сравнения -эстрона) активность [Kranzfelder G.. Scheider М. et al. 1980].

Антнокислнтельную активность соединений измеряли методом регистрашш ТБК-активных продуктов [Клебанов Г.И.. и соавт.,1988] и методом Ре>нндуцнрованнон хемилюминисценцип (\Л) [Лопухин Ю.М.. и соавт.. 1983]. Антифершльнуто активность определяли, используя метод Oettel М. et al.[1965].

В работе использованы стандартные методы статистического анализа. Все полученные количественные результаты представлены в виде: Х=М + т. где X -изу чаемый показатель. М - его среднее значение в исследуемой статистической выборке, m - ошибка среднего. Достоверность различий между экспериментальными группами по изучаемым параметрам оценивалась с помощью непараметрического U-критерий для непарных совокупностей Вилкоксона-Манна-Уитни [Гублер Е.В.. 1978].

Основные результаты исследования. Соединения с низкой эстрогенной и высокой гиполипидемической активностями в ряду аналогов 8-изоэстрогенов. Поиск соединений, обладающих гиполипидемической и низкой эстрогенной активностью, проведен в ряду аналогов 8-изоэстрогенов (Рис.1).

Рис.1. Аналоги 8-иэострогенов.

(СН2)п

145= ОН-8-изоэстрогены О -8-изоэстроны ОС2НЗ - 8-изоместранолы Х= О-окса-аналоги 142= ОС2НЗ-метиловые Эфиры п-2 - гомо-аналоги

Табл.1.

Огиосительмая конкурента» способность (ОКС) аналогов 8-нзо)С1ро1Снов связываться с Ег-рецеп горами в цитозолыюй фракции тканей матки ¡п \itro (М +т).

N АНАЛОГИ О К С, %

8-и10запрадио:ш:

1 8-изоэстрадиол 8,980+0,210

2 6-окса-8-изоэстрадиол 4,372-0,170

3 0-гомо-8-изоэстрадиол 0,518+0,031

4 6-окса-0-гомо-8-изоэстрадиол 0.159+0,020

8-изозстрона:

5 6-окса-8-изоэстрон 0,20110.081

6 метил-0-гомо-8-изоэстрон 0,190+0.042

7 ацетокси-4-метил-8-изоэстрон 0,175+0,021

8 ацетокси-2-метил-8-изоэстрон 0,152+0,024

метилового эфира 8-изоэстропа:

9 8-изоэстрона 0,103+0,053

10 метнл-8-изоэстрона 0,072+0,022

11 0-гомо-8-нзоэстрона 0,023+0,008

12 метил-0-гомо-8-изоэстрона 0.017+0.007

13 6-окса-0-гомо-8-изоэстрона 0,005+0,001

8-изоместраиола:

14 8-изоместранол 0,010+0,009

15 2-метил-8-изоместранол 0,005+0,001

16 4-метил-8-изоместранол 0,004+0,001

17 2,18-диметил-8-изоместранол 0,003±0,001

ОКС=|концентрацня Е2, обеспечивающая вытеснение 3Н-Ег из комплексов с Е2 рецепторами на 50%|*100% / концентрация аналога, обеспечивающая вытеснение 3Н- Е2 из комплексов с Ег рецепторами на 50%|.

Примечание: приведены средние значения из результатов 5 опытов.

В качестве критерия при первичном отборе из 17-ти аналогов 8-изоэстрогенов соединений с низкой эстрогенной активностью была выбрана их способность конкурировать sa связывание с рецеиюрамн-Е; в цнтозолыгой фракции ткани матки крыс в \словиях in \itro. Радиолнгандный анализ, используемый нами для первичного отбора соединении.позволил выделить из четырех групп аналогов 8-гпо эстрогенов - две (аналоги метилового эфира 8-п юэсгрона и 8-изоместранола). представители коюрых обладали наименьшей способностью конкурировать 1:; в данных с условиях! табл. I). Экспериментальная опенка эстрогенной активности (следующий этап отбора) соединений и! выбранных групп аналогов - S-иэоместраиола и метилового эфира 8-пзоэстрона показала (таол 2) изученные соединения обладают значительно меньшей, по сравнению с эстропом (эталоном эстрогенной активности) эсгрогенной активностью

Таб. 1.2.

