Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологические, иммуногистохимические и спектральные характеристики дисплазий, преинвазивных и инвазивных форм центрального рака легкого

005061510

На правах рукописи

ЖЕЛБУНОВА Елена Алексеевна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДИСПЛАЗИЙ, ПРЕИНВАЗИВНЫХ И ИНВАЗИВНЫХ ФОРМ ЦЕНТРАЛЬНОГО РАКА ЛЁГКОГО

Специальности: 14.01.12 - онкология

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

13 ИЮН 2013

Санкт-Петербург 2013 г.

005061510

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии им. H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук Арсеньев Андрей Иванович

доктор медицинских наук,

профессор Мацко Дмитрий Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Гафтон Георгий Иванович

доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник, руководитель отделения общей онкологии и урологии ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России

Двораковская Иветта Владиславовна доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, заведующая лабораторией экспериментальной пульмонологии и патоморфологии НИИП СПбГМУ

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Минздрава России.

Защита состоится «25» июня 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 при Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени . H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, д. 68). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова» Минздрава России по адресу 197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, д. 68. Автореферат разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: доктор медицинских наук Бахидзе Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Рак лёгкого (PJI) занимает одно из первых мест в мире по показателям заболеваемости - более 1,3 миллиона случаев, что составляет 12% от всех злокачественных новообразований, при этом погибает от него более 1,2 миллиона человек (18% всех смертей от рака и 2,2% общей смертности). В России ежегодно выявляется более 51000 новых случаев PJI, при этом в первый год после установления диагноза от этого заболевания умирает более 54% больных. Аналогичная ситуация складывается и в других странах [Барчук A.C., 2003; Чиссов В.И., 2010; Jemal А., 2010]. Соотношение «заболеваемость - смертность» при раке лёгкого самое неблагоприятное -умирают 95,6 % зáбoлeвшиx [Мерабишвили В.М., 2010; Komaki R., 2003; Parkin D.M., 2005]. Оставшаяся не решённой на сегодняшний день проблема ранней диагностики PJI приводит к тому, что основная масса больных (более 75%) поступает в специализированные лечебные учреждения в III-IV стадиях заболевания. Статистические данные свидетельствуют о том, что PJI является одним из наиболее часто встречающихся и характеризующихся неблагоприятным прогнозом онкологическим заболеванием [Давыдов М.И., 2010; Hansen H.H., 2005; Ganti A.K, 2006; Jett J.R, 2008].

Эффективность клинических мероприятий напрямую связана со стадией, при которой обнаружен опухолевый процесс, а решение проблемы улучшения результатов лечения РЛ лежит на пути его раннего выявления [Полоцкий Б.К, 2003; Häussinger К., 2005; Cortes-Funes Н„ 2005; Bach Р.В., 2007; Yasufuku К., 2010]. Несмотря на совершенствование методов лечения, показатели 5-летней выживаемости во всём мире сохраняются на уровне 70-х годов прошлого века и не превышают 15-20%. Очевидно, что даже восстановление системы ежегодного профилактического

флюорографического обследования и использование такой перспективной диагностической модели, как скрининг рака легкого с помощью низкодозной KT, окажутся недостаточно эффективны при выявлении ранних форм центрального PJL Известно, что чёткие рентгенологические признаки этой клинико-анатомической формы заболевания проявляются достаточно поздно, а решающая роль в её распознавании отводиться эндоскопической диагностике с обязательной морфологической верификацией опухолевого процесса [Арсенъев А.И, 2010; BardM., 2005; Васктап V., 2008; Wallace М.В., 2009; YarmusL., 2010; Becker H.D., 2010].

На современном этапе развития онкологии именно проведение гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического исследования образцов опухолевой ткани позволяет адекватно оценить

3

предиктивные, прогностические факторы и определить рациональный алгоритм специального лечения, индивидуализировав его. Однако при этом возникают затруднения, связанные со сложностями оценки значительного количества различных параметров в небольших образцах тканей, нередко повреждённых в процессе их получения. Отдельную проблему представляет собой определение точного места для выполнения прицельной биопсии, даже при распространённых процессах, когда участки опухолевого роста в бронхах могут сочетаться, или чередоваться с зонами реактивных и диспластических изменений. А при целенаправленном поиске и выявлении дисплазий, преинвазивного и микроинвазивного рака респираторного эпителия возможности традиционного бронхоскопического исследования и вовсе следует признать весьма ограниченными [Полоцкий Б.Е., 2003; Шацева Т.А., 2004; Lee J.S., 2002; DacicS., 2008; RenoufD.J., 2009; Meert А Р., 2010].

Таким образом, оптимизация методов эндоскопической и морфологической диагностики центрального PJI является одним из приоритетных направлений современной онкологии, а многие аспекты рационального подхода к разрешению этой актуальной проблемы остаются нерешёнными и требуют дальнейшего изучения.

Цель исследования:

Определить морфологические, иммуногистохимические и спектральные характеристики дисплазий, преинвазивных и инвазивных форм центрального рака лёгкого при использовании комбинированного эндоскопического метода диагностики, включающего выполнение бронхоскопии и спектрометрии в отражённом и аутофлуоресцентном режимах.

Задачи исследования:

1. Проанализировать особенности получения и подготовки биопсийного материала для морфологического (гистологического и иммуногистохимического) исследования при фибробронхоскопии.

