Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Морфоиммунологические варианты периферических мелкоклеточных лимфом

РГ5 од 1 5 НАНКЛ!

На правах рукописи

ТАХАЕВ Зорикто Владимирович

МОРФОИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ МЕЛКОКЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ.

14.00.14 - онкология 14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2002

Работа выполнена в Российском Онкологическом Научном Центре им. H.H. Блохина РАМН.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор H.A. Пробатова

Доктор медицинских наук, профессор H.H. Тупицын

Официальные оппоненты:

Академик РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор A.A. .Ярилин

Доктор медицинских наук, профессор Г.А. Франк

Ведущее учреждение - Московский областной научно-исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского

Защита состоится « | Ъ » ОЪуо?хо^уЯ2002г. в « \0 » часов на заседании диссертационного совета К. 001.017.01 Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского "Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан « 2002г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук - Ю.А. Барсуков

Общая характеристика работы.

Актуальность.

В последние годы отмечается стойкая тенденция к росту числа больных гемобластозами, в структуре заболеваемости которых ведущее место занимают опухоли лнмфоидной ткани, аналогичны данные и об увеличении смертности среди лнц, страдающих этой патологией [Трапезников H.H., Аксель Е.А. 1999].

У взрослых больных преобладающей группой опухолей гемопоэтической системы являются периферические лимфомы из мелких клеток. Периферические мелкоклеточные лимфомы - это гетерогенная группа опухолей, представленная преимущественно небольшими, иебластными лимфоидными клетками со зрелым обликом, более 90% которых являются В- клеточными.

Наиболее часто встречаемыми опухолями из когорты периферических мелкоклеточных лимфом являются - лимфома из малых лимфоцитов / хронический лнмфолейкоз (J1MJ1 / В-ХЛЛ), лимфома из клеток мантии (ЛКМ), лимфома из клеток фолликулярного центра 1 цитологической степени ЛКФЦ-1).

В современных классификационных схемах сравнительно-морфологический принцип в значительной степени уступил свои позиции морфоиммунологическому. В 1994 году была опубликована Уточненная Европейско-Американская классификация лимфоидиых опухолей - REAL, а в 1999 году - проект классификации опухолевых болезней гемопоэтической и лнмфоидной тканей ВОЗ, основу которых составляют новообразования, классифицированные по морфологическим, клиническим, иммунофенотипическим и цитогенетическим признакам [Harris NL. et а!. 1994, 1999].

В то же время далеко не все гематологические учреждения располагают возможностями иммунофенотнпирования лимфом, поэтому отработка морфологических критериев диагностики представляется весьма актуальной.

В литературе нет достаточных сведений об ультраструктурных критериях диагностики периферических мелкоклеточных лимфом, имеющих определенное диагностическое и прогностическое значение.

Мало изучены вопросы, касающиеся связи ультраструктурной, морфологической и иммуногистохимической диффсренцнровки клеток при различных вариантах периферических мелкоклсточиых лимфом. В то же время их разграничение имеет большое клиническое значение, как в плане оценки прогноза, так и в выборе тактики ведения больных и отработки лекарственного противоопухолевого воздействия.

Цель исследования заключалась в определении морфо-иммунологических критериев дифференциальной диагностики периферических мелкоклеточных лимфом.

Задачи исследования.

1. Применить иммуногистохимическне критерии для диагностики вариантов периферических мелкоклеточных лимфом на основании использования широкого набора маркеров Т- и В-линейной принадлежности лимфоцитов, а также линейно нерестриктированных антигенов.

2. Изучить иммуногистохимическим методом уровень экспрессии белка циклин 01, кодируемый протоонкогеном ВСЫ, в исследуемой группе лимфом и установить его роль в дифференциальной диагностике.

3. Разработать морфологические критерии дифференциальной диагностики вариантов периферических мелкоклеточных лимфом.

4. Оценить возможности использования особенностей ультраструктуры опухолевых клеток в дифференциальной диагностике различных вариантов периферических мелкоклеточных лимфом.

Научная новизна.

Определены наиболее стабильные и информативные иммунофенотипическис и морфологические признаки, позволяющие дифференцировать варианты периферических мелкоклеточных В-клеточных лимфом. Выявлены иммуноморфологические особенности каждой нозологической единицы. Выделены подварианты в отдельных группах периферических В-клеточных мелкоклеточных лимфом. Определены возможности использования иммуногистохимического, морфологического и электронно-микроскопического методов в целях диагностики и дифференциальной диагностики исследуемых лимфом.

Практическая значимость результатов исследовании.

Разработаны иммунофепотипичсскис, морфологические и ультраструктурныс признаки для вариантов периферических мелкоклеточных лимфом.

Установлена гетерогенность клеточного состава В-клсточного хронического лимфолейкоза/ лимфомы из малых лимфоцитов, лнмфомы из клеток мантии лнмфондного фолликула и лнмфомы из клеток фолликулярного центра 1 цитологической степени. Выделены гистологические формы соответствующих вариантов периферических мелкоклеточных лимфом.

