Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Морфофункциональные особенности мегакариоцитарно-тромбоцитарного звена гемостаза у больных хроническими лейкозами

Бурнашева Ева Владимировна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МЕГАКАРИОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ЛЕЙКОЗАМИ

14 00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2007 г.

003177542

Работа выполнена в ФГУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шатохин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

O.A. Рукавицын

доктор медицинских наук И.Б. Лысенко

Ведущая организация Волгоградский государственный

медицинский университет

Защита состоится « с ^Ч_2007 г. в ^У часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д208 083 01 при ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (344037, г Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия 63)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Автореферат разослан « У! 2007 г

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Общая характеристика работы Актуальность темы исследования. Лейкозы - это злокачественные опухоли кроветворной ткани с преимущественным первичным диффузным поражением костного мозга, обладающие свойствами диссеминации практически во все органы и ткани Хронические формы этих заболеваний характеризуются способностью опухолевых гемопоэтических клеток к дозреванию до определенного уровня дифференцировки (Воробьев А И -2003, Окороков Н А -2004, Волкова М А -2007)

Повышенный интерес к проблеме хронических лейкозов объясняется значительным ростом заболеваемости гемобластозами в мире, регистрируемым на протяжении последних 10-15 лет (Давыдов МИ-2004) Наиболее распространенными видами лейкемии среди взрослого населения являются хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) и хронический миелолейкоз (XMJI), доля которых в структуре гемобластозов составляет соответственно - 30% и 20% (Волкова М А -2007) Заболеваемость ХЛЛ колеблется от 2,0 до 3,9 случаев на 100 000 населения, а хронического миелолейкоза - от 1,0 до 1,5 случаев на 100 000 населения (Рукавицын О А -2006)

По данным ВОЗ хронические гемобластозы составляют около 1% от всех причин смертности населения (Давыдов М И -2004). При этом необходимо отметить, что около 55% летальных исходов больных хроническими лейкозами обусловлено геморрагическими и инфекционными осложнениями (Абдулкады-ров К М -2006, Волкова М А -2007)

Патогенез геморрагического синдрома у больных хроническими лейкозами весьма сложен (Баркаган 3 С -2005) Во многом это определяет трудности прогнозирования развития витальных геморрагических осложнений и способы медикаментозной их коррекции как у больных хроническим лимфолейкозом, так и у пациентов с хронической миелоидной лейкемией У большинства больных хроническими лейкозами отмечается тромбоцитопения Однако количественные показатели содержания тромбоцитов в крови не позволяют определить характер этой цитопении, уточнить вероятность развития клинически-манифестированного геморрагического синдрома и выбрать

манифестированного геморрагического синдрома и выбрать оптимальную тактику медикаментозной терапии

Многими исследователями у пациентов с хроническими лейкозами отмечено развитие геморрагического синдрома при нормальном уровне тромбоцитов в периферической крови, что позволяет предполагать наличие качественной неполноценности этих клеток (Шитикова АС -1998, Баркаган 3 С -2002) Ряд авторов предполагает возникновение в этих ситуациях «аномальности» ме-гакариоцитов костного мозга за счет непосредственного или опосредованного влияния лейкозного окружения (Воробьев А И -2003) В связи с указанным, значительный интерес представляет изучение у больных хроническими лейкозами не только функциональных особенностей тромбоцитов, но и их предшественников - мегакариоцитов

В настоящее время не разработаны доступные объективные критерии прогнозирования развития геморрагических осложнений хронической лимфо-идной и миелоидной лейкемии, не определены временные взаимоотношения развития тромбоцитопатий и тромбоцитопений Не смотря на большое количество исследований в области патогенеза, диагностики и терапии хронических лейкозов, остается не решенным вопрос индивидуализации медикаментозной терапии у пациентов с высоким риском развития геморрагических осложнений

Таким образом, актуальность исследования определяется недостаточной ясностью патогенеза развития тромбоцитопений, отсутствием объективных прогностических критериев формирования геморрагического синдрома и способов индивидуализации гемостатической терапии у больных хроническими лейкозами

Цель исследования

Изучить патогенетические аспекты геморрагического синдрома, определить достоверные прогностические критерии его развития и методы оптимизации терапии хронических лейкозов

Задачи исследования

1 Изучить характер морфофункциональных нарушений тромбоцитов и мега-кариоцитов у больных хроническими лейкозами,

2 выявить возможные механизмы формирования геморрагического синдрома при хронических лейкозах,

3 определить объективные прогностические критерии развития геморрагических осложнений у больных хроническими лейкозами,

4 изучить влияние полихимиотерапии на функциональные и морфологические показатели мегакариоцитарно-тромбоцитарного звена гемопоэза,

5 разработать объективные критерии дифференцированного назначения медикаментозной цитостатической терапии больных хроническими лейкозами с высоким риском развития геморрагических осложнений

Научная новизна В диссертационной работе впервые

1 определена роль морфофункциональных нарушений мегакариоцитарно-тромбоцитарного звена гемопоэза в патогенезе сосудисто-тромбоцитарных и коагуляционных нарушений гемостаза при хронических лейкозах,

2 показана значимость цитохимических методов исследований в выявлении признаков дисмегакариоцитопоэза при хронических лейкозах,

3 выработаны прогностические критерии развития геморрагического синдрома при хронической миелоидной и лимфоидной лейкемии,

4 предложены критерии оптимизации медикаментозной терапии хронических лейкозов при высокой вероятности развития геморрагических осложнений

Практическая значимость

1 Установлена диагностическая значимость морфофункциональных нарушений мегакариоцитарно-тромбоцитарного звена гемопоэза в прогнозировании развития геморрагических осложнений хронических лейкозов,

2 определены морфо-функциональные критерии дифференцированного назначения медикаментозной терапии при хронических лейкозах с целью

уменьшения количества осложнений у больных с различной вероятностью развития геморрагических нарушений