2. Оценить уровень экспрессии антител CD31 и CD34 (тенденции ангиогенеза) и EGFR в бронхобиоптатах, в зависимости от этапа канцерогенеза респираторного эпителия.

3. Изучить динамику пролиферативной активности (Ki-67) в биоптатах бронхиальной стенки в зависимости от степени выраженности патологических изменений (гиперплазия, метаплазия, дисплазия, преинвазивный и инвазивный рак).

4. Определить степень апоптоза в участках бронхиальной стенки, получаемых при биопсии в ходе комбинированного эндоскопического

исследования на основании уровня экспрессии Р53 в зависимости от характера патологии.

5. Исследовать возможность использования спектрометрических коэффициентов (Bl-V, 02sat, НЬ02, Hb, IRG) для точного определения в доступных обзору бронхах и трахее интересующих участков, требующих выполнения прицельной биопсии с целью морфологического установления характера патологического процесса.

6. Провести сравнительный анализ спектральных й морфологических характеристик, свойственных различным состояниям бронхиальных стенок -нормы, реактивных изменений, метаплазии, дисплазии различной степени, преинвазивного (CIS) и инвазивного рака.

Положения, выносимые на защиту:

1) Комбинированная эндоскопическая диагностика, включающая проведение аутофлуоресцентной бронхоскопии и спектрометрии, является безопасным, информативным, не сопряжённым с каким-либо дополнительным риском или существенным дискомфортом для пациентов методом, позволяющим проводить дифференциальную диагностику различных патологических состояний бронхиальных стенок, в том числе при выявлении преинвазивного и инвазивного центрального рака легких.

2) Изучение морфологических характеристик тканей из доступных обзору воздухоносных путей, полученных при щипцовой биопсии в ходе фибробронхоскопии, сопряжено со сложностями интерпретации данных, обусловленными небольшими их размерами, артифициальными изменениями и, соответственно, значительной долей неинформативного материала, что требует тщательной их подготовки и, нередко, проведения иммуногистохимического анализа.

3) Использование спектрометрических коэффициентов (Bl-V, 02sat, НЬ02, Hb, IRG) позволяет точно локализовать участки бронхиальных стенок, подозрительные на наличие предопухолевых и опухолевых изменений для выполнения прицельной биопсии, снижая их количество на 40-70% (в зависимости от заданных параметров чувствительности и специфичности), минимизируя травматичность процедуры и уменьшая нагрузку на морфологические подразделения.

4) По мере усугубления патологических изменений в бронхиальных стенках, от этапа к этапу канцерогенеза существенно увеличивается пролиферативная активность, нарастают уровни ангиогенеза и апоптоза (Ki-67, CD31, CD34, EGFR, Р53) в респираторном эпителии, давая возможность достоверно различать преинвазивные и инвазивные опухолевые процессы от неопухолевых изменений.

5) Спектрометрические параметры, получаемые в ходе комбинированного эндоскопического исследования бронхов и трахеи, подтверждённые данными морфологического исследования биоптатов, позволяют проводить доказательный математический анализ количественных показателей и обеспечивают объективную оценку состояния бронхиальных стенок.

Научная новизна:

Выполненная работа явилась комплексным, многоплановым и многофакторным исследованием, раскрывшим на основе использования современных высокотехнологичных методик новые, научно обоснованные пути решения актуальной проблемы клинической онкологии - оптимизации диагностики центральных клинико-анатомических форм рака лёгкого, в том числе раннего, а также реактивных и предопухолевых патологических процессов.

Впервые на большом клиническом материале (620 биопсий) в проведённом исследовании изучены морфологические (гистологические и иммуногистохимические) особенности различных состояний бронхиальных стенок (норма, реактивные изменения, метаплазия, дисплазия, преинвазивный и инвазивнын рак), в частности характеристики ангиогенеза, пролиферативной активности, способности к метастазированию и дифференцировке, уровня апоптоза (СОЗ1, СБ34, Ю-67, ЕОРЯ, Р53).

В доступной отечественной и зарубежной литературе не удалось обнаружить научные работы, посвящённые анализу такого исключительно сложного для морфологического исследования материала, как образцы ткани из бронхиальных стенок, полученные при прицельной щипцовой биопсии в ходе комбинированного эндоскопического исследования.

Доказана высокая клиническая ценность нового метода комбинированной эндоскопической диагностики рака легкого, включающего бронхоскопию в обычном свете, отраженную спектрометрию, аутофлуоресцентную бронхоскопию и аутофлуоресцентную спектрометрию. Продемонстрирована возможность проведения дифференциальной диагностики с использованием этой методики между нормальным состоянием бронхиальных стенок, предопухолевыми, преинвазивными и инвазивными опухолевыми изменениями.

На основании оценки полученных результатов предложена, зарегистрирована и опубликована новая медицинская технология комбинированного эндоскопического контроля эффективности лечения злокачественных опухолей бронхов и/или трахеи с использованием аутофлуоресцентной спектроскопии.

Практическая значимость

Проведённое исследование позволило научно обосновать необходимость, возможность и эффективность использования комбинированного эндоскопического метода диагностики центрального рака лёгкого, в том числе раннего, включающего бронхоскопию в обычном свете, отраженную спектрометрию, аутофлуоресцентную бронхоскопию и аутофлуоресцентную спектрометрию.

