Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Некоторые аспекты патогенеза метаболических нарушений и возможности их коррекции при травматических повреждениях коленного сустава в эксперименте

На правах рукописи

ШУТОВА МАРИЯ ИВАНОВНА

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ ПРИ ТРАВМАТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ КОЛЕННОГО СУСТАВА

В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.03 — патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 3 ОК-Т 2014

005553805

Саранск - 2014

005553805

Работа выполнена на кафедре общей хирургии имени профессора Н.И. Атясова Медицинского института ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева»

Научный руководитель:

Козлов Сергей Александрович - доктор медицинских наук, профессор кафедры общей хирургии имени профессора Н.И. Атясова, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск

Официальные оппоненты:

Микуляк Надежда Ивановна - доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой физиологии человека ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет», г. Пенза

Пучиньян Даниил Миронович - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник группы физиологии и патофизиологии отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Саратов

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Нижний Новгород

Защита состоится «28» ноября 2014 г. в «14.00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.08 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68), с авторефератом - на официальном сайте Министерства образования и науки РФ.

Автореферат разослан« 2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В структуре распространенности травматических повреждений крупных суставов важное место занимают травмы коленного сустава, составляющие около 5% от числа всех повреждений опорно-двигательной системы и 50% среди всех внутрисуставных травматических нарушений (Вялков А.И., 2001; Андреева Т.М., 2006; Ударцев Е. Ю., 2012). В 9-11% случаев повреждения этой локализации приводят к стойкой утрате трудоспособности из-за развития посттравматического остеоартроза. Согласно современным литературным данным, у лиц трудоспособного возраста остеоартроз коленного сустава в 80% является постгравматическим (ТроценкоВ.И., 2003; Kramer W.C., 2011).

Известно, что травматическое повреждение компонентов сустава, сопровождающееся кровоизлиянием в его полость, в ранние сроки приводит к возникновению внутри- и внесуставных воспалительных изменений и, в первую очередь, к развитию синовита (Дубровин Г.М. и соавт., 2005; Нетяга С. В., 2005; Goldring М.В., 2011). Зачастую воспалительный процесс в травмированном суставе приобретает хронический характер, что ведет к вторичной альтерации гиалинового хряща и усиливает воспалительную реакцию в суставе, способствуя преобладанию катаболических процессов в хряще и приводя к дегенеративно-дистрофическим изменениям в тканях суставов (Митрофанов В.А., Пучиньян Д.М., Федотова М.В., 2010). Существенную роль в этом играет нарушение физиологического равновесия между факторами с провоспалительными (Ил-lß, ФНО-а) и противовоспалительными (Ил-4, Ил-10) эффектами со сдвигом в сторону первых, что вызывает деградацию коллагена и протеогликанов хряща (Цурко В. В., Королев А. А., 2003; Широкова Л.Ю., 2010; Алексенко Е.Ю., 2011).

Традиционно применяемые нестероидные противовоспалительные препараты далеко не всегда приводят к купированию воспаления в суставе и предотвращению деструкции хряща, кроме того, их использование ассоциируется с широким спектром побочных реакций, наиболее часто развивающихся со стороны желудочно-кишечного тракта (Балабанова P.M., 2002; Муравьев Ю.В., 2003; Воробьева О.В., 2011).

В настоящее время в дополнение к ранее изученным механизмам повреждения хряща важное место в патогенезе посттравматического остеоартроза отводится активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), продукты которого участвуют в формировании дегенеративно-дистрофических изменений всех компонентов сустава (Алексеева Л.И., Шарапова Е.П., 2012). При этом патогенетически обоснованный подход к профилактике постгравматического остеоартроза, предполагающий воздействие на механизмы липопероксидации, в настоящее время отсутствует. В этом отношении наше внимание привлек препарат мексидол из группы синтетических антиоксидантов, производных 3-оксипиридина, применяемый в настоящее время при терапии широкого круга патологических состояний, сопровождающихся активацией процессов свободнорадикального окисления (Беляев А.Н., 2005; Сипров A.B., 2007; Микуляк

Н.И., 2010). Более того, в доступной литературе нет исследований по применению данного препарата при посттравматических артрозо-артритах. Поэтому мы считаем перспективным изучение эффективности использования мексидола для профилактики дегенеративно-дистрофических изменений суставов после их травмы.

Цель исследования: изучить некоторые метаболические нарушения при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте и обосновать возможность их патогенетической коррекции.

Задачи исследования:

1. Изучить процессы перекисного окисления липидов в динамике экспериментального постгравматического артрита.

2. Исследовать в динамике некоторые показатели цитокинового профиля при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте.

3. Изучить нарушения некоторых показателей обмена коллагена и морфологические изменения тканей сустава при посттравматическом артрите в эксперименте.

4. Обосновать целесообразность антиоксидантной коррекции патофизиологических нарушений при экспериментальном посттравматическом артрите.

Положения, выносимые на защиту:

1. Травма коленного сустава сопровождается дисбалансом в соотношении процессов липопероксидации и антиоксидантной системы, что обосновывает применение препаратов, обладающих антиоксидантным эффектом, в комплексном лечении посттравматического артрита.

2. Дисбаланс в цитокиновом статусе играет важную роль в развитии деструктивно-дистрофических процессов в хрящевой ткани при посттравматическом артрите в эксперименте.

