Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Нейрохимические аспекты патогенеза гипоксических поражений мозга у новорожденных

обязательный

бесплатный экземпляр.

На правах рукописи

ГОЛОСНАЯ ГАЛИНА СТАНИСЛАВОВНА

Нейрохимические аспекты патогенеза гипоксических поражений мозга у новорожденных

14.00.13- Нервные болезни 14.00.09- Педиатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА 2005

Работа выполнена в Государственном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального Образования "Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Научный консультант:

Профессор, доктор медицинских наук

А.С. Петрухин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

О.И. Маслова В.А.Карлов Г.А. Самсыгина

Ведущая организация:

НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

Защита диссертации состоится « »_2005 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.208.072.01 в ГОУ ВПО РМГУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г.Москва, ул. Островитянова, д.1).

Автореферат разослан «__»_2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

П.Х.Джанашия

Ш*- Л4ЧМ6

lo(¿f ■^Wy ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Гипоксические повреждения головного мозга занимают первое место в структуре перинатальных повреждений нервной системы (Volpe J.J., 1995;Самсыгина Г.А.,1996; Яцык Г.В., 1998; Baud О. et al.,2000; Барашнев Ю.И.,2001), и являются основными причинами перинатальной смертности, составляя от 20 до 50% в ее структуре, а также факторами возникновения необратимых структурных дефектов ткани головного мозга (Дементьева Г.М., 1999 Bernstein I.M., et al., 2000; Петрухин А.С,2004). У 5-15% недоношенных детей, перенесших гипоксическое поражение ЦНС, впоследствии формируются выраженные спастические параличи, эпилепсия, поражение органов слуха и зрения, а у 25-50% детей диагностируется расстройство когнитивных функций и нарушение поведения. У доношенных детей 50% случаев церебрального паралича имеет пренатальную этиологию, 36%- пери/неонатального происхождения и 14% случаев - неизвестного происхождения (Савельева Г.М.и др.,1993; De Vries L.S.et al.,1998;Campos-Castello J.et al, 1999; Antoniuk S.et al.,2000; Carteaux P. et al.,2003).

Развивающийся мозг новорожденного чрезвычайно чувствителен к воздействию гипоксии, которая не только вызывает очаговые повреждения мозговой ткани, но и задерживает развитие сосудистой системы и нарушает клеточную дифференциацию. Толерантность у каждого ребенка к воздействию повреждающих факторов различна. Поэтому при сравнительно равных условиях у всех детей развиваются неоднозначные последствия (Вельтищев Ю.Е., Зелинская Д.И.,2000; Agustines L.A. et al.,2000; Володин Н.Н. и др.2001 ;Барашнев Ю.И.,2002; McGrath М.,2002; Ment L.R.et а1.,2003).Как таковой инсульт у новорожденных отличается от инсульта у взрослых не только локализацией, но и обширностью дистрофических изменений и задержкой миелинизации нервной системы. Уже доказано, что смерть клеток при гипоксии происходит не только по типу некротического поражения, но и с развитием апоптоза клеток, который, в свою очередь, угнетается и индуцируется факторами специфической и неспецифической защиты (Гусев

Е.И., Скворцова В.И.2001; Гомазков 0.4,1«2;нЛ|йрШН1ьИА , и др.,2003;

БИБЛИОТЕКА

о? xx$"»éóS \

' W

McQuillen P.S.etv al.,2003; Ontiniente В.,et al.,2003; Чехонин В.П. и др.,2004; Thomgren-Jemeck К. Et al.,2004).

В настоящее время получено значительное количество новой информации о патогенезе гипоксического перинатального поражения ЦНС, его молекулярных и биологических основах. На биологических моделях установлена многоуровневая система химической регуляции, обеспечивающая жизнеспособность и защиту нейронов от неблагоприятных влияний, и программируемую гибель клеток в случае повреждения мозга с участием многочисленных нейротрофических и ростовых факторов (Schulze-Osthoff K.et al.,1998; Paulson O.B.et al.,2002; Rosenstein J.M.,et al.,2003; Quartu M.et al.,2003; Perrott S. et al.,2003; Schmitz L.et al.,2004).

В связи с этим большой интерес представляет изучение этих факторов и репаративных механизмов, определяющих течение и исходы гипоксии мозга у новорожденных детей, а также установление в сыворотке крови с помощью иммуноферментного метода маркеров деструктивного процесса и состояния ГЭБ при гипоксических поражениях головного мозга в неонатальном периоде.

Все вышеперечисленное определяет актуальность настоящей работы, ее цели и задачи.

Цель работы. Изучить нейрохимические аспекты патогенеза тяжелых гипоксических поражений головного мозга у новорожденных детей, выявить маркеры степени тяжести и оценить их диагностическую значимость.

Задачи исследования.

1. Исследовать факторы, отражающие состояние сосудистой системы головного мозга (VEGF и ALCAM) и определить их диагностическую значимость при гипоксическом поражении мозга у новорожденных.

2. Изучить проницаемость гематоэнцефалического барьера при различной степени тяжести гипоксии мозга на основании определения нейротрофических белков (BDNF,CNTF) и структурного белка астроцитарной глии (белок S-100) иммуноферментным методом.

3. Определить уровень маркера апоптоза ОЯ5 и молекулы клеточной адгезии АЬСАМ в зависимости от гестационного возраста ребенка и степени тяжести асфиксии при рождении в сопоставлении с характером структурных изменений, выявленных методом нейросонографии.

4. Исследовать изменение концентрации нейротрофинов, белка астроцитарной глии Б-100, васкулоэндотелиального фактора роста, маркера апоптоза, молекулы клеточной адгезии АЬСАМ в зависимости от вида изменений на нейросонографии: геморрагический инсульт, ишемический инсульт, смешанный.

5. Выявить корреляционные связи между нейротрофинами, факторами роста, и проапоптотическими факторами при различных видах инсульта у новорожденных, оценить роль каждого фактора в патогенезе постгипоксических структурных изменений мозга: кровоизлияние, лейкомаляция.

6. Установить, какие из исследуемых нейроспецифических белков являются участниками пластического процесса в нервной системе. Выявить факторы пластичности, обеспечивающие способность нервной ткани к репарации.

7. Оценить иммунохимические факторы прогноза жизнедеятельности организма ребенка в состоянии тяжелой гипоксии и определить корреляционные показатели выживаемости после перенесенной гипоксии тяжелой степени.

8. Провести клинико-биохимический анализ значимости исследуемых связей между антигенами и прогнозированием исхода поражения головного мозга и степенью восстановления нарушенных функций.

Научная новизна.

Впервые был проведен мониторинг содержания нейротрофических факторов ВО№, СШТ, нейроспецифического белка астроцитарной глии 8-100, васкулоэндотелиального фактора роста \ТЮР, а также исследована концентрация маркера апоптоза и активность молекулы клеточной адгезии АЬСАМ у новорожденных детей в норме и при тяжелом гипоксическом поражении ЦНС.

Показано, что в норме в сыворотке крови у новорожденных присутствуют почти все из исследованных факторов: нейротрофины, белок астроцитарной глии, васкулоэндотелиальный фактор роста; в очень низкой концентрации маркер апоптоза и молекулы клеточной адгезии, АЬСАМ. Не

обнаруживается в норме в сыворотке крови только цилиарный нейротрофический фактор.

Прогноз течения постнатального периода во многом связан с сосудистыми изменениями и ростом сосудистой системы. Для выявления ответа сосудистой системы на гипоксию впервые у новорожденных детей исследованы васкулоэндотелиальный фактор роста и молекула клеточной адгезии АЬСАМ, динамика концентрации которых в сыворотке крови уже на первой неделе жизни ребенка позволяет с большой вероятностью прогнозировать формирование структурных изменений головного мозга. Выявлена связь сывороточного уровня УЕвИ с наличием гестоза у матери во время беременности, что свидетельствует об угнетении васкулогенеза у новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.

Впервые рассмотрена роль маркера апоптоза, проапоптотического фактора в патогенезе постгипоксических нарушений у новорожденных. Уровень этого фактора коррелирует с развитием деструктивных процессов и имеет большое значение для ингибирования факторов защиты нервных клеток -нейротрофических и ростовых факторов.

Определены биохимические маркеры повреждения нервной ткани при перинатальном гипоксическом поражении головного мозга. В теоретическом и в практическом плане проведенные исследования позволили раскрыть механизмы нарушений на клеточном и сосудистом уровне. Выяснена роль процесса апоптоза в формировании постгипоксических структурных изменений головного мозга.

Доказано, что у детей с хорошими компенсаторными возможностями даже при тяжелой гипоксии не формируются структурные изменения головного мозга. Это связано с балансом в системе трофических, ростовых факторов и проапоптотических антигенов.

Практическое значение работы.

При формировании тяжелых постгипоксических повреждений головного мозга в виде геморрагического, ишемического или сочетанного инсульта преобладают факторы, сопутствующие деструктивным процессам в ткани мозга (Б-100, ОЯ5, АЬСАМ).

Диагностическую значимость для прогнозирования формирования тяжелых постгипоксических структурных изменений головного мозга имеют все нейроспецифические белки, а для раннего выявления внутрижелудочкового кровоизлияния - цилиарный нейротрофический фактор, СШТ.

Нейротрофический фактор, ВОМ7, обнаруживается в сыворотке крови в очень малых количествах при гипоксически-ишемических поражениях -перивентрикулярной лейкомаляции и сочетании ПВЛ и ВЖК, что свидетельствует об истощении компенсаторных механизмов и имеет прогностическое значение.

Впервые рассмотрена роль цилиарного нейротрофического фактора. Выявлено, что ОПТ проникает через гематоэнцефалический барьер только при развитии кровоизлияний, что позволяет расценивать его как ранний маркер нарушения целостности сосудистой системы мозга. Подтверждено его участие в процессе восстановления пораженной ткани мозга и влияние на выживаемость детей с тяжелыми перинатальными гипоксически-геморрагическими поражениями ЦНС.

Таким образом, в исследовании предложены иммунобиохимические критерии объективизации тяжести и прогноза состояния новорожденных, перенесших тяжелое гипоксическое поражение ЦНС в первые дни заболевания и в течение периода новорожденное™. Выделены особенности концентрации исследуемых антигенов в зависимости от гестационного возраста, состояния при рождении, вида структурных изменений, а также в зависимости от исхода заболевания при сравнении по критерию «выжил-умер».

Внедрение в практику.

Результаты работы внедрены в практическую работу детского корпуса городской клинической больницы № 7; НПЦ медицинской помощи детям с

7

пороками развития черепно-лицевой области и врожденными заболеваниями нервной системы; входят в программу постдипломного обучения на кафедре нервных болезней педиатрического факультета РГМУ.

Апробация работы. Официальная апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры нервных болезней педиатрического факультета и кафедры биохимии РГМУ 02.02.2005г. Номер государственной регистрации темы 01950005768.

Основные положения и результаты исследования представлены в материалах X конгресса «Человек и лекарство», (Москва,2004); Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань,2004;2005), Международной конференции «Информационные технологии в образовании, технике и медицине» (Волгоград,2004); Всероссийской научной конференции "Фармакотерапия гипоксии и её последствий при критических состояниях», (Санкт-Петербург,2004); Всероссийской научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике», (Москва, 2004); III Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», (Москва,2004); Пятой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», (Москва,2004); Научно-практического симпозиума «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина», (Москва, 2004); VI научно-практической конференции с международным участием "Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург,2004); Международной научно-технической конференции «Наука и образование-2005», (Мурманск,2005); Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение», (Уфа, 2005);1Х Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»,(2005); X конгресса педиатров (Москва,2005), где работа была награждена специальным призом на конкурсе молодых ученых.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 12 в центральных периодических изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания общей характеристики больных и методов исследования, 4-х глав собственных наблюдений и их обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка цитируемой литературы из 385 работ, включающего 93 отечественных и 292 зарубежных источника. Работа изложена на 302 страницах, иллюстрирована 59 таблицами, 58 рисунками, 5 схемами, 4 клиническими наблюдениями.