Описаны и обоснованы особенности получения и подготовки биопсийного материала для морфологического (гистологического и иммуногистохимического) исследования при фибробронхоскопии. Определены типичные для различных состояний бронхиальных стенок (норма, реактивные изменения, метаплазия, дисплазия, преинвазивный и инвазивный рак) гистологические и иммуногистохимические параметры, в том числе уровни экспрессии молекулярных маркеров (CD31, CD34, Ki-67, EGFR, Р53), характеризующих тенденции ангиогенеза, пролиферативной активности, способности к метастазированию и дифференцировке, уровень апоптоза.

Исходя из результатов анализа, предложен оптимальный комбинированный эндоскопический алгоритм диагностики центрального, в том числе раннего рака лёгкого. Доказана целесообразность, эффективность и безопасность его использования. Апробация диссертации:

Основные итоги работы обсуждались на научной конференции отделений торакальной онкологии, эндоскопии, радиационной онкологии и ядерной медицины, биотерапии и трансплантации костного мозга, опухолей молочной железы и общей онкологии, группы опухолей желудочно-кишечного тракта ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России, кафедр онкологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова и Санкт-Петербургского северо-западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, курса онкологии медицинского факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета, отделения торакальной онкологии Санкт-Петербургского клинического научно-практического центра специализированных видов медицинской помощи (онкологического).

По материалам исследования сделано 9 докладов: 1) на научно-практической конференции НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова «Актуальные вопросы диагностики и лечения рака лёгкого» (Санкт-Петербург, 14.09.2006г.); 2) на научно-практической конференции «Актуальные вопросы хирургической пульмонологии» (Санкт-Петербург,.

7

10.02.2006г.); 3) на научно-црактической конференции с международным участием «Оптимизация .. лечебно-диагностической тактики при онкологических заболеваниях» (Архангельск, 07.06.2006г.); 4) на 11 юбилейном московском международном конгрессе по эндоскопической хирургии (Москва, 20.04.2007 г.); 5) на конференции, посвященной 60-летию. Городского клинического онкологического диспансера (Санкт-Петербург, 04.09.2008); 6) на Всероссийской научно-практической конференции «Диагностика и лечение опухолей грудной полости» (Санкт-Петербург, 05.09.2008г.); 7) на Российской научно-практической конференции «Современные эндоскопические технологии в онкологии» (г. Томск, 27.05.2010 г.); . 8) на международной конференции «Наследие Пирогова: прошлое, настоящее, будущее...» (Санкт-Петербург, 2010 г.); 9) на VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Душанбе, 04.10.2010 ri).

Публикации:

Публикации охватывают все разделы работы. Опубликовано 16 научных работ, в том числе 8 - в отечественных журналах, рекомендованных ВАК. По данной теме оформлена, утверждена и опубликована новая медицинская технология.

Внедрение результатов работы в. практику:

В настоящее время методики, изученные в работе, внедрены в клинике ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России и применяются в практической работе отделений ГБУЗ «Санкт-Петербургский клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)», в учебном процессе кафедр эндоскопии и онкологии Санкт-Петербургского северо-западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, кафедры онкологии Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им., акад. И.П. Павлова, курса онкологии медицинского факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Структура и объём диссертации:

Диссертация состоит из введения, .обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 159 страницах текста и содержит 18 таблиц, а также' 43 рисунка. Список литературы включает 186 источников, в том числе 33 отечественных и 153 иностранных автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика клинических наблюдений.

Материалом для настоящего исследования послужили проспективные данные обследования 167 больных, направленных в НИИ онкологии им. H.H. Петрова с января 2006 по февраль 2007 года из различных поликлиник, онкологических отделений, диагностических центров и стационаров г. Санкт-Петербурга. Всем пациентам было выполнено комбинированное эндоскопическое исследование, включающее выполнение бронхоскопии и спектрометрии, в отраженном и аутофлуоресцентном режимах.

Среди пациентов преобладали мужчины - 111 (66,5%), в то время как женщин было лишь 56 (33,5%) (рис. 1). Средний возраст пациентов в изучаемой группе составил 59,4 (99%С1:57,1-61,8). Диагноз рака лёгкого по результатам бронхобиопсии был подтверждён у 25,1% (п=42) больных, а отвергнут, соответственно, у 74,9% (п=125).

Рисунок 1. Распределение больных, вошедших в исследование по полу

Обязательным этапом комбинированного эндоскопического метода была морфологическая верификация процесса, а перед выполнением щипцовой биопсии производилась спектрометрия из подозрительного участка. В общей сложности при реализации разработанного алгоритма у 167 больных выполнено 620 биопсий. Проведённый морфологический анализ всех 620 биопсий' показал, что 20,0% (95%С1:17,0%-23,4%; п=124) микропрепаратов были по разным причинам расценены как недостаточно информативные, что закономерно было обусловлено небольшими размерами изучаемых участков бронхиальных стенок и артифициальными изменениями в них, связанными с раздавливанием тканей при щипцовой биопсии.

В 47,6% случаев микроскопическая картина соответствовала нормальному строению бронхиальной стенки, либо реактивным изменениям в ней. Гиперплазия респираторного эпителия обнаружена в 22,9% микропрепаратов, метаплазия - в 2,3% (п=14), дисплазия - в 1,5% (п=9). Инвазивный рак обнаружен в 36 биоптатах, что составило 5,7% от общего количества образцов.