3. Определение количественного и фракционного состава оксипролина, являющегося специфическим маркером метаболизма коллагена, позволяет прогнозировать развитие посттравматических дегенеративно-дистрофических изменений в суставах.

4. Применение мексидола снижает вероятность развития дегенеративных изменений суставов после травм в эксперименте и является способом профилактики формирования посттравматических экспериментальных артрозов.

Научная новизна.

1. Установлено, что при посттравматическом артрите происходит активация свободнорадикального окисления липидов, способствующая деградации биополимеров соединительной ткани суставного хряща, что проявляется увеличением содержания не только свободного и пептидносвязанного оксипролина в плазме крови, но и массивным накоплением белковосвязанного оксипролина. Выявленный дисбаланс в активности синтеза и распада коллагена говорит о недостаточной эффективности процессов репарации суставного хряща на фоне продолжающейся деструкции с формированием его фиброза. Показано, что цитокиновый дисбаланс, развивающийся при посттравматическом артрите, обусловлен повышением уровня провоспалительных цитокинов, а рост концентрации противовоспалитель-

ных цитокинов в плазме имеет компенсаторный характер и направлен на уменьшение активности провоспалительных цитокинов с целью ограничения воспаления в поврежденном суставе.

2. Констатировано, что процессы свободнорадикального окисления и дисбаланс в цитокиновом профиле играют важную роль в патогенезе посттравматического артрита, способствуя усилению процессов деструкции и уменьшению репа-ративных возможностей хрящевой ткани коленного сустава.

3. Корреляционный анализ выявил обратную корреляционную зависимость между концентрацией провоспалительных цитокинов и активностью антиокси-дантных ферментов, содержанием продуктов перекисного окисления липидов и белковосвязанным оксипролином, прямую зависимость между концентрацией противовоспалительных цитокинов и белковосвязанным оксипролином при посттравматическом артрите.

4. Установлено, что антиоксидантная коррекция, в отличие от нестероидной противовоспалительной терапии, препятствует свободнорадикальной деградации биополимеров соединительной ткани коленного сустава на фоне уменьшения первичных и вторичных продуктов ПОЛ и повышения активности антиоксидант-ных ферментов. Патогенетически обосновано комбинированное применение нестероидной противовоспалительной и антиоксидантной терапии посттравматического артрита, позволяющее в ранние сроки купировать воспалительный процесс и предотвратить развитие дегенеративно-дистрофических процессов в тканях сустава.

Практическая значимость. В результате проведенных экспериментальных исследований разработан способ профилактики посттравматического остеоартроза, заключающийся в пятикратном внутрисуставном введении антиоксиданта мексидола в дозе 5 мг/кг.

Доказана целесообразность включения в комплексную терапию посттравматического артрита внутрисуставного введения мексидола, позволяющего уменьшить выраженность воспалительных изменений в суставе и степень вторичной альтерации тканевых структур, препятствуя развитию дегенеративно-дистрофических процессов в хрящевой ткани.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в научную деятельность ЦНИЛ Медицинского института ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева». Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами, клиническими ординаторами и интернами на кафедре общей хирургии имени профессора Н. И. Атясова ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева».

Апробация результатов исследования. Результаты исследования доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2008); Всероссийской конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009); итоговой научной конференции с международным участием «Татьянин день» и школы

молодых исследователей «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2010); научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в хирургии и интенсивной терапии» (Саранск, 2010); научно-практических конференциях молодых ученых и Огаревских чтениях МГУ им. Н.П. Огарева (Саранск, 2009-2013). Результаты работы прошли апробацию в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») (2009-2011 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых научных изданиях. Зарегистрировано одно рационализаторское предложение, получен патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста, содержит 13 таблиц, 25 рисунков и 1 схему. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 121 отечественный и 98 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены экспериментальные исследования, проведенные на 125 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180 — 200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария МГУ им. Н.П. Огарева. Протокол экспериментов был составлен в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (принятой Советом Европы в 1986 г.), с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики»; он соответствует требованиям Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (2000 г.), одобрен Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева».

Для решения поставленных задач животные были разделены на 5 серий. I серию составили интакгные животные (п=15). Во II контрольной (n=30), III (n=25), IV (п=27) и V (п=28) опытных сериях моделировали травму коленного сустава под ингаляционным наркозом механическим способом в модификации Г.М. Дубровина (удостоверение на рац. предо. № 1628 от 21.09.2004). Во II контрольной серии крысам внутрисуставно вводили 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия через день. Животные III серии, начиная со дня моделирования травмы, получали курс лечения нимесулидом, который вводили через зонд, в среднетерапевтической дозе 2 мг/кг массы тела ежедневно в течение 10 дней. В IV серии проводили внутрисуставное введение антиоксиданта мексидола в дозе 5 мг/кг массы тела крыс в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия через день. Курс лечения составлял 7 инъекций. Животных V серии подвергали комбинированному воздействию нимесулида в дозе 2 мг/кг массы тела (вводимого per os через зонд) и мексидола в дозе 5 мг/кг массы тела

(вводимого в пораженный сустав по указанной выше схеме). Исследования проводили на 3,15 и 28 сутки после травмы.

