Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Морфофункциональные нарушения гемолимфоциркуляции при длительном приёме комбинированных оральных контрацептивов

На правах рукопи

003056236

Ванурина Ирина Анатольевна

Морфофункциональные нарушения гемо-лимфоциркуляции при длительном приёме комбинированных оральных контрацептивов

14.00.01 - Акушерство и гинекология 14.00.02 - Анатомия человека

Автореферат

Диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Самара - 2007

003056236

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Целкович Людмила Савельевна

доктор медицинских наук, академик РАМТН, профессор Марков Игорь Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Липатов Игорь Станиславович,

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Чучков Виктор Михайлович

Ведущее учреждение: ГОУ ДПО «Казанская государственная

медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и

социальному развитию, а 1/)^°

Защита состоится чСМу » г в Л С/ часов на заседании

диссертационного совета К 208.085.01 в Самарском государственном

медицинском университете (443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 «Б».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Самарского

государственного медицинского университета (443001, г.Самара,

ул. Арцыбушевская, 171) лп

Автореферат разослан « Ч г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор <^7 у Л.И.Захарова

Актуальность исследования Современные комбинированные оральные контрацептивы широко применяются не только для профилактики абортов, но и для снижения риска развития рака эндометрия, доброкачественных и злокачественных опухолей яичников, эндометриоза, остеопороза, гиперандрогении (Прилепская В.Н., 1997; Тарасова М.А, Капустин С.Н., 1998; Двуреченская О.В., 2004; Knopp. К.Н., 1993).

Потребность в использовании контрацептивных препаратов с профилактической и терапевтической целью возрастает у женщин старше 35 - 40 лет (Тарасова М.А., Савельева И.С., 1998; Дж. Ньютон, 1999). Считается, что применяемые в настоящее время технологии для получения комбинированных оральных контрацептивов с низким содержанием гормонов позволяют использовать их большинству женщин любого возраста, как эффективную и обратимую форму контрацепции. Новые прогестагены (дезогестрел, нонгестимат и гестоден, фемоден, марвелон, триквилар и др.) обладают более сильным прогестивным действием, чем используемые ранее прогестагены и очень слабой андрогенной активностью (Прилепская В.Н., 1997; Серов В.Н., Пауков C.B., 1998).

В связи с этим считается, что они оказывают незначительное влияние на уровень липидов и липопротеинов плазмы крови, минимальное - на метаболизм углеводов и сбалансированное - на гемостаз (Тарасова М.А., 1999; Редькин Ю.В., 2000).

Современные комбинированные оральные контрацептивы с малыми дозами прогестагенов нового поколения настолько безопасны, хорошо переносимы и эффективны, что было бы трудно их улучшить. Авторы (Пузырькова И.А., 1999; Lonn Е.М., 1994) указывают, что большинство «неудач» при приёме контрацептивов связано, скорее, с их неправильным приёмом, чем с недостатками препаратов. Анализ данных литературы (Урманчёва А.Ф., 2001; Volpe А., 1993) свидетельствует о том, что в большинстве публикаций делается акцент на несомненные достоинства комбинированных оральных контрацептивов. Это и справедливо, и

объективно, поскольку эти препараты прошли клинические испытания и всестороннюю проверку. Однако значительно меньше внимания уделяется побочным эффектам контрацепции, хотя «ни одно фармакологическое средство не является абсолютно безопасным. Опасность может быть незначительной или приемлемой с учётом терапевтического действия лекарства» (Bruyniks N.P., 1995, с. 44). Три качества препарата определяют его будущий эффект: эффективность, переносимость и безопасность (Холодов Л.Е., Яковлев В.П., 1985; Машковский М.Д., 1986). Эффективность для комбинированных оральных контрацептивов ниже 99,0 - 99,5 % считается неприемлемой (Bruyniks N.P., 1995; Goldzieher I.W., 1994), а их приём вообще не должен подвергать риску здоровье женщин (Кудрин А.Н., 1977; Hotcher R.A., 1990). Тем не менее, спектр побочных эффектов при приёме комбинированных гормональных контрацептивов весьма широк (Шехтман М.М., 1999; Kleerekoper М., 1991). В связи с этим оценка факторов риска тромбофилии и выбор критериев наблюдения за состоянием гемостаза в процессе их применения (Бурлеев В.А., Прилепская В.Н., 1997, Пузырькова И.А., 1999) являются весьма актуальными. К сожалению, на стадии минорных побочных эффектов диагностика тромбогеморрагического или неявного ДВС -синдромов крайне затруднительна, а порой и невозможна. Дальнейшее развитие событий при длительном приёме комбинированных оральных контрацептивов может завершиться серьёзнейшими осложнениями, включая инфаркт миокарда, нарушения мозгового кровообращения, тромбоз нижней полой вены и эмболию лёгочной артерии (Гринхалг P.M., 1984; Матюшенко A.A., 1999; Панченко Е.П., 1999; Королёва И.М.; Долгушина Л.М., 2004; Рябов В.В., 2004; Griffin J.H, 1993; Jick Н., 1995).

Цель работы - выявить закономерности в развитии осложнений в системе гемо-лимфоциркуляции при длительном применении комбинированных оральных контрацептивов.