Таким образом, предопухолевым и опухолевым изменениям соответствовал 201 микропрепарат - 32,4% от всего морфологического материала и 40,5% от объёма всех информативных биоптатов (п=496).

Методы исследования.

Комбинированный эндоскопический метод подразумевал использование современной высокотехнологичной эндоскопической системы «ClearVu Elite», разработанной в лаборатории компании «Perceprtonix Medical Inc.» в сотрудничестве с Противораковым Агентством Британской Колумбии (Канада) и при непосредственном участии сотрудников НИИ онкологии им. H.H. Петрова. Сущность метода заключалась в последовательном проведении бронхоскопии и спектрометрии, в отраженном и аутофлуоресцентном режимах (рис. 2)

Рисунок 2. Диагностический алгоритм комбинированного

эндоскопического исследования

В качестве подозрительных были определены участки бронхиальной стенки, хоть как-либо отличающие от обычной картины. Основным эндоскопическим признаком раннего центрального РЛ и предопухолевых изменений была определена локальная гиперемия стенки бронха либо в обоих режимах, либо только в аутофлуоресцентном, тогда этот признак визуализировался как красное свечение на зеленом фоне.

Спектральные измерения обязательно выполнялись из подозрительных участков перед каждым получением образцов биопсийного материала с последующим сопоставлением накопленных визуальных, спектрометрических и морфологических данных. На выполнение эндоскопических исследований согласно принятому диагностическому алгоритму требовалось дополнительно не более 3-5 минут к обычному времени, необходимому для выполнения стандартной фибробронхоскопии.

В последующем микропрепараты, соответствующие критериям одного из этапов канцерогенеза (п=201) были подвергнуты углублённому

морфологическому и иммуногистохймическому исследованию. Оценивались тенденции ангиогенеза (CD31 и CD34), пролиферативная активность (Кд-67) и уровень апоптоза (Р53). По уровню экспрессии EGFR оценивали способность к дифференцировке, инвазии и метастазированию, индукции ангиогенеза и опухолевой трансформации респираторного эпитедия.

Для обеспечения объективного контроля полученных результатов биопсийный материал одновременно исследовался в 2-х центрах. Первичная подготовка микропрепаратов и получение гистологического заключения согласно градации WHO/IASLC выполнялось в отделе морфологии опухолей НИИ онкологии им. H.H. Петрова. Затем гистологические микропрепараты направлялись на пересмотр в патологоанатомическую лабораторию Противоракового Агентства Британской Колумбии (Канада), а в случае несовпадения диагноза препараты в третий раз пересматривались в независимой лаборатории.

Для обработки спектрометрических данных была использована математическая модель, описывающая спектральные показатели ткани [Fawzy Y, 2008]. Согласно используемой модели вычислялись 4 основные спектральные характеристики: 1) доля объема крови в ткани (B1-V); 2) параметр насыщения крови кислородом (02sat); 3) содержание сатурированного гемоглобина (Bl-V*02sat; НЬ02); 4) содержание десатурированнош гемоглобина (Bl-V*(l-02sat)), 5) показатель Infra-Red-Green Ratio (IRG), соответствующий отношению средней интенсивности флуоресцентного спектра в около-инфракрасной области (715-835нм) к средней интенсивности в зеленой области (495-515нм) (рассчитывался в аутофлуоресцентном режиме). Именно использование отношения IRG, а не непосредственного измерения интенсивности отражения, позволило избежать необходимости проведения поправок на расстояние до участка бронхиальной стенки для объективного сопоставления результатов [Арсеньев А.И., 2010, 2011].

Дополнительный аналитический показатель был получен с помощью линейного регрессионного анализа. Биномиальный доверительный интервал (95 и 99%) для представленных значений был рассчитан по методу Клоппера-Пирсона. Точный тест Фишера применялся при установлении критерия независимости для таблиц сопряженности признаков. Для расчета корреляций между показателями был использован коэффициент Спирмена. Часть исследования основана на анализе характеристических (ROC) кривых. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Оценка эффективности комбинированной эндоскопической диагностики центрального рака легкого с использованием отражённой и аутофлуоресцентной бронхоскопии с интегрированной спектрометрией в обоих режимах при получении образцов морфологического материала из бронхиальных стенок.

Проведённый анализ безопасности системы, включающий данные в отношении всех выполненных эндоскопический исследований (п=167), продемонстрировал, что ни у одного пациента не было клинически значимых осложнений, потребовавших проведения лечебных мероприятий, а метод, соответственно, не сопряжен с каким-либо дополнительным риском для пациентов. Клинически незначимыми побочными явлениями, возникшими после проведения комбинированной бронхоскопии со спектрометрией, были: общая слабость - у 24,6% (п=41) пациентов, головокружение - у 13,8% (п=23), тошнота - у 3,6% (п=6), дискомфорт при глотании более 1 часа - у 4,8% (п=8). Описанные побочные явления были неспецифичны и характерны для обычных фибробронхоскопий, выполненных под местной анестезией, а сравнительный анализ с собственными (р=0,03) и литературными данными (р=0,02-0,04) не выявил статистически значимых различий в их частоте.

Чувствительность комбинированного эндоскопического метода составила 94,74% (95%С1:80,9%-99%) при специфичности 79,95% (95%С1:75,8%-83,6%).

