Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Морфофункциональная оценка влияния перфторана на репаративную регенерацию печени при её ишемии и обширной резекции

МАШКОВЦЕВ Олег Валерьевич

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПЕРФТОРАНА НА РЕПАРАТИВНУЮ РЕГЕНЕРАЦИЮ ПЕЧЕНИ ПРИ ЕЁ ИШЕМИИ И ОБШИРНОЙ РЕЗЕКЦИИ (экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

т

f

МАШКОВЦЕВ Олег Валерьевич

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПЕРФТОРАНА НА РЕПАРАТИВНУЮ РЕГЕНЕРАЦИЮ ПЕЧЕНИ ПРИ ЕЁ ИШЕМИИ И ОБШИРНОЙ РЕЗЕКЦИИ (экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

UféOK

Работа выполнена в Кировской государственной медицинской академии.

Научный руководитель:

Научный консультант:

доктор медицинских наук Распутин Павел Геннадьевич

доктор медицинских наук, профессор

Косых Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор

Артифексов Сергей Борисович доктор медицинских наук, профессор

Смирнов Владимир Павлович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

Защита состоится «_»_2005 г. в_часов на заседании

диссертационного совета К 208.061.02 при Нижегородской государственной медицинской академии по адресу: 603005, Нижний Новгород, пл. Минина 10/1.

i

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

О.В. Халецкая

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ j БИБЛИОТЕКА^ ^ | СИ О»

'тип

БЛИОТЕКА I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Основным методом хирургического лечения объемных заболеваний печени остается резекция органа.

В лечении очаговых заболеваний печени (первичный и метастатический рак, гемангиомы, аденомы, непаразитарные кисты, эхинококкоз, альвеококкоз и др.) в настоящее время имеются большие достижения: хорошо изучена хирургическая анатомия органа / (внутриорганная ангиоархитектоника и строение секреторных структур), в

клинической практике применяется целый комплекс достаточно новых диагностических методов обследования больных с патологией печени, разработаны технические приемы резекции печени, установлены показания к различным хирургическим вмешательствам.

Однако, несмотря на очевидные успехи в гепатологии, оперативные вмешательства на печени, и в первую очередь, обширные резекции, остаются одними из самых сложных в абдоминальной хирургии и сопровождаются высокой летальностью и большим числом послеоперационных осложнений (Альперович Б.И., 1997; Журавлев В.А., 1997; Рахимов Б.М. и соавт., 1998).

Обширными резекциями печени (ОРП) считаются операции с удалением от 50 до 80 % массы печени.

Установлено, что основными причинами летальных исходов ОРП являются массивные интраоперационные кровопотери, требующие массивных гемотрансфузий, и развитие печеночно-почечной недостаточности (Рахимов Б.М. и соавт., 1998). С целью борьбы с операционным кровотечением весьма эффективным средством является пережатие печеночно-двенадцатиперстной связки (ПДС). Однако этот прием небезопасен вследствие высокой чувствительности

высокоспециализированных в функциональном отношении клеток печени к ишемии и довольно быстро наступающих расстройств центральной гемодинамики, в связи, с чем многие рекомендуют ограничивать время окклюзии ПДС 15-25 минутами (Карагюлян С.Р., 1990; Альперович Б.И., 1997). В хирургической же практике часто возникают ситуации, когда к требуется прекратить приток крови к печени на более длительный срок.

По мнению В.А. Журавлева (2003), основной причиной послеоперационной печеночной недостаточности являются малый объём и функциональная недостаточность остающейся после обширной резекции части печени.

В связи с вышеуказанным, поиск препаратов, обладающих противоишемической активностью (с целью увеличения длительности безопасного пережатия ПДС) и, одновременно, стимулирующих процессы репаративной регенерации печени (с целью профилактики послеоперационной печеночной недостаточности) является актуальной задачей.

