Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Некоторые особенности иммунитета и факторов неспецифической резистентности при урогенитальном хламидиозе у женщин

На правах рукописи

РГБ ОД

1 4 МАЙ /Ч-?

МОГИЛЕВЕЦ Татьяна Леонидовна

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА И ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПРИ УРОГЕНИТАЛЫЮМ ХЛАМИДИОЗЕ У ЖЕНЩИН

14.00.10 - инфекционные болезни 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Великий Новгород 2002

Работа выполнена в Институте медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Г.С. Архипов В.Н. Чеботкевич

К.С. Иванов А.М.Королюк

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

Защита диссертации состоится « 20 » мая 2(Щ года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 215.002.01 в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

Автореферат разослан « /У» ¿-7//У) 2002 года Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Ю.И. Ляшенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Урогенитальный хламидиоз является одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения вследствие его широкого распространения и влияния на уровень здоровья и воспроизводства населения (Гомберг М.А. и соавт., 1988; Beatty W.L., Morrison R.P, Byrne G.I., 1994; Davies H.D., Wang E.E., 1996; Адаскевич В.П., 1997; Шинский Г.Э. и соавт., 1999; Скрипкин Ю.К., Кубанова A.A. и соавт., 1999).

Серьезность таких осложнений генитального хламидиоза, как постинфекционные (реактивные) артриты, синдром Рейтера, внематочная беременность, невынашивание беременности, бесплодие, патология новорожденных, заставляет продолжать поиски эффективных методов диагностики, терапии и профилактики хламидиозов (Дружинин П.Н., 1994; Воропаева С.Д., 1996; Савичева A.M., Башмакова М.А., 1998; Кротов С.А. и соавт., 1999; Rastogi S.et al, 1999; Sharara F.I., Queenan J.T.Jr., 1999).

В настоящее время наиболее чувствительными и специфичными методами диагностики хламидиоза признаны молекулярно-биологические методы. Однако их высокая стоимость делает необходимым дальнейшее изучение диагностических возможностей других более доступных, но не менее информативных тестов. Одним из таких методов может стать непрямой иммунопероксидазный метод (НИПМ), имеющий ряд преимуществ, основным из которых является возможность объективной характеристики инфекционного процесса в очаге поражения (Насыров P.A.,1989; Tsutsumi К. et al, 1989).

Разработан широкий арсенал средств этиотроппой и патогенетической терапии, но недостаточно четко определены критерии необходимости применения тех или иных средств (Помитун A.B., 1999; Савичева A.M., Чхартишвили М.Г. и соавт., 1999). По результатам контроля излеченности также имеются противоречивые данные (Машкилейсон A.JL, Гомберг М.А., 1995; Чулиг Й., 1996; Аковбяи В.А., 1997; Дорохипа О.В., 2000).

Достигнуты определенные успехи в изучении характера иммунного ответа у больных хламидиозом, в том числе при персистентной форме инфекции (Вард М.Е., 1996; Соловьев A.M., 1996; Соколовский Е.В., 1998; Левчик Л.К., 1997, 1999). Но, вместе с тем, недостаточно изученными остаются особенности иммунитета при смешанных инфекциях. При этом следует отметить, что сочетанные инфекционные заболевания приобретают все большее значение в структуре заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем (ИППП) (Анчупане И.С., Минтиньш А.П., 2000; Исаков В.А и соавт, 1999). Кроме того, недостаточно внимания уделяется изучению местного иммунитета при хламидиозе, хотя при многих инфекционных заболеваниях, в том числе, с преимущественным поражением мочеполовой системы показана его существенная роль (Шварцман Я.С., Хазенсон Л.Б., 1978; Говало В.И., 1987; Тотолян А. А., 1999).

Наряду с иммунными механизмами в защите от инфекций важное значение имеют факторы неспецифической резистентности и, в частности, антиоксидантная система. Доказана ее определенная роль в патогенезе многих бактериальных и вирусных инфекций (Kushner J., 1982; Исаков В.А., Туркин В.В. и соавт., 1996). При хламидийной инфекции состояние антиоксидантной системы остается практически не изученным.

В связи с этим представлялось целесообразным изучить состояние местного и общего иммунитета и оценить роль антиоксидантной системы организма при различных клинических вариантах течения моно- и смешанной хламидийной инфекции.

Цель исследования.

Изучить состояние факторов неспецифической резистентности и особенности иммунологических и цитологических изменений при хламидийной инфекции для определения их диагностической и патогенетической значимости.

Задачи исследования.

1) Оценить удельный вес хламидийной инфекции в структуре заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем (ИППП) в женской урогенитальной патологии.

2) Изучить клинико-иммунологические особенности инфекционного процесса при различных клинических вариантах течения хламидиоза.

3) Разработать и стандартизировать метод определения уровня секреторного иммуноглобулина А (б^А) в секрете цервикального канала и с его помощью оценить состояние местного иммунитета при хламидиозе.

4) Исследовать состояние антиоксидантной системы (АОС) по содержанию в сыворотке крови церулоплазмина (ЦП), трансферрина (ТФ), лактоферрина (ЛФ) и супероксиддисмутазы плазмы (СОД плазмы).

5) Определить возможности использования показателей иммунитета и факторов неспецифической резистентности для оценки эффективности терапии хламидиозов.

6) Изучить диагностическую ценность непрямого иммунопероксидазного метода в диагностике различных клинических форм хламидиоза.

Научная новизна исследования.

Разработан и стандартизирован метод определения з^А в секрете цервикального канала и впервые по его содержанию дана характеристика состояния местного иммунитета при хламидиозе.

Изучено состояние антиоксидантной системы у больных хламидиозом по содержанию в сыворотке крови комплекса основных металлосвязывающих белков (ЦП, ЛФ, ТФ и СОД плазмы).

Впервые оценены диагностические возможности непрямого иммунопероксидазного метода при хламидиозе и предложено использование количественной оценки уровня экспресс™ антигена хламидий.

Практическая значимость работы.