Методы исследования

1. Методы определения показателей перекисного определения липидов

и антиоксидантной системы

Оценку интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) проводили по накоплению в плазме крови первичных и вторичных продуктов липопероксидации - диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида при спонтанном (МДА) и железоиндуцированном окислении (Fe-МДА). МДА и Fe-МДА определяли методом С.Г. Конюховой (1989); ДК - модифицированным методом Плацера и соавт. (1976). Антиоксидантная система (АОС) оценивалась по активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) плазмы крови. Активность каталазы определяли по методу М.А. Королюк (1988), активность СОД - по методу Е.Е. Дубининой (1983).

2. Методы определения иммунного статуса

Цитокиновый профиль исследовали по уровню провоспалительных (Ил-lß, ФИО-а, Ил-6, Ил-17) и противовоспалительных (Ил-4, Ил-2, Ил-10) цитокинов в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа. Для регистрации результатов использовали иммуноферментный анализатор «Multiscan». Для определения цитокинов использовали набор реагентов Bender Medsystems (Австрия).

Оценку кислородзависимых механизмов бактерицидное™ и функциональных резервных возможностей лейкоцитов изучали при помощи теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). Средний цитохимический коэффициент (СЦК) рассчитывали по формуле СЦК=((0а) + (1-6) + (2-в) + (Зт)) / 100, где 0,1,2,3 - степень активности восстановления диформазана; а, б, в, г - количество клеток каждой степени активности соответственно (Петров Р.В. и соавт., 1981). Фагоцитарный показатель (ФП) определяли микроскопическим методом. При этом учитывали поглотительную способность нейтрофилов крови, определяя процент клеток, вступивших в фагоцитоз (процент активных нейтрофилов).

3. Методы определения обмена коллагена

Состояние обмена коллагена в плазме крови оценивали по содержанию свободного (СО), пептидносвязанного (ПСО) и белковосвязанного оксипролина (БСО) по методу П.Н. Шараева (1990). Для оценки скорости метаболического оборота коллагена использовали коэффициент ПСО/СО.

4. Морфологические исследования суставов

Гистологическим методом изучали морфологию суставного хряща и субхондрального слоя костной ткани. Материал фиксировали в 10%-ном растворе формалина, после декальцинации заливали в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

5. Методы статистической обработки

Полученные данные были обработаны методом вариационной статистики и корреляционного анализа по методу Пирсона с использованием персонального компьютера и общепринятых программ, включенных в электронные таблицы

Microsoft Excel пакета Microsoft Office (2003, 2007). Уровень значимости различий вычисляли с учетом критерия Стьюдента. Числовые данные выражали в работе как средняя арифметическая (М)±ошибка средней (ш). Данные считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

Корреляционный анализ проводили по методу Пирсона с использованием программы «Microsoft Excel 07» и таблицы минимальных значений коэффициентов корреляции (г) Пирсона. При ±0,7<К±1 отмечалась сильная, при ±0,3<К±0,69 - средняя, при ±0<К±0,29 - слабая прямая или обратная корреляционная связь.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Интенсивность процессов липопероксидации при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте. Проведенное на 3 сутки после травмы исследование выявило значительное повышение содержания продуктов ПОЛ в плазме крови экспериментальных животных, обусловленное травмой коленного сустава. Концентрация МДА и Fe-МДА в плазме возрастала в 2,2 и 2,25 раза соответственно. Наряду с этим происходило увеличение содержания диеновых конъюгатов в 2,44 раза по сравнению с исходными данными.

Деструкция суставного хряща и активация процессов липопероксидации приводили к снижению антиоксидантной защиты организма. Так, активность каталазы и СОД в плазме уменьшалась в 3,05 раза. К 28 суткам эксперимента дальнейшего роста продуктов ПОЛ в крови не происходило, но сохранялся высокий уровень МДА плазмы, превышающий показатели интактной серии на 101,17% (р<0,001). Оценка железоиндуцированного ПОЛ показала, что Fe-МДА был выше, чем у интактных животных, на 112,06% (р<0,001). Содержание первичных продуктов липопероксидации в виде диеновых конъюгатов несколько уменьшилось относительно данных интактной серии, но по-прежнему превышало исходные цифры на 118,75% (р<0,05).

В серии с пероральным применением нимесулида к концу эксперимента произошло некоторое снижение содержания продуктов ПОЛ, хотя их уровни были выше аналогичных значений интактной серии в 1,79 и 1,99 раза (р<0,001). Также сохранялся высокий уровень диеновых конъюгатов, превышавший норму в 1,94 раза (р<0,001). При оценке состояния антиоксидантной системы организма обнаружено, что активность каталазы в плазме была в 1,85 раза (р<0,001) ниже, чем показатель интактных животных (рис.1), а значение СОД было меньше, чем у животных интактной серии, в 2 раза (р<0,001). Однако при сравнении с соответствующими показателями контрольной серии на фоне нимесулида наблюдалась положительная динамика: уровень каталазы в плазме крови возрос на 22,0% (р3<0,05), а СОД - на 25,49% (р3<0,05).

На фоне внутрисуставного введения мексидола к концу эксперимента уровни ДК, МДА и Fe-МДА продолжали снижаться и составили 0,24±0,03 ед/мл, 7,36±0,31 мкмоль/л и 15,48±0,34 мкмоль/л соответственно, что на 31,4% (р3<0,001), 28,7% (р3<0,001) и 30,1% (р3<0,001) соответственно ниже относитель-

но данных серии контроля. Активность каталазы увеличилась на 52% (р3<0,001). рост супероксиддисмутазы составил 62,7% (р3<0,001) (рис. 1).