Работа выполнена в родильном доме и детском корпусе 7 городской клинической больницы, (гл.врач к.м.н. В.А.Афанасьев, зам.гл.врача по детскому корпусу к.м.н. А.Б.Дуленков). Лабораторные исследования проводились на базе лаборатории группы компаний БиоХимМак (ген.директор Н.Е.Тамм).Автор выражает благодарность за помощь в работе к.б.н. Н.С.Рытиковой.

Содержание работы.

Общая характеристика больных и методов исследования. Общая характеристика методов исследования.

1. Анализ состояния здоровья матерей, акушерско-гинекологического анамнеза, течения беременности и родов.

2. Ежедневное клиническое наблюдение за новорожденным от момента рождения, пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии, патологии новорожденных до выписки.

3. Все методики для определения уровня в сыворотке крови исследуемых антигенов: белка астроцитарной глии S-100, мозгового нейротрофического фактора (BDNF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF); васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF); маркера апоптоза, «рецептора смерти», DR5; молекулы клеточной адгезии ALCAM, основаны на принципе количественного твердофазного иммуноферментного анализа сэндвичевого типа (ELISA: Епгуте Linked-Immuno-Sorbent Assay). Проведение анализа проводилось по стандартному протоколу.

Образцы крови отбирали из пупочной вены при рождении, а в последующие сроки - путем аспирации из центральных катетеров (пупочный, подключичный, транскутанный) в объеме 0,3 - 1,0 мл. Кровь центрифугировали в течение 3-4 минут при 2000 g. Полученную сыворотку аликвотировали, замораживали и хранили при температуре - 20°С не более 2-х месяцев. Определение содержания белка S-100, проводилось с использованием реактивов фирмы CanAg (Швеция) на 1-е;3-е;7-е;14-е и 21-е сутки жизни. Концентрацию белка BDNF определяли, применяя реактивы фирмы R&D (Англия) дважды: в первые 48 часов жизни и на 3-5-е сутки жизни. Цилиарный нейротрофический фактор исследовался в мониторном режиме: в 1-2; 5-7; 1214; 24-28 сутки жизни, использовались реактивы фирмы R&D (Англия). При проведении исследования концентрации белков VEGF и DR5 в сыворотке крови применяли реактивы фирмы "Biosource" (Бельгия). VEGF в сыворотке крови определяли в 1-2 сутки жизни (24 - 48 часов), на 7-е и 28-е сутки. Для определения уровня проапоптотического фактора, DR5, в сыворотке крови проводилась только одна проба крови в интервале 24-48 часов жизни, когда уровень антигена в сыворотке крови соответствует максимуму активности процессов апоптоза. Для определения уровня молекулы клеточной адгезии ALCAM применяли реактивы фирмы R&D (Англия). Пробы крови проводились трижды: возрасте до 48 часов жизни; на 5-7-е; 12-14-е сутки жизни.

4. Ультразвуковое сканирование головного мозга (НСГ) проводилось в течение всего времени наблюдения за ребенком с 1-х суток поступления в стационар (в среднем 1 раз в 5-7 дней, при необходимости - ежедневно).

5. Статистический анализ данных выполнен с применением пакета Statistica 5.0. Группы обследованных новорожденных сравнивались между собой с использованием дисперсионного анализа (тест множественного сравнения средних ANOVA, с последующим сравнением групп по методу Манна-Уитни), внутри группы сравнение переменных производилось знаково-ранговым методом Вилкоксона. Корреляционную зависимость вычисляли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R).

Общая характеристика больных.

В основу работы положены результаты обследования 130 новорожденных, поступивших в детский корпус 7 ГКБ, 40 из них составили контрольную группу.

Контрольная группа была представлена 20 здоровыми доношенными новорожденными и 20 недоношенными, без клинических и нейросонографических признаков поражения головного мозга. Материал для работы забирался из проб крови для регламентированного биохимического исследования.

Под нашим наблюдением находилось 90 детей с гестационным возрастом от 26 до 42 недель, массой тела при рождении 890-4630 г. Длина тела составила от 32 до 54 см. Мальчиков-59, девочек-31, новорожденных из двоен-8. Все дети родились от женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим и соматическим анамнезом. Дети были разделены в соответствии с гестационным возрастом на 3 группы: I- 26-31 неделя; П-32-37 недель; Ш-38-42 недели. В каждой по 30 детей. В соответствии с этим делением рассматривались анамнестические данные матерей.

Изучение здоровья матерей наблюдаемых пациентов имеет большое значение, так как различные социально-биологические факторы, а также репродуктивная функция и соматический статус женщины являются предопределяющими для развития возможных осложнений беременности, формирующих угрозу состояния плода и новорожденного. Отягощенный профанамнез в I группе имели - 40% женщин, почти все во И и около 70 % в III группе. Эмоциональное напряжение во время беременности по нашим данным испытывали практически все женщины. При изучении вредных привычек у матерей наблюдаемых детей, установлено, что курили 40% в I группе, 50%- во П и 93,3% в Ш группе. Большинство женщин 93,3%; 83,3% и 100% в I; II; Ш группах соответственно находились в благоприятном репродуктивном возрасте от 20 до 35 лет. Заболевания почек фиксированы в 56,7%, 40% и 46,7% случаях в I; II и Ш группах соответственно. Обострение хронического пиелонефрита - в

50%, 30% и 20% соответственно. Аллергические состояния в I и П группах отмечены у каждой третьей женщины, а в III у каждой второй.

Гинекологический анамнез также был предметом нашего пристального внимания. Доказано, что преждевременные роды в анамнезе являются наилучшим индикатором риска невынашивания текущей беременности. В наших наблюдениях этот показатель составил 53,3% в I группе, 36,7% во II группе. Серьезной проблемой является искусственное прерывание беременности. По нашим данным, от 50 до 97% женщин всех групп в промежутке между родами имели неоднократные артифицированные аборты, самопроизвольные выкидыши. У женщин в I группе искусственные аборты в анамнезе были в 70% случаев, причем у 63,3% - более 3-х искусственных абортов, во второй группе - в 96,7% случаев, а в III группе- у каждой второй женщины. Среди гинекологической патологии у обследованных женщин доминировали самопроизвольное прерывание беременности, привычное невынашивание, осложнения предыдущих родов, что особенно характерно для I и III групп, различные гинекологические заболевания, количество которых было значительным в каждой группе. Наивысшую степень риска для плода и новорожденного представляют осложнения текущей беременности. Угроза прерывания в первой половине беременности отмечалась в 86,7% случаев и у всех женщин во 2-й половине беременности (I группа); во II группе - 80% в 1-й и 2-й половине беременности, а в III группе: 66,7% и 73,3% соответственно в 1-й и 2-й половине беременности. Общеизвестно неблагоприятное влияние анемии на внутриутробное развитие плода. Данный показатель составил в наших наблюдениях от 30% (П1 гр.) до 40% (I гр.). Гипертония во время беременности отмечалась у каждой второй женщины. Во всех группах отмечался высокий процент ОПТ - гестозов. У женщин I группы данная патология выявлялась в 86,7%, во второй - у 60%, а в III- у каждой третьей женщины. Кровотечение в первой половине беременности регистрировалось в I и Ш группе у 30% женщин, во II - у 6,7%. Данные о состоянии матерей во время беременности представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Факторы риска материнского анамнеза при различном гестационном возрасте новорожденных.

н III

группа

СЗгин инф. S анемия О угроза 1 9 угроза 2 В крое 1 О кров 2 Иотслойка ■ гестоз

Обозначения: гинекологическая инфекция, анемия, угроза прерывания беременности в 1-й половине, угроза прерывания во 2-й половине беременности, кровотечение в 1 -й половине беременности, кровотечение во 2-й половине беременности, отслойка плаценты, гестоз.

Таким образом, проведенный анализ свидетельствует, что при изучении роли различных факторов в генезе хронической внутриутробной гипоксии у обследованных детей ведущими явились: наличие хронических инфекций и обострение их во время беременности, курение во время беременности, ранний токсикоз, гестозы, анемия, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. На основании индивидуального анализа здоровья групп обследуемых женщин выявлена различная частота встречаемости исследуемых факторов риска для развития плацентарной недостаточности и хронической внутриутробной гипоксии и рождении недоношенного ребенка.

Группы сравнения детей с гипоксическим перинатальным поражением головного мозга (ГППГМ). В качестве группирующих факторов использовался гестационный возраст и наличие на нейросонографии структурных изменений головного мозга. Дополнительно проводился анализ изучаемых белковых факторов патогенеза ГППГМ в сыворотке крови в зависимости от тяжести состояния при рождении; вида поражения на НСГ, а также в зависимости от исхода заболевания по критерию "выжил-умер" у новорожденных с различными структурными изменениями на НСГ и без них. Проведение многофакторного статистического анализа данных в зависимости

от различных критериев связано с тем, что практически все из изучаемых белков, кроме 8-100, не были исследованы у детей.

Дети были разделены по сроку гестации на 3 группы: первая-26-31 неделя (I), вторая-32-37 недель (II), третья-38-42 недели (1П). Каждая группа, в свою очередь, делилась на 2 подгруппы: А - без структурных изменений на НСГ;

Б- со структурными изменениями на НСГ (перивентрикулярная лейкомаляция (ПВЛ); внутрижелудочковые кровоизлияния (ВЖК); сочетание этих изменений).

Дети в каждой группе были сопоставимы между собой по гестационному возрасту, состоянию при рождении, основным клиническим симптомам и объему оказываемой медицинской помощи.

Так как определенному гестационному возрасту присущи свои особенности, важно было сравнивать между собой детей аналогичного срока гестации, т.е. в каждой группе сравнивались дети со структурными изменениями на НСГ и новорожденные без патологии при ультразвуковом сканировании головного мозга. Структура изменений головного мозга на нейросонографии представлена в таблице 1.

Таблица 1. Структура изменений головного мозга на НСГ (представлено число пациентов).

Вид изменений на НСГ Группа

I (26-31 нед.) II (32-37 нед.) III (38-42 нед.) Всего

ВЖК II 1 1 3 5

ВЖК III 2 3 3 8

ВЖК IV 1 1 0 2

ПВЛ 5 5 5 15

ВЖК И+ПВЛ 1 1 3 5

ВЖК ш+пвл 3 2 1 6

ВЖК 1У+ПВЛ 2 2 0 4

Без изменений 15 15 15 45

Проводилось также разделение на группы с использованием результатов оценки тяжести состояния при рождении по шкале Апгар. Всего были сформированы две группы с учетом оценки по шкале Апгар на 1-й минуте жизни.

Таблица 2. Распределение обследованных детей на группы с учетом оценки по шкале Апгар на 1-й минуте после рождения.

№ группы Оценка по шкале Апгар на 1-й минуте Количество детей Средняя оценка по шкале Апгар, баллы, \liSD Средняя масса при рождении, г, М±БО

I 0-4 74 2,6±0,8 2332±350

II 5-7 16 6,45 ±0,2 2467±360

Результаты исследования и их обсуждение.

В работе проведена оценка участия в патогенезе постгипоксических изменений головного мозга у новорожденных нейроспецифических антигенов: белка астроцитарной глии 8-100, нейротрофического фактора головного мозга (ВОМ7), цилиарного нейротрофического фактора (СШТ), васкулоэндотелиального фактора роста (УЕСР), маркера апоптоза (01*5) и молекулы клеточной адгезии (активированная молекула лейкоцитарной клеточной адгезии (АЬСАМ)).