Разработана стандартная методика исследования секрета цервикального какала, которая позволяет использовать ее для оценки состояния местного иммунитета и улучшения качества диагностики урогенитального хламидиоза у женщин.

Показана возможность использования показателей э^А, ТФ, ЛФ, ЦП и плазменной СОД в качестве дополнительных критериев для оценки состояния иммунитета и неспецифической резистентности организма. Кроме того, в процессе терапии динамика содержания б^А в цервикальном секрете, а также уровня ТФ и ЦП в сыворотке крови могут послужить дополнительными критериями излеченности, поскольку при неэффективной терапии хламидиоза возвращение к норме указанных показателей задерживается или не происходит.

Определены возможности непрямого иммунопероксидазного метода в диагностике хламидиоза как наиболее приемлемого по сумме качеств: доступности, чувствительности, информативности.

Основные положения, выносимые на защиту.

Показатели общего иммунного статуса при хламидиозе существенно не изменяются. При изучении местного иммунитета при хламидиозе выявлено достоверное снижение уровня sIgA в секрете цервикального канала. Динамика данного показателя позволяет судить об эффективности проводимой терапии.

Изменение содержания в сыворотке крови комплекса основных металлопротеидов (ТФ, ЛФ, СОД плазмы и ЦП) говорит об участии антиоксидантной системы в патогенезе хламидийной инфекции. Содержание ТФ и ЦП в сыворотке крови больных хламидиозом позволяет уточнить клинический вариант его течения, а также дает возможность оценивать эффективность терапии.

Непрямой иммунопероксидазный метод является информативным методом этиологичекой диагностики и тестом оценки активности инфекционного процесса при хламидиозе.

Апробация диссертационного материала.

Материалы доложены на VI научно-практической конференции "Актуальные вопросы клинической медицины и организации здравоохранения" (Новгород, 1999); на VII и VIII научно-практической конференции сотрудников и студентов ИМО (Великий Новгород, 2000 и 2001).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Внедрение в практику.

Разработанные методы этиологической и клинико-иммунологической диагностики ИППП внедрены в практику работы женской консультации № 1 Великого Новгорода. Материалы работы используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней (МИиИБ) ИМО НовГУ.

Метод получения секрета цервикалыюго канала и использование его в качестве материала для иммунологического исследования включены в работу иммунологической лаборатории Центра по профилактике и борьбе со СПИД ("Хелпер") Великого Новгорода. Данные серологических исследований, полученные при использовании тест-системы для определения антихламидийных IgG, IgA, позволили внедрить ее в практическую работу лаборатории иммунологии Центра "Хелпер".

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, обсуждения, выводов, и указателя литературы, включающего 137 отечественных и 89 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 14 рисунками, в том числе 9 микрофотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились в период 1998-2000 гг. на базе кафедры микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней Института Медицинского Образования Новгородского Государственного Университета (зав. каф., д.м.н. проф. Архипов Г.С.), лаборатории патоморфологии НИИ детских инфекций МЗ РФ (руководитель лаборатории д.м.н., проф. Насыров P.A.), лаборатории иммунологии Института акушерства и гинекологии им. Д О. Отга РАМН (руководитель лаборатории д.м.н., проф. Сельков С.А.), лаборатории иммунологии Центра по профилактике и борьбе со СПИД "Хелпер".

Под наблюдением находилось 106 женщин репродуктивного возраста (20-35 лет) с выявленными Hl II 111, а также 10 здоровых женщин в качестве контрольной группы. У всех женщин наряду с общепринятым набором общеклинических методов исследования, а также повторным обследованием на ИППП для выявления смешанных инфекций, определяли концентрацию slgA в секрете цервикального канала. Предварительно проводилась стандартизация метода определения концентрации slgA.

В группе женщин с выявленной хламидийной инфекцией (59 больных) проводилось изучение показателей иммунного статуса с помощью набора стандартных методик, а также изучение состояния АОС по содержанию в сыворотке крови комплекса основных металлопротеидов - ТФ, ЛФ, ЦП и СОД плазмы (Туркин В.В., 1994). В дополнение к клинико-иммунологичеким исследованиям было произведено изучение мазков - соскобов цервикального канала с применением НИПМ (Насыров Р.А.,1995).

Наблюдаемым больным в динамике заболевания проводили следующие лабораторные исследования: 1. Методы этиологической диагностики ИППП:

а) Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) суспензий эпителиальных клеток цервикального канала и уретры проводили в пробирках 0,5 мл типа "Эппендорф" на амплификаторах "Терцик" ("ДНК-технология", Москва). Из

исследуемого материала предварительно выделяли ДНК сорбентным методом на реактивах НПФ "ЛИТЕХ" (Москва). Результаты реакции оценивали в электрофорезе в 8% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолете.

б) Непрямой иммунопероксидазный метод с использованием моноклональных антител к Chlamydia trachomatis проводили в модификации Насырова Р.А., 1995. Применяли набор реагентов системы визуализации фирмы DACO (Дания).

в) С помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяли видоспецифические антитела классов IgG, IgA к С. trachomatis в единицах оптической плотности (ЕОП). Применяли иммуноферментную тест-ситему "Комби - Хлами - IgG/IgA - ДС - TR" фирмы "Vector-Best" (Г.Новосибирск). Результаты ИФА регистрировали с помощью фотометра АИФ - С (Витебск).

г) Для выявления Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis был использован метод, основанный на метаболических свойствах данных микроорганизмов (полукультуральный метод). Использовали среды, приготовленные в НИИ гематологии и трансфузиологии МЗ РФ по методу V. Tchebotkevitch (1995).

д) Для культивирования Т. vaginalis использовали экспресс-систему С.А.Т.-тампон ООО "ТРАСТ-ЮВС" (Москва). Данная система предназначена для забора проб, их перевозки и культивирования. После культивирования из осадка в питательной среде готовили препарат на стекле и микроскопировали. 2. Методы оценки общего иммунологического статуса:

а) Подсчет количества лейкоцитов и лимфорцитов проводили унифицированным методом в счетной камере Горяева.