При сравнении данных второй и третьей опытных серий оказалось, что при внутрисуставном введении мексидола уже на 3 сутки происходило достоверное снижение содержания продуктов ПОЛ по отношению к данным контрольной серии (р3<0,05). К концу эксперимента уровни МДА и Ре-МДА в серии с применением мексидола оказались на 19,7% (р4<0,05) и 22% (р4<0,05) ниже, чем в серии с пероральным введением нимесулида. Достоверно установлено, что внутрисуставное введение мексидола в большей степени, чем зондовое пероральное применение нимесулида, активирует ферменты АОС, что подтверждают данные, полученные в ходе эксперимента (рост активности каталазы и СОД на 24,6% (р4<0,05) и 29,7% (р4<0,05)).

интгктные кон-рольная нимссуллд глсксидол нимесулид-» животные серия мск.ндо/

■ МДА ■ Ре-1УДА ДК ■ каталаъа СОД

Рис. 1. Значения показателей ПОЛ и АОС на 28-е сутки после моделирования посттравматического артрита у крыс

Примечание: "- достоверность показателя по отношению к данным интактных животных (р<0,001); * - достоверность показателя по отношению к данным контрольной серии (р3<0,05).

Динамика цитокинового профиля и фагоцитарного звена иммунитета при моделировании травматического повреждения коленного сустава в эксперименте. При экспериментальном травматическом повреждении коленного сустава выявлено нарушение баланса цитокинов про- и противовоспалительного ряда. Исследование уровня провоспалительных цитокинов в плазме крови животных показало их увеличение на протяжении всех сроков наблюдения. Так. на 3 сутки эксперимента отмечалось существенное повышение уровня провоспалительных цитокинов ФНО-а, Ил-1р, ИЛ-6 и Ил-17 в среднем в 3 раза (р<0,001) относительно показателей интактных животных, что, по-видимому, обусловлено активацией воспалительного процесса в поврежденном суставе (табл. 1). Наблюдалось также резкое увеличение уровней противовоспалительных цитокинов. Так, Ил-2 увеличился в 3,2 раза, Ил-4 - в 2,5 раза (р<0,001), Ил-10 - в 3 раза (р<0,001) относительно аналогичных показателей интактных животных.

что, вероятно, имеет компенсаторный характер и направлено на уменьшение активности провоспалительных цитокинов с целью ограничения воспаления в поврежденном суставе.

Несмотря на то, что в динамике постгравматического периода уровни Ил-1р и ФНО-а достоверно снижались, к концу эксперимента их содержание относительно данных интактной серии по-прежнему оставалось повышенным в 2,5 и 3 раза соответственно. Также сохранялся высокий уровень Ил-6 и Ил-17 относительно интактных значений - в 2,2 и 2,3 раза соответственно. Достоверных различий с данными 15-х суток эксперимента не наблюдалось (р2>0,05). Снижение концентрации противовоспалительных цитокинов оказалось более выраженным. Согласно полученным данным, уровень Ил-2 вырос на 12,5 % (рг<0,001) по сравнению с данными на 15-е сутки эксперимента. В то же время происходило достоверное снижение содержания Ил-4 и Ил-10 на 22,6% (р2<0,001) и 16,6% (р2<0,001) соответственно относительно данных 15 суток контроля (табл. !)•

Таким образом, ранний посттравматический период сопровождается ростом концентрации провоспалительных цитокинов, под действием которых хондро-циты начинают синтезировать протеолитические ферменты, вызывающие разрушение коллагена и протеогликанов хряща. При этом сохраняются регуляторные механизмы, ограничивающие воспалительную реакцию, путем усиленной продукции противовоспалительных цитокинов. К концу эксперимента наблюдается незначительное уменьшение концентраций провоспалительных цитокинов на фоне более выраженного снижения противовоспалительных маркеров воспаления, свидетельствуя о разбалансированности иммунного ответа цитокиновой системы, что способствует усилению процессов деструкции суставного хряща и переходу воспаления в хронический процесс.

К концу эксперимента нестероидная противовоспалительная терапия не приводила к полному купированию воспалительного процесса в поврежденном суставе, что подтверждали сохраняющиеся на высоком уровне значения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов по отношению к показателям интактных животных, хотя и произошло некоторое снижение их содержания. Так, концентрации ФНО-а и Ил-1р были соответственно в 2,7 и 2,5 раза (р!<0,001), а Ил-6 и Ил-17 в 2 раза (р!<0,001) выше, чем у интактных животных. Одновременно выявлено достоверное снижение уровней провоспалительных цитокинов: ФНО-а, Ил-10 и Ил-17 соответственно на 8,6% (р2<0,05), 13,6% (р2<0,05) и 8,9% (р2<0,05) по отношению к их концентрации на 15 сутки.

Противовоспалительные цитокины Ил-4 и Ил-10 изменялись недостоверно (рз>0,05). Содержание Ил-2 уменьшилось на 12,2% (р3<0,05) в сравнении с контрольной серией и на 35,7% (р<0,001) относительно данных 3-х суток в серии с применением НПВС. Таким образом, на фоне применения нимесулида сохранялся цитокиновый дисбаланс, не способствующий полному купированию воспалительного процесса.