Эсгрогашая активность аналогов метилового эфира 8-изоэсгрона и 8-изоместранола (М+m, п=10).

N АНАЛОГ И ЭА,% в дозе 1.0 мьсг/мышь

мепииоеого эфира:

1 8-изоэстрона 119.91+4,1

2 метпл-8-изоэстрона 113,50+3.2

3 D-roMo-8-изоэстрона 118.81+2.8

4 MeTii.T-D-roMo-8-ri зоэстрона 56,45+1,5

5 6-OKca-D-roM0-8-ii303CTp0Ha 10,17+1,3

8-юоместрапода:

6 8-изоместранол 115,21+2,6

7 2-метил-8-гтзоместранол 56,24+2,1

8 4-метил-8-изоместранол 40,19+1,7

9 2.18-диметил-8-изоместранол 50,48+2,4

ЭА= (Et - Ev)/(Es - Ev) xlOO %, где E= m/M xlOO %, масса: т-матки; М-животного. Е-эффект: v-растворителя; t-тестнруемого вещества; s-стандарта (эстрон в дозе 0.1 мы/мышь).

Рис.2. Содержание холестерина и триглицеридов в плазме крови крыс после 3-х дневного введения аналогов 8-гооэстрогенов в дозе мг % 0.2 мт/кг (М±т, п=9).

Б232,18-димет11л-8-томестранол

¡;" ^ ¡метиловый эфир б-окса-Ю-гомо-З-шоэстрона

* - статистически достоверное отличие от контроля при р<0 05 Влнянне однократного введения метилового эфира 6-окса-0-гомо-8- изоэстрона. 4-метнл-8-изоместранола и 2.18-диметил-8-изоместранола. обладающих наименьшей эстрогеннои активностью, на содержание холестерина и триглицеридов в плазме кровиовариэктомированных крыс (рис.2) позволило выделить метиловый эфир 6-окса--0-го.мо-8-пзоэстрона как соединение, характеризующееся наиболее выраженной гиполипидемической активностью. Исходя из полученных данных мы сочли целесообразным оценить влияние всех представителей группы метилового эфира 8-изоэстрона на состав липидов плазмы крови овариэктомированных крыс. Результаты исследования показали, что аналоги метилового эфира 8-изоэстрона, наряду со снижением уровня холестерина и триглицеридов в плазме крови, достоверно снижают содержание свободных жирных кислот и отдельных фракций фосфолипидов, что в большей степени характерно для того же метилового эфира 6-окса-0-гомо-8-изоэстрона (рис.3).

Рис.3. Содержание общих липидов в плазме крови овариэктомированных крыс через 24 ч. после однократного введения аналогов метилового эфира З-изоэстрона в дозе 1.0 мк'кг (М±т, п=9)

пкг.'мл плазмы

ШШ контроль !..... | метил-З-тозстрона ЦХОмстш Б гомо-З шоэстрона Шъ -изоэстрона !5530-гомо-8-тозстрона I I б-пкга-Р-гпмп-Я-нзтгтрпна

а - статистически достоверное отличие от контроля при р<0 05

С" целью выяснения механизмов действия представителей группы метилового )фпра 8-изоэстрона на ткани органов-мишеней, исследовано влияние метилового эфира 6-окса-0-гомо-8-пзоэстрона на состав липидов плазматических мембран клеток матки крыс. Статистически достоверное снижение уровня холестерина, свободных жирных кислот, фосфатнднлхолина и фосфатндилэтаноламнна в плазматических мембранах клеток матки овариэктомированных крыс обнаружено через 24 часа после однократного введения метилового эфира 6-окса-0-го.мо-8-изоэстрона в дозе 1.0 мг/кг и не обнаружено в дозах 0.01 и 0.10 мг/кг. Таким образом можно предположить, что данное соединение в терапевтических дозах, не будет оказывать значимого для нормального функционирования клеток матки влияния на структуру плазматических мембран.