б) Субпопуляции Т-лимфоцитов иммунотипировали с помощью МАТ методом непрямой иммунофлюоресценции. Использовали диагностикум ТОО "Сорбент" (Москва). Спектр клеточных субпопуляций, исследованых с помощью МАТ включал Т-клетки (CD3), Т-хелперы (CD4), Т-цитотоксические (CD8) и NK-клетки, моноциты, гранулоциты (CD 16).

в) В-лимфоциты определяли методом прямой иммунофлюоресценции. Использовались люминесцирующая сыворотка против глобулинов человека в рабочем разведении.

г) Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов проводили методом радиальной иммунодиффузии (Mancini G. Et al, 1964).

3. Для оценки местного иммунитета определяли концентрацию slgA в секрете цервикального канала с помощью ИФА. Использовали моноклональные антитела (МАТ) против секреторного компонента и меченые пероксидазой МАТ против альфа-цепи.

4. Методы оценки факторов неспецифической резистентности:

а) Тест фагоцитарной активности нейтрофилов проводили с частицами латекса. Определяли фагоцитарное число в - % фагоцитирующих клеток на 100 клеток.

б) Функциональную активность нейтрофилов крови изучали с помощью теста восстановления красителя нитросинего тетразолия (НСТ).

в) Для оценки состояния антиоксидазной системы использовали следующие показатели: Т.Ф, ЛФ, ЦП, СОД плазмы. Для определения ЦП, ЛФ, СОД применяли ТИФА, разработанный на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Санкт-Петербургской Педиатрической Медицинской Академии (ПМА). Концентрацию ТФ в плазме сыворотки крови определяли по Mancini G. et al., (1964) с применением набора "Севак" (Прага). Использовали специфические антитрансферриновую, антицерулоплазминовую, антилактоферриновую и антисупероксиддисмутазную антисыворотки и стандартные препараты данных белков.

Статистические методы исследования

Математическое обеспечение решения задач исследования проводили с использованием пакета прикладных программ" Statistica for Windows", версия 5,0. Использовали определение числовых характеристик переменных - средней арифметической (М), средней ошибки выборки (тх), определяли также достоверность различия (р), проверяемую по t критерию Стьюдента в репрезентативных выборках с использованием модуля непараметрической

статистики (Киреев О.В., Кобзеев A.C. и соавт, 1997; Боровиков В.П.,1998; ГланцС., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Этиологическая структура ИППП обследованных женщин

Полученные нами данные позволили подтвердить важную роль хламидийной инфекции в урогенитальной патологии у женщин. Удельный вес геннтального хламидиоза в структуре заболеваемости ИППП составил 43,8%, причем в половине случаев - в составе микст-инфекций. В нашем исследовании он находится на втором месте по выявляемое™ среди ИППП после уреаплазмоза, который встречается у 54% больных (рис. 1).

%

У X т г м впг

Рис. 1. Доля некоторых возбудителей ИППП в общей структуре инфекций мочеполового тракта

Примечание: 1 - случаи выявления возбудителя в виде моноинфекции; 2 - случаи выявления возбудителя в составе микст-инфекций; X - хламидиоз; У - уреаплазмоз; Т - трихомониаз; ВПГ - инфекция, вызванная вирусом простого герпеса; Г - гарднереллез

В структуре смешанных инфекций с участием С. trachomatis наиболее частым вариантом сочетания является хламидийно-уреаплазменная инфекция 34,5%. Далее по мере убывания частоты встречаемости располагаются сочетания С. trachomatis, U. urealyticum, М. hominis (13,8%), С. trachomatis, Т.

vaginalis (17,2%) и С. trachomatis, HSV (10,3%), а также прочие варианты сочетаний, суммарно составляющие 24,1%.

Клинико-иммунологическая характеристика инфекционного процесса

при хламидиозе

При изучении структуры клинических синдромов при хламидиозе выяснилось, что наиболее частым синдромом поражения генитальной сферы при хламидиозе является цервицит, встречающийся у 84% лиц с клиническими признаками заболевания, что согласуется с данными о трогшости хламидий к цилиндрическому эпителию (рис.2).

90 80 70 60

□ 1 5°

Е32 40 30 20 10 0

-1 21

Рис.2 Частота выявления клинических синдромов при хламидиозе

Примечание: I - всего случаев выявления синдрома; 2 - в том числе в составе комлексов синдромов; Ц - цервицит; К - кольпит; У - уретрит; С - сальпингоофорит; Э - эктопия

На втором месте находится кольпит (73%), за ним по частоте встречаемости в порядке убывания следуют уретрит (69%), сальпингоофорит (27%), эрозия шейки матки (25%) и прочие варианты синдромов. Но, большая часть синдромов встречается в составе их комплексов

У лиц с клиничекими признаками заболевания при хламидиозе наиболее часто (в 25% случаев) встречаются комплекс синдромов кольпита и цервицита при одновременном поражении шейки матки. Обращает на себя внимание

частое сочетание аднексита и сальпингита (28%). Одновременная вовлеченность в процесс этих структур вполне объяснима их анатомической близостью и патогенетической общностью процесса.

Комбинации поражений многообразны, но при хламидийной моноинфекции преобладают симптомы поражения нижних отделов генитального тракта. При микст-инфекциях растет число тотального поражения генитальной сферы. Присоединение синдромов поражения мочевыделительной системы свойственно хламидийно-уреаплазменной инфекции. При монохламидиозе вовлечение мочевыделительного тракта в воспалительный процесс наблюдается лишь в 22% случаев, а при хламидийно-уреаплазменой инфекции в 64% случаев. Эти данные подтверждают известное мнение о том, что U. urealyticum является важным патогеном, вызывающим поражение мочеполовой сферы и у мужчин и у женщин (Прозоровский C.B. и др., 1995; Раковская И.В., Вульфович Ю.В., 1995; Салехов С.А. и соавт, 1997), хотя несомненно имеют значение биовар возбудителя и массивность колонизации им, как указывает Загребина О.С. (2001).