Изучение концентрации исследуемых факторов у новорожденных контрольной группы показало, что в нормальных условиях все антигены, кроме СОТТ, присутствуют в сыворотке крови. В контрольной группе, у новорожденных без поражения ЦНС, не было выявлено достоверных различий исследуемых антигенов в зависимости от гестационного возраста, а также времени определения. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3. Концентрация исследуемых факторов к контрольной группе.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ФАКТОРЫ ЗНАЧЕНИЯ В КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЕ

\tiSD тш-тах

Б-100, мкг/л 0,21 ±0,08 0,18-0,03

ВО№, мкг/л 2,5±1,7 1,0-3,9

ОПТ, мкг/л Не определяется в сыворотке крови

\niGF, мкг/л 193,467±59,035 122-400

АЬСАМ, мкг/л 0,036±0,015 0,018-0,06

ОЯ5, мкг/л 4,1 ±0,9 1,2-8,67

При гипоксическом поражении мозга изменения в системе исследуемых факторов присутствуют с первых часов, но наиболее выраженными они становятся уже к 48 часам жизни.

При изучении особенностей экспрессии изучаемых антигенов в зависимости от гестационного возраста мы выявили следующие закономерности: концентрация в сыворотке крови индукторов апоптоза Б-100; Б115 и АЬСАМ была достоверно (р<0,01) выше у новорожденных с меньшим гестационным возрастом, что согласуется с исследователями, доказавшими влияние зрелости нейронов на их устойчивость к процессам гипоксии-ишемии.

Концентрация ингибиторов апоптоза в сыворотке крови -В ОМ7 и УБвР-была достоверно выше (р<0,01) у доношенных новорожденных. Увеличенный сывороточный уровень ВБ№ у доношенных новорожденных можно объяснить более зрелой функциональной активностью нервной системы и способностью «включить» защитные механизмы. Низкий уровень нейротрофина у недоношенных - угнетением ЦНС при гипоксическом поражении. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4. Концентрация исследуемых факторов (мкг/л) в сыворотке крови у новорожденных в зависимости от гестационного возраста.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ФАКТОРЫ Группа

1(25-31 нед) II (32-3 7нед) П1 (38-42 нед) контроль

Б-ЮО 1,8±0,43* 1,69±0,39* 1,61±0,42* 0,21 ±0,08

ВБОТ 4,62±3,02* 4,5±2,7* 8,15±3,4 * 2,5±1,7

смт Определяется только при геморрагических изменениях, исследование в соответствии с гестационным возрастом не проводилось Не определяется в сыворотке крови

УЕОБ 86,145 ± 92,45* 126,14 ± 106,95 243,165 ± 153,63 193,467± 59,035

0115 64,68±27,09* 50,1±16,7* 36,75±14,36* 4,1±0,9

АЬСАМ 3,53±3,4* 2,62±1,34* 1,49±0,32* 0,036±0,015

♦-достоверно (р<0,01) отличаются от контрольной группы (по методу Манна-Уитни)

При сравнении концентрации исследуемых факторов в зависимости от гестационного возраста у новорожденных с отсутствием структурных изменений на НСГ (подгруппа А) и со структурными изменениями на НСГ (подгруппа Б) были получены следующие данные, представленные в таблице 5.

Максимальные значения 8-100; 0115; АЬСАМ отмечались у всех обследованных новорожденных в 1-е сутки жизни. Однако у детей подгруппы Б во всех группах сывороточная концентрация белка астроцитарной глии в-100 была в среднем в 3 раза выше, чем у детей в подгруппах А того же срока гестации.

Уровень АЬСАМ у новорожденных со структурными изменениями головного мозга превышал таковой у новорожденных подгрупп А в среднем в 2 раза.

Концентрация проапоптотического фактора ОЯ5 была максимальной у новорожденных с меньшим гестационным возрастом. При сравнении различий в уровне БИ5 в сыворотке крови у детей подгрупп А и Б выявлено, что у при формировании структурных постгипоксических изменений головного мозга концентрация ОЯ5 была в 3-5 раз выше. Максимальные различия выявлены во II группе.

Таблица 5.Концентрация исследуемых факторов в сыворотке крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и наличия изменений на НСГ. (Все данные, кроме УЕОР, в 1-е сутки жизни).

ИССЛЕДУЕМЫЕ Группа

ФАКТОРЫ контрольная 1(25-31 нед) II (32-37нед) III (38-4*,нед)

Подгруппа

А Б А Б А Б

Б-100, мкг/л 0,18-0,03 0,93±0,06*,** 2,67±0,04*,** 0,92±0,09*,** 2,46±0,06*,** 0,87±0,07*,** 2,35±0,02*,**

ВОМР, мкг/л 1,0-3,9 5,426±0,74*,** 1,548±0,74*,** 6,177±0,8*,** 1,44±0,7*,** 3,39±0,71** 8,843±3,41*,**

СОТТ, мкг/л Не определяется в сыворотке крови Определяется только при геморрагических изменениях, исследование в соответствии с гестационным возрастом не проводилось

УЕйР, мкг/л 122-400 471,84±168,39*,** 60,43±48,31*,* 555,44±248,35*, 57,12±52,93*, 489,8±184,7*, 69,1±56,3*,**

28с/ж,* * ** ** ♦*

АЬСАМ, мкг/л 0,018-0,06 2,6±1,8*,** 5,8±3,0*,** 1,56±1,2* ,♦* 2,56±1,08*,** 0,75±0,32*,** 1,61±0,68*,**

Ш15, мкг/л 1,2-8,67 34,37±28,13*,** 102,98±32,75*, ** 18,49±16,93*,** 93,91±18,09*, »* 20,31±21,62*, ** 78,02±52,2*,**

*-достоверное отличие от контроля р<0,01 (по методу Манна-Уитни)

♦"■-достоверное различие между подгруппами А и Б р<0,01 (по методу Вилкоксона)

Уровень нейротрофического фактора BDNF в сыворотке крови у недоношенных детей (I и II группа) в первые сутки жизни был в 3,5 и 4,3 раза выше у детей без структурных изменений головного мозга (подгруппа А). У доношенных новорожденных, напротив, уровень BDNF был выше у детей со структурными изменениями. При развитии ВЖК у доношенных новорожденных отмечалось значительное увеличение сывороточной концентрации BDNF, что, возможно, объясняется усиленным синтезом нейротрофина при репаративных процессах в нервной ткани. Кроме того, это повышение обусловлено нарушением целостности ГЭБ, и выходом в кровяное русло антигена, а также разрушением клеточных элементов - разница в сывороточной концентрации увеличивается при высвобождении BDNF при дегрануляции тромбоцитов и свертывании крови. В ШБ группе наблюдались трое детей с ВЖК III степени, сывороточный уровень BDNF у которых в первые сутки был экстремально высоким: 22,7; 29,0 и 44,96 мкг/л.

Для васкулоэндотелиального фактора роста не характерно изменение концентрации в первые 48 часов жизни, что, вероятно, связано с постепенным развитием микроциркуляторных нарушений. Однако, к 7-м суткам жизни, когда нарастает уровень тканевой ишемии, были выявлены различия в уровне VEGF в сыворотке крови у новорожденных со структурными изменениями на НСГ (подгруппа Б): отмечалось отчетливое снижение уровня васкулоэндотелиального фактора роста. У детей без развития таких нарушений (подгруппа А) регистрировалось повышение значений концентрации антигена, что свидетельствует о различных возможностях компенсации постгипоксических нарушений в тканях и угнетении синтеза васкулоэндотелиального фактора роста при более тяжелом течении заболевания. Этот факт косвенно доказывает меньшая концентрация VEGF у новорожденных с тяжелой острой асфиксией, чем с умеренной. Максимальная разница в концентрации VEGF отмечена к 28 суткам жизни: у новорожденных подгрупп А уровень антигена был выше, чем в подгруппах Б в 7,0-9,7 раз.

При выявлении зависимости концентрации исследуемых факторов от состояния при рождении (оценка по Апгар на 1-й минуте жизни) было выявлено, что у новорожденных с острой тяжелой асфиксией в первые сутки жизни уровни 8-100, ОЯ5 и АЪСАМ в сыворотке крови были достоверно выше, чем у детей с оценкой по Апгар 5-7 баллов в 1,5-2 раза по сравнению с контрольной группой.

Концентрация трофических факторов: ВОМ7 и УЕвР, была выше у детей с умеренной асфиксией в родах. Полученные данные свидетельствуют о том, что зрелость новорожденных и гипоксический стресс в родах являются важными составляющими в процессе реализации защитных и репаративных механизмов при гипоксии мозга. Это подтверждают данные других авторов, изучавших изменение индукторов и ингибиторов апоптоза в эксперименте [Е.И.Гусев,вгоН 8.В.,Еп<1ег8 М., И-ОвегШет 1.М]. Данные представлены в таблице 6.

Таблица 6. Концентрация исследуемых факторов в сыворотке крови в зависимости от оценки по шкале Апгар на 1 -й минуте жизни.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ФАКТОРЫ (1-е сутки жизни) Группа

I Оценка по Апгар 0-4 балла,М±8Б II Оценка по Апгар 5-7 баллов,М±8Б Контрольная, М±8Б

8-100, мкг/л 2,49± 0,8* 1,14± 0,27* 0,21±0,08

ВО№, мкг/л 5,6±1,7* 6,27±1,09* 2,5±1,7

ОПТ, мкг/л Не проводилась статистическая обработка по данному критерию

УБвР, мкг/л 122,631±115,44* 195,311±163,26 193,467±59,035

АЬСАМ, мкг/л 4,24±3,48* 2,46±1,34* 0,036±0,015

ОЯ5, мкг/л 51,4±8,3* 27,8±11,1* 4,1±0,9

•-достоверно отличается от контрольной группы(р<0,01) по методу Манна-Уитни

Для анализа уровня в сыворотке крови специфических и неспецифических факторов патогенеза гипоксического поражения головного мозга у новорожденных с различными типами изменения головного мозга дети были разделены на 4 группы в соответствии с изменениями на

20

нейросонографии: 1-новорожденные, у которых на НСГ отмечалось повышение перивентрикулярной эхогенности, от умеренной до выраженной, обозначаемой в протоколах описания как (++) и (+++) соответственно- (29 и 16 детей); II-новорожденные с перивентрикулярной лейкомаляцией (15 детей); Ш -новорожденные с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (15 детей); ГУ-новорожденные с сочетанием внутрижелудочкового кровоизлияния и перивентрикулярной лейкомаляции (15 детей). Группой сравнения кроме контрольной были дети первой группы, перенесшие гипоксию-ишемию мозга, у которых не было выявлено структурных поражений, но отмечалось повышение перивентрикулярной эхогенности на НСГ. Новорожденные контрольной группы и групп сравнения были сопоставимы по гестационному возрасту, состоянию при рождении, объему оказанной медицинской помощи и клиническим симптомам.

Исследование изучаемых факторов в соответствии с этим критерием показало, что концентрация антигенов, влияющих на тканевую деструкцию -Б-100, АЬСАМ, Б115 - была повышенной у всех детей, максимальные значения этих белков регистрировались в 1-е сутки жизни.

У новорожденных без структурных изменений на НСГ превышение уровня Б-100 в сыворотке крови было не больше, чем в 3 раза по сравнению с контрольной группой, уровень его значительно быстрее снижается. У новорожденных со структурными изменениями головного мозга превышение показателей концентрации Б-100 в 7-12 раз в первые сутки жизни по сравнению с нормативными значениями.

Максимальный уровень сывороточной концентрации белка Б-100

отмечался независимо от характера структурных изменений головного мозга,

определяемых на НСГ, в первые сутки жизни у всех обследованных детей.

Однако при сопоставлении средних значений антигена наибольший уровень в

сыворотке крови в первые сутки жизни регистрировался у детей с сочетанным

поражением головного мозга: развитие ВЖК и формирование ПВЛ. В среднем

они превышали верхнюю границу нормы в 10 раз и составляли 3,05±0,15мкг/л.