Задачи работы:

1) Исследовать систему гемостаза женщин, длительное время принимавших КОК регулон;

2) оценить особенности структурной организации путей гемо-лимфо-циркуляции внутренних органов интактных половозрелых кошек;

3) изучить морфофункциональные изменения стенки кровеносных и лимфатических микрососудов внутренних органов кошек под влиянием КОК марвелона;

4) получить данные об изменениях реологических свойств плазмы и форменных элементов крови и лимфы внутренних органов кошек после длительного введения им КОК марвелона;

5) охарактеризовать структурные изменения органов иммунной системы кошек после длительного введения им КОК марвелона;

6) провести анализ морфофункционального состояния микрососудистого русла внутренних органов кошек при воздействии на них экстремальных факторов на фоне длительного введения КОК марвелона. Научная новизна исследования

1) Определена выраженность и динамика развития побочных эффектов у женщин при длительном приёме КОК регулона.

2) Показано, что патогенетической основой побочных эффектов является повышение мембранной активности плазмы крови.

3) Выявлены морфофункциональные изменения гистоструктуры стенки микрососудов (перицитов, базальной мембраны и эндотелицитов) в ответ на длительное введение экспериментальным животным КОК марвелона.

4) Установлено, что длительное введение экспериментальным животным КОК марвелона вызывает изменения реологических свойств плазмы и форменных элементов крови и лимфы, характерные для скрытой тромбофилии.

5) Выявлены морфофункциональные изменения в органах иммунной системы экспериментальных животных после длительного введения им КОК марвелона.

6) Получены морфологические данные, свидетельствующие о трансформации скрытой тромбофилии у экспериментальных животных в гиперкоагуляционный синдром при воздействии на них экстремальных факторов.

Теоретическая и практическая значимость

1) Результаты исследования расширяют и углубляют имеющиеся представления о роли стенки микрососудов в системе гемостаза;

2) Полученные данные о первичных изменениях в органах иммунной системы экспериментальных животных и вторичных нарушениях гемостаза под влиянием КОК марвелона дополняют теорию об иммунном механизме регуляции ферментативного гемостаза;

3) Под воздействием экстремальных факторов (эмоциональный стресс, антибиотикотерапия, вакцинация) скрытая тромбофилия у животных склонна к трансформации в гиперкоагуляционный синдром.

4) Использованные в работе способы определения состояния плазменной коагуляции крови просты, достоверны, выполняются за короткое время и могут широко применяться для контроля за приёмом КОК. Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре анатомии человека с курсом топографической анатомии, кафедры акушерства и гинекологии № 2 Самарского государственного медицинского университега, кафедры анатомии человека Ижевской медицинской академии. Результаты работы внедрены в практическую деятельность кафедры акушерства и гинекологии № 2 Самарского государственного медицинского университета, гинекологического отделения Пензенской областной больницы им. Н.Н.Бурденко, женской консультации городской больницы № 2 г.Пензы.

Положения, выносимые на защиту

1) Длительный приём КОК вызывает развитие побочных эффектов, патогенетической основой которых является скрытая тромбофилия или неявный ДВС - синдром.

2) Под влиянием экстремальных факторов (эмоциональный стресс, введение антибиотиков, прививки) скрытая тромбофилия или неявный ДВС - синдром могут трансформироваться в гиперкоакуляционный синдром.

3) Гистохимический способ окраски мазка периферической крови и способ определения мембранной активации крови дают возможность диагностировать начальные стадии развития нарушений гемостаза до и в процессе приема КОК.

Апробация работы

Данные, полученные в ходе выполнения работы и её результаты доложены и обсуждены на заседаниях Самарского отделения ВрНО АГЭ (Самара, 2003, 2005), на заседании проблемной комиссии кафедры акушерства и гинекологии № 2 Самарского государственного медицинского университета (2006), на научно-практической конференции «Региональная конференции патоморфологов Поволжья» (Ижевск, 2005). Диссертация апробирована на межкафедральном совещании кафедр акушерства и гинекологии № 1, № 2 и кафедры анатомии человека с курсом топографической анатомии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ (из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК).

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, Ш глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Диссертация изложена на 157 страницах машинописи, иллюстрирована 20 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель включает 335 источников, из них 217 отечественных и 118 - зарубежных.

Содержание работы Материал и методы исследования

Работа состоит из 2-х разделов: клинического и экспериментально-морфологического.

Материал и методы клинического исследования

Клинический раздел основан на результатах обследования 212 женщин, регулярно принимающих с целью контрацепции КОК регулон. Из них - у 159 женщин в процессе наблюдения были выявлены осложнения (основная группа). У 53 женщин - осложнения отсутствовали (контрольная группа).

Все женщины были обследованы до назначения КОК по протоколу, принятому в женских консультациях. В него заносились данные анамнеза, общего клинического обследования, исследования системы гемостаза до и в процессе приёма КОК. В работе использовался метод определения антитромбогенных свойств сосудистой стенки (антиагрегационного, антикоагулянтного, фибринолитического) в процессе проведения манжеточной пробы (Габбасов В.А., Попов Е.Г., 1989).

Реологические свойства крови изучали в мазках периферической крови, окрашенных гистохимическим методом. Для окраски использовались три основных красителя: оранжевый Ж, кислотный красный 2С и водный голубой. Время, необходимое для гистохимической окраски мазков крови, -30-40 мин. (Альтшулер М.Ю., Воронцова С.А., 2000).

Изучение мазка проводилось под микроскопом при увеличении х 400 или х 900 раз. Метод позволяет выявить агрегацию эритроцитов и даёт разное окрашивание фибрина в зависимости от его «возраста». Молодой фибрин (до 6 ч) окрашивается в жёлто-оранжевый цвет, «зрелый» фибрин (624 ч.) - в красный цвет, «старый» фибрин (свыше 24 ч.) - в фиолетовый цвет.