Полученные результаты исследования способствуют улучшению морфоиммуиологической диагностики периферических мелкоклеточных лимфом, определению прогноза, выбору оптимального лечения и адекватного ведения больных.

Апробация работы.

Апробация диссертации состоялась 27 декабря 2001г. на совместной конференции отделений НИИ Клинической Онкологии Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН и кафедры онкологии РМА ПО.

Основные положение работы были доложены па VI Международной научно-практической конференции "Пожилой больной. Качество жизни" (Москва, октябрь 2001г.), на Московском обществе патологоанатомов (Москва, февраль 2002г.).

Объем н структура диссертации.

Диссертация изложена на 140 страницах машинописи, состоит из введения, 5 глав, обсуждения, выводов и списка литературы. Указатель литературы включает 156 источников, в том числе 21 работа отечественных и 135 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами, 3 гистограммами, 61 фотографией.

Содержание работы.

Материалы и методы.

Для решения поставленных задач нами проведено исследование биопсий от 90 больных периферическими мелкоклеточными лимфомами, обследованных в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН за период с 1996 по 2001 гг. В группе пациентов было 50 мужчин и 40 женщин, в возрасте от 28 до 77 лет (средний возраст больных - 57 лет). Биопсийным материалом послужили 88 лимфатических узлов и 2 небные миндалины.

В основу рубрификации лимфом положены критерии REAL классификации. Из всего числа больных, в группе В-ХЛЛ/ЛМЛ наблюдался 31 пациент, ЛКМ - 24 больных, ЛКФЦ-1 - 35. Анализ лейкемического компонента больных периферическими мелкоклеточными лимфомами в работе не проводился.

Материал обрабатывали с применением гистологических, иммуногистохимнческнх и электронно-микроскопического методов.

Гистологическое исследование.

Для гистологического исследования кусочки ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном при рН 7.0 растворе формалина. Гистологические срезы толщиной 3-4 микрона окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, метиловым зеленым и пироиином по Браше.

На светооптическом уровне определяли варианты периферических лимфом по доминирующим цитологическим признакам (мелкоклеточный, из средних клеток, бластоиднын) и характеру роста (диффузный, нодулярный, смешанный). На срезах, окрашенных пикрофуксином по Ван - Гизону, определяли степень выраженности коллагеновых волокон стромы. При помощи гистохимической окраски по Браше выявляли клетки с плазматической направленностью дифференцировки. Цитоплазма таких клеток окрашивалась пиронином в розоватый или ярко красный цвет.

Для установления мнтотической активности подсчитывали фигуры митозов в 10 случайных полях зрения микроскопа при ув. 400 (п.з.м.) при окраске метиловым зеленым и пиронином по Браше.

Иммунофенотипирование.

Иммуноморфологическое исследование во всех 90 случаях периферических мелкоклеточных лимфом проводили на криостатных и на

парафиновых срезах лимфатических узлов. При этом на криостатных срезах использовали стандартный метод непрямой пммунофлуорссценции, па парафиновых срезах - непрямой иммунопероксидазиый метод (DAKO EnVision™+ System USA).

Иммуногистохимическое исследование проводили на криостатных и парафиновых срезах биопсий толщиной 4-5 мкм. Парафиновые срезы монтировали на стеклах, покрытых полн-Ь-лизипом. Парафиновые срезы подвергали депарафинацин в ксилоле (3 раза по 5 минут) и регндратации в спиртах нисходящей концентрации (100°,96°,70°) но 5 минут в каждом. Блокирование эндогенной пероксидазы проводили охлажденной 0,03% перекисью водорода в течении 10 минут.

Восстанавливали антигенную структуру клеток, фиксированного в формалине и заключенного в парафин материала, по стандартной методике, предложенной S.R.Shi с соавт. [ Shi S.R. et al. 1991].

Срезы инкубировали в растворе 0,01 М цитратного буфера (рН 6.0) в СВЧ-печи в течении трех циклов по 5 минут (700Вт) с интервалом 1 мин. Далее инкубировали с 20% сывороткой в течении 30 минут, чтобы избежать неспецифической адсорбции первичных антител. Затем наносили по 50 мкл. первичных моноклональных аитител (МКА) и срезы оставляли па ночь во влажной камере, в холодильнике при температуре +4"С.

После двукратного (поЮ минут) отмывания срезов в холодном 1М TRIS буфере (рН 7.6), срезы инкубировали в течение 45 минут во влажной камере с вторичным антителом (DAK.0 EnVision™+ System USA). Наличие биомолекулярных маркеров опухолей выявляли реакцией с диаминобензидином (ДАБ) в виде коричневого окрашивания продукта. После промывания срезов водой проводили докрашивание ядер гематоксилином Манера в течение 1 минуты с последующей дегидратацией в спиртах восходящей концентрации, обработкой ксилолом и заключением в канадский бальзам под покровное стекло.

Контрольная реакция проводилась без использования первичных специфических антител (негативный контроль).

В стандартном методе непрямой иммунофлуоресценции в качестве вторых антител использовали кроличьи, меченные FITC, аффинноочищенные антитела к IgG мыши. Препараты заключали в 50% раствор глицерина на PBS, просматривали в люминесцентном микроскопе "AxioPlan-2" Zeiss.