Данные серологических исследований помимо подтверждения этиологической роли хламидий в патогенезе конкретного заболевания позволили также оценить форму инфекционного процесса. При одновременном определении специфических антихламидийных IgG и IgA были получены несколько вариантов ответов, которые соответствовали острой, подострой, хронической хламидийной инфекции в стадии обострения и вне обострения. Признаками латентной инфекции считали отсутствие клинических проявлений, и серопозитивного результата при определении антигена или ДНК возбудителя хламидийной инфекции в очаге.

Оценивали зависимость индекса позитивности от уровня поражения генитального тракта и от наличия фактора микст - инфекций. За индекс позитивности принимали соотношение критической оптической плотности и оптической плотности исследуемой сыворотки.

Динамика концентрации специфических антихламидийных IgG и IgA при исследовании парных сывороток свидетельствует о более выраженной

остроте инфекционного процесса при синдромах поражения только нижнего генитального тракта. Выявлены достоверные различия индексов позитивности ^А при поражении только нижнего уровня генитального тракта (3,36+0,96) и при вовлечении верхнего уровня (1,65±0,16) (р<0,05). Нарастание уровня в в парных сыворотках также более выражено при поражении нижнего генитального тракта (табл.1).

Таблица 1

Зависимость индекса позитивности от уровня поражения генитального тракта

Показатель период Индексы позитивности, (М±тх) Р<0,05

Верхний уровень N=33 Нижний уровень N=19

1 2

ДО 1 3,10+0,40 3,91+0,47

2 3,49+0,81 4,63+0,77

3 3,82±1,11 3,67+0,28

1&А 1 1,65+0,16 3,36±0,96 1<2

2 1,55+0,21 3,15+0,51 1<2

3 2,614±1,16 3,27±1,24

Примечание: ¡период - первичное исследование при обращении; 2 период - повторное исследование до начала терапии; 3 период - проведение контроля излеченное™.

Так как ведущую роль при хронических воспалительных заболеваниях играют иммунопатологические реакции (Коэн С., Уорд ПЛ., Мак-Класки, 1983; Семенов В.Ф., Гаврилов В.И., 1976), вероятно с ними в большей степени, чем с наличием инфекционного агента связан воспалительный процесс в верхних отделах генитального тракта.

При монохламидиозе выявлено более выраженное нарастание титра антител классов и ^А в парных сыворотках, чем при микст-инфекциях и его динамика, свидетельствующая о более высоком уровне эффективности терапии при монохламидиозе (рис. 3). В частности, индекс позитивности ^С при моноинфекционном процессе увеличивается от 3,67+0,48 до 4,45+0,82, а при микст-инфекциях остается практически без изменений. В процессе лечения при монохламидиозе происходит снижение индекса позитивности 1§А (от

2,26+0,38 до 1,83+0,35), а при микст-инфекции с участием хламидий происходит напротив его наростание от 2,61 ±0,75 до 4,06±0,78 (р>0,05).

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 О

4,45 4,46

Ж 4,06

1 7R Л 7Я III

3,Б 3,52 11

'В! ш

I® 2,54 2,61 2,2 Щ

■ м Я 2.0£| 1,83

яр i ■ ■ fa

К.жл ЙЙ - и

А - "ft5«? ' .ll

if

lgG1 lgG2 lgG3 lgA1 tgA2 lgA3

Рис. 3 Динамика индексов позитивности в процессе терапии при монохламидиозе и микст-инфекции с участием хламидий.

Примечание: 1 - индексы позитивности при монохламидиозе; 2 - индексы позитивности при микст-инфекции; IgGl(IgAl) и IgG2(IgA2) - индексы позитивности IgG (IgA) в парных сыворотках до начала лечения, IgG3(IgA3) - индексы позитивности после лечения.

Вероятно, менее активный воспалительный процесс при микст-инфекциях и низкая эффективность терапии этой группы заболеваний может быть связана со снижением иммуногенности возбудителей, а также со снижением силы иммунного ответа и изменением его клонирования (Петров Р.В., 1982; Коэн С. и др., 1983).

Большинство изучаемых показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных с хламидиозом находилось в пределах нормы. В то же время, сравнительный анализ состояния системного иммунного ответа практически здоровых лиц контрольной группы и лиц, страдающих хламидиозом, выявил некоторые тенденции, сходные с описанными ранее другими авторами (Соловьев A.M., 1996; Левчик JI.K., 1999).

Процентное содержание лимфоцитов при хламидийной инфекции (35,3±1,65%) достоверно ниже, чем в контрольной группе (47±3,9%) (р<0,05). Снижение содержания лимфоцитов при хламидиозе происходит за счет

□ 1

фракции Т-лимфоцитов, о чем говорят выявленные достоверные различия в абсолютном содержании CD3 (1351±73,5 кл/мкл при хламидиозе против 1855,3+218 кл/мкл в контроле) и CD4 (960 ±54,1кл/мкл при хламидийной инфекции против 1314±161кл/мкл в контрольной группе) (р<0,05). Проведение комплексного анализа иммунограмм в зависимости от формы инфекционного процесса показало, что угнетение иммунных реакций более свойственно хронической хламидийной инфекции вне- и в стадии обострения. При латентной форме большинство показателей оказались наиболее близкими к физиологической норме. Но, хламидии не являются нормальной микрофлорой мочеполовых путей (Schachter J., 1978). Следует согласиться с мнением авторов, считающих, что при этой форме инфекции раздражение иммунокомпетентных клеток минимально (Ward М.Е., 1995).