На фоне внутрисуставного введения мексидола уровни ФНО-а и Ил-lß упали на 31,4% (р3<0,001) и 19,3% (р3<0,001) относительно показателей контрольной серии в эти же сроки, содержание Ил-6 и Ил-17 уменьшилось на 22,8% (р3<0,001) и 41,1% (р3<0,001). Также выявлено снижение концентраций противовоспалительных цитокинов - Ил-2 на 22,7% (р3<0,001) и Ил-10 на 22,4% (р3<0,001). Со стороны Ил-4 статистически значимых различий не выявлено (р3>0,05). Таким образом, при внутрисуставном применении мексидола происходило выравнивание темпов роста про- и противовоспалительных цитокинов, что способствовало восстановлению цитокинового баланса.

Таблица 1

Характеристика цитокинового профиля при различных методах лечения животных с экспериментальным посттравматическим артритом на 28 сутки наблюдения (М±т)

Показатель, пг/мл Интактные животные (11=15) Контрольная серия (п=30) нпвс (п=25) Мексидол (п=27) НПВС+ мексидол (п=28)

ФНО-а 48,69±0,73 148,49±1,12* 122,13±1,03*" 101,83±1,03*" 72,91±1,11*"

Ил-lß 35,61±1,04 87,76±1,23* 76,32±1,12*" 70,79±1,12*" 54,88±1,04*"

Ил-6 57,43±0,85 127,94±1,39* 102,53±1Д7*" 98,82±1,23*" 78,16±1,11*"

Ил-17 21,43±0,18 48,52±0,19* 39,56±0,21*" 28,56±0,15*" Z9,42±0,21*"

Ил-2 62,72±1,43 123,46±1,47* 101,29±1,19*" 95,44±1,31*" 81,86±1,26*"

Ил-4 6,59±0,49 15,49±0,43* 9,84±0,47*" 10,93±0,42*" 8,52±0,47*"

Ил-10 17,04±0,68 35,39±82* 32,02±0,87* 27,47±0,65*" 29,21±0,72*"

Примечание: * - достоверность показателя по отношению к данным интактных животных (р<0,001); " - достоверность показателя по отношению к данным контрольной серии (р3<0,05)

Комбинация мексидола, вводимого внутрь сустава, с перорально вводимым нимесулидом оказалась наиболее эффективной в отношении купирования воспалительной реакции. Комбинированное применение препаратов сопровождалось достоверным снижением уровня провоспалительных цитокинов в среднем на 50%.

Анализ динамики показателей функции фагоцитоза в ответ на травму сустава в эксперименте показал следующее. Начиная с третьих суток после моделирования травмы коленного сустава, отмечались высокие значения показателя фагоцитарной активности по сравнению с нормой. На 3 сутки величина показателя была максимальной, превышая данные интактных животных в 2,3 раза (р<0,001). К 15 суткам опыта наблюдалось снижение величины показателя до 53,16±0,63%, а к 28 дню - до 46,33±0,51%, что, однако, было в 1,6 раза выше исходного значения.

При изучении НСТ-теста выявлено, что на 3 сутки эксперимента отмечалось достоверное увеличение показателя в 2,7 раза - с 20,15±0,35% (норма) до 53,82±0,74% (р<0,001), что являлось максимальным значением. К 15 суткам

наблюдалось снижение функциональной активности нейтрофилов до 44,26±0,68%, оставаясь на этом уровне до конца эксперимента.

Средний цитохимический коэффициент на 3 сутки эксперимента с 0,18±0,06 вырос до 0,44±0,15 усл. ед. (в 2,4 раза). Но к концу эксперимента его уровень снизился на 47,7% относительно данных 3-х суток контроля.

Данные изменения фагоцитарного звена иммунного ответа могут свидетельствовать об уменьшении функционального резерва фагоцитов на фоне увеличения общего числа фагоцитирующих клеток, что свидетельствует о высокой напряженности метаболических и энергетических процессов клеточных элементов фагоцитарного звена.

На 3-й сутки в серии с применением НПВС активность фагоцитоза оставалась повышенной по отношению к данным контрольной серии в среднем в 3 раза и изменялась недостоверно по сравнению с данными 3-х суток контрольной серии. Показатели НСТ-теста и СЦК также оставались повышенными.

Фагоцитарная активность нейтрофилов после травмы суставов на фоне введения мексидола в меньшей степени подвергалась увеличению, чем в контрольной серии и в серии с применением нимесулида. Показатели НСТ-теста на 3 сутки эксперимента были ниже показателей серии контроля в эти же сроки в 2,6 раза. В дальнейшем, как и в контрольной серии, отмечалось плавное снижение этого показателя к концу срока наблюдения. Анализ результатов НСТ-теста показал, что введение мексидола сопровождалось оптимизацией метаболических процессов в нейтрофилах, увеличением их функционального резерва.

Таким образом, в ответ на травму сустава страдают иммунорегуляторные и фагоцитарные звенья иммунитета экспериментальных животных на протяжении всего срока наблюдения. Гиперпродукция провоспалительных цитокинов в очаге воспаления обеспечивает хемотаксис гранулоцитов и моноцитов в очаг, усиленную дегрануляцию фагоцитов с высвобождением медиаторов воспаления, лизосомальных ферментов, продукцию и секрецию реактивных кислородных радикалов, повышенную цитотоксичность фагоцитов.