В исследовании использовали широкую панель антител к линейно-ограниченным антигенам В-лимфоцитов CD19, CD20 ("Сорбент", Россия), CD79a (Novocastra, Великобритания); антител к Т-клеточным антигенам CD3, CD4, CD7, CD8 серии ICO (Медбноспектр, Россия). Для выявления антигена CD5 на крностатных срезах использовали МКА BLla (J. Brochier, Франция), а на парафиновых срезах - МКА CD5 (Novocastra, Великобритания). Антигены CD23 выявляли МКА HD50 и LT23 (G.Moldenhauer, Германия, "Сорбент", Россия соотвественно), CD21 (J. Brochier, Франция), CD45 ("Медбиоспектр", Россия), CD38 - 1СО-20 («Медбноспектр», Россия).

Результаты реакций оценивались в случае ядерной локализации продукта по проценту окрашенных ядер на 300 клеток, а при цитоплазматической локализации продукта - полуколичественным методом в крестах (табл.1).

Таблица 1.

Критерии оценки няшуногистохшшческих реакции

% окрашенных клеток Интенсивность реакции.

Слабая Умеренная Выраженная

50-100% + ++ +++

10-49% + ++ ++

0-9% - - -

Электроипо-микроскопическое исследование.

Из 90 периферических мелкоклеточных лимфом, исследованных гистологически, 32 случая были исследованы электронно-микроскопическим методом (8 случаев В-ХЛЛ/ЛМЛ, 9 наблюдений ЛКМ и 15 - ЛКФЦ-1). Для электронно-микроскопического изучения был использован свежий и фиксированный в формалине материал, обработанный стандартным способом: фиксация в глютаральдегиде с дофиксацией в осмиевой кислоте, обезвоживание в спиртах восходящей концентрации и заключение в смеси эпоксидных смол (ЭПОН-812). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме ЛКБ-3 (Швеция), контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца, срезы просматривали и фотографировали в электронном микроскопе .ШМ-1200-ЕХ-11. Ультраструктурную оценку вариантов периферических

мелкоклеточпых лимфом проводили на основании ранее разработанной классификации опухолевых клеток [РаПхлип Н.Т. с соапт. 1981, 1990, Райхлин Н.Т., Смирнова Е.А. 1984].

Из каждой опухоли вырезали 5 -10 кусочков, взятых из разных участков. В среднем исследовалось по 5 сеток. В каждой сетке подсчитывали по 100 клеток, всего около 500 клеток из каждого случая. При наличии исследуемого признака не более чем в 30% просчитанных клеток, данное количество расценивалось градацией "мало", до 50% -"умеренно" и выше 50% - "много".

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием коэффициента Стыодепта для малых выборок, все числовые значения приведены с указанием среднего значения и стандартного отклонения. Достоверным считалась разница с вероятностью не менее 95% (р<0,05).

Результаты исследования.

В-кл сточный хронический лнмфолейкоз / лимфома из малых лимфоцитов.

Группу больных В-ХЛЛ I ЛМЛ составил 31 пациент. Средний возраст пациентов - 57 лет. Наибольшее количество больных В-ХЛЛ / ЛМЛ наблюдалось в возрастном промежутке от 40 до 70 лет (25 пациентов - 80,7%). По половому признаку в группе больных немного преобладали мужчины, в соотношении 1,4:1 (табл. 2).

Таблица 2.

Распределение больных В-ХЛЛ / ЛМЛ по возрасту и полу.

Количество больных Проценты %

Возраст, годы Мужчин Женщин Общее количество

20-29 - I 1 3,2

30-39 - 1 1 3,2

40-49 6 1 7 22,6

50-59 3 5 8 25,8

60-69 5 5 10 32,3

70-79 4 - 4 12,9

Всего 18 13 31 100

Средний возраст (годы) 58,11 54,69 56,67

Иммунофеиопптирование.

Во всех наблюдениях (100%) опухолевые клетки В-ХЛЛ / ЛМЛ экспрессировали общин лейкоцитарный антиген CD45 и антиген HLA -DR. Все лимфомы имели B-клеточный фенотип - экспрессировали маркеры CD 19; CD20; CD79a и не экспрессировали линейные Т-клеточныс антигены CD4; CD7; CD8, CD45RO. Реактивные Т-лимфоциты в исследованных лимфатических узлах присутствовали в единичном количестве вблизи сосудистых стенок или небольшими группами по периферии опухолевого роста.

В 100% случаев ЛМЛ на опухолевых клетках наблюдали мембранную экспрессию маркеров CD5. Отмечено, что выраженность экспрессии молекул CD5 на опухолевых клетках В-ХЛЛ / ЛМЛ была не однородной.

Экспрессия антигенов CD23 была установлена во всех случаях ЛМЛ. В 25 (96,2%) наблюдали яркую мембранную реакцию на большинстве опухолевых клеток, в 1 наблюдении (3,8%) реакция была слабо положительной.