У 17 женщин основной группы было изучено состояние плазменной коагуляции по результатам определения времени рекальцификации. Время рекапьцификации определялось в субстратной плазме крови, содержащей модифицирование фрагменты клеточных мембран, обладающие в отличие от повреждённых мембран клеток, коагулирующей активностью (Момот А.П., Бишевский K.M., 1996).

Материал и методы экспериментально-морфологического исследования

Работы проведены на 19 беспородных половозрелых кошках (возраст 1 - 2 года) с массой тела 2,2 - 3,5 кг. Экспериментальная группа (16 животных) получала низкодозированный монофазный эстроген-гестагенный гормональный контрацептив марвелон. Контрольную группу составили 3 кошки. Экспериментальная группа была разделена на 3-й подгруппы. Животные экспериментальной группы получали марвелон в течение 30 суток (1 подгруппа), 90 суток (II подгруппа) и 180 суток (III подгруппа). После окончания эксперимента животные каждой из подгрупп подвергались экстремальным воздействиям: 1) подгруппа - создание вторичной иммунной депрессии (введение тетрациклина хлорида 40.000 ЕД/кг ежедневно в течение пяти дней) (Бойко В.И., 1959); 2) подгруппа -создание иммобилизационного стресса (Ведяев Ф.П., 1983); 3) подгруппа-моделирование вакцинального процесса (0,01 мг вакцины БЦЖ - однократно в кожу паховой области) (Ельшанская М.П., 1972).

Животные содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для эксперимента (Страсбург, 1986), и «Правилами использования экспериментальных животных (приказ Минвуза РФ от 13.11.84 г. № 724). Условия содержания: освещение с 800 до 24 часов, кормление 2 раза в день при свободном доступе к воде. При поступлении животных в виварий-карантин, противоглистная терапия. Забор крови для исследования -

подкожная вена голени. Выведение из эксперимента - внутрибрюшинное введение 2 %тиопентала натрия (5 мг/кг).

Морфологическому исследованию подвергались органы: сердце, оболочка головного мозга, стенка тонкой кишки, большой сальник, тимус, селезёнка, лимфатические узлы. Материал фиксировался в 10 % нейтральном формалине или в 2,5 % глютаровом альдегиде. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивались гематокслин-эозином, по Ван Гизон, азур-П-эозином, гистохимическим методом (Богомолова Н.В., 2001). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Документирование полученных светооптических данных проводили на цветной фотоплёнке через микроскоп МБИ 15. Электронное микроскопирование образцов проводили по стандартным методикам (Шахламов В.А., 1971; Рязанцева Н.В., Ткаченко С.Б., 2004).

Кровеносное и лимфатическое русло органов инъецировали через брюшную аорту под наркозом 0,05 % раствором азотнокислого серебра (Марков И.И., 1985, 1991). В контрольной и в экспериментальной группах животных проводили морфометрию компонентов микрососудистого русла: измеряли внутренний диаметр микрососудов, плотность их распределения, вычислялись показатели, демонстрирующие их морфофункциональные изменения. Среди них: 1) сосудистые изменения - изменения формы микрососудов (извитость, деформации, «варикозность»); 2) внесосудистые изменения - эмиграция форменных элементов крови, паравазальные инфильтраты; 3) внутрисосудистые изменения - агрегация форменных элементов крови, слайдж-синдромы, микротромбоз (Чернух A.M. с соавт., 1975; Ярыгин Н.Е., 1996). Частоту каждого признака вычислялась в процентах, подсчитывали эти признаки в 200 полях зрения при увеличении микроскопа х 400.

Статистическая обработка полученных морфометрических данных проводили с определением средних показателей (М) и средней стандартной

ошибки (± т), а так же с учётом групповых различий исследуемых показателей.

В качестве достоверных показателей выделялись те, отличия ошибки которых не превышали 5 % (Р <0,05). При наличии достоверного различия признака вычисляли его информативность по формуле:

0 = 10 1е £..О,5(/>-/>2)

Где: Р1 и Р2 - относительные частоты признака в сравнительных выборках (в долях единицы); 0 - информативность, бит. Признаки с величиной менее 0,1 бит не учитывались. Расчёт информативности проводили только при наличии статистически достоверных различий между частотами сравниваемых признаков. Для получения достоверных результатов всех животных выводили из эксперимента в одно и то же время (в 12 часов дня) через 18 часов после кормления (Шмид-Нильсен К., 1982).

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных в работе данных позволяет считать, что гормональная контрацепция эстроген-гестагенными препаратами потенциально связана с риском развития побочных эффектов, даже если речь идёт о низкодозированных препаратах последнего поколения (таблица 1). Уже после первого цикла приёма препарата у 32 женщин (15,09 %) были выявлены минорные побочные эффекты тошнота, головная боль, нарушения менструального цикла, боли в суставах, конъюктивит. После 12-го цикла приёма препарата уже у 159 женщин (75,0 %) были выявлены минорные побочные эффекты и они были включены в основную группу наблюдения. В клинической практике в такой ситуации врач должен принять решение: отменить ли приём контрацептива, заменить ли его другим препаратом или рекомендовать продолжить приём уже назначенного препарата?

К сожалению, на стадии минорных эффектов диагностика развивающихся более сеоьёзных осложнений, в том числе тромбоэмболического или неявного ДВС-синдромов крайне затруднительна, а порой и невозможна.

Таблица 1.