Введение мексидола способствует угнетению синтеза провоспалительных цитокинов поврежденными хондроцитами и активированными лейкоцитами, мигрирующими в очаг воспаления из системного кровотока, предупреждает гиперактивацию макрофагально-фагоцитарного звеньев иммунитета после травмы, оказывая противовоспалительный и хондропротекторный эффект. В результате уменьшается выраженность воспалительных явлений в суставе, что предупреждает вторичную альтерацию тканей и развитие в последующем деструктивно-дистрофических изменений.

Динамика метаболизма коллагена при моделировании травматического повреждения коленного сустава в эксперименте. При развитии посправматического артрита на 3 сутки в сыворотке крови животных II серии отмечалось значительное увеличение содержания СО и ПСО соответственно в 2,3 и 2 раза (р<0,001) по сравнению с интактными животными. Достоверных изменений содержания БСО не происходило (р>0,05). Данные сдвиги свидетельствовали о снижении метаболизма коллагена и преобладании ката-

болических процессов в тканях сустава. Коэффициент ПСО/СО уменьшился до 0,46±0,02 усл. ед. (р<0,05), что свидетельствовало о снижении метаболизма коллагена и преобладании катаболических процессов в тканях сустава.

К 28 суткам происходило незначительное снижение содержания в крови лабораторных животных II серии СО на 9,6% (р1>0,05) по отношению к показателю 3 суток. Уровень ПСО и БСО к 28 суткам увеличился в 2,7 (р1<0,001) и 2,4 раза (рх<0,001) соответственно по сравнению с аналогичными показателями на 3 сутки, что связано, по-видимому, с продолжающейся избыточной пролиферацией соединительной ткани и развитием субхондрального склероза сустава (рис. 2). Коэффициент ПСО/СО повысился до 1,38±0,14 усл. ед. (р<0,05), что свидетельствовало об ускорении метаболического оборота коллагена на фоне продолжающейся деструкции.

Данные изменения свидетельствовали о высоком уровне неполноценного фибриллогенеза на фоне продолжающихся деструктивных процессов коллагеновых структур суставного хряща. Это, возможно, связано с тем, что после повреждения суставного хряща дифференцировка фибробластов несовершенна и приводит к синтезу неполноценного, не образующего фибрилл коллагена. Накопление таких коллагеновых волокон приводит к потере биомеханических свойств матрикса и изменению упругоэластических свойств хряща.

Вышеуказанные изменения подтверждались данными морфологических исследований тканей сустава. При микроскопическом исследовании выявлено, что экспериментально созданный дефект суставного хряща распространялся на всю его толщу. Дно дефекта заполнено тканевым детритом. Вне зоны повреждения обнаруживались признаки отека хряща в виде его утолщения и участков разволокнения поверхностной зоны. Зональная структура хряща сохранена. К 28 суткам произошли организация дефекта фиброзной тканью, усугубление дегенеративно-дистрофических изменений хрящевой ткани в виде явлений мукоидного и фибриноидного набухания (дезорганизации соединительной ткани) с последующим фиброзом, что приводит к развитию посттравматического деформирующего остеоартроза.

При пероральном введении нимесулида изменения фракций оксипролина свидетельствовали об уменьшении степени деструкции, однако показатели СО и ПСО, отражающие катаболические процессы основного белка соединительной ткани, превышали интактные значения в 1,7 (р<0,001) и 2,8 (р<0,001) раза. Важно, что отношение ПСО/СО к концу эксперимента оставалось повышенным, составив 0,91±0,04 усл. ед.

При гистологическом исследовании в серии с применением нимесулида наблюдалось заполнение области дефекта фиброзной тканью. В покровном хряще выявлялись дегенеративные изменения в виде очаговой узурации поверхностной зоны, наличия бесклеточных участков и уменьшения количества хондроцитов с дистрофией части из них. Зональное деление просматривалось не четко. В промежуточном и глубоком слоях имелось расслоение матрикса, появление скоплений хондроцитов, у большинства из которых были разрушенные ядра.

мкмэль/л 140 у

120 •

100 -

30

60 -

40 -

20

о -

■ СО ■ ПСО 5СО

Рис. 2. Содержание фракций оксииролина при посттравматическом артрите, 28 сутки эксперимента

Примечание: * - достоверность показателя по отношению к данным интактных животных (р<0,001)

Сравнивая данные, полученные при применении нимесулида и мексидола при внутрисуставном введении, как на 3-й, так и на 15-е сутки эксперимента достоверных отличий не обнаружено (р4>0,05). На 28 сутки наблюдения в серии с применением мексидола отмечалось более выраженное снижение фракций, отражающих деструкцию основного вещества соединительной ткани. СО и ПСО при введении мексидола соответственно на 20% (р4<0,05) и 37% (р4<0,001) были ниже, чем в серии с применением нимесулида. Отличительной особенностью явилось предотвращение повышения на 28 сутки уровня БСО при внутрисуставном использовании антиоксиданта, а при введении нимесулида происходил дальнейший рост данного показателя. Это свидетельствует о том, что применение НПВС в некоторой степени препятствует деградации биополимеров соединительной ткани сустава, однако не способствует ограничению избыточного фиброза тканей сустава.

Внутрисуставное введение мексидола в большей степени, чем нимесулид, оказало защитное действие на суставной хрящ - у животных на протяжении всего срока эксперимента не наблюдали распространения патологического процесса глубже поверхностного слоя, однако полной редукции дистрофических изменений к концу эксперимента не было отмечено. В участках, прилежащих к пограничной с дефектом зоне, происходила пролиферация клеточных элементов, выражающаяся в образовании изогенных групп хондроцитов и знаменующая собой процессы репарации. Средняя и глубокая зоны сохранены, определялось типичное лакунарное расположение хондроцитов.