ФДК (CD21+; CD23+) были выявлены в трех (11,5%) из 26 исследованных случаев В-ХЛЛ / ЛМЛ. Они располагались в остаточных зародышевых центрах фолликулов.

В восьми случаях (33,3%) реакция с антигенами CD38 была позитивной, степень выраженности экспрессии этого маркера была неоднородной.

Экспрессия белка циклин D1 в ядрах опухолевых клеток В-ХЛЛ / ЛМЛ не установлена. Антиген CD 10 на опухолевых клетках также не был обнаружен.

При изучении профиля экспрессируемых иммуноглобулинов: IgA, ' IgG, IgM отмечено, что в большинстве случаев (91,7%) имелась выраженная, моноклональная экспрессия IgM в большинстве опухолевых клеток. В одном случае (8,2%) реакция с IgM была слабая.

Гистологическая картина.

Цитоморфологически все лимфомы этой группы были представлены, главным образом, мелкими опухолевыми клетками.

В 24 случаях (77,4%) лимфондные клетки обладали ровными, округлыми ядрами и узким ободком цитоплазмы. В 3 наблюдениях (9,7%)

большинство клеток имели плазмоцитоидпую дифферепцировку -широкий ободок пиронинофнльной цитоплазмы. В 4 образцах (12,9% случаев) ядра опухолевых клеток были с неровными, выщербленными контурами мембраны.

С учетом преобладания в опухолевом инфильтрате клеток с округлыми ядрами, с плазмоцитоидной дифференцировкой или с центроцитоидными ядрами нами было выделено три морфологических подварианта В-ХЛЛ / ЛМЛ.

Клетки средних размеров - пролимфоцнты и крупные клетки -параиммунобласты встречались во всех наблюдениях. Пролимфоцнты и параиммунобласты среди мелкоклеточного пролиферата в 23 наблюдениях (74,2%) В-ХЛЛ / ЛМЛ присутствовали в виде скоплений -псевдофолликулов. Соответственно, в 8 (25,8%) случаях опухолевый рост имел вид монотонного, диффузного инфильтрата без псевдофолликулов.

Митотическая активность среди опухолевых клеток с округлыми, центроцитоидными ядрами и лимфоцитов с плазмоцитоидной дифференцировкой существенно не различалась и варьировала в диапазоне от 4 до 20 фигур митозов, в среднем 8,6±4,4 на 10 п.з.м. при увеличении 400.

В 6 случаях (19,4%) в лимфатических узлах можно было видеть сохранившиеся центры размножения вторичных лимфоидных фолликулов.

Фиброзная капсула лимфатических узлов во всех случаях В-ХЛЛ / ЛМЛ оставалась тонкой, не склерозированной. Строма лимфоузлов также не имела признаков склероза.

Ультраструктурное исследование.

Электронно-микроскопически были изучены 9 случаев В-ХЛЛ / ЛМЛ. По ультраструктурным признакам в группе В-ХЛЛ / ЛМЛ преобладали клетки с ровными, округлыми контурами ядерной мембраны. Цитоплазма этих клеток была бедна органеллами. Лишь в трех наблюдениях ядра опухолевых клеток имели инвагинации, придающие их контурам угловатые очертания. Эти варианты соответствовали лимфомам с классической и центроцитоидной цнтоморфологией, выделенным на светооптическом уровне.

Лимфома из клеток мантпн лнмфоидиого фолликула.

В исследуемую группу больных ЛКМ вошли 24 человека. Возраст больных колебался в пределах от 35 до 74 лет. Средний возраст больных составил 61,5 года (у мужчин 59 лет, у женщин 66 лет). Наибольшее количество наблюдений (21 больной - 87,5%) распределились в возрастном промежутке от 50 до 74 лет. В исследуемой группе больные мужского пола преобладали над больными женского пола в отношении 2:1. (табл.3.)

Таблица 3.

Распределение больных ЛКМ по возрасту и полу.

Возраст, годы Количество больных Проценты %

Мужчин Женщин Общее количество

30-39 - 1 1 4,2

40-49 2 - 2 8,4

50-59 6 - 6 25

60-69 5 2 7 29,2

70-79 3 5 8 33,2

Всего 16 8 24 100%

Средний возраст (годы) 59,37 66,13 61,62

Иммунофенотипирование.

Во всех исследованных случаях (100%) опухолевые клетки экспрессировали общий лейкоцитарный антиген CD45 и антигены HLA-DR. Также в 100% случаев они несли на мембране маркеры В-лпнейной дифференцировки CD19, CD20, CD79a, и отсутствовала реакция с маркерами Т- линейной дифференцировки CD3, CD4, CD7, CD8, CD45RO. Небольшие группы реактивных Т-лимфоцитов выявлены вблизи сосудов, субкапсулярно, по периферии опухолевого роста.

Во всех наблюдениях ЛКМ на опухолевых клетках установлена экспрессия антигенов CD5. Выраженность экспрессии CD5 была не однородной. Молекулы CD23 на опухолевых клетках в 95,2% случаев (20 наблюдений) отсутствовали, при этом крайне слабая экспрессия этого антигена установлена в 1 случае ЛКМ.