Основное положение диссертации, выносимое на защиту Изучение морфофункциональных особенностей тромбоцитов, оцениваемых на основании их цитохимической и морфологической характеристики, целесообразно для раннего прогнозирования развития геморрагических осложнений и их своевременной коррекции у больных хроническими лейкозами Внедрение результатов работы в практику Разработанные методы прогнозирования развития геморрагических осложнений, оптимизации назначения медикаментозного лечения больных хроническими лейкозами внедрены в практическую работу отделения гематологии клиники Ростовского государственного медицинского университета, гематологического отделения областной клинической больницы №2 Полученные данные по клинико-морфологическим особенностям нарушений гемостаза у пациентов с хроническими лейкозами используются в учебном процессе на кафедрах внутренних болезней №2, гематологии и трансфузиологии ФГУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава РФ»

Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены на заседании Ростовского областного общества терапевтов в 2005 и 2006 гг , на совместной конференции Ростовского государственного медицинского университета и медицинского факультета университета города Кельн (31 мая 2006 года - Ростов-на-Дону). Апробация диссертации состоялась 31 августа 2007 года на совместном заседании кафедры внутренних болезней №2 и кафедры гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС ФГУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава РФ»

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит 187 страниц машинописного текста, 23 таблицы, 12 рисунков Состоит из введения, обзора литературы, характеристики клинического материала и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы Указатель литературы содержит 214 источников, в том числе 87 на русском и 127 на иностранных языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика материала, методов исследования и лечения В основу работы положен клинический материал 163 пациентов с хроническими лейкозами (96 больных хроническим лимфолейкозом и 67 — хроническим миелолейкозом) в возрасте от 31 до 78 лет, наблюдавшихся в гематологическом отделении клиники ФГУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава РФ» Срок наблюдения за больными составил 3,5±0,9 лет

В группе пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) анализировались стадии заболевания с использованием классификации Яа1, во внимание принимались больные с 1-ГУ стадиями лейкоза Все пациенты были разделены на три подгруппы с уровнем тромбоцитов в периферической крови более 100 х 10% (37 человек), с количеством тромбоцитов в крови менее 100 х 109/л (59 человек) Особое внимание уделялось пациентам уровнем тромбоцитов в периферической крови менее 30 х 109/л (28 человек) Для уточнения роли изучаемых показателей в формировании клинических проявлений геморрагического синдрома раздельно анализировались пациенты с клинической манифестацией нарушений гемостаза и без таковой

Больные хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в зависимости от содержания тромбоцитов в периферической крови были разделены нами на 3 группы пациенты с содержанием тромбоцитов в периферической крови менее 100 х 109/л (21 человек), с количеством тромбоцитов в периферической крови от 100

до 400 х 109/л (27 человек), больные с содержанием тромбоцитов в периферической крови более 400 х 109/л (19 человек) Пациенты с критической тромбо-цитопенией-количеством тромбоцитов менее 30 х 109/л в периферической крови - в виду малочисленности данного контингента больных (4 человека) в отдельную группу выделены не были Для изучения аспектов формирования клинических проявлений геморрагического синдрома сопоставлялись данные пациентов без клинических проявлений гемостазиологических нарушений и с наличием геморрагических осложнений Стадирование этой формы гемобластоза проводилось согласно классификации ВОЗ 2002 года Во внимание принимались пациенты только с I-II стадиями заболевания

Анализируемые подгруппы в каждой их групп больных хроническими лейкозами были сопоставимы по возрастному и половому составам

Всем пациентам хроническими лейкозами выполнялось исследовании общего анализа крови, инцизионная биопсия костного мозга При цитологических исследованиях мазков периферической крови и костного мозга обращали внимание на выявление признаков дисмегакариоцитопоэза С этой целью после паноптической окраски по Нохту подсчитывалось процентное соотношение юных, зрелых, старых и дегенеративных форм клеток

Оценка содержания мегакариоцитов в миелограмме проводилась как в цитологических мазках, так и в камере Фукс-Розенталя с подсчетом функционирующих и нефункционирующих клеток, указанием процентного содержания атипичных и диспластичных элементов

Оценка нарушений обменных процессов в мегакариоцитах костного мозга и тромбоцитах периферической крови больных хроническими лейкозами проводилась с использованием цитохимических методов исследования

Для объективизации суждений о содержании изучаемых веществ в клетках использована полуколичественная оценка цитохимических реакций, предложенная L Kaplow, модифицированная G Astaldi и L Verga (1957) (Коломний АИ, 1976, Хейхоу Дж ФГ исоавт, 1983) Количественным выражением ин-

тенсивности окраски клеток являлся средний цитохимический коэффициент Kaplow

В мегакариоцитах костного мозга и тромбоцитах периферической крови изучались содержание углеводов и активность альфа-нафтилацетатэстеразы (АНАЭ) Помимо этого в тромбоцитах проводилась цитохимическая оценка активности АТФ-азы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Для обнаружения в клетках углеводов проводилась PAS - реакция с использованием реактива Шифр - йодная кислота (метод McManus) Активность альфа - нафтилацетатэстеразы определялась по методу Пирса (1962)(Коломний АИ, 1976)

Цитогенегические, морфологические и цитохимические исследования выполнялись в центре клинической морфологии и генетики Ростовского государственного медицинского университета (руководитель-к м н Куцев С И.)