Установлено, что спектрометрические показатели между группами больных с инвазивным опухолевым ростом (п=36) и диспластическими изменениями/С18 в бронхиальных стенках (п=9) имели статистически значимые различия для коэффициентов 02ва1 (р=0,025), НЬ (р=0,017) и ПШ (р=0,002). Сопоставление спектральных характеристик объединённых групп - «норма/реактивные изменения/гиперплазия/ метаплазия» и «дисплазия/ ОБ/инвазивный рак» показали, что отличия между ними были существенны (р<0,0001), как и после исключения инвазивных опухолей - в группах «дисплазия/ОБ» и «норма/реактивные изменения/гйперплазия/метаплазия» (О^ - р=0,03; В1-У - р=0,00002; НЬ02 - р=0,00004; НЬ - р=0,0002; 11Щ -р=0,0001) [Барчук А.А., 2010, 2011].

Таким образом, доказано, что использование спектрометрических коэффициентов (В1-У, О^аЪ НЬ02, НЬ, ПЮ), позволяет обнаружить статистически значимые (р=0,0003-0,0004) различия между опухолевыми и прочими изменениями бронхиальных стенок, точно локализовать подозрительные участки для выполнения прицельной биопсии. Проведённые расчёты показали, что использование комбинированного эндоскопического

12

метода со спектрометрией в отражённом и аутофлуоресцентном режимах, позволяет уменьшить количество ненужных биопсий на 40% без потери чувствительности и на 70% при потере чувствительности в 10%, тем самым минимизировав травматичность исследования и существенно снизив нагрузку на морфологические подразделения.

Таблица 1. Средние значения спектрометрических коэффициентов При иивазивных опухолях/С18/дисплазиях и норме/реактивных

изменениях/гиперплазии/метаплазии в бронхиальной стенке

Коэффициент Норма/реактивные изменения/ гиперплазия/ метаплазия Опухолевый рост / дпсплазия Р Разница средних значений С1:99%

BI-V 0,098723 0,181825 <0,0001 -0,08310 -0,11300 -0,05320

02sat 0,801681 0,753007 0,041 0,04867 -0,01283 0,11017

НЬ02 0,078923 0,128538 <0,0001 -0,04962 -0,07138 -0,02785

Hb 0,019799 0,053287 <0,0001 -0,03349 -0,04520 -0,02178

IGR 0,659447 2,795371 <0,0001 -2,13592 -2,82376 -1,44809

Используемая математическая модель позволила осуществить для спектрометрических коэффициентов (Bl-V, 02sat, НЬ02, Hb, IRG) построение характеристических кривых с сопоставлением площадей (AUC) под ними [Барчук A.A.; Арсеньев А.И., 2010, 2011]. Как представлено в таблице 2 и на рисунке 3, полученные различия между всеми показателями оказались статистически значимы для группы «инвазивные опухоли/Сге/дисплазии»: SBi-v=0,76; (р<0,0001); SdO2=0,83 (р<0,0001); Sirg=0,83 (р<0,0001); SdOziRG^0,89 (р<0,0001; регрессионный анализ - LRS) (таб. 2, рис. 3).

Таблица 2. Площадь под характеристическими кривыми (AUC)

для спектрометрических коэффициентов в группах «опухоли/ОБ/дисплазии» и «только CIS и дисплазии»

Коэффициент Группа AUC 99% CI Н0:Агеа < 0.5Ш: Агея>0.5

B1-V Опухоли/СК/дисплазии 0,76 0,65-0,86 р<0,0001

Только CIS и дисплазии 0,70 0,42-0,98 р=0,0315

dOj Опухоли/СВ/дисплазии 0,83 0,76-0,89 р<0,0001

Только CIS и дисплазии 0,65 0,42-0,88 р=0,0457

IRG Опухоли/СВ/дисплазии 0,83 0,73-0,94 pO.OOOl

Только CIS и дисплазии 0,67 0,36-0,98 р=0,0304

НЮ2 Опухоли/СВ/дисплазии 0,67 0,55-0,79 р=0,0002

Только CIS и дисплазии 0,68 0,40-0,96 р=0,042

Hb Опухоли/аЭ/дисплазии 0,86 0,79-0,93 р<0,0001

Только CIS и дисплазии 0,71 0,46-0,97 Р=0.03

Рисунок 3. Сравнение характеристических (ROC) кривых спектрометрических показателей Hb, НЬ02, B1-V и d02 для группы «CIS и днсплазии» (А) и показателя регрессионного анализа (LRS - d02/IRG) для группы «инвазивные опухоли/СК/дисплазии» (Б).

Морфологическое и иммуногистохимическое исследование образцов тканей бронхиальных стенок, полученных при комбинированной эндоскопической диагностике.

В соответствии с современными представлениями канцерогенез респираторного эпителия проходит несколько этапов: 1) гиперплазия (обратимый процесс); 2) метаплазия; 3) дисплазия; 4) преинвазивный рак (carcinoma in situ - CIS); 5) инвазивный рак. Исходя из этой модели, в исследовании был произведён сравнительный анализ гистологических и иммуногистохимических характеристик каждого из последовательных этапов, критериям которых соответствовало 40,5% всех информативных образцов (п=201) (таб. 3). Согласно таблице 3 - большинство образцов бронхиальных стенок 70,6+3,2% (п=142) пришлось на те, или иные варианты гиперплазии слизистой бронхов, 6,9+1,7% (п=14) на метаплазию, 4,5+1,5% (п=9) на дисплазию различной тяжести и CIS, а 17,9+2,7% (п=36) на инвазивный рак бронхов.