Таблица 2

Сравнительные данные состояния клеточного и гуморального иммунитета в зависимости от наличия фактора микст-инфекций

показатель ■ Параметры иммунитета,(М±тх) P<0,05

N=10 N=30 N=29 N=10 N=14

1 2 3 4 5

Лейкоциты 10У/л 5565±255,6 6156±352 5742+440 4983+545 6363+624 2>4

Лимфоциты % 47±3,96 33,4±2,14 37,4+2,54 39,6+4,38 35,6+3,01 1>2,3,5

лимфоциты 2602+230,8 1196±139 2018+116 1865+138 2142+174 1>2,4

CD3 % 69,7±3,54 66,3±1,2 66,7+1,43 66,5+2,26 66,8+1,9

CD3 1855+218,8 1341±109 1363+982 1256+123 1450+147 1>2,4

CD4 % 49,2±2,83 49,3±1,2 44,5+1,4 44,7+2,25 44+1,86

CD4 1315±161,2 998+80,6 916+71 843+82,4 975+110 1>3,4

CD8 % 18,8+1,4 18,0±0,96 22,7+1,21 22,4+2,43 23,0+1,1 1< 5

CD8 506,4±72,6 368±35 468+39,7 437+73,4 493+42,4

В-лимфоциты % 14,6±2,1 16,4+1,08 16,7+1,18 17,3+2,11 16,2+1,38

В-лимфоциты 361,8±52,7 315,6±242 327+21,9 307,7+24 343,6+35

CD 16 % 13,4±1,69 12,8±0,85 20,4+5,65 15,7+0,92 24,2+10,3

CD 16 341,2±52,2 256±23,7 305+22,7 300+31,9 306+33,6

CD4/CD8 2,73±0,25 2,9±0,08 2,06+0,14 2,18+0,27 1,96+0,12 5<1, 2

IgA 1,9±0,3 1,96±0,21 2,07+0,24 2,05+0,41 2,09+0,31

IgM 1,73±0,35 1,86±0,15 1,77+0,17 1,47+0,22 2,01+0,22 4<5

IgG 16,2+1,16 15,7+1,13 15+1,09 13,7+1,57 16,1+1,49

Примечание: 1- практически здоровые лица контрольной группы; 2 - больные с монохламидиозом; 3 - все случаи микст-инфекций с участием хламидий; 4 - случаи хламидийно-уреаплазменной инфекции; 5 - микст-инфекции за исключением хламидийно-уреаплазменной.

Учет наличия фактора смешанных инфекций выявил признаки наименее активного воспалительного процесса при хламидийно-уреаплазменной инфекции (табл.2).

Выявлены статистически достоверные различия (р<0,05) при сравнении числа лейкоцитов при хламидийно-уреаплазменной инфекции (4983±545 х 107л) и монохламидиозе (6156+352 х109/л). Относительное количество лимфоцитов при хламидийно-уреаплазменной инфекции достоверно выше (39,6±4,38%) чем при моноинфекции (33,4+2,14%), вероятно за счет В-лимфоцитов, содержание которых равно 17,3% против 16,4% у больных с монохламидиозом. Абсолютное содержание СЭ4 равно 843±82,4 кл/мкл против 998+80,6 кл/мкл при монохламидиозе (р<0,05).

При микст-инфекциях имеется тенденция к повышению СГЭ8 и СО 16. Иммуно-регуляторный индекс колеблется при этом между 1,96±0,12 и 2,18+0,27. При монохламидиозе он равен 2,9. Вероятно, это говорит о наибольшей активности супрессорных функций иммунитета при микст-инфекциях.

Состояние местного иммунитета при хламидиозе

С целью изучения роли бТцА в местной защите при урогенитальном хламидиозе у женщин, нами предварительно была проведена стандартизация метода определения концентрации э^А в секрете цервикального канала с помощью твердофазного ИФА. В результате проведения данного исследования в группе здоровых женщин, были получены результаты, используюемые нами в дальнейшем как показатели нормы.

При сравнении содержания б^А в цервикальном секрете при различных ИППП без учета фазы менструального цикла достоверных различий выявлено не было. Это объясняется нестабильностью данного биологического субстрата у женщин. Учет функционального состояния организма выявил достоверные различия между показателями sIgA у здоровых женщин и женщин с выявленной хламидийной инфекцией (табл.3). Концентрация б^А в пробе полученной в первую фазу менструального цикла при хламидийной инфекции

оказалась достоверно ниже (196±14,9 мкг/мл), чем в группе здоровых женщин (499+46 мкг/мл), а также при прочих ИППП (387±7,2мкг/мл)(р<0,05).

Таблица 3

Концентрация slgA с учетом фазы менструального цикла

Фаза цикла период Содержание slgA в мкг/мл, (М+тх) Р< 0,05

здоровые N=10 Больные хламидиозом, N=59 Больные прочими Ш11111, N=39

1 2 3

I До лечения 499+46 196±14,9 387±7,2 2< 1,3

После лечения 224+11,9 234±26,9

II До лечения 353±120 192±9,7 289+78

После лечения 210+11,4 234±26,9

При исследовании цервикального секрета в экссудативную фазу достоверных различий между указаными группами выявлено не было. В связи с этим более целесообразно забор материала проводить в первую фазу менструального цикла.

При сравнении содержания slgA в первую фазу менструального цикла при некоторых вариантах микст-инфекций с участием хламидий выявлена наиболее низкая концентрация IgA при сочетании хламидийной инфекции и инфекции, вызванной ВПГ (123±27,7 мкг/мл). Достоверно выше в сравнении с данным вариантом сочетания концентрация IgA при монохламидиозе (202±16,9 мкг/мл), а также при хламидийно-уреаплазменной инфекции (218±44 мкг/мл) и хламидийно-трихомонадной (180+21,2 мкг/мл) (Р<0,05).

Эти данные позволяют сделать вывод о том, что при хламидийной инфекции, в том числе в составе сложного паразитоценоза, иммунобиологичекая реактивность цервикального секрета страдает более выраженно, чем при других инфекциях урогенитального тракта.

Известно, что одним из основных моментов в жизненном цикле хламидий является процесс адгезии на мембране клетки-хозяина (Stamm W.E., Holmes

К.К., 1984). Основная роль slgA заключается в предотвращении этого процесса. Поэтому низкая концентрация slgA при хламидиозе может объясняться тем, что slgA, препятствуя адгезии хламидий к клеткам эпителия, со временем расходуется. Это приводит к беспрепятственному внедрению возбудителя в клетку и может способствовать развитию восходящей инфекции. Подтверждением этому служит сииженние содержания slgA при отсутствии возбудителя во входных воротах инфекции, но его наличии в вышележащих органах, подтверждаемое результатами серологических исследований.