Для определения характеристики сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза всем пациентам выполнялись исследования манжеточная проба, время кровотечения по Дьюке Агрегационная функция тромбоцитов оценивалась на стекле с помощью набора «Агрескин-тест» с универсальным индуктором агрегации фирмы «Технология-стандарт» (Баркаган 3 С , 1999)

С целью изучения роли морфо-функциональных нарушений клеток мега-кариоцитарно-тромбоцитарного ряда в патогенезе коагуляционных расстройств у больных хроническими лейкозами оценивали следующие показатели время рекальцификации плазмы, активированное парциальное тромбопластиновое время, протромбиновый индекс, содержание фибриногена, тромбиновое время, уровень антитромбина III, XII-A-калликреинзависимый фибринолиз При проведении указанных исследований использовались наборы производства фирмы «Технология- стандарт»

Цитологическая оценка мазков периферической крови и костного мозга, исследования показателей клеточного и коагуляционного гемостаза осуществлялись в клинической лаборатории Ростовского государственного медицинского университета (руководитель-к м н Нагорная Г Ю )

Иммунофенотипирование лимфоцитов крови и костного мозга выполнялось методом проточной цитофлюометрии с использованием моноклональных антител, конъюгированных флюорохромами флюоресциина изиотиоционата или флюэритрином (Филатов А В , 1990, Кузнецов В А и соавт, 1993,) Было исследовано содержание клеток, экспрессирующих В-линейные антигены CD 19, CD 20, CD23 (Van Rood и соавт, 1976)

Иммунологические исследования проводились на базе НИИ клинической иммунологии Ростовского государственного медицинского университета (руководитель - д м н , профессор Сизякина JIП)

С целью оценки влияния различных схем полихимиотерапии на основные звенья гемостаза больных XJIJI изучаемые морфофункциональные, биохимические показатели определялись до и после курсов лечения В этом разделе исследования сопоставлялись данные четырех выделенных групп больных хронической лимфоидной лейкемией получавшие лечение по схеме СОР-циклофосфан 400 мг/м2 в/в 1-5 дни, винкристин 1,4 мг/м2в/в в 1й день, предни-золон 60 мг/м2 внутрь 1-5 дни (18 человек); по схеме FluCycl- введение флуда-рабина в дозе 25 мг/м2 в течение Зх дней подряд в сочетании с введением цик-лофосфана в дозе от 200 мг/м2 до 350 мг/м2 (22 человека), CHOP- циклофосфан 750 мг/м2 в 1-й день, винкристин 1,4 мг/м2 в 1-й день, адриамицин (доксоруби-цин) 50 мг/м2 в 1-й день, преднизолон 40 мг/м2 внутрь с 1-го по 5-й дни (31 человек), CFOP-замена доксорубицина в схеме CHOP на флударабин, введение которого осуществлялось в дозе 25 мг/м2 в 1-й день, остальные препараты вводились в прежних дозах (25 человек)

У пациентов с хроническим миелолейкозом исследование клеточного и коагуляционного звеньев гемостаза проводилось на фоне лечения гливеком в суточной дозе от 400 до 600 мг (20 человек), гидроксимочевиной от 1000 до 4000 мг в день (28 человек) и малыми дозами цитозинарабинозида 20 - 40 мг в сутки подкожно (19 человек).

Статистический анализ материалов проводился методом вариационной статистики с помощью пакетов прикладных программ Excell и Statistica 6,0 for

Windows При статистическом анализе каждого признака были вычислены основные характеристики среднее, среднее квадратическое отклонение, стандартная ошибка среднего значения Вычисление достоверности различий между группами проводилось методами однофазного дисперсионного анализа с использованием t-критерия Стьюдента (Гланц С , 1999) Результаты исследования Нами изучены основные показатели периферической крови, костного мозга и основных звеньев гемостаза у больных хроническими лейкозами с различным содержанием тромбоцитов в периферической крови и разной степенью выраженности геморрагическим синдромом (ГС)

Глубина анемии, выраженность лейкоцитоза и абсолютного лимфоцитоза была значительно выше в группе больных XJIJI с тромбоцитопенией в периферической крови (р<0,05) Значимых различий при сравнении данных показателей у пациентов с разной степенью выраженности ГС выявлено не было Число тромбоцитов в группе обследуемых с клинической манифестацией ГС превышало количество кровяных пластинок у пациентов без признаков кровоточивости (66,82±8,9 х 109/л и 48,15±3,93 х 109/л, t=l,916, р<0,05), что свидетельствовало о превалировании функциональных нарушений клеток мегакариоцитарно-тромбоцитарного аппарата в генезе кровоточивости у больных XJIJI

При XMJI содержание лейкоцитов, так же как и абсолютное количество незрелых клеток нейтрофильного ряда, было значительно выше в группе обследуемых с тромбоцитопенией в периферической крови (84,5±И,21 х 109/л, р<0,05) и при наличии ГС (99,45±16,14 х 109/л, р<0,05) Уровень гемоглобина был достоверно снижен у больных с кровоточивостью (98,25±5,3 г/л) Количество тромбоцитов у пациентов ХМЛ при наличии клинических проявлений ГС было ниже-135,16±24,12х 109/л, чем у больных без геморрагий-214,92±21,43х 109/л (t=3,16, р<0,05), что могло свидетельствовать об определяющей роли тромбоцитопении в генезе формирования геморрагических нарушений у больных XMJI Тем не менее, снижение содержания тромбоцитов в периферической крови у основной массы обследуемых не достигало критических значений

Для выявления качественной неполноценности тромбоцитов у больных хроническими лейкозами, нами был проведен ряд исследований по обнаружению функциональной несостоятельности кровяных пластинок

Морфологическое исследование мазков периферической крови выявило наличие значительного количества тромбоцитов с признаками дисплазии

Изменение структурной организации тромбоцитов у больных ХЛЛ характеризовалось повышением патологических форм клеток Выраженное увеличение форм раздражения тромбоцитов до 8,2±2,85% (1=0,86, р<0,05) было обнаружено при уровне кровяных пластинок менее 30 х 109/л У пациентов с клиническими проявлениями ГС преобладали дегенеративные формы (7,23±0,98%, р<0,05)

При ХМЛ во всех группах обследуемых было выявлено статистически значимое увеличение форм раздражения, наибольшие изменения были отмечены у больных с ГС (9,5±1,17%, р<0,05) Увеличение дегенеративных форм регистрировалось у пациентов с ГС (6,5±0,52%, р<0,05) и с гипертромбоцитозом (6,3±0,49, р<0,05) Выявлена взаимосвязь между количеством дегенеративных форм тромбоцитов (г=+0,8) и общим уровнем кровяных пластинок в группе обследуемых с количеством тромбоцитов более 400 х 109/л, что может быть обусловлено удлинением продолжительности жизни тромбоцитов