У новорожденных с ПВЛ средние значения концентрации белка Б-100 в первые

21

сутки жизни были несколько ниже (2,4±0,58 мкг/л), чем в группе с сочетанным поражением головного мозга. Превышение концентрации S-100 по сравнению с нормативными данными было в 7-8 раз. У новорожденных с ВЖК -концентрация белка S-100 в первые сутки жизни была в среднем 2,29+0,<45мкг/л, т.е. превышала нормальный уровень в 7 раз. В ipynne детей без структурных изменений головного мозга на НСГ отмечалось повышение сывороточного уровня S-100 не больше, чем в 3 раза по сравнению с верхней границей нормы. В среднем он составлял 1,06±0,34 мкг/л.

Динамика концентрации антигена в последующие сутки исследования характеризовалась снижением его уровня. Но у новорожденных со структурными изменениями головного мозга к 7-м суткам жизни средние значения сывороточного уровня белка S-100 в сыворотке крови были больше нормативных в 5-6 раз и составили - 1,96±0,3 мкг/л у детей с сочетанным поражением и 1,6 мкг/л у новорожденных с изолированным ВЖК или ПВЛ. В группе детей без структурных изменений головного мозга на НСГ превышение средних значений S-100 было выше нормативных показателей концентрации в 1,5-2 раза и соответствовало 0,68±0,23 мкг/л. К концу второй недели жизни -максимальная концентрация белка S-100 в сыворотке крови регистрировалась у новорожденных с сочетанием ВЖК и ПВЛ и была равна 1,17+0,3 мкг/л. У детей с изолированным ВЖК или ПВЛ средние значения сывороточной концентрации S-100 составляли 0,9 мкг/л. У новорожденных без структурных изменений головного мозга на НСГ средняя концентрация S-100 в сыворотке крови к 14 суткам жизни была равна 0,52± 0,17 мкг/л. На 21 сутки жизни достоверные различия между показателями концентрации S-100 не определялись: в группе со структурными нарушениями на НСГ сывороточный уровень составлял 0,44 мкг/л, а без изменений на НСГ- 0,39 мкг/л. Данные представлены в таблице 7.

Таблица 7.Сравнительная характеристика исследуемых факторов у новорожденных с различными изменениями на нейросонографии.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ФАКТОРЫ ГРУППА

БСН пвл вжк ВЖК и пвл

Ненроспецифические факторы Б-ЮО, мкг/л гг?ш -ш ЙШ Максимальные замша в первые сутки жизни, К 21 суткам жизни нет достоверных различий с контрольной группой

Сутки жизни (с/ж)

- г- N 1- т п - —| л г- ■ ^ М т Ж -М-« ►«я

1 - . г14т(| | 00 м $ 00 о т г» 00 чо о Г- 5 м о £ о\ ГО О I «о «л 1 о & ! * 3 || (Ч N 5? § е> о | 'ы' .1 1 ' •О

N>N1, мкг/л Р 14 «Л 11 . Зи5сЛк 1-е с/ж 3-5 с/ж К« ¿щ 1P.fr 1-е с/ж

,3,8*1,73 0,53±0,42 2,87±1,5 ты* 0,47±0,64

СЛТК, мкг/л * ^ 4* 1»• 4,-1 '45 -г * , # ар .-„'"У. *Л %ЧГ . у.' ..>< - Не определяется в сыворотке крови Максимальные значении иа 12-14 с/ж

1-есА* 12-14 с/ж 1-е с/ж Л2-14 с/ж

15,7±63 44,7Ш<М 11,7±4£

Высока« уровень к 28*/ж,М±ЗЕ>: 21,№И,87 Низкий уровень к 28с/ж, М±Я>: 7,56±1,34

Сосудистые факторы УХвГ, мкг/л кг -"Тг"? >* -'и 'Ц -',!': и Исходные уровни не имеют достоверных различий с контрольной группой

Не огаичаетса от кошродьвнХ значений (во есть увеличение к 28 суткам жизни) Уменьшение МЮТ к концу 1-й недели жнзнн, значительное снижение к 28с/ж, до 78,54*37,01 Снижение М±вР к 28 суткам жизни до 117,46±84,91 Снижение к 1-й неделе жизни, значительное уменьшение к 28с/ж (в 2 раза меньше нижней границы Ы) до 53,22± 40,96

АЬСАМ, мкг/л Максимальный уровень в сыворотке крови в первые 48 часов жизни (ч/ж)

48ч/ж 12-14с/ж 48ч/ж 12-14с/ж | МЬЦ.....ЧДО^'

Быстрое снижение

0, 65±0,21 | 0,14±0,09 0,76±0,16 1 'ШШ 14.3з*а.ть Г ОаОДЬ

Ало птоз Ш*5, мкг/л ¿ймм* щ Максимальный уровень в сыворотке крови в интервале 24-48 часов жизни

10,35± 9,98 73,22*53,89

Возможно, у детей без развившихся постгипоксических изменений головного мозга белок астроцитарной глии Б-100 выполнял присущие ему нейротрофические функции, что при начале восстановительных процессов является особенностью новорожденных детей.

Если степень гипоксического повреждения тяжелая, то не только нейроны, но и глиальные элементы участвуют в процессах восстановления. При нарастании энергетического дефицита поврежденная ткань подвергается апоптозу и воспалению, вызывающих окончательную деструкцию клеточных структур. Эти данные согласуются с результатами, подтвержденными в эксперименте и изучении инсультов у взрослых [Гомазков О.А, Чехонин В.П., (Заггок) О.].

Повышение уровня молекулы клеточной адгезии АЬСАМ у новорожденных со структурными изменениями головного мозга было в 3-6 раз выше, чем у детей без таких изменений.

При изучении динамики АЬСАМ в зависимости от развившихся и выявленных с помощью нейросонографии изменений головного мозга, установлено, что максимальные значения концентрации АЬСАМ регистрировались у новорожденных с сочетанными поражениями головного мозга - ВЖК и ГТВЛ. У них также отмечались самые низкие темпы снижения антигена, что, возможно, отражает процесс воспаления и тромбообразования в сосудах герминативного матрикса и связано с большим объемом поражения ткани головного мозга и более длительным течением процессов организации в очаге постгипоксических изменений. Данные представлены в таблице 8.

Таблица 8. Изменение средних значений сывороточной концентрации АЬСАМ (мкг/л) у новорожденных в зависимости от результатов НСГ.

Статистические показатели Группа

I (БСН) П(ПВЛ) III (ВЖК) IV (ВЖК и ПВЛ)

1 проба (48 часов жизни)

0, 65±0,21* 2,05±0,3*,** 2,44±0,33*,*+ 4,33±0,73#,**

! тт-тах 0,19-1,03 1,2-2,78 1,92-2,81 2,66-9,0

2 проба (5-7 сутки жизни)

М±8Б 0,18±0,12* 1,94±0,41*," 2,07±0,41+,+% 2,93±0,38*,*+

тт-тах 0,1-0,82 1,2-2,63 1,65-2,9 1,99-4,8

3 проба(12-14сутки жизни)

М±8Б 0,14±0,09♦ 0,76±0,16^,** 1,06±0,48%,*+ 1,67±0,27+,"

тт-тах 1 0,04-0,26 0,53-2,1 0,82-1,6 1,07-1,93

♦- достоверность различий средних показателей сывороточной концентрации АЬСАМ от контрольной группы по методу Манна - Уитни (р<0,01);

♦♦-достоверные различия концентрации АЬСАМ от I группы по методу Манна - Уитни (р<0,01)

Сравнение концентрации РЯ5 показало, что у детей без структурных изменений на НСГ уровень маркера апоптоза был в 7-10 раз ниже, чем у новорожденных с постгипоксическими изменениями на НСГ. Анализ результатов исследования уровня маркера апоптоза в сыворотке крови выявил достоверность различий от контрольных величин (р<0,01) по методу Манна-Уитни во всех группах детей, как с отсутствием, так и с наличием структурного дефекта головного мозга на НСГ(*). Самая высокая концентрация антигена фиксировалась в случаях сочетанного поражения: комбинации ВЖК и ПВЛ -100,72±27,22 мкг/л (90,7-146,66 мкг/л). Минимальные же значения сывороточного уровня имели дети с повышением эхогенности в ПВО -10,35±9,98 мкг/л (3,71-26,05 мкг/л), что также подтверждает корреляцию уровня исследуемого белка и степени активности деструктивных процессов в

нервной ткани. Достоверные различия от I группы (р<0,01) выявлены у всех новорожденных II, III и IV групп (**). Данные представлены на рисунке 2.

Рисунок 2. Уровень DR5 в сыворотке крови у детей с различными изменениями на НСГ.

140 120 loo Н 80

solio

20 -I 10 35

-20 --40 -

7322

44

Sil

ю Е ф

* Ш

С

ш

£

л

I

£ X & п

S *

Группа ш

Необходимо отметить, что концентрация вышеописанных факторов была максимальной у новорожденных с сочетанием ВЖК и ПВЛ, то есть имеет прямую корреляционную связь с объемом поражения мозга. Повышение уровня индукторов апоптоза в первые 48 часов жизни доказывает, что критический момент в программе поражения ткани возникает раньше, чем необратимое нарушение в клетках, и прогноз формирования структурных изменений в тканях определяется значительно раньше их морфологической визуализации.

Среди нейротрофических факторов рассматривались преимущественно глиальные факторы (ВБОТ- астроглия и нейроны). Роль этих веществ в патогенезе гипоксии у новорожденных была практически не изучена. Встречались лишь единичные примеры [Дш^ЫгНЬ 8,1997]. Однако у взрослых пациентов и на экспериментальных моделях доказано участие этих белков в нейропротекции и дифференцировке клеток нервной ткани. Перед педиатрами и неврологами, занимающимися новорожденными высокого риска всегда встает вопрос: разовьется ли ПВЛ у ребенка с повышенной эхогенностью перивентрикулярных зон? Что лежит в основе таких изменений?

26

Нанотехнологии, применяемые в современной иммуноферментной диагностике, позволяют исследовать молекулярные соединения, которые играют в трофообеспечении нервной ткани важную роль.

В работе показаны достоверные различия в концентрации нейротрофического фактора (BDNF) у новорожденных с повышенной эхогенностью перивентрикулярных зон с формированием и без трансформации вПВЛ.

При изучении концентрации BDNF в сыворотке крови, выявлено, что у новорожденных без структурных изменений головного мозга на HCT всегда отмечалось повышение исследуемых антигенов, а при трансформации в ПВЛ -снижение BDNF регистрировалось уже в первые сутки жизни. Данные представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. Динамика изменений средних значений концентрации BDNF (мкг/л) у новорожденных с различными структурными изменениями головного мозга на нейросонографии.

16 п 1412 10 8 6 4 2 0 -2 -4 J

£

И

И

> 2

£8

* W* у

mjr,____L'jjt'ij 1»J_

группы

+ i

El BDNF 1 □ BDNF 2

•-достоверно отличается от контрольной группы (р<0.01)(метод Манна-

Уитни);**- достоверно отличается значения 1-й и 2-й проб (р<0.01)(метод

Вилкоксона)

ВООТ 1; 2- номер пробы

Анализируя полученные результаты, мы выявили тенденцию к

повышению показателей антигена первой пробы у детей без структурных

изменений головного мозга на НСГ (в 1,5-2 раза по сравнению с контрольной

27

группой) 5,59±3,16 мкг/л. При развитии внутрижелудочкового кровоизлияния -средние показатели сывороточной концентрации В ОМ7 резко возрастают (до 4 раз выше К) и равны 10,9±11,77мкг/л. У новорожденных с тяжельм ишемическим поражением (ПВЛ) и сочетанным (ПВЛ+ ВЖК) - концентрация ВБ^Л7 значительно снижается и практически равны между собой, составляя 0,53±0,42 мкг/л и 0,47±0,64 мкг/л соответственно.