Эти данные согласуются с мнением о том, что местный иммунитет может нейтрализовать инфекционную активность С.trachomatis, поскольку уровень секреторных IgA в цервикальной слизи обратно пропорционален количеству хламидийных телец в половых путях (Коэн Р.К., Брунем Р.К., 1999).

При сравнительном анализе динамики показателей секреторного иммунитета при эффективном и неэффективном лечении (табл. 4) выяснилось, что содержание slgA в секрете цервикального канала при эффективной терапии достоверно повышается от 174+14,6 до 234+15,2 (р<0,05). При неэффективной терапии содержание slgA продолжает снижаться (р>0,05).

Таблица 4

Динамика показателей зТ^А в первую фазу менструального цикла при эффективном и неэффективном лечении хламидиоза

показатель период Содержание si gA в мкг/мл, (М+тх)

При эффективном лечении, N=34 При неэффективном лечении, N=11

1 2

IgA 1 174±14,6 244±61,4

2 234±15,2 196+32,4

Р<0,05 1<2

Примечание: период 1 - до лечения; период 2- после лечения

Следовательно, содержание sIgA в секрете цевикального канала может быть использовано в качестве дополнительного критерия оценки эффективности терапии. Однако, следует обратить внимание на то, что

восстановление уровня slgA идет медленно по причине иммуносупрессивного действия антибактериальной терапии и показатели slgA длительно остаются даже при условии эффективной терапии на низком уровней.

В ходе исследования не выявлено корреляционной зависимости между содержанием slgA в цервикальном секрете и сывороточным неспецифическим IgA (гху=0,06, р<0,05) у больных хламидиозом женщин. С другими показателями общего иммунного ответа коррелляционной связи slgA также не было обнаружено. Это говорит о преимущественно локальном образовании slgA и самостоятельном его значении в иммуологической защите. Однако обнаружена положительная корелляционная связь между slgA цервикального секрета и специфическим антихламидийным сывороточным IgA (гху=0,72; р<0,05). Это объясняется тем, что наиболее высокие показатели специфического иммунного ответа свойственны в большей степени острой фазе инфекционного процесса, при которой наблюдается менее существенное снижение slgA.

Таким образом, уровень slgA в секрете цервикального канала отражает напряженность местных факторов иммунной защиты, характеризует течение инфекционного процесса и может использоваться в качестве дополнительного критерия оценки эффективности терапии.

Непрямой иммунопероксидазный метод в диагностике хлампдийной инфекции

В связи с отсутствием в доступной нам литературе данных по использованию непрямого иммунопероксидазного метода в диагностике хламидиоза нами разработаны методические подходы, учитывьпощие особенности данной инфекционной патологии.

Не всегда при поражении верхнего этажа генитального тракта молено выявить возбудителя во входных воротах инфекции. По некоторым данным местом персистенции хламидий является не постоянно обновляющийся эпителиальный слой слизистой, а субэпителиальные ткани (Глазкова Л.К., Акилов O.E., 1999). Поэтому для изучения диагностических возможностей

НИПМ исследовали мазки-соскобы от 36 женщин с выявленной хламидийной инфекцией, подтвержденной с помощью других методов этиологической диагностики при использовании аналогичного материала, т.е. мазка-соскоба из цервикального канала.

В результате исследовния во всех случаях в изучаемых препаратах была обнаружена специфическая экспрессия антигена хламидий.

На препаратах, полученных в острый период хламидийной инфекции, экспрессия антигена отмечалась в 10-20 клетках из 100, где визуализируемый антиген занимал более 1/3 цитоплазмы пораженных клеток. В случаях подострой инфекции и обострении хронической степень экспрессии антигена оказалась сравнимой по интенсивности и выявлялась ориентировочно в 10-15 из 100 клеток, причем антиген занимал от 1/3 цитоплазмы до нескольких единичных гранул не менее 5. При хронической инфекции вне обострения и при латентной инфекции экспрессия антигена наблюдалась в 5-7 клетках из 100, где выявлялось менее 5 визуализируемых гранул.

На основании этого нами предложено при практическом использовании данного метода для этиологической диагностики хламидийной инфекции оценивать патоморфологические изменения в мазках со слизистой цервикального канала по прямым и косвенным признакам. Прямым признаком является экспрессия хламидийного антигена. Степень экспрессии оценивается, как массивная при визуализации антигена, занимающего более 1/3 цитоплазмы в 10-20 пораженных клетках из 100. Если гранулы антигена занимают от 1/3 цитоплазмы до нескольких гранул не менее 5 гранул и выявляются в 10-15 клетках из 100, степень экспрессии может быть оценена как умеренная. Слабовыраженная экспрессия хламидийного антигена - при выявлении единичных гранул антигена (< 5) в 5-7 из 100 клеток. Косвенными признаками следует считать наличие воспалительной реакции, дистрофические и некробиотические изменения, а также наличие сопутствующей микрофлоры. Таким образом, оценка уровня экспрессии антигена поможет диагностировать форму инфекционного процесса при хламидиозе, как ранее предполагалось другими авторами (Хмельницкий O.K., Белянин B.JL, 1996).

Состояние фагоцитарного звена иммунитета и АОС при хламидиозе в дннампке

Хламидии, как и другие возбудители инфекционных заболеваний мочеполовой сферы не оставляют безучастными различные звенья неспецифической резистентности, в частности, изучаемую нами фагоцитарную функцию и АОС.

Общая фагоцитарная активность при хламидийпой инфекции достоверно ниже (56,3±2,55% против 76,7+2,44% в контроле) (р<0,01), что согласуется с мнением других авторов, указывающих на угнетение активности фагоцитарной функции при хламидиозе (Левчик Н.К., 1999) Показатели НСТ теста говорят о низкой напряженности процессов окислительного метаболизма при хламидиозе и о сохранении способности гранулоцитов к его активации (р>0,05) (табл.5).