Кроме этого, для выявления функциональной несостоятельности тромбоцитов, мы определяли длительность кровотечения по Дюке и время агрегации кровяных пластинок на стекле с универсальным индуктором агрегации (УИА) Однако достоверных отличий указанных показателей у обследуемых с разной степенью выраженности ГС выявлено не было Таким образом, использование данных показателей позволяло выявлять больных хроническими лейкозами только с выраженными нарушениями агрегационной функции тромбоцитов и не являлось объективным ранним критерием развития клинически значимого геморрагического синдрома

Для оценки вклада гипопродукционной тромбоцитопении в развитие геморрагического синдрома у больных хроническими лейкозами нами были со-

поставлены показатели тромбоцитов периферической крови и мегакариоцитов костного мозга

Абсолютное количество лимфоцитов в костном мозге было максимальным у пациентов ХЛЛ с тромбоцитопенией в периферической крови (145,28±77 х 10, р>0,05) Была обнаружена корреляция между содержанием лимфоцитов костного мозга и уровнем мегакариоцитов (г=-0,56) в данной группе больных Снижение общего количества мегакариоцитов и активных форм этих клеток у больных ХЛЛ происходило параллельно с уменьшением количества тромбоцитов в периферической крови Количество продуцирующих мегакариоцитов было минимальным у пациентов с критической тромбоцитопенией (1,62±0,34, р<0,05)

У больных ХЛЛ с признаками ГС количество мегакариоцитов при подсчете в камере Фукс-Розенталя было значительно меньше, чем у пациентов без кровоточивости (4,9±1,09 и 8,52±1,73 х 10, р<0,05) Однако уровень продуцирующих мегакариоцитов практически не отличался в обеих группах обследуемых Абсолютное содержание лимфоцитов в костном мозге было значительно выше у пациентов без ГС (153,74±24,65 и 72,25±11,16 х 10, р<0,05) Таким образом, можно говорить о том, что уровень лимфоидной метаплазии костного мозга определяет уровень мегакариоцитопении, но не влияет на выраженность ГС у больных ХЛЛ

У больных ХМЛ содержание как миелокариоцитов, так и мегакариоцитов в костном мозге было выше в группе обследуемых с гипертромбоцитозом в периферической крови (р>0,05) Количество мегакариоцитов с отшнуровкой тромбоцитов так же превалировало у пациентов с гипертромбоцитозом (р<0,05) Зафиксирована прямопропорциональная зависимость между количеством кариоцитов и содержанием кровяных пластинок в периферической крови (г=+0,92) в данной группе обследуемых Т е , повышение общего содержания мегакариоцитов у больных ХМЛ обусловлено преимущественным накоплением активных форм этих клеток, следствием чего является увеличение количества кровяных пластинок в периферической крови

Сравнение пациентов с различной степенью выраженности ГС выявило снижение содержания мегакариоцитов и повышение клеточности костного мозга у пациентов, имеющих клинические проявления кровоточивости (р<0,05) Редукция мегакариоцитарного ростка кроветворения была обусловлена преимущественным сокращением продуцирующих форм мегакариоцитов (5,6±1,12 и 21,17±4,8 кл/мкл, р<0,05) Указанные изменения сочетались с увеличением уровня бластов и промиелоцитов, нейтрофильных миелоцитов, эрит-робластов, статистически значимым повышением количества эозинофилов и базофилов на фоне снижения содержания палочкоядерных и сегментоядерных клеток Таким образом, развитие гипопродукции тромбоцитов, связанной с лейкозной метаплазией костного мозга, является одним из факторов, определяющих степень выраженности геморрагического синдрома у больных ХМЛ

Практически у всех больных хроническими лейкозами обнаруживались выраженные морфологические изменения мегакариоцитов Наиболее часто выявлялись следующие формы мегакариоцитов- голоядерные, мегакариоциты с неразделенным на доли ядром, мегакариоциты с разобщенным ядром, клетки с грубыми глыбками гликогена, выявляемыми при РА8-реакции, многоядерные мегакариоциты, клетки с уродливыми ядрами

У больных ХЛЛ с содержанием тромбоцитов более 100х109/л в периферической крови и не имеющих признаков ГС, в мазках костного мозга превалировали голоядерные формы (13,5±2,83%) и мегакариоциты с неразделенными ядрами (18,5±4,79%) У пациентов с ГС на фоне уменьшение продуцирующих форм мегакариоцитов происходило увеличение клеток с разобщенными ядрами (10,6±2,43%) Выявлена корреляция между количеством мегакариоцитов в костном мозге и числом голоядерных форм (г=+0,55), клеток с разобщенными ядрами (г=+0,99) в данной группе обследуемых

У пациентов ХМЛ с тромбоцитопенией отмечалось увеличение содержания мегакариоцитов с разобщенными ядрами и снижение продуцирующих форм мегакариоцитов (р<0,05) Для больных с гипертромбоцитозом было ха-

рактерно увеличение количества мегакариоцитов с неразделенными ядрами (35,3±12,4%, р>0,05)

При сопоставлении морфологических форм мегакариоцитов у пациентов ХМЛ с разной степенью выраженности ГС обнаружена тенденция увеличения клеток с разобщенными ядрами (8,1 ±2,1%) и неразделенным на доли ядром (28,7±4,6%), снижения количества продуцирующих форм мегакариоцитов у больных с кровоточивостью Корреляционная зависимость найдена между общим содержанием мегакариоцитов и клетками с разобщенными ядрами (г=+0,83) Таким образом, увеличение в костном мозге больных ХЛЛ мегакариоцитов с разобщенными ядрами, а у пациентов ХМЛ - клеток с неразделенным на доли ядром и разобщенными ядрами является неблагоприятным прогностическим признаком, свидетельствующем о возможном присоединении геморрагических осложнений