При изучении динамики значений сывороточного уровня нейротрофина во второй пробе - на 3-5 сутки жизни - у новорожденных без структурных изменений показатели сывороточной концентрации ВООТ имеют тенденцию к уменьшению (достоверных различий с 1-й пробой нет). В группе с гипоксически - геморрагическим поражением (ВЖК) - достоверно снижаются (в среднем на 50%) и составляют 6,14±5,5 мкг/л, но остаются увеличенными по сравнению с верхней границей нормы более, чем в 2 раза (р<0,01). У детей с ишемическими структурными изменениями головного мозга на НСГ (ПВЛ) и сочетанной формой поражения (ВЖК и ПВЛ) сывороточный уровень ВОМ7 увеличивается по сравнению с исходными данными в 4-5 раз: 2,28±1,96 мкг/л и в среднем становится равным норме (р<0,01).При исследовании выявлено, что уровень трофического обеспечения при гипоксии-ишемии влияет на исход процесса. При адекватном его состоянии часто наблюдается уменьшение неврологического дефицита после тяжелого поражения мозга даже при оставшемся морфологическом дефекте, изначально его вызвавшем, что свидетельствует о хороших компенсаторных возможностях у детей. Низкий сывороточный уровень ВОЛ7 у новорожденных, возможно, является одним из важных моментов в возникновении отсроченных морфологических и функциональных изменений головного мозга вследствие перенесенной гипоксии- ишемии или истощении метаболических запасов, что приводит в конечном счет к деструкции.

При изучении полученных результатов иммуноферментного анализа сывороточного уровня цилиарного нейротрофического фактора. ОПТ, мы выявили, что у новорожденных I группы (без структурных изменений

головного мозга на НСГ) и у детей с постгипоксической перивентрикулярной лейкомаляцией, II группа, эндогенный уровень ОПТ не определялся в сыворотке крови. Возможно, это связано с тем, что при описанных выше нарушениях СШТ не проникает через гематоэнцефалический барьер.

В группах с геморрагическими и комбинированными формами постгипоксических изменений головного мозга на НСГ (ВЖК и сочетание ВЖК и ПВЛ) цилиарный нейротрофический фактор определялся в сыворотке крови уже в первые 48 часов жизни.

Говоря об этих группах новорожденных, необходимо отметить, что характер изменения сывороточного уровня СШТ был идентичен. Данные представлены на рисунке 4. Все данные достоверно (р<0,01)отличались от контрольной группы при сравнении по методу Манна-Уитни.

Цилиарный нейротрофический фактор рассматривается как ключевой фактор дифференцировки для развивающихся нейронов и глиальных клеток. ОПТ обеспечивает трофику и участвует в защите поврежденных или аксонотомированных нейронов. Предположительно этот нейротрофический фактор участвует в дифференцировке глии. У новорожденных с геморрагическим типом нарушений уровень его в сыворотке крови фиксируется с первых суток жизни, что, несомненно, может служить ранним маркером внутрижелудочковых кровоизлияний. За время наблюдения, мы выявили, что максимальная концентрация нейротрофина отмечалась к концу второй недели жизни. Однако у новорожденных с изолированным ВЖК она в среднем была в 2 раза выше, чем у детей с сочетанным поражением головного мозга (ВЖК и ПВЛ). Это повышение можно объяснить усиленным синтезом СШТ в ответ на формирующиеся изменения нервной ткани для реализации репаративных механизмов. Сравнение концентрации СШТ в сыворотке крови новорожденных с изолированным и сочетанным поражением свидетельствует о том, что при обширном поражении головного мозга экспрессия СШТ угнетается в большей степени, уменьшая функциональные возможности новорожденных.

Рисунок 4.Динамика изменения сывороточной концентрации СТ^ПТ у новорожденных в зависимости от изменений на НСГ.

60 50 40 30 20 10 0

-10 Ф

2

пробы

сочетанное поражение

■ВЖК

Для другого ростового фактора - васкулоэндотедиального фактора роста. являющегося одним из главных активаторов ангиогенеза, не характерно изменение концентрации в первые 48 часов жизни, что, вероятно, связано с постепенным развитием микроциркуляторных нарушений. Это подтверждается анализом концентрации антигена по всем избранным нами критериям. Данные представлены на рисунке 5.

Анализ полученных результатов выявил следующее: наиболее высокая концентрация УЕОИ наблюдалась у детей с отсутствием структурных нарушений, а также с гиперэхогенностью перивентрикулярных зон, причем показатели стремительно увеличивались с 1-х по 28-е сутки жизни, с максимумом (3 проба) в конце исследования. Средний уровень УЕОБ в I группе к 28-м суткам составлял- 376,76±185,59 мкг/л (27,01 - 646,1 мкг/л), что превышало достоверно (р<0,01) величину контрольных значений.

Рисунок 5. Динамика изменения сывороточной концентрации УЕСР (мкг/л) у новорожденных в зависимости от изменений на НСГ.

ИСТ1 проба Е2Э2 проба проба

У новорожденных с наличием структурного дефекта головного мозга на НСГ, напротив, четко прослеживалась динамика к снижению уровня содержания исследуемого антигена к 28 суткам жизни. Минимальную концентрацию васкулоэндотелиального фактора роста имели дети с сочетанным поражением головного мозга: ВЖК и ПВЛ (3 проба) - 53,22±40,96 мкг/л (0 - 89,06 мкг/л). В группе новорожденных с перивентрикулярной лейкомаляцией (1-я и 2-я пробы) и сочетанным поражением головного мозга первоначально уровень васкулоэндотелиального фактора роста находился в пределах нормы, однако затем всегда следовало его снижение с выходом из интервала контрольных значений. В этих группах (П и IV) при индивидуальном анализе у каждого третьего ребенка в течение первой недели наблюдения фиксировались значения сывороточной концентрации УБвР <50 мкг/л.

Выявленные изменения в концентрации УБвР у новорожденных позволяют сделать вывод о том, что при умеренной гипоксии, когда повреждения мозга еще не успели сформироваться или они носят незначительный характер, наблюдается чрезвычайно важный феномен в виде активации механизмов клеточного восстановления и индукция синтеза такого необходимого фактора защиты, как У1ЮР.

Сравнительная характеристика всех исследуемых факторов в зависимости от изменений на НСГ и особенности изменения их концентрации приведены в таблице 7.

Проведя многофакторный анализ динамики исследуемых антигенов в зависимости от гестационного возраста, состояния при рождении, наличия или отсутствия структурных изменений головного мозга на нейросонографии, мы пришли к заключению, что наиболее показательным для сравнения является анализ их корреляционных связей при различных типах структурных поражений головного мозга. Данные представлены в таблице 9.

Характеризуя корреляционные связи у детей без структурных изменений головного мозга на НСГ. можно отметить, что уровни трофических и ростовых факторов были в обратной зависимости от уровней фактора апоптоза, молекулы клеточной адгезии. Отмечался наиболее высокий уровень трофических и ростовых факторов как исходно, так и в динамике, уровни деструктивных показателей в этой группе были самыми низкими. Уровень ВБМ7 не коррелировал с уровнем белка Б-100. Возможно, это связано с тем, что концентрация белка Б-100 здесь увеличивалась незначительно, и реализовались нейротрофические свойства белка.

Таким образом, у детей с гипоксическим поражением мозга и без структурных изменений хорошо выражены трофические функции нервных клеток за счет адекватного синтеза нейротрофических и ростовых факторов и ингибирования процессов апоптоза.

У новорожденных с ПВЛ прямые корреляционные связи были выявлены между уровнем в-100 в сыворотке крови и уровнем маркера апоптоза ОЯ5 и молекулы клеточной адгезии АЬКАМ, обратные - с уровнем нейротрофического фактора ВОМ7, то есть, чем выше была концентрация факторов, влияющих на тканевую деструкцию, тем больше снижалась способность клеток к синтезу нейротрофина. ВБМ7 прямо коррелировал с уровнем васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови к концу первой недели жизни.

Таблица 9.Корреляционные связи между исследуемыми факторами у новорожденных с различными изменениями наНСГ.

Примечание:

\ТЮР2; ОПТЗ - уровни \TEGF и ОПТ в сыворотке крови в соответствующей пробе. Выделено шрифтом - корреляционная связь сильная, достоверная (К>0,6; р<0,01)

В условиях поражения тканей УЕвР является ингибитором процессов апоптоза. У новорожденных с ПВЛ маркер апоптоза находился в обратной зависимости от концентрации УЕвР , что также это доказывает. Факторы, участвующие в процессе апоптоза и воспаления (АЬСАМ и ОЯ5) находились в прямой корреляционной зависимости друг от друга, чем выше была концентрация тем больше был сывороточный уровень АЬСАМ. Таким образом, при тяжелом гипоксически-ишемическом поражении ЦНС у новорожденных с развитием ПВЛ отмечено достоверное влияние факторов клеточной деструкции на синтез трофических антигенов.

При анализе корреляционных зависимостей у новорожденных с ВЖК и сочетанным поражением головного мозга (ВЖК и ПВЛ) дополнительно оценивались связи с цилиарным нейротрофическим фактором (ОПТ).

Анализируя корреляционную зависимость между изучаемыми факторами у новорожденных с ВЖК, мы выявили, что повышение уровня в-100 в крови не зависело от уровня ВОМ7, но находилось в обратной зависимости от цилиарного нейротрофического и васкулоэнлотелиального факторов. Возможно, отсутствие связи между Б-100 и ВБИТ вызвано резким повышением концентрации ВО№ в сыворотке крови уже в первые сутки жизни, что обусловлено и повреждением гематоэнцефалического барьера и, возможно, лучшим синтезом этого фактора при развитии изолированного ВЖК. Увеличение ВООТ также могло быть стимулировано распадом форменных элементов крови, в частности, дегрануляцией тромбоцитов.

Отмечена прямая корреляционная зависимость между белком 8-100 и факторами, индуцирующими апоптоз4Ж5 и АЬСАМ. У индукторов апоптоза фиксировались обратные корреляционные связи в

васкулоэндотелиальным фактором УБвР.

Корреляционные связи между специфическими и неспецифическими факторами патогенеза перинатального гипоксического поражения головного мозга у новорожденных с сочетанием ВЖК и ПВЛ характеризовались следующими особенностями.

Концентрация в сыворотке крови факторов, способствующие деструктивным изменениям в тканях (8-100, Ш15, АЬСАМ) находилась в обратной корреляционной зависимости от уровня мозгового нейротрофического и васкулоэндотелиального факторов. Последние имели прямую корреляционную зависимость между собой, и УЕвИ прямо коррелировал с концентрацией цилиарного нейротрофического фактора к концу второй недели жизни. Эта корреляционная связь подчеркивает, что развитие сочетанного поражения головного мозга с формированием перивентрикулярной лейкомаляции на фоне внутрижелудочкового кровоизлиянии имеет предпосылки практически сразу после рождения ребенка группы риска, а уменьшение синтеза трофических и ростовых факторов на фоне индукции проапоптотических факторов способствует снижению васкуляризации и развитию глиоза ишемизированной ткани. Уровень маркера апоптоза и молекулы клеточной адгезии прямо коррелировали между собой. Взаимосвязь индукторов и ингибиторов процесса апоптоза у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением головного мозга при формировании структурных изменений свидетельствует об угнетении нейротрофических факторов, и преобладании

проапоптотических антигенов. У детей этой группы отмечались самые высокие уровни маркера апоптоза и молекулы клеточной адгезии, а также максимальный исходный уровень белка астроцитарной глии 8-100. Нейротрофический фактор ВО№ был минимальным по сравнению с новорожденными других групп. УЕвИ был ниже, чем у других детей, как в начале наблюдения, так и к 28 суткам жизни (в 2 раза ниже нижней границы нормы). Уровень цилиарного нейротрофического фактора в сыворотке крови к концу второй недели жизни прямо коррелировал с мозговым нейротрофическим фактором и обратно с белком астроцитарной глии 8-100.