Таблица 5

Состояние функциональной активности фагоцитарного звена и АОС при хламидийпой инфекции

показатели Параметры, (М+т„) Р< 0,05

Здоровые, N=10 Больные хламидиозом, N=59

1 2

Фагоцитоз с латексом % 76.7+2,44 56,3±2,55 1>2

Фагоцитоз с латексом кл/мкл 2035,6+176,3 2140+187

НСТ-тест % 14,7±2,01 16,6+1,48

СЦК 0,22+0,05 0,23±0,03 |

НСТ-тест стим. зимозаном % 72+1,85 68,8±2,5

СЦК 1,5+0,04 1,2310,056 1>2

ТФ, г/л 2,344+0,048 1,53210,043 1>2

ЛФ, мкг/мл. 0,405+0,032 0,43910,003

ЦП, г/л 0,398±0,015 0,51910,07 1<2

СОД плазмы, нг/мл 49,610,06 52,1210,16 1<2

Закономерно снижено содержание ТФ, как "отрицательного острофазного реактанта". Его концентрация у лиц страдающих хламидиозом оказалась достоверно ниже (1,532±0,043 г/л), чем в контрольной группе практически здоровых лиц (2,344±0,048 г/л) (р<0,05). Достоверно выше при хламидийпой

инфекции содержание СОД плазмы (52,12+0,16 нг/мл против 49,6+0,06 нг/мл в контроле) и ЦП (0,519± 0,07 г/л в отличие от 0,398+0,015 г/л в контрольной группе) (р<0,05). Умеренное повышение содержания плазменной СОД, которая является ключевым ферментом неспецифической АОС говорит о глубоком оксидативном стрессе, вызванном не столько активностью инфекционного процесса, сколько его длительным течением. В содержании ЛФ достоверных различий выявлено не было. Последнее объясняется склонностью хламидийной инфекции к хроническому течению.

Учет формы инфекции выявил наиболее глубокие изменения состояния АОС при хроническом процессе. Имеются признаки декомпенсации специфической ферментативной антиоксидантной системы. Кроме того, в процессе терапии этой формы инфекции динамика показателей говорит о ее низкой эффективности. В частности, общий фагоцитарный индекс снижается от 62,4±4,28% до 61,6+2,48%, HCT- тест, стимулированный зимозаном достоверно снижается от 73,2±3,73% до 63,8±2,14% (Р<0,05). Одновременно со снижением ТФ от 1,421+0,056 г/л до 1,342±0,06 г/л продолжает увеличиваться в процессе лечения ЦП от 0,520+0,018 г/л до 0,547+0,012 г/л.

Беременность в некоторой степени усугубляет недостаточность функции АОС, о чем говорит наиболее низкий уровень ТФ у беременных при хламидиозе (1,371±0,045г/л) в сравнении с контрольной группой (2,344+0,048 г/л). Это объясняется тем, что при беременности наиболее ярко проявляется конкуренция за связывание железа между ТФ, ЛФ, гемоглобином и микроорганизмами. Кроме того, при токсикозах беремености и гестозах и при инфицировании организма отмечается низкий уровень ТФ, что имеет место в группе беременных женщин с хламидийной инфекцией.

Не выявлено существенного влияния фактора микст-инфекции на изучаемые показатели. Исключение составляет группа больных с сочетанной хламидийно-уреаплазменой инфекцией. Наиболее низкое число фагоцитов при данном варианте сочетания (1887+354 кл/мкл) при наиболее высоком его процентном содержании (63,44±5,65%) относительно других групп говорит о

незавершенности фагоцитоза (р>0,05). Вероятно переклонирование иммунного ответа приводит к менее выраженным иммунным реакциям, незавершенности фагоцитоза, и, как следствие, слабой выраженности клинических проявлений.

Для изучения возможности использования исследуемых показателей в оценке эффективности терапии вышеуказанные параметры сравнивались в группах лиц с эффективной и с неэффективной терапией. В группе больных с эффективной терапией имеется положительная динамика средних величин острофазных белков и в большей степени это относится к ТФ, концентрация которого в плазме возрастает с 1, 469+ 0,031 г/л до 1,689+ 0,075 г/л (р<0,05). В процессе лечения при эффективной терапии закономерно снижается содержание ЦП с 0,526 до 0,49 (р<0,05). В отношении содержания плазменной СОД и ЛФ достоверных изменений в процессе лечения выявлено не было. Следовательно, при хламидийной инфекции наиболее значимыми показателями являются ТФ и ЦП, однако исследование всего комплекса металлопротеидов, включающего ТФ, ЦП, ЛФ и СОД плазмы позволяет наиболее полно характеризовать состояние неспецифической резистентности организма и давать оценку эффективности терапии.

Таким образом, наше исследование позволило подтвердить известные данные о том, что хламидийная инфекция является одним из наиболее распространенных заболеваний мочеполовой сферы у женщин. Получены данные, свидетельствующие об угнетении местного иммунитета при хламидийной инфекции. Показатели иммунного статуса в целом находятся в пределах нормальных колебаний, хотя имеются некоторые тенденции, свидетельствующие об угнетении Т-клеточного звена иммунитета. Выявленные изменения АОС говорят о ее вовлеченности в патогенез хламидийной инфекции и о необходимости коррекции данного звена неспецифической резистентности организма.

Использование непрямого иммунопероксидазного метода в комплексе методов этиологической диагностики хламидийной инфекции, а также в совокупности с клинико-анамнестическими данными позволит характеризовать вариант течения инфекции и определить тактику ведения больного.

ВЫВОДЫ

1. В структуре заболеваемости ИППП у женщин репродуктивного возраста хламидийная инфекция занимает второе место после уреаплазменной. В 49% случаев хламидиоз протекает в виде микст-инфекции, наиболее частым вариантом которой является хламидийно-уреаплазменная инфекция.