Антигены CD 10 не обнаружены ни в одном случае ЛКМ.

У 16 больных (66,6%) в опухолевом пролнферате ЛКМ имелись ФДК (С021+, СЭ23+).

В 85,7% случаев ЛКМ (18 наблюдении) выявлена гппсрэкспрсссия онкопротеина Циклим 0!, кодируемого геном ВСП, образуемого в результате хромосомной аберрации 1(11; 14)(я 13;я32).

В 8 случаях (88,9%) ЛКМ выявлена моноклональпая экспрессия 1цМ большинством клеток.

Экспрессия молекул С038 установлена в б случаях (35,3%) ЛКМ -реакция была слабой на части опухолевых клеток.

Гистологическая картина.

По морфологии опухолевых клеток все случаи были поделены па классический и бластоидный подварианты ЛКМ.

В 16 случаях ЛКМ (66,7%) опухоль состояла из мелких лимфоидных клеток. В 5 случаях (20,8%) опухоль была представлена клетками средних размеров.

Мелкие и средние опухолевые клетки имели неправильно-округлые, центроцитоидные ядра. Среди мелкоклеточного инфильтрата в 1 случае ЛКМ присутствовали скопления клеток с плазмоцитоидной дифференцировкой.

Крупные клетки в опухолевом инфильтрате встречались крайне редко. Единичные .или группами по 2-3 клетки, напоминавшие центробласты, обнаруживались, главным образом, в области остаточных зародышевых центров лимфоидных фолликулов. '

Однородность клеточного состава опухоли - размеров клеток, форм ядер в пределах каждого конкретного случая, обуславливала монотонность опухолевого инфильтрата в 100% случаев ЛКМ из мелких и средних клеток. 4

В 3 случаях ЛКМ (12,5%) опухолевые клетки имели бластную морфологию. Из этой группы ЛКМ, в одном случае опухоль была представлена, в основном, опухолевыми клетками типа центробластов и в 2 наблюдениях — типа лимфобластов.

Во всех трех наблюдениях бластоидных ЛКМ в опухолевом инфильтрате присутствовало большое количество апоптотических телец.

В ЛКМ из мелких клеток количество фигур митозов составило в среднем 11,46+0,86 на 10 п.з.м. (ув.400), из средних клеток - 30,25+4,5 (на 10 п.зм. ув.400). В трех случаях бластоидных ЛКМ митотическая

активность равнялась 89+10,8 митозов на 10 п.з.м. Отличия между количеством митозов среди разных подвариантов ЛКМ были статистически достоверными (р<0,05).

В большинстве случаев (15 наблюдений - 62,5%) ЛКМ опухоли имели диффузный характер роста, в 9 случаях (37,5%) - нодулярно-диффузный тип роста клеток. В большинстве случаев подули не имели четких границ, "сливались" с участками диффузного роста.

Остаточные зародышевые центры лимфондных фолликулов среди опухолевого инфильтрата были обнаружены в 6 наблюдениях (25%). Границы зародышевых центров были не четкими, в результате центростремительного роста опухолевых клеток.

Единичные реактивные плазматические клетки, Т-лимфоциты и крайне редко эозннофилы, тучные клетки и гистиоциты располагались преимущественно вблизи капилляров и капсулы.

ФДК были обнаружены в семнадцати наблюдениях ЛКМ (70,8%). ФДК располагались как в нодулях, так и в участках диффузного роста.

Соединительно-тканная капсула лимфатических узлов была тонкой в 94,7% ЛКМ (18 наблюдений из 19 исследованных лимфоузлов). Строма ЛКМ также не была склерозирована в большинстве случаев (в 23 наблюдениях - 95,8%). В одном случае (4,2%) нами отмечено сочетание грубой склерозированной стромы и склерозированной капсулы.

Инфильтративный рост опухолевых клеток за капсулой лимфатических узлов в окружающей жировой ткани наблюдался в 17 случаях (89,5%) ЛКМ.

Улыпраструктурное исследование.

Электронно-микроскопическое исследование было проведено в 8 "случаях ЛКМ. К особенностям ультраструктурного строения можно было отнести плотное расположение клеток, слегка неровные округлые контуры ядер мелких клеток, присутствие глубоких инвагинаций в ядрах средних клеток. Крупные клетки имели бластную морфологию. Среди опухолевых клеток можно было видеть тонкие темные отростки ФДК.

Лимфома из клеток фолликулярного центра 1 цитологической степени.

Всего исследовано 35 больных ЛКФЦ-1. Средний возраст больных составил 53 года. Наибольшую по численности группу больных ЛКФЦ-1 составили больные в возраст от 40 до 60 лет (21 наблюдение - 60%). Среди больных мужчин и женщин, несколько преобладали женщины в соотношении 1: 1,2. Распределение больных ЛКФЦ-1 по возрасту и иолу представлено в табл. 4. Объектом исследования послужили лимфатические узлы.

Таблица 4.

Распределение больных ЛКФЦ-1 по возрасту п полу.