Данные, характеризующие корреляционные связи между уровнями исследуемых факторов патогенеза гипоксического перинатального поражения головного мозга у новорожденных и формированием постгипоксических структурных изменений головного мозга представлены в таблице 10.

Факторы, определяющие выраженность деструктивного и воспалительного процесса (Б-100, ОЯ5, АЬСАМ) находились в прямой корреляционной связи с формированием постгипоксических структурных изменений головного мозга у новорожденных. Нейротрофические факторы: уровень ВОКГС7 в сыворотке крови в раннем неонатальном периоде находился в обратной зависимости с формированием постгипоксических ишемических поражений: чем ниже был его уровень, тем с большей вероятностью у ребенка формировалась перивентрикулярная лейкомаляция. Цилиарный нейротрофический фактор прямо коррелировал с формированием гипоксически-геморрагических нарушений. Концентрация

васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови в раннем неонатальном периоде не коррелировала с формированием структурных изменений головного мозга на НСГ.

Таблица Ю.Корреляционные связи исследуемых факторов с развитием структурных изменений на нейросонографии. Указаны только сильные корреляционные связи (Я>0,6;р<0,01)

ИССЛЕДУЕМЫЕ ФАКТОРЫ

ГРУППА

£

Ы

ш

0 8

1 =

а §

«

х з

♦ о

■ 5

Я X

в "

§ «

в

Сосудистые факторы

Маркер апоптоза

Б-100

0,614

0,6

0,72

ВБМ7

СКП7

УЕв¥

АЬСАМ

в

к

« о

X §

к

§

& £

-0,63

-0,68

Всюорщв крови не

отредеиется

0,68

0,94

Корреляционной связи нет

0,94

0,939

0,68

0,69

0,83

0,797

В работе также выявлено влияние концентрации исследуемых антигенов в сыворотке крови на летальный исход заболевания. При статистической

обработке данных мы выявили, что с неблагоприятным (летальным) исходом заболевания прямо коррелируют белок астроцитарной глии Я-100, маркер апоптоза Б115 и АЬСАМ. Концентрация трофических факторов ВБ№,СМТР и УЕвР имела обратную зависимость от летального исхода заболевания. Таким образом, длительная гипоксия ткани приводит к грубому энергетическому дефициту, неспособности рецепторного аппарата клеток воспринимать сигналы трофических факторов и аутокринной стимуляции. Недостаточность трофического обеспечения, усиление воспалительных реакции (повышение уровня АЬСАМ в сыворотке крови и медленное его снижение), усиление процессов апоптоза ведет к необратимым изменениям в клетках мозга, и даже повышение уровня трофических факторов ВОМ7, ОПТ оказывается недостаточным для спасения поврежденных клеток. Данные представлены в таблице 11.

Таблица 11. Корреляционные связи исследуемых факторов с летальным исходом. Указаны только сильные корреляционные связи (Я>0,6;р<0,01)

ИССЛЕДУЕМЫЕ ФАКТОРЫ ГРУППА

Контрольная БСН ПВЛ ВЖК Сочетанное поражение

Нейроспецифические факторы в-ЮО • 0,62 0,66 0,64

ВООТ - -0,72 - -0,84

СШТ Ь ВНЯМВЕНН х щшшшявшшя ШМШШШЯШШ £ ГТДИГТш ЦИННИИ я ниШпН нвнн -0,78 -0,6

Сосудистые факторы УЕвЮ § « ч & * - -0,6 -0,62 -0,79

АЬСАМ 0,6 0,78 0,8

Маркер апоптоза ПК5 0,6 0,65 0,79

Нервная, иммунная и сосудистая система являются компонентами единой системы и выполняют совместную функцию сохранения динамического гомеостаза в организме. Присутствующие с первых минут гипоксии мозга нарушения гематоэнцефалического барьера становятся наиболее выраженными через несколько часов (6-72 часа), вследствие деятельности сложного каскада микроциркуляторно-клеточных реакций. Возникновение патологической проницаемости барьера способствует проникновению в кровь не только нейроспецифических белков, но и других крупномолекулярных соединений.

Систематизация явлений, развивающихся на фоне острой ишемии, позволяет ещё раз подчеркнуть, что нарушения микроциркуляции отражают все основные события, происходящие в ткани мозга. Данные процессы являются компонентами единой тканевой системы и на столько взаимозависимы и тесно связаны друг с другом, что невозможно рассматривать их в причинно -следственном взаимоотношении.

Клиническое исследование, проведенное у новорожденных с гипоксическим поражением головного мозга, позволило увидеть суммарный результат разнонаправленных дегенеративно-репаративных процессов: в первые сутки жизни при неблагоприятном прогнозе снижено содержание нейротрофических и ростовых факторов на фоне выраженного увеличения проапоптотических факторов, что свидетельствует о недостаточности защитных механизмов, снижении устойчивости нейронов и сосудистой системы к ишемии, низкой способности к репаративным процессам.

Результаты, полученные в исследовании, позволили во многом расширить понимание патогенеза постгипоксических изменений головного мозга у новорожденных, а также выделить факторы, которые возможно применять в диагностике патологических процессов в ткани мозга как маркеры.

Выводы.

1. Определены нормальные значения нейроспецифических белков (Б-100; ВОМ7; ОПТ) и неспецифических факторов патогенеза гипоксических повреждений головного мозга (УТЮГ; АЬСАМ) в сыворотке крови у новорожденных. Нормальная концентрация исследуемых факторов: Б-100 = 0,21±0,08 мкг/л; ВВ№ = 2,5±1,7 мкг/л; ОПТ: не определяется в сыворотке крови; УЕвР= 193,47±59,03 мкг/л; ОИ5= 4,1±0,9 мкг/л; АЬСАМ: 0,036±0,015 мкг/л.

2. Повышение молекулы клеточной адгезии АЬСАМ в сыворотке крови у новорожденных свидетельствует о роли процессов воспаления в развитии перивентрикулярной лейкомаляции и внутрижелудочковых кровоизлияний.

3. Установлены корреляционные связи между уровнем УЕОБ в сыворотке крови и развитием структурного постгипоксического дефекта. Прогностически неблагоприятным является снижение уровня УЕвР в сыворотке крови к концу первой недели жизни.

4. У новорожденных со всеми видами структурных постпшоксических изменений головного мозга концентрация Б-100 в сыворотке крови в первые сутки увеличивалась более чем в 9 раз. Максимальные значения концентрации Б-100 в сыворотке крови отмечались у новорожденных с сочетанной формой поражения (ВЖК и ПВЛ), они превышали нормативные показатели в 10-12 раз.

5. Цилиарный нейротрофический фактор в норме и при гипоксически-ишемических поражениях не определяется в сыворотке крови.

При развитии ВЖК его уровень регистрируется в крови с первых суток жизни. Максимум его концентрации в сыворотке крови определяется к концу второй недели жизни. Выживаемость новорожденных с ВЖК и сочетанным поражением ЦНС прямо коррелирует с уровнем ОПТ.

6. Содержание нейротрофина ВО№ в сыворотке крови новорожденных с тяжелыми гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС (ПВЛ) и гипоксически-геморрагическими (ВЖК и ПВЛ) в первые сутки жизни было

очень низким, что имеет прогностическое значение при формировании этих нарушений и влияет на выживаемость новорожденных.

7. Повышение уровня маркера апоптоза ОЯ5 имеет значение при определении прогноза по формированию структурного дефекта нервной ткани и выживаемости новорожденных.

8. У новорожденных без структурных изменений головного мозга хорошо выражены трофические возможности нервных клеток за счет адекватного синтеза нейротрофических факторов, факторов роста и ингибирования процессов апоптоза.

9. У детей с тяжелыми постгипоксическими изменениями ткани головного мозга в раннем неонатальном периоде в сыворотке крови преобладают факторы, способствующие деструктивным изменениям, их концентрация находится в обратной зависимости от нейротрофических факторов и фактора роста.

10. Проведенное исследование позволило выявить ранние маркеры патологического процесса в ткани головного мозга при гипоксических повреждениях в неонатальном периоде. К ним относятся: Б-100; ВОМ7. Ранним биохимическим критерием ВЖК является наличие в сыворотке крови СШТ. Неспецифические факторы патогенеза являются предикторами патологического процесса, но для прогноза посгипоксических структурных изменений головного мозга у новорожденных важно их определять совместно с нейроспецифическими белками.

Практические рекомендации

1.Важно выявлять беременных женщин группы высокого риска и проводить профилактику и лечение внутриутробной гипоксии плода, а также разрабатывать индивидуальную подготовку к родам.

2. У новорожденных детей группы риска по развитию неврологических нарушений необходимо проводить раннее определение нейроспецифических

белков и фактора роста (VEGF), а также МКА ALCAM для совокупной оценки компенсаторных возможностей каждого новорожденного индивидуально

3. При подозрении на ВЖК в первые сутки жизни рекомендовано определять уровень CNTF в сыворотке крови.

4. Изучение динамики сывороточного уровня BDNF и VEGF в течение первых 10-ти суток жизни позволяет уточнить прогноз состояния новорожденного в неонатальном периоде.

5. Снижение синтеза нейротрофических факторов у новорожденных со структурными изменениями головного мозга обусловлено еще внутриутробным влиянием гипоксии, поэтому дети с хронической внутриутробной гипоксией не устойчивы к воздействию повреждающих факторов и являются группой риска по развитию ПВЛ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. А.С. Петрухин, Л.И.Ильенко, Г.С.Голосная. Катамнестическое наблюдение за детьми, перенесшими перинатальную патологию ЦНС//Журнал Педиатрия.-М., 1996.-№5 .-стр.46-49.

2. А.С.Петрухин, Г.С.Голосная. Пролонгированное обследование детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию // В сб.Перинатальные повреждения нервной системы.-Уфа.-1996,с.38.

3. Г.С.Голосная. Follow-up study of full term newborns // 5-th Asian and oceanican congress of child neurology.9-1 l/10.-1996.Istanbul.Turkey.

4. Г.С.Голосная, К.А.Маркевич, З.С.Тебина, Н.А.Пронько, Е.Н.Утешева. Иммуноферментный анализ уровня S-100 у новорожденных детей. Тезисы X конгреса «Человек и лекарство» 2004 год, с.700.

5. А.С.Петрухин, Г.С.Голосная, К.А.Маркевич, О.Е.Трифонова. Нейротрофин BDNF у новорожденных со структурными поражениями ЦНС. Тезисы X конгресса «Человек и лекарство» 2004 год.,с.699.

6. Г.С.Голосная. Роль нейроспецифических белков в диагностике тяжелых поражений мозга у новорожденных детей. «Актуальные вопросы

диагностики и фармакотерапии в педиатрии». Лекции для практикующих врачей.Х конгресс «Человек и лекарство»,2004г.,с. 189-207.

7. Г.С.Голосная, К.А.Маркевич. Диагностические возможности иммуноферментного метода определения нейроспецифических белков у новорожденных детей с перинатальным поражением ЦНС. Тезисы IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» Казань.2004 год. с.61.

8. Г.С.Голосная, А.С.Петрухин, К.А. Маркевич, О.Е.Трифонова. Изменение уровня белка S-100 у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС //Педиатрия.- М. 2004. - №1.-стр. 10-15.

9. Г.С.Голосная. Нейроспецифические антигены в диагностике тяжелых гипоксических поражений ЦНС у новорожденных. Рос.Гос.мед.ун-т.-М.,2004.-16с. Рук. деп. в ЦНМБ № 27468 от 5.04.2004г.