С целью определения биологического действия аналогов метилового эфира 8-изоэстрона на матку нами исследована их эстрогенергическая активность. Полученные результаты показали, что изученные соединения можно разделить на: снижающие (метиловый эфир 6-окса-0-гомо-8-изоэстрона и метиловый эфир D-ro.Mo-8-изоэстрона. в дозе 0.1 мг/кг веса) и повышающие (8-нзоэстрон. метил-Г>гомо-8-пзоэстрон. D-гомо-8-мю»строи в дозе 1.0 мг/кг веса) связывание -;Н-Е: с рецепторами Е; в цитозольнон фракции ткани матки овариэктомированных крыс (рис.4).Низкую эстротенную активность метилового эфира 6-окса-0-гомо-8-изоэсгрона можно, с нашей точки зрения, объяснить аллостерическим взаимодействием с Е>-\ чистками связывания, в реплыате которою не происходит усиления синтеза новых связывающих участков, что по мнению Ferguson Е.. K.atzenellenbogen В. (1977). ведет к истощению цитоплазматического пула них структур.

Рис.4. Влияние аналогов метилового эфира8-шоэстрона на связывание ЗН-Е2 в тканях матки овариэктомированных-крыс (в % от контроля)

ш. 0.1 мг/кг ч

■:•.•.. .- .. : --.■■::■ ■:• : '¡

1.0 мг/кг

ш^ш^шшшшш^шш.

i i -i--¡- ■ "Г

О БО ЮЗ 150 200 258 300 350

ИИ б-окса-Р-гомо-8-шоэстрона D-roMo-8-тоэстрана мет1[л-В-гомо-8таоэтрона tWi 3-изоэстрона

Для изучения возможных механизмов антматерогенного действия аналогов 8-изоэстрогенов нами проведен анализ антиокислительной активности данных соединении (табл.3).

Табл.3.

Лнгиокнслптельная активность аналогов 8-изозстрогенов.

N А налоги: АО А, М 1

Н-иэоэстропа:

1 метил-0-гомо-8-изоэстрон 7.08* 1

2 6-окса-8-изоэстрон 3.98*10"

3 ацетоксн-2-метил-8-пзоэстрон 8.31*10-;

4 ацетоксн-4-.метил-8-изо)строн 8.25* 10-'

метилового эфира:

5 8-изоэс трона 0.76*10"-

6 метил-8-пзоэстрона 0.56* Ю-5

7 0-гомо-8-изоэстрона 0.34*105

8 метил-0-гомо-8-изоэстрона 0.23* Ю-5

9 6-окса-0-гомо-8-изоэстрона 0.14* 10 я

8-изоэстрадиола:

10 8-изоэстрадиол 7.08*10*

11 0-гомо-8-изоэстрадиол 2.82*10*

12 6-окса-0-гомо-8-изозстрадиол 2.24*106

13 6-окса-8-изоэстрадиол 3.55* Ю5

в-изоместранола:

14 8-изоместранол 1.04*10-'

15 2-метил-8-пзоместранол 6.82*10-'

16 4-метил-8-изоместранол 6.64*103

17 2,18-диметил-8-изоместранол 3.71*105

Полученные результаты показали, что не все аналоги 8-пзоэстрогенов обладают такой же, как и у их природных родоначальников эстрадиола (7,01*107М"') и эстрона

(3,52* 105М"') - сильных антиокспдантов, антиокислительной активностью. Аналоги 8-изоэстраднола в 10-100 раз уступают по данному параметру природному эстрадиолу. тогда как анатогп 8-изоэстрона - мегил-0-томо-8-изоэстрон и 6-окса-8-нзоэстрон на порядок превосходят природный эстрон. Местранол. являющийся метиловым эфиром этиннлэстраднола. и метиловый )фир эстрона. как и их 8-изоаналоги можно отнести к соединениям с низкой антиокнелнтельной активностью, чго. по-видимому, определяется наличием эфирной группы, резко снижающей данный параметр. Следовательно антиатерогенное действие аналогов метилового эфира 8-июэстрона и 8-изоместранола заключается в их высокой пшолиппдемической активности и не связано с антиокнслительным действием.