Частота побочных эффектов при приёме КОК регулона

Побочные эффекты Частота побочных эффектов

п=212 п= 180 п= 140 п.= 95 п=68

1-й цикл 3-й цикл 6-й цикл 9-й цикл 12-й цикл

абс. % абс. % абс. % абс. % абс %

1. Тошнота 10 4,72 8 3,98 5 2,84 1 1,05 - -

2. Головная боль 5 2,36 7 3,48 12 6,81 1 1,05 - -

3. Увеличение массы тела > 2 кг - - 3 1,49 5 2,84 1 1,05 2 2,94

4. Уменьшение массы тела > 2 кг - - - - 2 1,13 1 1,05 4 5,88

5. Межменструальные (скудные) выделения 5 2,36 5 2,49 4 2,27 4 4,21 1 1,47

6. Межменструальные (прорывные) выделения - - 3 1,49 1 0,60 3 3,16 2 2,94

7. Акне - - 2 1,0 2 1,13 - - 2 2,94

8. Нагрубание маточных желёз - - 3 1,49 5 2,84 9 9,47 1 1,47

9. Депрессивное состояние - - 1 0,50 2 1.13 - - 2 2,94

10. Боли в суставах 7 3,30 5 2,49 7 3,98 - - 1 1,47

11 Конъюнктивит 5 2,36 3 1,49 5 2,84 7 7,38 - -

Итого 32 15,09 40 19,9 45 25,56 27 28,42 15 22,05

Обнаружить ДВС-синдром лабораторным путём можно лишь на стадии вторичной гипокоагуляции, когда снижается уровень коагулируемого фибриногена и в циркулирующей крови появляются растворимые комплексы фибрин-мономера (РКФМ) (Русяев В.Ф., Кузник Б.И., 1979; Astrup Т., 1982). Новый методический подход с использованием определения антитромбогенных свойств сосудистой стенки был разработан В.А. Габбасовым и Е.Г. Поповым (1989) и был использован в нашей работе.

Метод позволил выявлять степень агрегации тромбоцитов, активность активаторов плазминогена в ходе выполнения манжеточной пробы. Данные об уровне мембранной активности плазмы крови у женщин основной и контрольной групп представлены в таблице 2. У женщин основной группы фоновая мембранная активность плазмы крови достоверно отличалась от этого показателя у женщин контрольной группы: соответственно

- 122,0±4,6 % и 104,6±8,1 %. Для здоровых доноров показатель мембранной активности плазмы крови не превышает 99,0 % (Момот А.П., Бишевский K.M., 1996). Через три цикла приёма КОК средней показатель мембранной активности плазмы крови у женщин основной группы возросло 161,8±9,8 %. Это достоверное свидетельство наличия у женщин основной группы неявного ДВС-синдрома. У женщин контрольной группы этот показатель возрос менее значительно по сравнению с фоновым показателем и достиг

- 114,0±7,6%.

Циркулирующие в крови модифицированные фрагменты клеточных мембран обладают, в отличие от поврежденных мембран клеток, коагуляционной активностью. Эта фоновая активность определяется и физиологических условиях. По современным представлениям (Шиффман Ф.Дж., 2000), многие виды нарушения свертываемости крови (ДВС-синдром, тромбозы , эмболии) сопровождаются избыточным накоплением в кровотоке коагуляционно активных фрагментов клеточных мембран. Именно они запускают свертывание крови как по внешнему, так и по внутреннему

Таблица 2.

Уровень мембранной активности плазмы крови у женщин основной и контрольной групп до и на фоне приёма КОК регулона (%).

Группы Мембранная активность свертывания плазмы крови

женщин, принимавших КОК До приёма КОК Через 3- и цикла приёма КОК

1 2 3 Среднее 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Среднее

Контрольная (п=9) «о о ,—1 м 00* + X чо ■Ч-* о о о\ о> о (Ч V) о во со о м »—< С\ <ч чэ -Н X О

Основная (п=9) сч 1—< т (Ч С\ <ч ЧО ? X о. р- N "О 1—( •л о ГЧ во во (Ч »-н чо го во К") < с-4 ю во <зС •Н X 00 5

Примечание: х Р > 0,05 - показатель достоверности различий в основной и контрольной группах.

Таблица 3.

Степень агрегации и агглютинации в периферической крови женщин из основной и контрольных групп на фоне приёма КОК регулона (через 3-й цикла) (М± ш, %).

Группы женщин, принимавших КОК Степень агрегации Степень агглютинации

1 2 3 4 5 СВ 1 2 3 4 5 СВ

Контрольная (п=5) 9 15 12 17 16 13,8±2,4 -

Основная (п=5) 27 31 33 31 35 31,4*±5,0 2 2 2 1 1 1,6*±0,03

Примечание: х Р > 0,05 - показатель достоверности различий в основной и контрольной группах.

механизмам. В настоящее время предложен надежный и достоверный способ определения активации свертывания плазмы крови фрагментами клеточных мембран (Момот А.П., Бишевский K.M., 1996). Он позволяет создать базу для получения новых данных о патогенезе коагулопатий, новых критериев лабораторной диагностики и контроля за их лечением. Ранее в лабораторной практике использовались способы определения циркулирующих в крови фрагментов мембран клеток путем определения активности их специфического маркера 5'- нуклеотидазы (Зубаиров Д.М., Андрушко И.А. 1999, Cambell D.M., 1962). Но они оказались трудоёмкими и малоинформативными.

Хронические инфекционные процессы (микоплазмозы, хламидиозы), протекающие без клинических проявлений вызывали увеличение микровезикуляции в крови от 2-х до 4,5 раз (Зубаиров Д.М., 1978). Во многих случаях усиленная микровезикуляция сопровождается развитием явной картины ДВС-синдрома. При меньшей интенсивности процесс может остановиться на стадии скрытого внутрисосудистого свёртывания крови. Эта стадия рассматривается субкомитетом Международного общества по тромбозам и гемостазу как неявный ДВС - синдром (Зубаиров Д.М., Андрушко И.А., 1999).