Возраст, годы Количество больных Проценты %

Мужчины Женщины Общее количество

20-29 1 1 2,8

30-39 2 I 3 8,6

40-49 3 7 10 28,5

50-59 6 5 11 31,3

60-69 2 4 6 17,4

70-79 2 2 4 11,4

Всего 16 19 35 100%

Средний возраст (годы) 52,87 53,16 53 /

Иммуиофеиотипирование.

Все лимфомы этой группы имели экспрессию молекул главного .комплекса гистосовместимости HLA-DR, экспрсссировали общий лейкоцитарный антиген CD45. Во всех наблюдениях ЛКФЦ-1 опухолевые клетки имели В-липейный иммунофенотнп - экспрсссировали антигены CD19, CD20, CD79a и не экспрсссировали маркеры Т-линейной дифференцировки CD3, CD4, CD7, CDS, CD45RO. Реактивные Т-лимфоциты располагались, главным образом, в межнодулярных прослойках и единичные клетки визуализировались в проекции опухолевых нодулей.

Ни в одном из исследованных случаев ЛКФЦ-1 на клетках не был выявлен антиген С05. Экспрессия активационного антигена С023 на мембране опухолевых клеток была обнаружена в 12 наблюдениях (37,5%) из 32 исследованных ЛКФЦ-1. Выраженность экспрессии этого антигена варьировала от случая к случаю. В 20 наблюдениях реакция отсутствовала (62,5%).

В 9 случаях (42,9%), из 21 исследованных, опухолевые клетки ЛКФЦ-1 экспрессировали антиген СОЮ. Экспрессия молекул СОЮ не была мономорфной.

В 21 наблюдении (70%) ЛКФЦ-1 в опухолевом инфильтрате были установлены скопления или дискретно расположенные ФДК (С021+, С023+).

Во всех 15 исследованных случаях (100%) отмечена экспрессия иммуноглобулинов класса М, из этого числа в 5 лимфомах наблюдали коэкспрессию иммуноглобулинов класса М и О. Выраженность экспрессии наблюдаемых иммуноглобулинов была не однородной.

Экспрессия онкопротеина Циклин 01 не обнаружена ни в одной ЛКФЦ-1.

В 15 случаях (48,4%) установлена экспрессия молекул С038.

Гистологическая картина.

По клеточному составу все опухоли были представлены мелкими и средними клетками с единичными крупными бластными клетками.

Мелкие и средние опухолевые клетки имели морфологию центроцитов вторичных зародышевых центров. Единичные крупные клетки соответствовали центробластам.

Строение лимфатических узлов во всех наблюдениях ЛКФЦ было полностью стерто за счет пролиферации опухолевых клеток. В 21 наблюдении (60%) опухолевые клетки формировали нодулярные структуры. Нодули, как правило, имели четкие границы, располагались равномерно по срезу лимфатического узла. В 9 наблюдениях (25,7%) опухолевый рост имел смешанный, нодулярно-диффузный характер. В 5 случаях (14,3%) опухолевые клетки росли диффузно.

Количество митотических фигур в исследуемых лимфомах варьировало в пределах от 8 до 38 в 10 п.з.м (ув.400) и в среднем составило 20,76±7,41 на 10 п.з.м..

Реактивный компонент был представлен, главным образом, Т-лимфоцитами, единичными плазматическими клетками, оозннофилами и тучными клетками и гистиоцитами. Реактивные клетки располагались в основном по периферии опухолевых подулей - в межнодуляриых прослойках и/или небольшими скоплениями вблизи кровеносных сосудов в участках диффузного роста.

ФДК выявлены во всех случаях с нодуляриым и со смешанным типом роста ЛКФЦ-1.

Коллагеновые волокна и участки склероза в стромс опухоли, главным образом, располагались вокруг подулей, а в участках диффузного роста в виде линейных прослоек.

В 9 наблюдениях ЛКФЦ-1 (25%) в центре опухолевых подулей отмечено экстрацеллюлярное гиалиноподобное вещество.

Капсула лимфатических узлов в 20 случаях (69%) ЛКФЦ-1 (из 29 наблюдений, где возможно было проследить ее состояние) была в той или иной степени склерозированной. И, соответственно, в 9 наблюдениях (31%) соединительно-тканная капсула была топкой. Опухолевые клетки в большинстве случаев инфильтрировали капсулу, расщепляя се и образуя нодулярные скопления в ее пределах.

Во всех отмеченных выше 29 случаях ЛКФЦ-1, где можно было оценить степень распространения опухоли в окружающую ткань, нами обнаружен широкий перинодальный рост опухолевых клеток.

В одном из наблюдений лимфома состояла из опухолевых клеток с округлыми контурами ядер.

Улыпраструктурпое исследование.

Электронно-микроскопически изучено 15 лимфом. 'Ультраструктурные особенности клеток характеризовались неправильными контурами ядер - глубокими инвагинациями мембраны. Во всех наблюдениях отмечалось наличие крупных клеток с бластиой морфологией. В единичных случаях ЛКФЦ-1 отмечалось большое количество ядерных карманов. В части наблюдений можно было видеть тонкие пучки коллагеновых волокон, располагавшиеся межклеточпо.