Таблица 3. Распределение микропрепаратов при морфологическом

исследовании образцов респираторного эпителия.

Характеристика биоптата Количество биопсий (п) Доля, %

Гиперплазия 1. Бокаловидных клеток 39 19,4

2. Базально-клеточная 74 36,8

3. Смешанная 29 14,4

Всего 142 70,6

Метаплазия 14 6,9

Дисплазия 1. Дисплазия лёгкой степени 2 1,0

2. Дисплазия средней степени 1 0,5

3. Дисплазия тяжёлой степени/ОБ 6 3,0

Всего : 9 4,5

1. Аденокарцинома 17 8,5

2. Плоскоклеточный рак 12 6,0

Инвазивный 3. Крупноклеточный рак 2 1,0

рак 4. Мелкоклеточный рак 3 1,5

5. Карциноидная опухоль 2 1,0

Всего 36 17.9

ВСЕГО 201 100,0

Как следует из рисунка 4 при оценке тенденций ангиогенеза, отмечено симметричное нарастание уровня экспрессии антител CD31 и CD34, от этапа к этапу канцерогенеза, в зависимости от степени выраженности патологии бронхиальной стенки. Так, если при гиперплазии респираторного эпителия уровень экспрессии этих антител оценивался в 1 балл, то при метаплазии и дисплазии он достигал 1,5 баллов, при CIS - 2 баллов, а при инвазивном раке увеличивался до 2,5 баллов (р=0,031-0,042). Уровень экспрессии EGFR при гиперплазии был минимальным (1 балл), для процессов метаплазии, дисцлазии и CIS был характерен одинаковый средний уровень в 2 балла, а при инвазивных карциномах он увеличивался до 3 баллов (р=0,029-0,044).

Рисунок 4. Уровень экспрессии СБ 31, СБ 34 и ЕС полученный при иммуногистохимическом исследовании, характерный для различных вариантов патологии бронхиальной стенки (баллы).

CD 34 (баллы)

СО 31 (баллы)

EGFR (баллы)

В Гиперплазия О Метаплазия В Дисплазия В CIS

Н Инвазивный рак

Антитело/ Патология CD 34 (баллы) CD 31 (баллы) EGFR (баллы)

Гиперплазия 1 1 1

Метаплазия 1,5 1,5 2

Дисплазия 1,5 1,5 2

CIS 2 2 2

Инвазивный рак 2,5 2,5 3

Прослежена чёткая динамика нарастания пролиферативной активности, по мере усугубления патологических процессов в бронхиальной стенке. Если при гиперплазии слизистой оболочки бронхов уровень Ki-67 не превышал 6%, то на этапе метаплазии и дисплазии он статистически значимо (р=0,002-0,003) повышался до 32% и 30%, соответственно. Причём существенных различий в. уровне экспрессии Ki-67 между метаплазией и дисплазией не было (р>0,1). Однако на этапе собственно опухолевого процесса вновь отмечено значительное увеличение (р=0,002-0,004) пролиферативной активности (Ki-67 - 60%), в равной степени для CIS и инвазивного рака (рис. 5).

Ещё более показательными оказались данные, полученные при оценке уровня апоптоза в биоптатах бронхиальной стенки. Так, если при гиперплазии респираторного эпителия уровень экспрессии Р53 был менее 1%, то при метаплазии он несколько увеличивался (до 5%; р=0,08), на этапе дисплазии стремительно нарастал до 30% (р=0,0009), а при CIS и инвазивном раке вновь делал статистически значимый (р=0,0006) скачок до 80% и 70% соответственно. Причём уровень апоптоза после завершения опухолевого

развития существенно не различался между CIS и инвазивным раком (р=0,07) (рис. 5).

Рисунок 5. Уровень экспрессии Ki-67 и Р53, полученный при иммуногистохимическом исследовании, характерный для различных вариантов патологии бронхиальной стенки (%)._

а Гиперплазия & Метаплазия ЫДисплазия BCIS Q Инвазивныйрзк

-

ЭО ,----------------------

80 ----------------------------------------------------------------------------------------------cam---------

70----------------------------ИИ^-

I"" -- 1 щ I

1 I —

Ki-67 (%) Р 53 {%)

Антитело/Патология Ki-67 {%) Р53 (%)

Гиперплазия 2-6 <1

Метаплазия 32 5

Дисплазии 30 30

CIS 60 80

Инвазивный рак 60 70

ВЫВОДЫ

1. Морфологическое исследование биоптатов, получаемых при фибробронхоскопии, сопряжено со сложностями интерпретации данных, обусловленными небольшими размерами изучаемых участков бронхиальных стенок, артифициальными изменениями в них и, соответственно, значительной долей неинформативного материала (20,0%; 95%С1:17,0%-23,4%), что требует тщательной их подготовки, а в ряде случаев проведения углубленного, в том числе иммуногистохимического анализа.

2. При иммуногистохимической оценке тенденций ангиогенеза отмечено существенное повышение уровня экспрессии антител CD31 и CD34, от этапа к этапу канцерогенеза — при гиперплазии респираторного эпителия - 1 балл, при метаплазии и дисплазии -1,5 балла, при CIS - 2 балла, а при инвазивном раке - 2,5 балла (р=0,031-0,042), Уровень экспрессии EGFR при гиперплазии слизистой был минимальным (1 балл), для процессов метаплазии, дисплазии и CIS был характерен одинаковый уровень в 2

балла, а при инвазивиых карциномах он значимо увеличивался до 3 баллов (р=0,029-0,044).