Данные об изменениях реалогических свойств периферической крови проведены в таблице 3. Оценка степени агрегации эритроцитов позволила в мазках крови, окрашенных гистохимическим методом (Альтшулер М.Ю., Воронцова С.А., 2000), выявить не только отдельные её формы, но и характер проявления этого процесса. Так, в мазках крови женщин основной группы в «гирляндах» эритроцитов их количество достигало 31 и более эритроцитов. Эритроциты располагались либо в один ряд, либо формировали сложные фигуры агрегатов: «монетные» столбики, петли, гирлянды, конгломераты. В основе этого феномена, по нашему мнению, лежит коагуляция фибриногена и его адсорбции на эритроцитах. В мазках крови женщин основной группы были обнаружены и агглютинаты эритроцитов, являющиеся по существу

прижизненными свёртками, т.е. тромбами. В состав агглютинатов входили и нитевидные структуры фибрина, принимающие в зависимости от сроков его выпадания различную окраску: оранжевую, красную или краснофиолетовую. У женщин контрольной группы показатель агрегации эритроцитов не превышал 13,8±2,4 %, а агглютинаты в мазках крови полностью отсутствовали.

По современным представлениям можно выделить два механизма, посредством которых стероидные гормоны осуществляют свое действие на клетки-мишени: геномный («медленный» или транснуклеарный) и экстрагене-тический («быстрый») (Сергеев П.В., Духанин A.C., 1995). Геномные эффекты стероидов опосредованы взаимодействием их с внутриклеточными (цитозольными и ядерными) рецепторами. Для ядерных эффектов стероидов характерны продолжительный латентный период (1-2 час) и зависимость от синтеза белка de novo.

Экстрагенетические эффекты стероидов реализуются на уровне цитоплазматической мембраны. Они развиваются в пределах 30 мин, не чувствительны к ингибиторам синтеза РНК и белков и включают влияние гормонов на образование вторичных посредников, трансмембранный перенос глюкозы и аминокислот, на активность мембранно- связанных ферментов. С привлечением новых методов исследования и развитием теории избирательного действия лекарственных препаратов за последнее время накоплен экспериментальный материал, расширяющий представления о молекулярных механизмах действия стероидных гормонов. R.J.Pietras, C.M.Srego (1977) впервые обнаружили участки связывания для природного гормона эстрадиола на поверхности клеток миометрия. Затем в плазматических мембранах компететных клеток были найдены специфические места связывания для всех классов стероидных гормонов-эстрогенов, прогестинов, глюкокортикоидов и минерапкортикоидов (Сергеев П.В., Духанин A.C., 1995). Неожиданностью стало обнаружение несвязанных с лигандами рецепторов эстрогенов и прогестинов в ядрах клеток-мишеней (JidaK.,2001).

В нашей работе в качестве клеток - мишеней выделены эндотелиоциты, тромбоциты, эритроциты и лимфоциты. Так, на фоне приёма КОК марвелона, особенно при иммунизации животных БЦЖ, красная пульпа селезёнки и регионарных лимфатических узлов превращалась в своеобразную расширенную структуру синусов, в просвете которых находятся многочисленные и чрезвычайно полиморфные клетки. Эндотелий синусов при этом десквамировался целыми пластами, причём в просвете синусов он контактировал с другие иммунокомпетентными клетками. Эти морфологические картины позволяют нам считать, что эндотелиоциты играют активную роль в формировании иммунного ответа.

По сравнению с паренхиматозными клетками эндотелий находится в условиях постоянного нестабильного осмотического равновесия, поскольку является пограничной с кровью тканью. Эндотелиоцит, как «береговая» клетка, испытывает различные воздействия, которые в совокупности обуславливают постоянный диффузионный поток воды вовнутрь клетки (Кошев В.И. с соавт., 2004). Это - и высокое гидростатическое и гидродинамическое давление в капиллярах, и положительный градиент онкотического давления, в 3 раза превышающий давление плазмы крови, и отрицательное давление интерстициального геля на аблюминальнарную мембрану эпдсп елиоцита. Ни одна другая клетка не расходует столько энергии на стабилизацию осмотического тонуса, столько затрачивает эндотелиоцит (Банин В.В., Алимов Г.А., 1992). Это обстоятельство имеет важное общебиологическое значение, если учесть, что суммарная масса микрососудистого эндотелия достигает от 3,0 до 7,3 кг (Чернух A.M. с соавт., 1975). К настоящему времени достоверно доказано, что в норме почти 50% из 40 миллиардов капилляров являются резервными, т.е не перфузируются

(Фолков Б., Нил Э., 1976).

В области разветвлений капилляров были обнаружены особые

эндотелиальные клетки, способные округляться и выбухать в просвет капилляра и частично или полностью перекрывать его (Кошев В.И. с соавт., 2004). Эти клетки получили название специализированных эндотелиальных

клеток (СЭК). Наши данные свидетельствуют о том, что эндотелиоциты могут увеличивает свой объём за счёт гидропического набухания в 100 и более раз и перекрывать просвет микрососудов диаметром до 60 мкм. Наибольшее количество СЭК обнаружено нами в капиллярах и в посткапиллярно-венулярном отделе микроциркуляторного русла стенки тонкой кишки, миокарда, селезёнки, лимфатических узлов.