2. Существенных изменений в состоянии общего иммунного ответа при хламидиозе не выявлено, имеются лишь некоторые тенденции к снижению показателей Т-клеточного звена иммунитета. Наиболее выраженное снижение абсолютного содержания CD3, CD4 и CD8 при сохранении относительных показателей в пределах нормы наблюдается при хронической инфекции в стадии обострения.

3. Состояние местного иммунитета, и в частности содержание slgA в секрете цервикального канала имеют наибольшую диагностическую и прогностическую ценность. Выявлено достоверное снижение содержания slgA в секрете цервикального канала (196±14,9 мкг/мл) у женщин при хламидийной инфекции по сравнению с нормой (499±46 мкг/мл) и показана зависимость его концентрации от фазы менструального цикла (р<0,05).

4. При комплексном исследовании системы металлопротеидов при хламидиозе выявлено достоверно значимое снижение уровня трансферрина до 1,532±0,043 г/л наряду с повышением содержания церулоплазмина до 0,519+0,07 г/л (р<0,05) при незначительном увеличении концентрации СОД плазмы до 52,12+0,16 нг/мл (р>0,05) по отношению к норме. Данные показатели состояния антиоксидантной системы являются наиболее значимыми факторами неспецифической резистентности при хламидиозе.

5. При эффективной терапии хламидиоза наблюдается нормализация содержания трансферрина, церулоплазмина в сыворотке крови, а также slgA в секрете цервикального канала, что делает возможным использование данных показателей при оценке эффективности терапии.

6. Непрямой иммунопероксидазный метод является одним из наиболее информативных, достоверных и доступных методов этиологической диагностики хламидиоза. Он позволяет с высокой степенью специфичности выявить экспрессию хламидийного антигена в клетках эпителия и при количественной оценке уровня экспрессии характеризовать клиническую форму инфекции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение содержания б^А в секрете цервикального канала по нашей методике может быть использовано как тест оценки состояния местного иммунитета при И111111. Эти данные при исследовании в динамике даюг дополнительную оценку эффективности проводимой терапии и имеют прогностическую значимость.

2. При изучении состояния неспецифической резистентности организма при хламидиозе целесообразно использование комплекса металлопротеидов (ТФ, ЦП, ЛФ и СОД плазмы). Исследование данных показателей позволяет характеризовать течение хламидийной инфекции, а также контролировать степень эффективности терапии.

3. В качестве метода этиологической диагностики хламидиоза рекомендуется использовать непрямой иммунопероксидазный метод. Количественная оценка уровня экспрессии хламидийного антигена в совокупности с клинико-иммунологическими данными позволит уточнить клиническую форму инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Архипов Г.С., Могилевец Т.Л. Причины и последствия поздней выявляемости хламидийной инфекции // Клиническая медицина. Межвузовский сборник стран СНГ. Т. 4. - Великий Новгород - Алматы, 1999.-е. 167-169.

2. Архипова Е.И., Могилевец Т.Л., Москвин И.И. Половое воспитание студентов // Русский журнал. "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы". Т. 2. -№2. - СПб, 1998. -с. 62-63.

3. Уваров Ю.М., Громова А.Л., Могилевец Т.Л. Состояние иммунного статуса у больных с острыми воспалительными заболеваниями органов малого таза // Материалы международной конференции. "Проблемы иммунологии инфекционных болезней". - 1999. - 36 с,

4. Могилевец Т.Л., Степанова И.В. Состояние местного секреторного иммунитета при хламидийной инфекции // Материалы Всероссийской конференции Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. - СПб, 2000. - с. 186-187.

5. Стрибук В.А., Могилевец Т.Л. К вопросу о заболеваниях передающихся половым путем // Клиническая медицина. Т. 6. Межвузовский сборник стран СНГ. Великий Новгород - Алматы , 2000. - с. 216-217.

6. Могилевец Т.Л, Архипов Г.С. Роль смешанных инфекций в патологии урогенитального тракта. // Клиническая медицина. Т. 6. Межвузовский сборник стран СНГ. Великий Новгород - Алматы , 2000. - с. 221-222.

7. Могилевец Т.Л., Чеботкевич В.Н. Состояние местного секреторного иммунитета при воспалительных заболеваниях мочеполового тракта у женщин // Клиническая медицина. Т. 6. Межвузовский сборник стран СНГ. Великий Новгород - Алматы , 2000. - с. 223-224.

8. Могилевец Т.Л., Шигина Ю.В. Частота встречаемости заболеваний передающихся половым путем (ЗППП) среди лиц молодого возраста // Клиническая медицина. Т. 6. Межвузовский сборник стран СНГ. Великий Новгород - Алматы , 2000. - с. 225-226.

9. Архипов Г.С., Могилевец Т.Л., Пуговкин А.И., Шигина Ю. В. Клинико-иммунологическая характеристика хламидиоза в структуре микст-инфекций генитального тракта // Материалы международной конференции. Русский журнал. "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы". Т. 4. - № 1. - 2000. - 38 с.

10. Архипова Е.А., Архипов Г.С., Загребнева С.Н., Москвин И.И., Пьяных А.И., Чуприй Н.Ю., Могилевец Т.Л. Эпидемиологические и иммунологические аспекты заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем в г. Новгороде // Материалы международной конференции. Русский журнал. "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы". Т. 4. -№ 1. -2000.-е. 120-121.

11 .Архипов Г.С., Могилевец Т.Л. Урогенитальный хламидиоз // Современное состояние вопроса. Медицинский академический журнал. Т. 1. -№ 1. - 2001. - с. 74- 87.

12.Могилевец Т.Л. Иммуногистохимический анализ в диагностике инфекций передающихся половым путем (ИППП) // Актуальные проблемы современной медицины. Великий Новгород, 2001. - с. 64-66.

13.Могилевец Т.Л., Азовцева О.В. Особенности течения хламидийной инфекции у беременных женщин // Актуальные проблемы современной медицины. Великий Новгород, 2001. - с. 62-64.