Таким образом, при анализе иммунофенотипических результатов установлено, что каждая форма периферических мелкоклеточных лимфом имеет достаточно стандартный фенотип, но, при этом, их морфологический спектр достаточно широк.

Для дифференциальной диагностики этих заболеваний необходимо отмстить наиболее специфические черты каждой из описываемых лимфом.

Все лимфомы экспрессировали молекулы главного комплекса гистосовместимости 2 класса (HLA-DR) и общий лейкоцитарный антиген (CD45). Имели В-линсйный иммунофенотип.

Наличие коэкспрессии молекул CD5 и CD23 на мембране опухолевых клеток было специфично для ЛМЛ, тогда как на мембране опухолевых клеток ЛКМ присутствовали маркеры CD5 и отсутствовали антигены CD23. Для ЛКФЦ-1 было характерно отсутствие антигенов CD5, а экспрессия CD23 наблюдалась только в части случаев.

Гиперэкспрессия белка циклина D1 была специфична только для ЛКМ и ни в одном случае ЛМЛ и ЛКФЦ-1 не наблюдалась.

Наличие молекул CD 10 была выявлено в одной трети случаев ЛКФЦ-1.

Фолликулярно-дендритные клетки выявлялись как в ЛКМ, так и ЛКФЦ-1 (см. табл. 5).

Все описываемые лимфомы состояли из мелких лимфоидных клеток. Единичные бластные клетки всегда присутствовали среди клеточного субстрата ЛМЛ и ЛКФЦ-1. При ЛМЛ это были параиммунобласты, при центрофолликулярных лимфомах - центробласты.

Форма ядер опухолевых клеток в высоком проценте наблюдений позволяет провести дифференциальную диагностику между изучаемыми лимфомами. Так для клеток типичных ЛМЛ характерны округлые ядра. Для клеток мантийноклеточных лимфом более характерны ядра с неправильно-округлыми контурами, имеющие вдавления, выщербленность. Для клеток ЛКФЦ-1 контуры ядер были угловатыми, расщепленными.

Характер роста опухолевых клеток лимфом имеет также специфические черты. Диффузный тип с наличием псевдофолликулов встречался только при ЛМЛ. Присутствие псевдофолликулов надежный диагностический признак ЛМЛ, однако, их отсутствие не противоречит

диагнозу ЛМЛ. Фолликулярный рост, при котором подули хорошо отграничены, с небольшими вариациями в размере п форме указывал па центрофолликулярную природу лимфомы. ЛКМ имели как диффузный, так и смешанный диффузно-нодулярный тип строения. При смешанном характере роста подули были разных размеров с тенденцией к слиянию между собой и участками диффузного роста.

Соединительно-тканная капсула лимфоузлов обычно оставалась интактной при ЛМЛ и ЛКМ. Склероз и расщепление капсулы был более специфичен ЛКФЦ-1 (см. табл. 6).

При ультраструктурном исследовании в типичных случаях лпмфом характерными признаками следует считать округлые контуры ядерной мембраны при ЛМЛ, неровные ее контуры при ЛКМ и глубокие инвагинации мембраны ядер при ЛКФЦ. Также в части наблюдений ЛКФЦ определялись ядерные карманы.

Перечисленные морфологические критерии дифференциальной диагностики справедливы для типичных форм ЛМЛ, ЛКМ и ЛКФЦ. В случаях атипичной морфологии лпмфом необходимо опираться па исследование иммуиофенотипа.

Таблица 5.

Иммупофенотппичеаспе сопоставления периферических мелкоклеточных лпмфом.

ЛМЛ ЛКМ ЛКФЦ-1 '

ньл-оя + + +

СЭ45 + + +

СО 19 СЭ20 С079а + + +

СОЗ С04С08 - - -

С05 + + -

СЭ23 + - -/+ (40%)

Циклим 01 - + (85%) -

СОЗ 8 -/+ (20%) -/+ (35%) +/- (50%,)

СОЮ - - -/+ (30%)

ФДК - + (рассеянные) + (организованная сеть)

Иммуиоглобулимы 1кМ 1ВМ !ВМ/ 1цО

Таблица 6.

Морфологические сопоставления периферических мелкоклсточных лнмфом.

В-ХЛЛ/ЛМЛ ЛКМ ЛКФЦ-1

Мелкие клетки + + +

Округлая форма ядер + - -

Неправильная форма ядер -/+(13% центроцитоидные) + (центроцитоидные) + (расщепленные -центроциты)

Единич. крупные клетки + (параиммупобласты) - + (цситробласты)

Диффузи характер роста + +/- -/+

Псевдофолликуляриый тип роста +/- - -

модулярный характер роста - -/+ +

топкая капсула лимфоузла + +/- -/+

Склероз, расщепление капсулы лимфоузла - - +/-

колич. митозов наЮп.з.м. (ув.400) 8,6±2,4 21 ±2,6 (89±10,8*) 20,7±7,4

* - количество митозов при бластном варианте J1KM

Выводы.