Для выявления наиболее ранних изменений функциональной активности клеток мегакариоцитарно-тромбоцитарного ряда, возникающих до появления тромбоцитопений и развития геморрагических осложнений, нами были сопоставлены цитохимические характеристики мегакариоцитов костного мозга и тромбоцитов периферической крови

Нарушения обменных процессов в клетках мегакариоцитарно-тромбоцитарного аппарата были зарегистрированы у больных ХЛЛ с различным содержанием тромбоцитов в периферической крови Цитохимические изменения тромбоцитов заключались в уменьшении содержания гликогена, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), АТФ-азы и повышении активности альфа-нафтилацетатэстеразы (АНАЭ) Указанные нарушения присутствовали у 56% больных с уровнем тромбоцитов более 100 х 109/л, у 72% больных с количеством тромбоцитов менее 100х109/л, у 85% обследуемых с содержанием тромбоцитов в периферической крови менее 30х109/л и у 100% больных с геморрагическим синдромом У пациентов с признаками кровоточивости наиболее значимым было увеличение среднего цитохимического коэффициента (СЦК) АНАЭ - на 60% по сравнению с нормальными значениями

(1,85±0,12, р<0,05) (табл 1) Выявлена корреляция этого показателя со временем агрегации (г=+0,83) в данной группе обследуемых Повышение активности АТФ-азы на 26% было отмечено у 34% больных с выраженной клинической манифестацией геморрагического синдрома, найдена корреляционная зависимость между содержанием тромбоцитов в периферической крови и активностью АТФ-азы в тромбоцитах (г=-0,89)

Таблица 1

Средний цитохимический коэффициент тромбоцитов периферической крови у больных ХЛЛ в зависимости от наличия геморрагического син-

дрома (ГС)

Содержание веществ и активность ферментов (СЦК) Группы обследуемых больных

С признаками ГС п=22 Без признаков ГС п=39

PAS (норма 2,12±0,38) 1,8±0,11 1,6±0,05

Гл6ФДГ(норма 2,04±0,18) 2,02±0,21 1,81±0,07

АТФ-аза (норма 1,84±0,16) 1,98±0,25 1,64±0,03

АНАЭ (норма 1,16±0,4) 1,85±0,12** 1,56±0,06'

Примечание - достоверные различия между показателями в группах больных с признаками ГС, без признаков ГС и нормальными значениями (р<0,05),

* - достоверные различия между показателями в группах обследуемых больных (р<0,05)

Пациенты ХЛЛ с уровнем тромбоцитов более 100 х 109/л в периферической крови и без признаков ГС, имеющие цитохимические нарушения в кровяных пластинках (повышение активности АНАЭ на 20%, АТФ-азы - на 15 % по сравнению с нормой) были отнесены в группу высокого риска по развитию клинически значимого геморрагического синдрома

При анализе цитохимических показателей мегакариоцитов костного мозга у больных ХЛЛ выявлено снижение содержания гликогена и уменьшение активности АНАЭ во всех группах обследуемых Однако при наличии геморрагического синдрома отмечено наименьшее отклонение уровня гликогена в мега-кариоцитах костного мозга от нормы (1,93±0,09, р>0,05) Наличие значительного количества мегакариоцитов с грубыми глыбками гликогена, корреляция между уровнем гликогена и количеством мегакариоцитов (г=-0,88) в сочетании

со снижением активности АНАЭ в мегакариоцитах могут свидетельствовать о функциональной неполноценности последних у больных ХЛЛ при наличии геморрагического синдрома

Цитохимические параметры тромбоцитов периферической крови больных ХМЛ характеризовались уменьшением содержания гликогена, активности Г6ФДГ и АТФ-азы, повышением активности АНАЭ, при этом наибольшие отклонения от нормы были зарегистрированы у больных с тромбоцитопенией в периферической крови (р<0,05) Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем продуцирующих мегакариоцнтов и содержанием гликогена в тромбоцитах у больных с тромбоцитопенией (г=+0,85) и у пациентов с клиническими проявлениями геморрагического синдрома (г=+0,78)

При сравнении содержания гликогена и активности ферментов у больных ХМЛ с разной степенью выраженности геморрагическим синдромом, было выявлено снижение уровня гликогена на 30% (р>0,05), активности Г6ФДГ на 25% (р<0,05) и АТФ-азы на 27% (р<0,05) по сравнению с нормой у пациентов с кровоточивостью Средний цитохимический коэффициент АНАЭ у больных ХМЛ с признаками ГС превышал нормальные значения на 68% (табл.2)

Таблица 2

Средний цитохимический коэффициент тромбоцитов периферической крови у больных ХМЛ в зависимости от наличия геморрагического син-

дрома (ГС)

Содержание веществ и активность ферментов (СЦК) Группы обследуемых больных

С признаками ГС п=12 Без признаков ГС п=21

РА8(норма 2,12±0,38) 1,49±0,19 1,64±0,09

Гл6ФДГ(норма 2,04±0,18) 1,55±0,12* 1,74±0,08

АТФ-аза (норма 1,84±0,16) 1,33±0,07* 1,52±0,07

АНАЭ (норма 1,16±0,4) 1,96±0,16** 1,62±0,09

Примечание ' - достоверные различия между показателями в группах больных с признаками ГС, без признаков ГС и нормальными значениями (р<0,05),

* - достоверные различия между показателями в группах обследуемых больных (р<0,05)

Динамическое наблюдение за пациентами с повышенной активностью АНАЭ в тромбоцитах показало, что вероятность развития витальных геморрагических осложнений у этой категории больных гораздо выше, чем у обследуемых с изменениями других цитохимических параметров в кровяных пластинках.