Низкая эсзротенная активность, способное 1Ь конкурировать с '11-Е: за свя!ывание с рецепторами Е; ¡п \itro и способность снижать связывание -;Н-Е; с рецепторами П; в цнгозольной фракции тканей матки овариэкюмированных крыс ¡п м\о, а также высокая гиполнпндемическая активность и отсутствие токсических эффектов в диапазоне доз, значительно превышающем терапевтический, позволяют предполагать перспективность использования метилового эфира 6-окса-0-го.мо-8-нзоэстрона в заместительной терапии пациенток в перименолаузальном периоде, относящихся к группе высокого риска развития агеросклеротических процессов.

Высокоактивное соединение в ряду окисленных по кольцу С эстрогенов.С целью получения высокоактивных эстрогенов в ЭНЦ РАМН синтезирован ряд, окисленных по кольцу С эстрогенов и на основании первичного отбора предложено соединение, обладающее наибольшей эстрогенной активностью-11|3-нитроокси-9а-гидрооксэтн-нилэстрадиолдиацетат (нистранол) (рнс.5.) для дальнейшего доклинического исследования.

Рис.5. Нистранол.

Нами обнаружено, что данный синтетический эстроген практически не облалаег способностью конкурировать с -"Н-Е: та связывание с рецепторами i 1-Н; в шпоюльной фракции тканей матки в отличие от тгшшлэстрадиола. моиоииратом нитроокеппрои ¡водною которого он является (таб.1.4).

Табл.4.

Относительная конкурентная способность эстрадиола, лшш.тjcipa.uin.ia и ннстранола связываться с рецепторам» Е2 в цнтозолыюй ф ракцмм тканей матки крыс (М+ш).

N СОЕДИНЕНИЕ О К С, %

1 Этинилэстрадпол 150+16.8

2 Эстрадиол 100+0.04

3 i 1|3-гштрооксн-9а- 0.15+0.02

гидроокспэтинилэстрадиол-диацетат

Примечание: приведены средние значения из результатов 5 опытов.

Сравнительная оценка антифертильной и эстрогенной активностей ннстранола и этинилэстрадиола (ЭЭ) показала, что эффективная доза ннстранола необходимая для ингибирования беременности, в 24.5 раза ниже таковой для ЭЭ. а показатель его эстрогенной активности превосходит в 4.5 раза. Отсутствие у ннстранола способности конкурировать с 'Н-Е; за связывание с рецепторами Е; в цнтозолыюй фракции ткани матки in vitro и наличие выраженного влияния на связывание -'Н-Е; и 3Н-Р4 с Е;- и Р4-рецепторами in vivo (рис.6), наряду с высокой эстрогенной активностью, позволяет предположить, что нистранол проявляет свое эстрогенное действие либо превращаясь в

активный(е) метаболит(ы), который(ые) взаимодействует(ют) с цитозольнымп рецепторами Е:. либо воздепствует(юг) на другие структуры клетки.

Рис.6. Связывание ЗН-Е2 и ЗН-Р4 с рецепторами Е2 и Р4 в цитозольной фракции тканей матки и яичников крыс через 24 ч. после однократного введения нистранола (М±т, п=9). фмоль/мг Ьелка

25В V

ШШ контроль ЕНО нистранол (0.1 мг/кг) | I нистранол (1.0 мг/кг)

* - статистически достоверное отличие от контроля при р«0.05 Таким образом, для оптимального отбора препаратов с эстрогенной активностью необходимо использовать сочетание методов радиолнгандного анализа in vivo и in vitro. Нистранол по показателям эстрогенной и антифертильной активности является предпочтительнее этнннлэстрадиола, для использования в качестве компонента комбинированных контрацептивных препаратов.

Сравнительный анализ влияния комбинированных соединений, содержащих оригинальный отечественный эстроген-нистранол и гестаген-ацетомепрегенол (нитрогест - комбинация нистранола и ацетомепрегенола; эгестренол - комбинация этинилэстрадиола и ацетомепрегенола) и известного контрацептивного средства -тризистона (комбинация этнннлэстрадиола и левоноргестрела) на клеточное звено

регуляции фертильности - взаимодействие "Н-Е; с Е;-рецепторами в иитозольной фракции ткани матки оваризктомнрованных крыс (габл.5) показал, что препараты, содержащие нистранол и ацетомепрегенол. проявляют более высокую активность по сравнению с трпзистоном. выражающуюся в подавлении шпоюльного связывания 'НЕ; в 1канн матки.