Комбинированное применение нимесулида и мексидола показало наиболее выраженный эффект: к концу эксперимента отмечалось снижение СО и ПСО на 44,2% и 75% (р!<0,001) соответственно относительно контрольной серии. Наблюдалось дальнейшее снижение и концентрации БСО на 53,6% (р,<0,001) относительно контрольной серии (рис. 2).

У животных V серии к концу эксперимента произошло восстановление дефектной зоны грануляционной тканью с появлением в ней типичных хондроцитов. В хряще, окружающем дефект, цитоархитектоника была сохранена и появились признаки репарации. Хондроциты, лежащие в лакунах и образующие скопления, имели нормальную структуру и не отличались от хондроцитов нормального хряща.

Следовательно, комбинированное применение нимесулида и мексидола позволяет купировать посттравматическое асептическое воспаление в суставе и предотвратить развитие дегенеративно-дистрофических изменений.

Проведенный корреляционный анализ между продуктами перекисного окисления липидов, ферментами антиоксидантной защиты, цитокиновым профилем и фракциями оксипролина выявил тесную взаимосвязь между указанными показателями (табл. 2).

Таблица 2

Корреляционные взаимосвязи между изучаемыми показателями у лабораторных животных

Посттравматический период в динамике Изучаемые показатели

№НО-а и ката-лаза Ил-1Р и катал аза Ил-17 и ката-лаза Ил-2 и БСО Ил-4 и БСО Ил-17 и СО Ил-17 и БСО Ил-1р и БСО Ре-МДА и БСО

3 сутки -0,42 -0,55 -0,67 +0,65 +0,31 +0,37 +0,53 -0,78 -0,45

28 сутки -0,32 -0,38 -0,34 +0,73 +0,25 +0,49 +0,43 -0,65 +0,26

Учитывая результаты, полученные в ходе исследования, а также данные литературы, процесс развития деструктивно-дистрофических изменений в суставе после травмы, по нашему мнению, может быть обобщен в схеме, отраженной на рис.3.

Рис. 3. Схема патогенеза деструктивных изменений при посттравматическом артрите

выводы

1. При травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте значительное место в метаболических нарушениях принадлежит активации процессов перекисного окисления липидов в условиях снижения компенсаторных возможностей антиоксидантной системы.

2. Ранний посттравматический период сопровождается ростом концентрации цитокинов про - и противовоспалительного ряда. К концу эксперимента наблюдается недостаточная активность противовоспалительных цитокинов на фоне гиперэкспрессии провоспалительных, что способствует усилению процессов деструкции суставного хряща.

3. Посттравматический артрит в эксперименте приводит к нарушению обмена коллагена в виде увеличения содержания свободного и пептидносвязанного оксипролина и повышения белковосвязанного оксипролина. Подобное изменение метаболитов коллагена характеризует недостаточно эффективную репарацию на фоне продолжающейся деструкции и свидетельствует о формировании фиброза.

4. Нестероидная противовоспалительная терапия недостаточно эффективно корригирует выявленные нарушения при посттравматическом артрите и к 28 суткам после повреждения сохраняются изменения, свидетельствующие о высокой активности процессов ПОЛ, цитокиновом дисбалансе, нарушении обмена коллагена, что подтверждается морфологическими изменениями в тканях суставов.

5. Внутрисуставное введение мексидола и комбинированное его применение с пероральным введением нимесулида оказывают протективное действие на баланс ферментов антиоксидантной системы и продуктов перекисного окисления липидов, метаболический оборот коллагена, цитокиновый профиль, нарушенные при экспериментальном посттравматическом артрите у лабораторных животных, что сопровождается выраженной коррекцией исследуемых биохимических показателей в плазме крови и уменьшением дегенеративно-дистрофических изменений в тканях сустава.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕКОМЕНДАЦИЯ

Выявленное благоприятное действие мексидола на процессы липо-пероксидации, цитокиновый профиль и обмен коллагена, нарушенные при экспериментальном посттравматическом артрите, обосновывает целесообразность клинического исследования эффективности препарата у пациентов с посттравматическими артрозо-артритами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Суслов A.B. Изучение интенсивности процессов перекисного окисления липидов на фоне внутрисуставного введения мексидола при постгравматическом артрите в эксперименте / A.B. Суслов, С.И. Кузнецов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова) //Человек и его здоровье - 2008: материалы 81 конф. СНО СПбГМА им.

И.И. Мечникова. Санкг- Петербург: СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2008. - С. 269-270.

2. Кузнецов С.И. Цитологическое исследование синовии на фоне внутрисуставного введения мексидола при постгравматическом артрите в эксперименте / С.И. Кузнецов, A.B. Суслов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова) // Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации, приоритеты: сборник материалов II Всероссийской студ. науч. конф., Самара. - 2008. - С. 139-140.

3. Захватов А.Н. Антиоксидантная терапия посттравматического артрита в эксперименте / А.Н. Захватов, С.А. Козлов, А.Ю. Трифонов, С.И. Кузнецов, A.B. Суслов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова) // Актуальные вопросы современной хирургии: сборник материалов науч.-практ. конф. Красноярск,- 2008. - С.194-198.