СЭК первыми из энтотелиоцитов под воздействием КОК проявляли в эксперименте признаки функциональной активности. На электроннограмах это проявлялось в изменении формы ядра, в перинукпеарном смещении хроматина, образовании большого числа микропиноцитозных пузырьков и цитоплазматических отростков (рис.1). Набухание цитоплазмы СЭК достигало значительных размеров, за счёт неё перекрывался просвет не только капилляров, но и прекапиллярных артериол и посткапиллярных венул. От люминальной поверхности СЭК происходил отрыв фрагментов цитоплазмы больших размеров. Вначале они сохраняли связь с цитоплазмой СЭК, с помощью узких «ножек», но затем фрагменты отделялись и свободно циркулировали в крови и лимфе. Нередко от базальной мембраны отделялись целые набухшие СЭК в виде «эндотелиапьных шаров»

Рис. 1. Венозный синус селезёнки кошки. 90-е сутки введения КОК. 1) СЭК; 2) эритроцит; 3) лимфоцит; 4) тромбоцит В просвете синуса микровезикулы и плазма крови высокой электронной плотности. Электр оно ¡рамм а. Ув. 12000.

Структурно-функциональные изменения тромбоцитов в микрососудах внутренних органов у экспериментальных животных' на фоне длительного введения им КОК начинались с изменения их формы, образования псевдоподий и формирования рыхлых агрегатов. Из всех форменных элементов циркулирующей крови тромбоциты деформируются в меньшей степени, поскольку у них хорошо развит скелет из микротрубочек. Наши данные свидетельствуют о том, что адгезия тромбоцитов может осуществляться на эндотелиоцитах, не отторгнутых от базапыюй мембраны.

Активация тромбоцитов сопровождалась отделением от них микровезикул, которые формировались на их клеточной поверхности, слущивались с цитоплазматической мембраны. Эти микровезикулы представляют собой униламеллярные структуры со средним диаметром 0,2 мкм. Наиболее часто они определялись во время агрегации и секреции тромбоцитов. Тем не менее и активация одиночных тромбоцитов нередко сопровождалась отделением от них мельчайших частиц их мембраны и цитоплазмы. Такая ситуация характеризовалась резким увеличением электронной плотности плазмы крови в просвете микрососудов, образованием т.н. «тромбоцитарной пыли».

Наши данные свидетельствуют о том, что тромбоциты проявляли адгезивную активность к лимфоцитам и нейтрофильным гранулоцитам, образуя т.н. лимфоцитарно-тромбоцитарные розетки. При контакте с нейтрофильными гранулоцитами тромбоциты формировали цитоплазматические отростки, которые непосредственно контактировали с цитоплазматической мембраной гранулоцитов. Эти контакты, по всей вероятности, вели к разрушению тромбоцитов.

Система мегакариоцит-тромбоцит не имеет аналогов в организме млекопитающих. Это касается не только образования тромбоцитов путем отшнуровки участков цитоплазмы от мегакариоцитов, путём своеобразных «родов» (рис. 2). Уникален и принцип работы этой системы. Мегакариоцитарные системы костного мозга и селезёнки накапливают и

организуют мощный структурно-биохимический гемостатический потенциал. В начале он разделяется на части и впоследствии рассредоточивается в сосудистом русле в неактивном состоянии, безопасном с точки зрения блокады циркуляции крови.

В селезёнке кошек мегакариоциты локализованы в красной пульпе преимущественно в непосредственной близости от маргинальных и венозных синусов. У интактных животных в селезёнке наблюдался эмпериополез, феномен при котором мекакариоциты разрушаются нейтрофильными гранулоцитами. Выраженность эмпериополеза у интактных животных составляла 0,6 %. У животных, которым длительно вводился КОК марвелон, эмпериополез увеличивался в 3,5±0,7 раз.

В последнее десятилетие внимание исследователей вновь обратилось к эритроцитам, как источнику активирующих веществ, вызывающих адгезию тромбоцитов (Левтов В.А, 1982; Захарова Н.Б., Титова Г.П., 1992). Столкновение тромбоцитов со стенкой сосудов, эритроцитами и между собой является одним из пусковых моментов активации тромбоцитов. Причём активация тромбоцитов под влиянием индукторов, в том числе и эстрогенов, осуществляется чрезвычайно быстро: этот процесс протекает за 0,1 с (Gut Р.Н., 1992).

Главным фактором, способствующим выживанию эритроцитов, является их способность к деформации. Для интегральной оценки процесса трансформации эритроцитов на фоне длительного введения животным КОК, у отдельных особей вычислялся индекс трансформации (ИТ), т.е. отношение суммы всех трансформированных эритроцитов к числу всех эритроцитов. У интактных животных (ИТ) индекс трансформированных эритроцитов был невысоким (26,9±1,8%). У животных на фоне длительного приёма КОК марвелона среди эритроцитов с изменённой формой наиболее часто встречались сгоматоциты и пойкило- и шизоциты. Отмечено появление крупных ланцетовидных или биполярных вытянутых дискоцитов и сфероцитов. Индекс трансформации (ИТ) эритроцитов через 90 суток приёма КОК увеличивался до 44,7 ±2,9%.

Рис. 2, Тромбоцитопоэз в селезёнке кошки. 90-с сутки

введения КОК марвелока, 1) мегакариодат; 2) тромбоциты; 3) средний лимфоцит; (|) - просвет венозного синуса.

Электрограмма. Ув. 12500,

На электронограммах заметно увеличивалась гетерогенная структурная организация Эритроцитов (рис. 3).