Таол.5.

Связывание 'Н-Кг с Ег -рецепторами в шпозолыюй фракции тканей матки оварн-жтомированнмх крыс через 24 ч. после однократного введения трнзпсюна, згестренола и нитрогеста (М+т , п=10).

Соединение Связывание -'Н-Ег, фмоль/мг белка, Эстрогенный/Гестагенный компонент мкг/кг

Растворитель 33,9±6.0

Тризистон 4/20 мкг/кг 114.6+5.2 8/40 мкг/кг 67.9+13.5*

Эгестренол 4/80 мкг/кг 53,1 + 11,1* 8/160 мкг/кг 13.9+0.9*

Нитрогест 4/20 мкг/кг 33,3+0,7* 8/40 мкг/кт 31.0+9.1*

*- статистически достоверное отличие от контроля прп р<0.05.

Исследование хронической токсичности нпстранола подчеркнуло безопасность длительного использования данного соединения в дозах значительно превышающих терапевтические. Анализ влияния на связывание 'Н-Е; с рецепторами 0; в цитозольной фракции тканей матки т м\о, а также хронической токсичности позволяет рекомендовать дальнейшее исследование соединения - 11р-нитроокси-9агндрокси-этшшлэстрадиол-диацетата (нистранол), обладающего высокойэстрогеннойи анти-фертнльной активностью. Можно предположить, что использование данного

соединения в качестве эстрогенного компонента позволит снизить побочные эффекты комбинированных контрацептивных средств.

Высокоактивные антиэстрогены в ряду производных трмфенилэтилена.

Радиолигандный анализ, используемым нам» для скрннншма производных трифе)шлэшлена(Рнс.7.)(1-5ензмлокси4-( 1.2-дпфенил-2-х;юр>1еш1л) бензол (КЛ11-418-смесь цис- и транс-изомеров); 1.2-бис(4-беншлоксифенил)-1.2-дифемилэтплен(К.Н1-423). тамокснфенаиграг). позволил оценить их способность конкурировать с "41-1:: ¡а связывание с рецепторами Н: (отностительная конкурентная способность связываться е рецепторами эстрадпола. ОКС) вцитозолытом фракции тканей матки крыс, эндометрия, нормального п патологически измененного мнометрпя человека в условиях т \itro и влиять на связывание 3Н-Е: и 3Н-Р4С Ез- и Рл-рецеигорахит тп м\о. Рис.7. Производные трифснилэгилена.

ОСН2С6Н5 ОСН2С6Н5

Сравнительный анализ относительной конкурентной способности данных соединений (табл.6) связываться с Ез рецепторами в цитозольной фракции тканей матки крыс показал преимущество КЛИ-418 перед КЛИ-423 и тамоксифеном. Это соединение в 1.6

раза активнее вытесняет "Н-Е: из Е;-рецепторных комплексов по сравнению с тамоксифеном.

Табл.6.

Способность производных грифеннлэтилена конкурировать с 3Н-Ег за связывание с рецепторами Е> в цитозольной фракции тканей матки крыс (ОКС, %) (М+ш).

N СОЕДИНЕНИЕ О К с,%

1. "Гамоксифен 3.71+0.23

2. КЛП-418 5.87+0.17

3. КЛ11-423 1.05+0.09

Примечание: приведены средние значения из результатов 5 опытов

Рнс.8. Связывание ЗН-Е2 и ЗН-Р4 с рецепторами Е2 и Р4 в цитозольной фракщш тканей матки крыс в дозе 0.1 иг/кг через 24ч. после однократного введения производных: трифенилзтиленав дозе 0.1 мг/кг (М±та, п=9).

фмоль'мг белка

статистически достоверное отличие от контроля при р<0 05

Влияние тамокспфена, КЛИ-418. КЛИ-423 на связывание 3Н-Е; и -,Н-Р4 с Е> и Ра-рецепторами в цитозольной фракции ткани матки овариэктомированных крыс через 24 ч. после однократного введения (рис.8) свидетельствует, что все изученные вещества увеличивают связывание 'Н-Р-к Р-1-рецепторами.