3. Прослежена чёткая динамика нарастания пролиферативной активности по мере усугубления патологических процессов в бронхиальной стенке: если при гиперплазии слизистой оболочки бронхов уровень Kj-67 не превышал 6%, то при метаплазии и дисплазии он статистически значимо (р=0,002-0,003) повышался до 32% и 30%, соответственно, а на этапе собственно опухолевого процесса вновь существенно увеличивался (р=0,002-0,004) до 60% в равной степени для CIS и инвазивного рака.

4. Оценка уровня апоптоза в биоптатах бронхиальных стенок позволила установить, что если при гиперплазии респираторного эпителия уровень экспрессии Р53 был менее 1%, несущественно увеличиваясь при метаплазии до 5% (р=0,08), то на этапе дисплазии он нарастал до 30% (р=0,0009), а при CIS и инвазивном раке вновь делал статистически значимый (р=0,0006) скачок до 80% и 70% соответственно. Причём уровень апоптоза после завершения опухолевого развития существенно не различался между CIS и инвазивным раком (р=0,07).

5. Сравнительный анализ спектрометрических коэффициентов, характерных для различных состояний бронхиальных стенок, продемонстрировал статистически значимые различия между группами «дисплазия/CIS» и «норма/реактивные изменения/метаплазия» (для 02sat - р=0,04; для B1-V, НЪ02, Hb, IRG - р<0,0001); группами «дисплазия/CIS» и «инвазивный рак» (для 02sat - р=0,026; для НЬ - р=0,019 и для IGR - р=0,001), а также между объединённой группой «дисплазия/СК/инвазивный рак» и прочими состояниями (р=0,00031-0,00038).

6. Использование спектрометрических коэффициентов (Bl-V, 02sat, НЬ02, Hb, IRG) позволяет обнаружить статистически значимые (р=0,00042-0,00037) различия между опухолевыми и прочими изменениями бронхиальных стенок, точно локализовать подозрительные участки для выполнения прицельной биопсии, снижая их количество на 40% без потери чувствительности и на 70% при потере чувствительности в 10%, минимизируя травматичность процедуры и уменьшая нагрузку на морфологические подразделения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Существующий алгоритм диагностики центрального рака лёгкого, особенно ранних его форм, целесообразно дополнить проведением комбинированного эндоскопического исследования доступных обзору бронхов и трахеи, включающего бронхоскопию в обычном свете, отраженную

18

спектрометрию, аутофлуоресцентную бронхоскопию и аутофлуоресцентную спектрометрию. Предлагаемый метод продемонстрировал высокую диагностическую информативность, безопасность, простоту практической реализации при отсутствии дополнительного риска или существенного дискомфорта для пациентов, высокую чувствительность при достаточной специфичности.

Получаемые в ходе комбинированной эндоскопической диагностики патологии воздухоносных путей образцы бронхиальных стенок (биоптаты) требуют тщательной подготовки к гистологическому, а в ряде случаев иммуногистохимическому исследованию в связи со сложностями интерпретации данных, обусловленными небольшими их размерами и артифициальными изменениями.

При дифференциальной диагностике реактивных, предопухолевых, преинвазивных и инвазивных опухолевых изменений в бронхиальной стенке проведение иммуногистохимического исследования с оценкой пролиферативной активности, уровня ангиогенеза и апоптоза (CD31, CD34, EGFR, Ki-67, Р53) позволяет делать объективные заключения и избегать ошибочных интерпретаций микроскопической картины.

Для точного и обоснованного определения подозрительных в отношении центрального рака лёгкого участков бронхиальных стенок и прицельного получения образцов ткани в ходе комбинированной бронхоскопии целесообразно использовать спектрометрические коэффициенты (B1-V, 02sat, Hb02, Hb, IRG), что позволит снизить количество биопсий, минимизировать травматичность процедуры и уменьшить нагрузку на морфологические подразделения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. D.E. Matsko, Е.А. Zhelbunova, O.V. Koiytov. Histopathology of Lung Cancer // European Society for Medical Oncology 5x5x5 course "Lung cancer and thoracic tumors". - 2005. - P.67-74.

2. Д.Е, Манко, Е.А.Желбунова, E.H. Имянитов. Рак легкого: гистопатология и молекулярный патогенез. - М.¡Медицина, - 2007. - С. 1-24 — 1610р. — (Приложение к журналу «Архив патологии», 2007).

3. Барчук A.A., Арсеньев А.И., Барчук A.C., Морозова Ю.А., Тарков С.А., Желбунова Е.А.. Мацко Д.Е. Ранняя диагностика рака лёгкого с использованием современных высокотехнологичных скрининговых методов // Тезисы доклада. Сб. тез. 11-го московского международного конгресса по

19

эндоскопической хирургии под ред. Галлингера Ю.И. - Москва. 18-20 апреля 2007г.-2007.-С. 43-44.

4. Барчук A.C., Арсеньев А.И., Барчук A.A., Морозова Ю.А., Тарков С.А., Желбунова Е.А.ЛУТацко Д.Е., Новик В.И. Некоторые аспекты ранней диагностики рака лёгкого с использованием современных высокотехнологичных скрининговых методов // Вопросы онкологии —

2007. № 5. - С. 602 - 604.