Свободное состояние эритроцитов в плазме крови хотя и является наиболее характерным их состоянием, но не единственным. Эритроциты и в физиологических условиях нередко образуют агрегаты, особенно в узких участках Микрососудистого русла. У ннтактных животных иногда наблюдалось образование между эритроцитами цитоплазматических мостиков, хотя эритроциты представляют собой безъядерные клетки, не

имеющих цитошжматических оргшгелл. На фоне длительного введения животным КОК м ар цел «на в просвете ми Кросос у доп внутренних органон наблюдалось формирование эритроцитарнвд агрегат««. Крайней степенью их выраженности является формиротШй© слайджей. Деструкти иного изменения эритроцитов ¡юли к образованию агглютиматов.

Рк& 3 «Дырчатые» эритроциты в красной пульпе солеэйнки кошки. 30-е сутки введения КОК марие.чона.

1) просвет неполного синуса; 2) эритроциты; 3) цитошш-магические отростки эритроцитов; Сканирующая электронная микроскопия. У в, 3000,

В состав агглютинатов входили и нити фибрина и эозинофильные гранулоциты. Разрушение эритроцитов происходило на нитях фибрине, так и на цитоплазматических отростках эозинофильные гранулоцитов. В отдельных случаях окрашивались участки плазмы крови, фиксированные к эндотелию микрососудов. Цвет их варьировал от оранжевого к красному и красно-фиолетовому и зависел от их «возраста». К фибриновым пристеночным тромбам фиксировались эритроциты, которые постепенно подвергались лизису. В других случаях люминальная поверхность тромбов покрывалась эндотелием. Часть фибриновых тромбов подвергалась реканализации.

Согласно общепринятой точке зрения, синдром ДВС характеризуется образованием в микроциркуляторном русле агрегатов форменных элементов крови и тромбов, нередко сочетающихся с несвертываемостыо крови и образованием массивных геморрагий (Мовэт Г.З , 1975). Первым и главным условием развития ДВС- синдрома является массивное поступление в кровоток тканевого тромбопластина (Rodgers G.M., 1983). Результатом массивной тромбопластинемии является лавинообразное нарастание тромбинемии (Cambell D.M., 1962). Следующее за этим превращение фибриногена в фибрин, происходящее во всех отделах кровеносного русла, составляет основу ДВС- синдрома.

Вторым важным обстоятельством, обуславливающим общность патогенеза и проявлений ДВС- синдрома является, по нашим данным включение в этот процесс эритроцитарного и тромбоцитарного компонента гемостаза (рис. 4).

Рис. 4. Морфологические критерии ДВС- синдрома в вене подслизиетой основы тонкой кишки кошки. 30-е сутки введения КОК марвелона. Вакцинация БЦЖ. 1) СЭК; 2) просвет Вены, 3) деформированные эритроциты; 4) активированные тромбоциты. Элсктронограмма. Ув. 12500.

Стрессовые воздействия, связанные с разнообразными эмоциональными переживаниями, сопровождают человека на протяжении всей его жизни. Не случайно в научной литературе употребляются в качестве близкородственных понятий «эмоциональный стресс» и «стресс повседневной жизни» (Сапин М.Р., Никитюк Д.В.).

Эта концепция полностью соответствует представлениям отечественных ученых, воспитанных на идеях нервизма, развитых в трудах И.П.Сеченова и И.П.Павлова (Судаков К.В., 1997). Именно они первичное значение в реакциях стресса и возникающих на его основе заболеваний всегда придавали отрицательным эмоциям.

Клеточный состав тимуса и периферических органов иммунной системы экспериментальных животных длительное время, принимающих КОК, под воздействием экстремальных факторов существенно менялся (таблица 4.). У них формировался синдром вторичной иммунодепрессии, морфологической основой которого являлась усиленная эмиграция лимфоцитов и высокая степень их апоптоза. И по данным литературы (Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Abou-Rabia N., Kendal M.D., 1994), у людей и различных животных (мыши, крысы, кролики, собаки) вторичное иммунодефицитное состояние приводят к усилению сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, гиперкоагуляции, угнетению фибринолиза и выраженным сдвигом неспецифической резистентности. Эти изменения наиболее интенсивно проявляются в первые месяцы после оперативного вмешательства или экстремальных воздействий. Между тем у людей состояние гиперкоагуляции после тимэктомии может длиться годами (Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков H.H., 1989).

Таблица 4.

Показатели объемной плотности лимфоидных элементов в паракортикальной зоне брыжеечках лимфатических узлов кошек при длительном введения им КОК марвелона (М ± т), %

Клеточные элементы Контроль Сроки эксперимента (сутки)

30 90 180

1. Ретикулоциты 7,2 ± 2,1 6,4 ± 0,8 9,2 ± 0,9 7,2 ± 0,7

2 Лимфобласты 12,8 ± 1,7 10,4 ±0,7 8,7 ± 1,1 10,2 ± 1,1

3. Большие лимфоциты 4,8 ± 0,5 3,0 ± 0,5 8,2 ± 1,3 7,1 ±0,7

4. Средние лимфоциты 19,9 ± 2,7 10,8 ±1,4* 10,2 ± 0,9х 12,9 ± 1,3х

5. Малые лимфоциты 34,2 ±1,9 33,7 ± 1,9 24,9 ± 3,1х 30,5 ± 4,0

6. Плазмобласты 3,3 ±0,9 5,2 ±0,5 3,4 ±0,1 3,0 ±0,5

7 Плазмоциты 10,5 ± 1,7 15,2 ± 1,7 17,0 ±2,0 19,1 ± 2,0х

8. Ацидофильные миелоциты 1,2 ±0,3 0,5 ± 0,07х 0,9 ±0,1 1,2 ±0,08

9 Ацидофильные гранулоциты 0,4 ±0,12 1,2 ± 0,1х 2,1 ± 0,7х 0,6 ± 0,05

10. Тканевые базофилы - 1,2 ± 0,2х 2,0 ± 0,5х 0,9 ± 0,01х

11. Макрафаги 1,8 ±0,3 5,2 ±0,7 5,8 ± 1,0 3,8 ±0,1

12. Митотически делящиеся клетки 2,0 ± 1,1 3,0 ± 0,5 2,8 ± 0,6 1,5 ±0,07

13 Дегенеративные формы клеток 1,3 ±0,2 4,2 ± 0,7 4,8 ± 0,9 2,0 ± 0,04

Примечание: х достоверные различия по сравнению с контролем при р < 0,05.