1. В-ХЛЛ/ЛМЛ, Л КМ, ЛКФЦ-1, выделенные с учетом критериев диагностики REAL классификации, являются четко очерченными иммунофенотипическими единицами, между которыми отсутствуют промежуточные (переходные) формы.

Иммунофенотип клеток ХЛЛ/ЛМЛ: CD5+. CD23+, CDI0-. Циклин DI-. IgM+. Наличие ФДК (CD2I+, CD23+) не характерно.

Иммунофенотип ЛКМ представлен: CD5+, CD23-. CD 10-, Циклин D1+. IgM+. Характерно наличие как единичных, дискретных ФДК (CD2I+, CD23+), так и их скоплений.

Иммунофенотип ЛКФЦ-1: CD5-, CD23-/+. CD 10-/+, Циклин D1-IgM+, IgG-/+. Сеть ФДК (CD21+, CD23+).

2. Использование иммуногистохимического маркера Циклин D1 в дифференциальной диагностике лимфомы из клеток мантии значительно повышает степень достоверности диагноза.

3. Структура ядра н характер опухолевого роста являются наиболее информативными и стабильными морфологическими маркерами в диагностике периферических мелкоклеточных лимфом.

4. На основе морфологических критериев выделены: 13-ХЛЛ/ЛМЛ из клеток с округлыми ядрами, В-ХЛЛ/ЛМЛ с плазмоцитоидной дифференцировкой клеток, В-ХЛЛ/ЛМЛ из клеток с неправильно-округлыми ядрами.

. 5. Группа лимфом из клеток мантии разделена на ЛКМ из мелких клеток, ЛКМ из средних клеток и бластиую ЛКМ. Митотическая активность опухолевых клеток различных подтипов ЛКМ достоверно различались (р<0,05).

6. Среди лимфом из клеток фолликулярного центра 1 цитологической степени выделено: ЛКФЦ-1 с иодулярным характером роста, ЛКФЦ-1 с диффузным ростом.

7. Количество митозов в группе В-ХЛЛ/ЛМЛ (8,6±2,4 на 10 п.з.м ув.400) достоверно меньше, чем среди ЛКМ (21±2,6 па 10 п.з.м) и ЛКФЦ-1 (20,7±7,4 на 10 п.з.м) (р<0,05).

8. Ультраструктурными особенностями опухолевых клеток при В-ХЛЛ/ЛМЛ, ЛКМ, ЛКФЦ-1 являются контуры ядерной мембраны, ядерные карманы, наличие межклеточного преципитата.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Лимфома из клеток мантии. Тахаев З.В., Пробатова H.A., Тупицын H.H., Шолохова E.H., Османов Е.А. Архив патологии. №2, стр. 38-41, 2002г.

2. Дифференциальная диагностика периферических мелкоклеточных В-клеточных лимфом. Тахаев З.В., Пробатова H.A., Тупицын H.H., Смирнова Е.А., Шолохова E.H., Османов Е.А. Клиническая геронтология. №1, стр. 2002г.

3. Цитоморфологическая дифференциальная диагностика и оценка p53mut, bcl-2, CD95 при периферических В-клсточных мелкоклеточных лимфомах. Ковригина A.M., Лысюк Е.Ю., Пробатова H.A., Богатырев В.Н., Шолохова E.H., Барышников А.Ю., Поддубная И.В., Тахаев З.В. Архив патологии №5, стр. 30-34,2000г.

4. К диагностике лимфом из клеток мантии; анализ собственных наблюдений. Тахаев З.В., Пробатова H.A. Тезисы VIII научной конференции. Новые методы и разработки в онкоморфологии. Москва. с.77-79. 2001г.

5. Cytomorphological differential diagnosis and p53, bcl-2, CD95 expression in B-cell low grade lymphomas. Kovrigina A., Lysuk E., Probatova N., Bogatyrev V., Sholohova E., Baryshnikov A., Poddubnaya I., Takhaev Z. Abstracts for the 27lh European Congress of Cytology. 16th-19"' September, Lillehammer, Norwey. Cytopathology Vol.11 №5 p.411. 2000.

6. К диагностике лимфомы из малых лимфоцитов. Иммуноморфологическое исследование 31 случая. Тахаев З.В., Пробатова H.A., Тупицын H.H., Шолохова E.H., Османов Е.А. Архив патологии, 2002, № (Принята к публикации)

Список сокращений. REAL (a Revised European -American Classification of Lymphoid Neoplasms) В-ХЛЛ/ЛМЛ

Л KM

ЛКФЦ

ФДК CD

Is

MICA TdT

ЗЦЛФ

II.3.M.

Пересмотр Европейско-Американской классификации опухолей лимфоидной ткани.

В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз / лимфома из малых лимфоцитов.

Лимфома из клеток мантии лимфоидных фолликулов.

Лимфома их клеток фолликулярного центра.

Фолликулярные дендритические клетки Кластер дифференцировки Иммуноглобулины Моноклональные антитела Терминальная дезоксинуклеотидил трансфсраза

Зародышевый центр лимфоидного фолликула

Поле зрения микроскопа