10. A.C. Петрухин, Г.С.Голосная, А.А.Терентьев, К.А. Маркевич, А.Б. Дуленков. Использование специфических белков нервной ткани в диагностике внутрижелудочковых кровоизлияний и перивентрикулярной лейкомаляции у новорожденных// Нейрохимия. 2004г. том 21, № 4,с.293-301.

11. Г.С.Голосная, А.С.Петрухин, К.А.Маркевич, О.Е.Трифонова, А.Б.Дуленков, Д.Ю.Зиненко. Изменение уровня белков S-100 и BDNF при перивентрикулярной лейкомаляции у новорожденных и их диагностическое и прогностическое значение. Журнал«Вестник РГМУ» №6(37),2004.с.48/54.

12. Г.С.Голосная, О.Е.Трифонова. Новые аспекты в диагностике и прогнозировании течения тяжелых перинатальных гипоксических поражений центральной нервной системы у новорожденных детей. Материалы международной конференции. «Информационные технологии в образовании, технике и медицине» Россия, Волгоград. 18-22 октября 2004. Том Ш. с. 186192.

13. Г.С.Голосная, О.Е.Трифонова. Роль нейроспецифических белков S-100 и BDNF и васкулоэндотелиального ростового фактора (VEGF) в патогенезе формирования тяжелых постгипоксических структурных изменений мозга у

новорожденных. "Фармакотерапия гипоксии и её последствий при критических состояниях» Материалы всероссийской научной конференции, СПб., 7-8 октября 2004.-170 стр.; с.71-74.

14. Г.С.Голосная, Трифонова O.E. Изучение содержания васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) у новорожденных с перинатальными гипоксическими поражениями ЦНС. Материалы всероссийской научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» 27-29 октября 2004. Журнал «Ангиология и сосудистая хирургия» т.Ю.с.30-31.

15. Г.С.Голосная, К.А.Маркевич, Терентьев A.A., Утешева Е.Н, Дуленков А.Б. Определение нейроспецифических белков S-100 и BDNF у новорожденных детей с перинатальным поражением ЦНС. Тезисы Ш Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии».М, .26-28 октября 2004.C.166.

16. Г.С.Голосная, А.СЛетрухин, О.Е.Трифонова, О.В.Авилова, З.С. Тебина. Роль васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) у новорожденных с тяжелыми перинатальными гипоксическими поражениями ЦНС. Тезисы 1П Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии».М,.26-28 октября 2004.C.167.

17. Г.С.Голосная. Изменение сывороточного уровня нейротрофического и васкулоэндотельального фактора у новорожденных с тяжелым гипоксическим поражением ЦНС. Материалы Пятой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» 21-24 октября 2004 г.с.88.

18. Г.С.Голосная, К.А.Маркевич. Диагностические возможности иммуноферментного определения нейроспецифических белков у новорожденных детей с тяжелыми геморрагическими и ишемическими поражениями мозга. Материалы научно-практического симпозиума «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина». Журнал «Клиническая лабораторная диагностика» 2004, № 9, с.76-77.

19. Г.С.Голосная, О.Е.Трифонова. Сравнительная оценка сывороточного уровня васкулоэндотелиального фактора у новорожденных с тяжелым гипоксическим поражением ЦНС. "Санкт-Петербургские научные чтения". Материалы VI научно-практической конференции с международным участием. Издательство СПбГМУ, 2004. 1-3 декабря, с.29.

20. Г.С.Голосная, С.А.Котий. Факторы риска материнского анамнеза при формировании тяжелых структурных поражений головного мозга у новорожденных детей. Рос. Гос.мед.ун-т.-М.,2004.-17с. Рук. деп. в ЦНМБ № 27565 от 27.12.2004г.

21. Г.С.Голосная, К.А.Маркевич, О.Е.Трифонова. Сравнительная оценка сывороточного уровня васкулоэндотелиального, нейротрофического факторов и белка S-100 у новорожденных с тяжелым гипоксическим поражением ЦНС. Нижегородский медицинский журнал/Здравоохранение Приволжского федерального округа. ISSN 0869-0936. Стр. 15-16. 16.11.2004.

22. Г.С.Голосная, А.С.Петрухин, М.А.Писарчук, А.Б.Дуленков Изменение сывороточного уровня маркера апоптоза «рецептора смерти» DR5 у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС. Тезисы X конгресса педиатров. Москва, февраль 2005г. с. 123.

23. А.СПетрухин, Г.С.Голосная, А.А.Терентьев, А.Б.Дуленков, С.А.Котий. Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), его диагностическая и прогностическая значимость у новорожденных с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (ВЖК). Тезисы X конгресса педиатров. Москва, февраль 2005г. с. 123.

24. Г.С.Голосная, Петрухин A.C. Динамика изменения сывороточного уровня молекулы клеточной адгезии ALCAM у новорожденных с тяжелыми перинатальными поражениями ЦНС. Тезисы X конгресса педиатров. Москва, февраль 2005г.с.412.

25. Г.С.Голосная, С.А.Котий. Клинико-диагностическое значение определения нейроспецифических белков S100 и BDNF и васкулоэндотелиального ростового фактора (VEGF) при перинатальных

гитюксических поражениях ЦНС у новорожденных. Материалы международной научно-технической конференции «Наука и образование-2005», Мурманск, апрель 2005,с.96-101.

26. Г.С.Голосная. Роль процессов апоптоза в патогенезе гипоксических перинатальных поражений мозга у новорожденных детей. Тезисы X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» Казань.2005 год. с.89-90.

27. Г.С.Голосная. Показатели васкулопатии при гипоксических поражениях головного мозга у новорожденных. Журнал Вестник РГМУ , №5(44), с.42-46, 2005г.

28. Г.С.Голосная, А.С.Петрухин, А.А.Терентьев, А.Б.Дуленков. Нейротрофический фактор головного мозга (ВОМ7) в ранней диагностике внутрижелудочковых кровоизлияний и перивентрикулярной лейкомаляции у новорожденных детей. // Журнал Вопросы современной педиатрии. 2005. т.4., №3, с.13-18.

29. А.С.Петрухин, Г.С.Голосная, С.А.Котий. Иммунохимическая оценка нарушения функций гематоэнцефалического барьера у новорожденных детей с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС// Журнал Неврологический вестник им. Бехтерева. 2004г., т.36, выпуск 3-4, с.12-16.

30. Г.С.Голосная. Роль ингибиторов апоптоза в диагностике и прогнозировании исходов перинатальных гипоксических поражений головного мозга у новорожденных.//Журнал Педиатрия.-М. 2005.-№3. -стр.30-35.

31. А.С.Петрухин, А.А.Холин, Г.С.Голосная. В кн. Эпилепсия. Атлас электро-клинической диагностики. «Альварес-паблишинг», Москва, 2004. с.86-98.

32. Д. Ю. Зиненко, А. М. Мытников, К. П. Ермолаев, М. Ю.Владимиров, Г.С. Голосная, О.Е.Трифонова. Лечение недоношенных детей с постгеморрагической гидроцефалией.// Журнал неврология и нейрохирургия детского возраста.2004г.,.№3,с.39-45.

33. Г.С.Голосная. Перинатальная неврология. В кн. Неврология детского возраста. Под ред. А.С.Петрухина. Москва.,«Медицина», 2004 год, с. 353-371.

34. Г.С.Голосная. Иммуноферментный анализ сывороточного уровня нейроспецифических белков (8-100,ВО^) и васкулоэндотелиального фактора (УБвР) у новорожденных с перинатальными гипоксическими поражениями ЦНС. Материалы всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение», Уфа, 2005.с. 70.

35. Г.С.Голосная, А.А.Терентьев. Неспецифические макромолекулярные факторы прогноза тяжести перинатального гипоксического поражения мозга у новорожденных // Журнал Медицинская иммунология, 2005, т.7., №2-3, с. 183.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT антитело

ВЖК внутрижелудочковое кровоизлияние

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения

БСН без структурных нарушений(изменений) на НСГ

ГВ гестационный возраст

гапгм гипоксическое перинатальное поражение головного мозга

ГКБ городская клиническая больница

ГЭБ гемато энцефалический барьер

ДЦП детский церебральный паралич

ивл искусственная вентиляция легких

кос кислотно-основное состояние

МКА молекула клеточной адгезии

НСБ нейроспецифический белок

нсг нейросонография

опт ЕРН- синдром (отек, протеинурия, гипертензия)

пвл перивентрикулярная лейкомаляция

ПВО перивентрикулярная область

пивк пери-интравентрикулярное кровоизлияние

СДР синдром дыхательных расстройств

сэк субэпиндемальное кровоизлияние

УЗИ ультразвуковое исследование

ALCAM активированная молекула лейкоцитарной клеточной

адгезии (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule)

BDNF нейротрофический фактор роста головного мозга

(brain derivated growth factor)

DRS Death Receptor 5, TRAIL R2, TRICK 2, KILLER/DR 5

("рецептор смерти 5")

CNTF цилиарный нейротрофический фактор

(ciliary neurotrophic factor)

MRI магнитно-резонансное исследование

S-100 специфический белок астроцитарной глии

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor (васкулоэндотедиальный

фактор роста)

15111

РНБ Русский фонд

2006-4 12822

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.07.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ л.2,0.Тираж 150 экз. Заказ 453. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Актуальность. Проблема гипоксии плода и новорожденного в настоящее время является актуальной, что обусловлено и высокой частотой встречаемости и особо тяжелыми последствиями для ребенка. Гипоксические повреждения головного мозга стоят на первом месте в структуре перинатальных повреждений нервной системы. Перинатальная асфиксия является одной из основных причин перинатальной смертности, составляя от 20 до 50% в ее структуре. У недоношенных детей неврологическая инвалидность достигает около 40 %, а в структуре этой патологии около 60 % обусловлено пери - и интранатальными факторами, 10% -антенатального и около 30 % неизвестного происхождения. У 5-15 % недоношенных детей, перенесших гипоксическое поражение ЦНС, впоследствии формируются выраженные спастические двигательные нарушения (этим пациентам ставится диагноз «детский церебральный паралич»), судорожные состояния, поражение органов слуха и зрения, а у 2550% детей выявляются менее выраженные нарушения, охватывающие не только двигательную сферу, а также влияющие на формирование изменений когнитивных функций и поведения, приводящие к снижению школьной успеваемости. У доношенных детей 50% случаев церебрального паралича имеет пренатальную этиологию, 36 %- пери/неонатального происхождения и 14 % случаев - неизвестного происхождения.

Развивающийся мозг новорожденного чрезвычайно чувствителен к воздействию гипоксии, которая не только вызывает очаговые повреждения мозговой ткани, но и задерживает развитие сосудистой системы и нарушает клеточную дифференциацию. Толерантность у каждого ребенка к воздействию повреждающих факторов различна. Поэтому при сравнительно равных условиях у всех детей развиваются неоднозначные последствия.

Уже доказано, что смерть клеток при гипоксии происходит не только по типу некротического поражения, но и с развитием апоптоза клеток, который в свою очередь угнетается и индуцируется факторами специфической и неспецифической защиты.

В настоящее время развитие и использование сложных исследовательских технологий в сочетании с достижениями неврологии и смежных медико-биологических дисциплин позволили накопить значительное количество новой информации о патогенезе гипоксичекого перинатального поражения ЦНС, его молекулярных и биологических основах.В связи с этим большой интерес представляет изучение дегеративно-репаративных механизмов, определяющих течение и исходы гипоксии мозга у детей, а также верифицирование с помощью иммуноферментного метода маркеров деструктивного процесса и состояния ГЭБ при гипоксических поражениях головного мозга в неонатальном периоде, и на этой основе проанализировать связь элиминации исследуемых антигенов с нарушениями функции ЦНС, в частности, с тяжестью поражения и исходом патологического процесса, а также с характером выявленных структурных изменений головного мозга.