5. Барчук A.A., Арсеньев А.И., Барчук A.C., Морозова Ю.А., Тарков С.А., Желбунова Е.А.. Мацко Д.Е. Ранняя диагностика рака легкого с использованием современных высокотехнологичных скрининговых методов // Тезисы доклада. Сб. тез. III международной конференции "Актуальные вопросы эндоскопической хирургии" - Санкт-Петербург. 15-16 мая 2008г. -

2008.-С. 38-39.

6. A.C. Барчук, А.И. Арсеньев, A.A. Барчук, Ю.А. Морозова, С.А. Тарков, Е.А. Желбунова. Д.Е. Мацко, В.И. Новик. Некоторые аспекты ранней диагностики рака легкого с использованием высокотехнологичных скрининговых методов // Тезисы доклада. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Диагностика и лечение опухолей грудной полости» - Санкт-Петербург. 4-5 сентября 2008г. - СПб: Аграф+, 2008.-С. 9-11.

7. Е.А.Желбунова. Эпидемиология рака легкого в Северо-Западном регионе. России (данные за 2001-2004 г.г.) // Тез. Сборник научных трудов, посвященный памяти O.K. Хмельницкому «Современные проблемы клинической патоморфологии». - 10 декабря 2009 г. - Приложение. - 2007. 2. ^С. 9-10

8. Арсеньев А.И., Барчук A.A., Левченко Е.В., Барчук A.C., Лемехов В.Г., Желбунова Е.А.. Шулепов A.B., Аристидов Н.Ю., Щербаков A.M., Нефедов А.О. Опыт применения современных высокотехнологичных методов в диагностике и лечении рака лёгкого // «Наследие Пирогова: прошлое, настоящее, будущее...». Тезисы доклада. Материалы конференции, СПб., 2010.-С. 227.

9. Барчук A.A., Арсеньев А.И., Левченко Е.В., Барчук A.C., Желбунова Е.А., Щербаков A.M., Мацко Д.Е., Кулакова Ю.А. Опыт клинического использования аутофлуоресцентной бронхоскопии со встроенной спектроскопией // Сибирский онкологический журнал -2010. №2(38).-С. 10-11.

10. Барчук A.A., Арсеньев А.И., Барчук A.C., Левченко Е.В., Щербаков А.М., Желбунова Е.А.. Нефёдов А.О. Аутофлуоресцентная бронхоскопия и спектроскопия в диагностике рака легкого // Тезисы доклада. Материалы VI

20

съезда онкологов и радиологов стран СНГ — Душанбе 1-4 октября 2010г. - С. 79-80.

11. Арсеньев А.И., Барчук A.A., Левченко Е.В., Барчук A.C., Кулакова Ю.А., Нефедов А.О., Желбунова Е.А., Щербаков A.M., Канаев C.B., Комбинированный эндоскопический контроль эффективности лечения злокачественных опухолей трахеи и/или бронхов с использованием аутофлуоресцентной спектроскопии // Вопросы онкологии - 2010. т. 56, № 5. - С. 548-551.

12. Барчук A.A., Арсеньев А.И., Левченко Е.В., Барчук A.C., Новик

B.И., Щербаков A.M., Лемехов В.Г., Желбунова Е.А., Нефедов А.О., Канаев C.B., Аристидов Н.Ю. Автоматизированная количественная цитометрия в диагностике рака лёгкого // Вопросы онкологии — 2011. т. 57, №1.-С. 36-42.

13. Арсеньев А.И., Барчук A.C., Левченко Е.В., Барчук A.A., Кулакова Ю.А., Щербаков A.M., Мацко Д.Е., Желбунова Е.А.. Нефёдов А.О., Тарков

C.А., Тимофеева Е.С. Комбинированный эндоскопический контроль эффективности лечения злокачественных опухолей трахеи и/или бронхов с использованием аутофлуоресцентной спектроскопии // Новая медицинская технология. - СПб.: Типография Копицентр «Сенная площадь». 2011. — 18 стр.

14. Барчук A.A., Арсеньев А.И., Левченко Е.В., Барчук A.C., Щербаков A.M., Мацко Д.Е., Желбунова Е.А., Нефёдов А.О, Канаев C.B., Тарков С. А., Аристидов Н.Ю., Гагуа К.Э. Аутофлуоресцентиая бронхоскопия и спектрометрия в диагностике центрального рака лёгкого // Вопросы онкологии — 2011. т. 57, № 4. — С. 448-454.

15. Арсеньев А.И., Нефедов А.О., Левченко Е.В., Барчук A.C., Вагнер Р.И., Барчук A.A., Гагуа К.Э., Аристидов Н.Ю., Желбунова Е.А.. Канаев C.B., Тарков С.А., Щербаков A.M., Шутов В.А., Рыбас А.Н. Оптимизация методов лечения хирургических осложнений при раке лёгкого // Вопросы онкологии - 2012. т. 58, № 5. - С. 674-679.

16. Желбунова Е.А. Морфологические и эндоскопические параллели при - ранней диагностике центрального рака лёгкого // Medline (электронный

журнал).-2013. - т. 14. - С. 131-139.

Подписано в печать «23»мая 2013 г. Формат60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ № 416 Отпечатано в цифровом копировальном центре «Восстания-1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.