При сопоставлении цитохимических характеристик тромбоцитов и времени агрегации корреляционная связь этого показателя была выявлена с СЦК АТФ-азы (г=-0,78) и АНАЭ (г=+0,89) в группе больных с тромбоцитопенией в периферической крови, с СЦК АНАЭ у пациентов с клиническими проявлениями геморрагического синдрома (г=+0,81) Это свидетельствует о том, что изменение активности ферментов в кровяных пластинках может быть наиболее ранним проявлением их качественной неполноценности

Содержание гликогена в мегакариоцитах было достоверно снижено у всех больных ХМЛ У пациентов с клиническими проявлениями геморрагического синдрома уровень гликогена был ниже, чем у больных ХМЛ без геморрагии (1,3±0,01 и 1,44±0,12 соответственно, р>0,05) Выявлена прямая корреляция между содержанием гликогена в мегакариоцитах и уровнем продуцирующих мегакариоцитов, наиболее выраженная в группах больных с тромбоцитопенией в периферической крови и у пациентов с геморрагическим синдромом (г=+0,9 и г=+0,84)

Активность АНАЭ в мегакариоцитах также была снижена у всех обследуемых, при этом самые низкие показатели СЦК активности данного фермента (1,59±0,08, р<0,05) зафиксированы у пациентов ХМЛ с тромбоцитопенией в периферической крови У больных с клиническими проявлениями геморрагического синдрома активность АНАЭ была выше, чем у пациентов без признаков кровоточивости

В связи с активным участием тромбоцитов во всех фазах гемостатическо-го процесса, нами были проанализированы основные коагуляционные параметры у больных хроническими лейкозами Исследование плазменного звена гемостаза у больных ХЛЛ выявило незначительное повышение растворимых фиб-

рин-мономерных комплексов (РФМК) и замедление фибринолиза, более выраженное при тромбоцитопении Корреляционной зависимости между РФМК и уровнем тромбоцитов в периферической крови не было зафиксировано, что позволило говорить об отсутствии усугубляющего влияния ДВС-синдрома на тромбоцитопению в крови больных ХЛЛ Значимых различий между показателями коагулограммы пациентов с геморрагическим синдромом и больных ХЛЛ без геморрагий обнаружено не было Таким образом, изменения коагуляцион-ного звена гемостаза у больных ХЛЛ носят компенсаторный характер и могут быть расценены как корригирующий патофизиологический ответ системы гемостаза на имеющееся снижение уровня кровяных пластинок или их функциональную несостоятельность

При ХМЛ было отмечено значимое повышение времени рекальцифика-ции у больных с тромбоцитопенией в периферической крови (78,83±6,42 сек, р<0,05), незначительное снижение протромбинового индекса в группе пациентов с тромбоцитозом, тенденция повышения содержания фибриногена у больных 2й и Зй групп, тенденция увеличения продолжительности тромбинового времени во всех обследуемых группах Существенных отличий между основными показателями коагулограммы у пациентов ХМЛ с разной степенью выраженности геморрагического синдрома выявлено не было

С целью оценки вклада тромбоцитопении потребления, вызванной ДВС-синдромом, в развитие тромбоцитопении у пациентов ХМЛ, нами было проанализировано содержание РФМК во всех обследуемых группах Выявлено незначимое повышение растворимых фибрин-мономерных комплексов, более выраженное у больных с тромбоцитопенией в периферической крови (5,5±1,3 мг%, р>0,05) Цитохимические параметры кровяных пластинок у пациентов с нормальным и повышенным уровнем РФМК были примерно одинаковыми (р>0,05). Уровень антитромбина 3 был незначительно снижен у пациентов как с тромбоцитопенией, так и с тромбоцитозом в периферической крови Из этого следует, что в большинстве случае ДВС-синдром у больных ХЛЛ носил суб-

компенсированный характер и не мог приводить к существенному влиянию на уровень тромбоцитов в крови

Таким образом, полученные результаты еще раз свидетельствуют о том, что клиническая манифестация геморрагического синдрома при хронических лейкозах связана преимущественно с количественной либо качественной неполноценностью клеточного звена гемостаза Изменения коагуляционных параметров носят компенсаторный характер и могут быть расценены как корригирующий патофизиологический ответ системы гемостаза на имеющееся снижение уровня кровяных пластинок или их функциональную несостоятельность С целью уточнения влияния различных схем лечения на показатели тром-боцитарного звена гемостаза, а так же поиска объективных критериев индивидуализации терапии, нами проведена попытка сравнительной оценки эффективности некоторых вариантов медикаментозного лечения в наблюдаемых группах больных.

Увеличение содержания кровяных пластинок в периферической крови по сравнению с исходными значениями на фоне проводимых курсов ПХТ было выявлено у больных ХЛЛ с тромбоцитопенией (в 1,8-2,3 раза, р<0,05) Наиболее выраженные изменения зафиксированы при проведении схемы FC - отмечено увеличение числа кровяных пластинок при исходном содержании их в крови в количестве менее 30х109/л в 2,3 раза (t=2,14, р<0,05) Выявлена корреляция между снижением уровня лейкоцитоза и абсолютного лимфоцитоза в периферической крови и приростом тромбоцитов у пациентов с тромбоцитопенией при применении схем FC, СОР и CFOP У больных с уровнем кровяных пластинок в периферической крови более 100х109/л отмечено уменьшение общего содержания тромбоцитов на 17% при проведении схемы FC, на 28% - на фоне курса CFOP, на 12% - на фоне схемы CHOP

У пациентов ХЛЛ с клиническими проявлениями геморрагического синдрома незначительное повышение уровня тромбоцитов наблюдалось при проведении флударабинсодержащих курсов ПХТ - на 10%, при проведении схемы

CHOP - на 18%, при этом среднее содержание кровяных пластинок в крови оставалось ниже нормальных значений

Изменения среднего содержания морфологических форм кровяных пластинок были примерно одинаковыми при всех схемах лечения Уменьшение абсолютного содержания старых и дегенеративных форм тромбоцитов наряду со значительным увеличением форм раздражения (t=2,46, р<0,05) у пациентов с признаками кровоточивости на фоне курса химиотерапии по схеме FC можно рассматривать в качестве благоприятного прогностического признака