Выводы

1) У 159 женщин основной группы, принимавших КОК регулон, были выявлены минорные побочные эффекты: у 32 женщин (15,09 %) после 1-го цикла, у 40 женщин (19,9 %) после 3-го цикла, у 45 женщин (25,56 %) после 6-го цикла, у 27 женщин (28,42 %) после 9-го цикла и у 15 женщин (22,05 %) после 12-го цикла приема препарата.

2) Динамика нарушений реологических свойств крови и усиления мембранной активности плазмы крови свидетельствовала о развитии у женщин основной группы неявного ДВС — синдрома уже после 3-го цикла приема КОК регулона. Мембранная активность плазмы крови у женщин основной группы составила 161,8±9,8 % и привысила фоновый показатель в 1,32 раза.

3) В периферической крови женщин основной группы в эритроцитарные агрегаты было включено до 31,4±5,0 % эритроцитов и до 1,6±0,03% агглютинатов. В периферической крови женщин контрольной группы показатель агрегации эритроцитов не превышал 13,8±2,4%, а агглютинаты -полностью отсутствовали. Показатель мембранной активности плазмы крови у женщин основной группы составлял 161,8±9,8%, у женщин контрольной группы -114,0±7,7%.

4) Длительный прием КОК марвелона вызывал у экспериментальных животных усиление функциональной активности эндотелиоцитов: их набухание, образование многочисленных цитоплазматических отростков, их фрагментация и образование «эндотелиальных шаров». Этот процесс сопровождался активацией тромбоцитов: образованием агрегатов, адгезий к эндотелиоцитам, формированием микровезикул диаметром до 0,2 мкм, выходом их в микроциркуляцию и повышением электронной плотности плазмы крови и лимфы.

5) Под воздействием КОК марвелона изменялась форма эритроцитов, появлялись признаки их деструкции, усиливалась их способность к образованию агрегатов и агглютинатов. Индекс трансформации эритроцитов

достигал к 180 суткам эксперимента 40,4±3,1 %, т.е. увеличивался по сравнению с этим показателем интактных животных в 1,5 раза.

6) В органах иммунной системы экспериментальных животных под влиянием КОК марвелона развивался синдром вторичной иммунодепрессии, морфофункциональной основой которой являлась усиленная эмиграция лимфоцитов и высокая степень их апоптоза.

7) Нарушения гемо-лимфоциркуляции у экспериментальных животных были вызваны изменениями реологии крови, повышением мембранной активности плазмы, формированием микротромбов и сопровождались развитием неявного ДВС-синдрома. Под воздействием экстремальных факторов наблюдалась его трансформация в явный ДВС-синдром.

Практические рекомендации:

1) проводить исследование фонового состояния реологических свойств крови и мембранной активности плазмы у женщин до назначения им КОК и периодически - в процессе их приёма;

2) при показателях фоновой агрегации эритроцитов не более 15 %, уровня мембранной активности плазмы не более 115 % и полном отсутствии агглютинатов в мазках периферической крови целесообразен индивидуальный подход к назначению КОК;

3) проводить исследование реологических свойств крови в соответствии с описанием к патенту РФ № 2146052 «Способ диагностики степени выраженности ДВС - синдрома у больных сахарным диабетом и атеросклерозом» от 27.02.2000 г.;

4) проводить исследование мембранной активности плазмы крови в соответствии с описанием к патенту РФ № 2058031 «Способ определения активации свёртывания плазмы крови фрагментами клеточных мембран» от 04.10.1996 г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Морфология органов иммунной системы при некоторых экстремальных состояниях // В сб. «Актуальные вопросы хирургии», Ижевск, 2001, с. 201-205. (Соавт.: С.В.Шалаев, И.И.Марков).

2. Роль экстраорганных артерий и микроциркуляторного русла в формировании гистогематических барьеров // Морфологические ведомости, 2002, № 1-2, с. 75-78 (Соавт.: И.И.Марков, С.П.Селякин).

3. Мегакариоциты селезёнки морских свинок после антигенной стимуляции // Морфологические ведомости, 2002, №1-2, с. 27-29 (Соавт.: И.И.Марков).

4. Морфологические изменения микрососудистого русла и иммунных структур тонкой кишки после приёма эубиотика «Спорофтивина // Морфологические ведомости, 2005, №1-2, с. 77-81 (Соавт.: И.И.Марков, С.П.Селякин).

5. Морфологические аспекты длительной гормональной контрацепции // Морфологические ведомости, 2007, № 1-2, с. 47-55 (Соавт.: И.И.Марков).

Подписано в печать: 17.03.2007 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем: 1,62 печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 482

Отпечатано в типографии AHO «Издательство СНЦ РАН» 443001, Самара, Студенческий пер., За тел.: (846)242-37-07