Результаты изучения конкурентных взаимоотношений производных грифенил пилена в тканях миоматозною (МУ) и гистологически неизмененного миометрия (ГНТМ) при миоме человека (рис.9) показали, что данные соединения вьнесняюг -'Н-Е; из связи с цитозольнымп рецепторами Е: как в гисголо! нческн неизмененной, так и в опу холевой ткани миометрия.

Рис.9. Относительная конкурентная посооность производных

трифенилзтилена связываться с Е2 рецепторами в цитозольной фрахции ткани миомы нгистологическинетмененного мио-

ОКС ° о метР11Я человека (М+ш). 1.2 I

КБ-транс

ЯШ гистологическинеюмененная рчдя .„,„.„

^^ миома

ткань миометоия

* - статистически достоверное отличие от контроля(1ШМ) при р<0.05

* * - статистически достоверное отличие от контроля(ТАМ) при р<0 05

Примечание: приведены средние значения из результатов 5 опытов.

Из представленных антиэстрогенов наибольшей способностью конкурировать с 'Н-Е: за взаимодействие, независимо от вида ткани, обладает транс-изомер КЛИ-418. Анализ острой токсичности новых производных грифенилэтплена показал, что наименее токсичным является КЛИ-418. Способность производных грифенилэтплена конкурировать с-'Н-Е; за связывание с рецепторами Г:; обнаружена в ткани эндометрия при ет о т иперп.тазпях (рис. 10).

Рис.10. Вытеснение ТАМ, КЛИ-418, КБ-циг и КБ-транс ЗН-Е2 го комплексов с Е2 рецепторами в патологически измененном эндометрии человека (М±ш; п=15).

Ш фиброзные полипы кистозные полипы I I аденокарциномы

* - статистически достоверное отличие от контроля №11) пои р< 0.05 ** - статистически достоверное отличие от контроля (ТАМ) при р<0 05

По способности вытеснять -'Н-Е: в цнтозольной фракции тканей железисто-кистозных полипов транс-изомер КЛИ-418 превосходит цис- и смесь изомеров КЛИ-418, тогда как цис-изомер превосходит транс-изомер по этому показателю в железисто-фиброзных полипах. В ткани аденокарциномы изученные антиэстрогены практически не вытесняют 3Н-Е; из Е; -рецепторных комплексов.

Для оценки эффективности данных производных трифенилэтнена нами определена их утеротропная активность (эстрогенная и антизстрогенная) (табл.7).

Табл.7.

Утеротропная активность производных трифеннлэтилена (М+ш, п=10).

СОЕДИНЕНИЯ АЭА,%в дозе 1.0 мкг/мышь ЭА,% в дозе 1.0 мкг/мышь

КЛИ-418 45.9+3,1 79.9+2.4

КБ-цнс 11.2+1,1 84,5+3.2

ТАМ 53.5+3.8 70.1 + 1.3

A3A=((Es-Est)/(Es-Ev))xlOO %, где Е=(ш/М)х100 % масса: m-магки; М-животиого; Е-эффект: у- растворителя, t-ieciируемого вещества, st- совместного введения тестируемою вещества и стандарта, s- стандарта (эстрон в дозе 0.4 мкг/мышь).

Наибольшая антизстрогенная и наименьшая эстрогенная активность показана > транс-изомера КЛМ-418. что побочными эффектами. Анализ эстрогенергической акт1твностн производных трифеннлэтилена позволил заключить, что поиск новых высокоактивных антизстрогенов целесообразнее вести среди тратте- изомеров производных трифеннлэтилена. Открывается возможность дифференциального назначения различных атпиэстрогенных препаратов, в зависимости от их способности в опытах in vitro вытеснять ЛН-Е; из Е:-участков связывания, при разных гигтерпла-стических процессах. Можно ожидать наибольшую эффективность терапии железисто-кттегозных гиперплазии эндометрия человека в постменопаузальном периоде тамоксифеном и значительно меньшую его эффективность при аденокарцттномах.