У пациентов XJIJI с количеством тромбоцитов в периферической крови более 100 х 109/л с признаками нарушенной функциональной активности кровяных пластинок при проведении курсов по схеме FC и CHOP отмечалась тенденция нормализации содержания гликогена и активности АНАЭ в тромбоцитах, что, скорее всего, обусловлено элиминацией качественно неполноценных тромбоцитов

У больных XJIJI с тромбоцитопенией в периферической крови и у пациентов, имеющих клинические признаки повышенной кровоточивости, на фоне терапии отмечалось снижение, по сравнению с исходным уровнем и нормальными значениями, содержания гликогена, активности ГбФДГ и АНАЭ в тромбоцитах При этом нормальные значения СЦК были зарегистрированы только при определении активности АНАЭ, которая была значительно выше нормы до начала лечения (1,85±0,1 и 1,46±0,07 соответственно, р<0,05) Выявлена прямая корреляционная зависимость между активностью АНАЭ в тромбоцитах и уровнем дегенеративных форм кровяных пластинок у пациентов с клинической манифестацией геморрагического синдрома (г=+0,78) после лечения, что подтверждает предположение о благоприятном влиянии проводимой химиотерапии на функциональное состояние тромбоцитов Наиболее выраженные отклонения СЦК ферментов и содержания гликогена от нормальных значений были отмечены после проведения курсов ПХТ по схеме СОР и CHOP, значительно менее выраженные изменения цитохимических параметров тромбоцитов были зафиксированы на фоне применения схем FC и CFOP

При сопоставлении цитохимических характеристик мегакариоцитов костного мозга до и после терапии выявлено снижение содержания гликогена у больных с различным количеством тромбоцитов Усугубление нарушений, имевших место до начала терапии, было более выраженным у пациентов с количеством тромбоцитов более 100 х109/л в периферической крови В группах больных с разной степенью выраженности ГС после лечения содержание гликогена было одинаковым у всех обследуемых Активность АНАЭ в мегакарио-цитах на фоне лечения стала выше только у пациентов количеством тромбоцитов более 100 х109/л в периферической крови (1,94±0,06 и 2,065±0,09, р>0,05) У больных с разной степенью выраженности ГС более существенное уменьшение активности АНАЭ отмечено в группе больных без геморрагий

У больных ХМЛ наиболее существенное снижение количества тромбоцитов в периферической крови происходило на фоне терапии цитозаром в дозе 2040 мг/сутки - на 40% по сравнению с исходными значениями (р<0,05). Уменьшение числа тромбоцитов на фоне лечения гидроксимочевиной и иматинибом было сопоставимым - на 11 и 9% соответственно Снижение уровня кровяных пластинок при приеме гливека сопровождалось нормализацией активности АТФ-азы (1,78±0,09, р<0,05) и АНАЭ (1,27±0,1, р<0,05) в тромбоцитах, тенденцией повышения содержания гликогена в мегакариоцитах (1,6±0,07, р>0,05) У пациентов с клиническими проявлениями кровоточивости указанные изменения сопровождались регрессией геморрагического синдрома без дополнительного назначения гемостатических препаратов и трансфузий компонентов крови На фоне лечения гидроксимочевиной существенных изменений цитохимические параметры тромбоцитов и мегакариоцитов не претерпевали Терапия цитозаром приводила к усугублению имеющихся нарушений - снижению содержания гликогена в тромбоцитах (1,36±0,11, р<0,05) и мегакариоцитах (1,22±0,08, р<0,05), уменьшению активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (1,43±0,05, р<0,05) и повышению среднего цитохимического коэффициента альфа-нафтилацетатэстеразы (2,14±0,16, р>0,05)

23

ВЫВОДЫ

1 Развитие геморрагических осложнений у больных хроническими лейкозами определяется преимущественно функциональными нарушениями клеток мегакариоцитарно-тромбоцитарного ростка кроветворения, которые опережают и сопровождают формирование тромбоцитопении в периферической крови

2 Формирование гипорегенераторной тромбоцитопении вследствие лей-козной метаплазии костного мозга определяет тяжесть геморрагических проявлений при хроническом миелолейкозе, но не влияет на формирование геморрагических осложнений и степень их выраженности у больных хроническими лимфолейкозами

3 Изменения структурной организации тромбоцитов в периферической крови в виде увеличения содержания дегенеративных форм до 7,23±0,98% при хроническом лимфолейкозе, 6,5±0,52% при хроническом миелолейкозе, форм раздражения до 8,2±2,85% при хроническом лимфолейкозе и 9,5±],17% при хроническом миелолейкозе являются неблагоприятным прогностическим критерием развития геморрагических осложнений у больных хроническими лейкозами

5 Морфологическими критериями функциональной неполноценности мегакариоцитов являются повышение мегакариоцитов с разобщенными ядрами (10,6±2,43%) в костном мозге больных хроническим лимфолейкозом, увеличение количества клеток с разобщенными ядрами (8,1±2,1%) и неразделенным на доли ядром (28,7±4,6%) в костном мозге пациентов с хроническим миелолейко-зом

4 Цитохимические признаки дисмегакариоцитопоэза являются ранними объективными прогностическими критериями определения вероятности развития витальных геморрагических осложнений Для пациентов хроническим лимфолейкозом неблагоприятным прогностическим фактором является повышение активности в тромбоцитах альфа-нафтилацетатэстеразы на 60% (1,85±0,12), активности АТФ-азы на 26% (2,31±0,09) У больных хроническим

миелолейкозом о высоком риске развития геморрагических осложнения свидетельствуют уменьшение активности в тромбоцитах АТФ-азы на 27% (1,35±0,12), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы на 25% (1,53±0,13) и повышение активности альфа-нафтилацетатэстеразы в тромбоцитах на 68% (1,94±0,18)

5 Курсы химиотерапии, содержащие флударабин, способствуют повышению уровня кровяных пластинок у больных XJIJI с тромбоцитопенией в периферической крови в 1,8-2,3 раза, оказывают благоприятное влияние на функцию тромбоцитов при нарушениях активности альфа-нафтилацетатэстеразы и содержания гликогена в кровяных пластинках больных с начальными проявлениями качественной неполноценности тромбоцитов