4. Захватов А.Н. Антиоксидантная терапия в профилактике посттравматического остеоартроза (экспериментальное исследование) / А.Н. Захватов, С.А. Козлов, А.Ю. Трифонов, С.И. Кузнецов, A.B. Суслов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова) // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 1. - С. 340.

5. Кузнецов С.И. Влияние внутрисуставного введения мексидола и нестероидной противовоспалительной терапии на интенсивность процессов липопероксидации при постгравматическом артрите в эксперименте / С.И. Кузнецов, A.B. Суслов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова) // Вестник РГМУ. Периодический мед. журнал: Матер. III межд. Пироговской студенческой научной мед. конф. Москва: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. - 2008. - № 2 (61). - С. 121-122.

6. Пиянзина М.И. (Шутова М.И.) Влияние внутрисуставного введения мексидола на некоторые показатели обмена коллагена при постгравматическом артрите в эксперименте / М.И. Пиянзина (М.И. Шутова), С.И. Кузнецов, A.B. Суслов // Актуальные вопросы медицинской науки: сборник научных работ студентов и молодых ученых Всеросс. конф. с междун. участием, Ярославль. - 2009. - С. 244.

7. Захватов А.Н. Экспериментальное исследование эффективности антиокси-дантной терапии посттравматического артрита / А.Н. Захватов, С.А. Козлов, С.И. Кузнецов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова), A.B. Суслов // Актуальные проблемы медицинской науки и образования: сборник трудов II межрегиональной научной конференции. Пенза: ИИЦ ПГУ, 2009. - С. 86-87.

8. Захватов А.Н. Влияние внутрисуставного введения озона на процессы липопероксидации при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте / А.Н. Захватов, С.А. Козлов, A.M. Лещанов, С.И. Кузнецов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова), A.B. Суслов // Озон, активные формы кислорода и методы интенсивной терапии в медицине: материалы VIII Всеросс. науч.-практ. конф. с междун. участием. - Н. Новгород, Revista de Ozonoterapia, September, 2009.-Num. 1., Vol. 3. - C. 19-21. ,

9. Пиянзина М.И. (Шутова М.И.) Влияние внутрисуставной озонотерапии на обмен коллагена при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте / М.И. Пиянзина (М.И. Шутова), А.Н. Захватов, С.И. Кузнецов, И.Л. Анюшин // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал: Матер. IV межд. Пироговской студ. научной мед. конф.: Москва, ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. - 2010. - № 2. - С. 205-206.

10. Захватов А.Н. Морфологическая оценка эффективности внутрисуставной антиоксидантной терапии травматического повреждения коленного сустава в эксперименте / А.Н. Захватов, И.Н. Чаиркин, А.Н. Беляев, С.А. Козлов, М.И. Пиянзина (М.И. Шутова), С.И. Кузнецов // Морфологические ведомости. - 2010.-№ 2. - С. 50-52.

11. Шутова М.И. Эффективность внутрисуставного введения мексидола при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте / М.И. Шутова, С.А. Козлов, А.Н. Захватов // Актуальные проблемы совр. практ. здравоохранения: сб. тр. XVIII межрег. науч.-практ. конф. памяти академика H.H. Бурденко, Пенза, 2012. - С. 243-244.

12. Шутова М.И. Коррекция нарушений процессов липопероксидации и метаболизма коллагена нри посттравматическом артрите в эксперименте / М.И. Шутова, С.А. Козлов, А.Н. Захватов, С.И. Кузнецов // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №2. - URL: www.science-education.ru/102-5858

13. Шутова М.И. Экспериментальное обоснование эффективности антиоксидантной терапии посттравматического артрита / М.И. Шутова, С.А. Козлов, А.Н. Захватов, С.И. Кузнецов, И.Л. Анюшин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2013. - Т. 155, № 2. - С. 148-151.

14. Шутова М.И. Применение мексидола для коррекции обмена коллагена и морфологических внутрисуставных изменений нри травматических повреждениях коленного сустава в эксперименте / М.И. Шутова, С.А. Козлов, А.Н. Захватов // Вестник новых медицинских технологий (Электронный журнал). - 2013. - №1. - http://www.medtsu.tula.rU/VNMT/Bulletin/E 2013-l/00.html/2-112

Патент на изобретение

Патент № 2463000. Способ оценки интенсивности деструктивных процессов при травматическом повреждении коленного сустава и прогнозирования развития по-стгравматического артроза / Захватов А.Н., Беляев А.Н., Козлов С.А., Кузнецов С.И., Шутова М.И. Опубл. 10.10.2012. Бюл. №28. 7с.

Рационализаторское предложение

Пиянзина М.И. (Шутова М.И.), Захватов А.Н., Козлов С.А., Трифонов А.Ю., Суслов A.B. Способ диагностики дегенеративно-деструктивных изменений суставов при посттравматическом артрите в эксперименте. Рационализаторское предложение № 1065 выдано 23.06.08 г. ГОУ ВПО МГУ им. Н.П. Огарева.

Подписано в печать 26.09.14 г. Формат 60x84 1/18. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 2346

Отпечатано с оригинал-макета заказчика в ГУП РМ «Республиканская типография „Красный Октябрь"» 430030, Мордовия, г. Саранск, ул. Титова, 2а. E-mail: tko-saransk@mail.ru