ВЫВОДЫ:

1. Среди 17-ти аналогов 8-изоэстрогенов найдено соединение - метиловый эфир 6-окса-0-гомо-8-шоэстрона, обладающее низкой эстрогенной активностью (10.1% от показателя эстрогенной активности эстрона в дозе 0.1 мкг/мышь), связанной с введением кислорода в шестое положение стероидного кольца, и высокой

гпполиппдемической активностью (в дозах 0.1-1.0 мг/кг массы снижает содержание холестерина в 1.8-4.0 раза, свободных жирных кислот в 4.3-4.5 раз и триацилглицеридов в 1.9-2.2 раза в плазме крови оварпзктомнрованныч крыс), обусловленной наличием эфирной группировки.

2. Аналош 8-изоэстраднола и 8-изоэстрона обладают сильной антиокнслптельной активностью (7.08*106-3.55*10л М"'). в отличие 01 аналогов 8-пзоместранола и метилового эфира 8-июэстрона .

3. Острог енная активность 11 (5-нитрооксп-9и-| идроксиэтинил к'тралиол-лнацетата (нистранола) превосходит данный покамтель зтпнпл хчраднола и эстрона в 4.5 и 9 раза соответственно .

4. Среди изученных производных грифеннлэтилена наибольшей способностью конкурировать с 'Н-Е: за связывание с Е; -рецепторами в шпозольной фракции тканей матки крыс ¡п \itro среди изученых производных трифенилэтнлена обладает 1-бензил-оксн-4-('|.2-лифенил-2-\лорэтенил) бензол (КЛП-418)-5.87 транс-изомер коюрого (КБ-транс) обладает наименьшим соотношением между эстрогенной и антиэстрогенной активностями! 1.02). Отношение антиэстрогенной к эстрогенной активности производных трифенилэтнлена воэрастает в ряду КБ-транс (1.0) <ТАМ (1.3) <КЛИ-418( 1.76) <КБ-цис (7.54).

5. Способность производных трифенилэтнлена конкурировать с 3Н-Ез за связывание с Е:-рецепторами увеличивается в 2.4-5.0 раз в гиперплазированом миометрии (миома) человека по сравнению с окружающим миометриеч. что свидетельствует о нарушении связывающей способности рецепторов эстрадиола в патологически измененной ткани и возможноти применения препаратов данной группы для лечения миомы матки.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Влияние новых комбинированных эетроген-гестагенных препаратов на связывание эстрадиола в ткани матки крыс.//Всер.съезд фармакологов, г.Волгоград,-1995 октябрь, с.184 (соавт. Карева Е.Н.., Грнненко Г.С.. Федотов В.П.. Ржезников В.М.).

2. Рецепторные механизмы дейгвия эстрогенов п их синтетических аналоюв .//Сб. Второй национальный кожрес "Человек и лекарство".-1995.-с.23 (соавт.Карева Е.Н.. Шавва А.Г'.).

3. ГАМК-рецепторы - физико-химические свойства, особенности органной топографип.//Хим.фарм.Ж.-1995. -N.1.-C.4-7 (соавт.Карева И.11.. Cepi сев 11.В.. Сизов П.И.).

4. Поиск активных противоопухолевых средав в ряду производных трифенилэтилена. //Вопросы онкологии.-1995.-N2.-T.41.-C.49 (соавт. Сергеев П.В.. Савельева Г.М., Гриненко Г.С.. Карева Е.Н.).

5. Влияние нпстранола на содержание рецепторов половых стероидов в ткани магки и яичников крыс.//Сб.науч.работ Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии. г.Смоленск. 1994.-С.49-50 (соавт. Сергеев П.В.. Ржезников В.М.. Карева Е.Н.).

6. Влияние аналогов 8-изоэстрона на связывание эстрадиола в ткани матки овариэктомированных крыс.//БЭБиМ.-1995.-К'.2.-С.165-168 (соавт. Сергеев П.В., Карева Е.Н., Шавва А.Г., Абусалимов Ш.Н. ).

7. Interaction of Tamoxifen With Plasma Membranes of Human Neoplastic Endometrium. //Abstracts of the First European Congress of Pharmacology.- Milan, Italy.-1995.-P.82( coll. P.Sergeev, L.Kappusheva E.Kareva, V.Panov, T.Akhadov).

8. Properties of New Synthetic Estrogen 8-isoanalogues.//Abstracts of the First European Congress of Pharmacology.- Milan,Italy.-1995.-P. 146 (coll. E.Kareva, Shavva A.).

ПМП МПС. Здк 70 -