6 Улучшение функциональной активности тромбоцитов в периферической крови больных хроническим миелолейкозом на фоне терапии иматини-бом, а именно нормализация активности АТФ-азы (1,78±0,09) и альфа-нафтилацетатэстеразы (1,27±0,1) в тромбоцитах, повышение содержания гликогена в мегакариоцитах (1,6±0,07), является одним из ранних объективных критериев, определяющих позитивный ответ на этот вид таргентной терапии заболевания

Практические рекомендации

1 В качестве прогностических критериев развития геморрагических осложнений у больных хроническими лейкозами целесообразно использовать цитохимические признаки функциональной неполноценности тромбоцитов - изменение активности АТФ-азы и альфанафтилацетатэстеразы - даже при нормальном содержании кровяных пластинок в крови

2 Больным хроническим лимфолейкозом с высоким риском развития геморрагических осложнений при наличии тромбоцитопении предпочтительнее назначение схем полихимиотерапии, содержащих флударабин, схемы FC и CHOP улучшают функциональное состояние тромбоцитов у больных с качественной неполноценностью кровяных пластинок Больным хроническим миелолейкозом с качественной неполноценностью тромбоцитов целесообразно назначение препарата иматиниб (гливек)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Особенности нарушений функций тромбоцитов у больных хроническими лейкозами // В сб. «Материалы I съезда терапевтов Юга России» Ростов-на-Дону, 2000 С 49-50 (соавт Шатохин Ю В , Куцев С.И, Плескачева Н П )

2 Морфофункциональные особенности тромбоцитов в патогенезе геморрагических осложнений при хронических лейкозах // В сб «Материалы 56 итоговой научной конференции студентов молодых ученых и специалистов» Ростов-на-Дону, 2002 С 114

3 Особенности геморрагических нарушений у больных хроническими лейкозами II Сборник докладов и тезисов научно-практической конференции терапевтов ЮФО «Формулярная система, стандарты России в клинике внутренних болезней» Ростов-на-Дону, 2003 С 35

4 Влияние терапии препаратом иматиниб на мегакариотромбоцитопоэз у больных с хроническим миелолейкозом // В сб «Тезисы докладов 58 итоговой научной конференции молодых ученых и специалистов РостГМУ». Ростов-на-Дону, 2004 С 127 (соавт Зинченко Е Н)

5 Оптимизация диагностики и лечения неходжкинских зрелоклеточных лимфом и хронического лимфолейкоза // В сб «Труды IV научной сессии РостГМУ» Ростов-на-Дону, 2004 С 118-119 (соавт Шатохин Ю В , Снежко И В , Сизякина Л П)

6 Роль гливека в лечении хронического миелолейкоза, влияние на функциональные показатели мегакариоцитов костного мозга и тромбоцитов периферической крови // В сб «Труды IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета» Ростов-на-Дону, 2004 С 243-244 (соавт Шатохин Ю В , Нагорная Г Ю , Куцев С И, Отливщикова ВС)

7 Свертывающая и противосвертывающая системы крови (методы диагностики) // Методическое пособие для врачей гематологов, лаборантов, анестезиологов Ростов-на-Дону, 2004г 36 с (соавт Шатохин Ю В , Конева О В, Снежко И В , Шатохина О Н, Нагорная Г Ю ).

8 Хронический миелолейкоз // Сборник научных трудов «Современные достижения генетических исследований клинические аспекты» Выпуск 2 Ростов-на-Дону, 2004 С 175-176 (соавт ШатохинЮВ)

9 Влияние гливека на формирование геморрагических нарушений у больных хроническим миелолейкозом // Известия высших учебных заведений Северо-кавказский регион Естественные науки. Спецвыпуск 2006 С 172-173

10 Morphofunctional peculanties of platelets and megakaryocytes in patients with chronic myelogeneous leukemia treated with Imatimb // Haematologica reports «3rd internathional conference on thrombosis and hemostasis in cancer» October 1416,2005 Bergamo, Italy, 2005 P 83-84

11 Imatinib-induced disorder of platelet functions in patients with chronic myeloid leukemia // 4th Scientific symposium «Developing research for a common future», Rostov State Medical University Medical Faculty, Umversity of Cologne. 2006 P 62-63 (соавт Shatokhin Yu, Zeltzer A )

12 Хронический миелолейкоз патогенетические аспекты и современные подходы к лечению Влияние гливека на морфофункциональные показатели мегакариоцитов и тромбоцитов // Материалы IV научно-практической конференции ЮФО «Современные достижения генетических исследований- клинические аспекты» Кисловодск, 2006. С 49-55 (соавт Шатохин Ю В, Попова И В , Зельцер А Н )

13 Неходжинские лимфомы // Материалы IV научно-практической конференции ЮФО «Современные достижения генетических исследований клинические аспекты» Кисловодск, 2006 С 154-171 (соавт Шатохин Ю В , Шатохи-на О Н, Герасимова О В , Куцев СИ)

14 Лимфопролиферативные заболевания и синдромы (дополненное и переработанное) // Методическое пособие для врачей - гематологов, онкологов, терапевтов, иммунологов Ростов-на-Дону 2006 117 с (соавт СнежкоИВ, Лемешко С И, Шамрай ВС)

15 Геморрагический синдром у больных хроническими гемобластозами // Аннотации докладов и материалов дня науки 60-й итоговой научной конференции молодых ученых, Ростов-на-Дону, 2006 С 65

16 Анализ мутаций ВСЯ-АВЬ киназного домена у иматиниб резистентных пациентов с хроническим миелоидным лейкозом //Кардиология СНГ 2007 Т V №2 С 269-270 (соавт Куцев С И, Вельченко М В , Зельцер А Н, Морданов С В , Шатохин Ю В )

Печать цифровая Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Формат 60x84/16 Объем 1,0 уч -изд -л Заказ № 547 Тираж Л^экз Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г Ростов-на-Дону, ул Суворова, 19, тел 247-34-88