Все вышеперечисленное определяет актуальность настоящей работы, ее цели и задачи.

Цель работы. Изучить нейрохимические аспекты патогенеза тяжелых гипоксических поражений головного мозга у новорожденных детей, выявить маркеры степени тяжести и оценить их диагностическую значимость. Задачи исследования.

1. Исследовать факторы, отражающие состояние сосудистой системы головного мозга (УЕвР и АЬСАМ) и определить их диагностическую значимость при гипоксическом поражении мозга у новорожденных.

2. Изучить проницаемость гематоэнцефалического барьера при различной степени тяжести гипоксии мозга на основании определения нейротрофических белков (ВО№,С1МТР) и структурного белка астроцитарной глии (белок Б-100) иммуноферментным методом.

3. Определить уровень маркера апоптоза и молекулы клеточной адгезии АЬСАМ в зависимости от гестационного возраста ребенка и степени тяжести асфиксии при рождении в сопоставлении с характером структурных изменений, констатируемых методом нейросонографии.

4. Исследовать изменение концентрации нейротрофинов, белка астроцитарной глии, васкулоэндотелиального фактора, маркера апоптоза, молекулы клеточной адгезии в зависимости от вида изменений на нейросонографии: геморрагический инсульт, ишемический инсульт, смешанный.

5. Выявить корреляционные связи между нейротрофинами, факторами роста, и проапоптотическими факторами при различных видах инсульта у новорожденных, оценить роль каждого фактора в патогенезе постгипоксических структурных изменений мозга: кровоизлияние, лейкомаляция.

6. Установить, какие из исследуемых нейроспецических белков являются участниками пластического процесса в нервной системе. Выявить факторы пластичности, обеспечивающие способность нервной ткани к репарации.

7. Оценить факторы прогноза жизнедеятельности организма ребенка в состоянии тяжелой гипоксии и определить показатели выживаемости после перенесенной гипоксии тяжелой степени.

8. Провести клинико-биохимический анализ значимости исследуемых связей между антигенами и прогнозированием исхода поражения головного мозга и степенью восстановления нарушенных функций.

Научная иовизна.

Впервые был проведен мониторинг содержания нейротрофических факторов ВООТ, СШТ, нейроспецифического белка астроцитарной глии 8-100, васкулоэндотелиального роста УЕОР, а также исследована концентрация маркера апоптоза и активность молекулы клеточной адгезии АЬСАМ у новорожденных детей в норме и при тяжелом гипоксическом поражении ЦНС.

Показано, что в норме у новорожденных в сыворотке крови присутствуют почти все из исследованных факторов: нейротрофины, белок астроцитарной глии, васкулоэндотелиальный фактор роста; в очень низкой концентрации маркер апоптоза 0115 и молекулы клеточной адгезии, АЬСАМ. Не обнаруживается в норме в сыворотке крови только цилиарный нейротрофический фактор.

Прогноз -течения состояния новорожденных во многом связан с сосудистыми изменениями и ростом сосудистой системы. Для выявления ответа сосудистой системы на гипоксию впервые исследованы васкулоэндотелиальный фактор и молекула клеточной адгезии АЬСАМ, динамика концентрации которых в сыворотке крови уже на первой неделе жизни ребенка позволяет с большой вероятностью прогнозировать формирование структурных изменений головного мозга. Выявлена связь сывороточного уровня УБОР с наличием гестоза у матери во время беременности, что свидетельствует об угнетении васкулогенеза у новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.

Впервые рассмотрена роль маркера апоптоза, проапоптотического фактора в патогенезе постгипоксических нарушений у новорожденных. Уровень этого фактора коррелирует с развитием деструктивных процессов и имеет большое значение для ингибирования факторов защиты нервных клеток - нейротрофических и ростовых факторов.

Определены биохимические маркеры повреждения нервной ткани при перинатальном гипоксическом поражении головного мозга. В теоретическом и в практическом аспектах проведенные исследования позволили раскрыть механизмы нарушений на клеточном и сосудистом уровне, реализуемые как специфическими, так и неспецифическими факторами. Выделена роль процесса апоптоза в формировании постгипоксических структурных изменений головного мозга.

Доказано, что детей с хорошими компенсаторными возможностями даже при тяжелой гипоксии не формируются структурные изменения головного мозга. Это связано с балансом в системе трофических, ростовых факторов и проапоптотических антигенов. Практическое значение работы.

При формировании тяжелых постгипоксических изменений головного мозга: геморрагический, ишемический инсульт и сочетанное поражение преобладают факторы, способствующие деструктивным процессам в ткани мозга (8-100, Б115, АЬСАМ).

Диагностическую значимость для прогнозирования формирования тяжелых постгипоксических структурных изменений головного мозга имеют все нейроспецифические белки, а для раннего выявления внутрижелудочкового кровоизлияния — цилиарный нейротрофический фактор, С ШТ.

Нейротрофический фактор, ВОИР, обнаруживается в сыворотке крови в очень малых количествах при гипоксически-ишемических поражениях -перивентрикулярной лейкомаляции и сочетании ПВЛ и ВЖК, что имеет прогностическое значение.

Впервые рассмотрена роль цилиарного нейротрофического фактора, выявлено, что СШТ проникает через гематоэнцефалический барьер только при развитии гипоксически-гемморагических изменений, что позволяет использовать его как ранний маркер. Подтверждено его участие в процессе восстановления пораженной ткани мозга и влияние на выживаемость детей с тяжелыми перинатальными гипоксически-геморрагическими поражениями цнс.

Таким образом, в исследовании предложены иммунобиохимпческие критерии объективизации тяжести и прогноза состояния новорожденных, перенесших тяжелое гипоксическое поражение ЦНС в первые дни заболевания и в течение периода новорожденности. Выделены особенности исследуемых антигенов в зависимости от гестационного возраста, состояния при рождении, вида структурных изменений, а также в зависимости от исхода заболевания при сравнении по критерию «выжил-умер».

Внедрение в практику.

Результаты работы внедрены в практику детского корпуса городской клинической больницы № 7; НПЦ медицинской помощи детям с пороками развития черепно-лицевой области н врожденными заболеваниями нервной системы; используются в учебном процессе кафедры нервных болезней педиатрического факультета РГМУ.

Апробация работы. Официальная апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры нервных болезней педиатрического факультета и кафедры биохимии РГМУ 02.02.2005г. Номер государственной регистрации темы 01950005768.

Основные положения и результаты исследования представлены в материалах X конгресса «Человек и лекарство», (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004; 2005), Международной конференции «Информационные технологии в образовании, технике и медицине» (Волгоград, 2004); Всероссийской научной конференции "Фармакотерапия гипоксии и её последствий при критических состояниях», (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике», (Москва, 2004); III Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», (Москва, 2004); Пятой международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», (Москва, 2004); Научно-практического симпозиума «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина», (Москва, 2004); VI научно-практической конференции с международным участием "Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург, 2004); Международной научно-технической конференции «Наука и образование-2005», (Мурманск, 2005); Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение», (Уфа, 2005); IX Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт

Петербурге»,(2005); X конгресса педиатров (Москва, 2005), где работа была награждена специальным призом на конкурсе молодых ученых.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 12 в центральной медицинской печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания общей характеристики больных и методов исследования, 4-х глав собственных наблюдений и их обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка использованной литературы из 385 работ, включающего 93 отечественных и 292 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 59 таблицами, 58 рисунками, 5 схемами, 4 клиническими наблюдениями.

Выводы.

1. Определены нормальные значения нейроспецифических белков (8100; ВОМ7; СЫТР) и неспецифических факторов патогенеза гипоксических повреждений головного мозга (УЕвР; ОЯ5; АЬСАМ) в сыворотке крови у новорожденных. Нормальная концентрация исследуемых факторов: 8-100 = 0,21±0,08 мкг/л; ВЭЫР = 2,5±1,7 мкг/л; СОТР: не определяется в сыворотке крови; УЕвР= 193,47±59,03 мкг/л; 4,1 ±0,9 мкг/л; АЬСАМ:

0,036±0,015 мкг/л.

2. Повышение молекулы клеточной адгезии АЬСАМ в сыворотке крови у новорожденных свидетельствует о роли процессов воспаления в развитии перивентрикулярной лейкомаляции и внутрижелудочковых кровоизлияний.

3. Установлены корреляционные связи между уровнем УЕвР в сыворотке крови и развитием структурного постгипоксического дефекта. Прогностически неблагоприятным является снижение уровня УЕвР в сыворотке крови к концу первой недели жизни.

4. У новорожденных со всеми видами структурных постгипоксических изменений головного мозга концентрация 8-100 в сыворотке крови в первые сутки увеличивалась более чем в 9 раз. Максимальные значения концентрации 8-100 в сыворотке крови отмечались у новорожденных с сочетанной формой поражения (ВЖК и ПВЛ), они превышали нормативные показатели в 10-12 раз.

5. Цилиарный нейротрофический фактор в норме и при гипоксически-ишемических поражениях не определяется в сыворотке крови. При развитии ВЖК его уровень регистрируется в крови с первых суток жизни. Максимум его концентрации в сыворотке крови определяется к концу второй недели жизни. Выживаемость новорожденных с ВЖК и сочетанным поражением ЦНС прямо коррелирует с уровнем СОТР.

6. Содержание нейротрофина ЕЮЫР в сыворотке крови новорожденных с тяжелыми гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС (ПВЛ) и гипоксически-геморрагическими (ВЖК и ПВЛ) в первые сутки жизни было очень низким, что имеет прогностическое значение при формировании этих нарушений и влияет на выживаемость новорожденных.

7. Повышение уровня маркера апоптоза имеет значение при определении прогноза по формированию структурного дефекта нервной ткани и выживаемости новорожденных.

8. У новорожденных без структурных изменений головного мозга хорошо выражены трофические возможности нервных клеток за счет адекватного синтеза нейротрофических факторов, факторов роста и ингибирования процессов апоптоза.

9. У детей с тяжелыми постгипоксическими изменениями ткани головного мозга в раннем неонатальном периоде в сыворотке крови преобладают факторы, способствующие деструктивным изменениям, их концентрация находится в обратной зависимости от нейротрофических факторов и фактора роста.

10. Проведенное исследование позволило выявить ранние маркеры патологического процесса в ткани головного мозга при гипоксических повреждениях в неонатальном периоде. К ним относятся: 8-100; ВБЫР. Ранним биохимическим критерием ВЖК является наличие в сыворотке крови СШТ. Неспецифические факторы патогенеза являются предикторами патологического процесса, но для прогноза посгипоксических структурных изменений головного мозга у новорожденных важно их определять совместно с нейроспецифическими белками.

Практические рекомендации

1.Важно выявлять беременных женщин группы высокого риска и проводить профилактику и лечение внутриутробной гипоксии плода, а также разрабатывать индивидуальную подготовку к родам.

2. У новорожденных детей группы риска по развитию неврологических нарушений необходимо проводить раннее определение нейроспецифических белков и фактора роста (УБвР), а также МКА АЬСАМ для совокупной оценки компенсаторных возможностей каждого новорожденного индивидуально

3. При подозрении на ВЖК в первые сутки жизни рекомендовано определять уровень СШТ в сыворотке крови.

4. Изучение динамики сывороточного уровня ВОМ7 и УЕвР в течение первых 10-ти суток жизни позволяет уточнить прогноз состояния новорожденного в неонатальном периоде.

5. Снижение синтеза нейротрофических факторов у новорожденных со структурными изменениями головного мозга обусловлено еще внутриутробным влиянием гипоксии, поэтому дети с хронической внутриутробной гипоксией не устойчивы к воздействию повреждающих факторов и являются группой риска по развитию ПВЛ.