В этом контексте представляет интерес изучение эффективности использования эмульсий перфторуглеродов при ОРП. Перфторуглеродные эмульсии относятся к кровезамещающим средствам и, как показало исследование их свойств, обладают полифункциональным действием (Мороз В.В., 1995; Иваницкий Г.Р., 2001) Изучение перфторана - первого отечественного кровезаменителя этого класса, разрешенного к клиническому применению - выявило у него газотранспортные, противоишемические свойства (Воробьев С.И., 1994), а также способность к стимуляции роста тканей (Кузнецова И.Н., 2001).

Исследований действия перфторана на репаративную регенерацию при ОРП не проводилось.

Цель работы

Целью настоящего исследования явилось экспериментальное изучение влияния перфторорганических эмульсий на процессы репаративной регенерации печени при ишемическом повреждении и частичной гепатэктомии (ЧГЭ).

Задачи исследования

1) Провести оценку эффективности воздействия перфторана на процессы репаративной регенерации печени в условиях его профилактического введения при безопасном пережатии ПДС (20 мин.).

2) Изучить влияние перфторуглеродных эмульсий на восстановительные процессы в печени после критической ишемии органа (40 мин.).

3) Оценить воздействие перфторана на процессы репаративной регенерации печени после ЧГЭ у экспериментальных животных.

4) Исследовать влияние перфторана на регенерацию печени после ЧГЭ у крыс с хроническим гепатитом.

Научная новизна

Выявлено свойство перфторана предотвращать грубые ишемические повреждения паренхимы печени при его профилактическом введении во время пережатии ПДС.

Доказано усиление репаративной регенерации нормальной и патологически измененной печени и более быстрое восстановление печеночной ткани после ЧГЭ при введении перфторана.

Установлена роль полиаминов как катализаторов и индикаторов анаболической активности ткани печени при ее регенерации с использованием перфторана.

Теоретическая и практическая значимость

Установлено, что стимулирующее влияние перфторана на процессы репаративной регенерации печени после острой окклюзии ПДС и ЧГЭ обусловлено его мембраностабилизирующим действием и активацией цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени.

Основные выводы, изложенные в диссертации, могут быть применены в практическом здравоохранении при хирургическом лечении гепатологических больных.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Предварительное введение перфторана предотвращает грубые ишемические повреждения паренхимы печени при острой окклюзии ПДС в эксперименте.

2) Перфторан усиливает репаративную регенерацию нормальной и патологически измененной резецированной печени.

Апробация работы и публикации

Материалы исследования были представлены на X Международной конференции "Перфторуглероды в биологии и медицине" (Пущино, 1998), Всеармейских научных конференциях по проблеме перфторуглеродных соединений в медицине (С.-Петербург, 1997, 1999, 2001), I съезде патологоанатомов России (Москва, 1997), V конференции хирургов-гепатологов (Томск, 1997), научной конференции Кировского НИИ гематологии и переливания крови (Киров, 1997), заседании Кировского областного научного общества хирургов (Киров, 1998).

По теме исследования опубликовано 10 печатных работ.

Реализация результатов исследования

Результаты проведенного исследования внедрены в практику работы Кировской областной клинической больницы, а также в учебный процесс на кафедрах медицинской биологии и генетики, анатомии человека с курсом клинической анатомии и оперативной хирургии, госпитальной хирургии и хирургических болезней факультета повышения квалификации и последипломной подготовки специалистов Кировской государственной медицинской академии и на кафедре ФУВ Кировского НИИ гематологии и переливания крови.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 141 странице, из них 70 страниц текста, и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, приложения и списка

литературы. Работа иллюстрирована 28 таблицами, 14 микрофотографиями, 12 графиками, 1 схемой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

С целью оценки эффективности противоишемического эффекта перфторана при острой окклюзии ПДС было проведено исследование на 53 кроликах обоего пола породы "Шиншилла" массой от 2 кг 300 г до 3 кг 500 г. Было произведено 2 серии опытов: в 1 -й ишемия составила 20 минут, во 2-й -40. Ишемии добивались путем пережатия на зажиме печеночно-двенадцатиперстной связки после срединной лапаротомии. Вскрытие брюшной полости выполнялось под комплексной общей анестезией с внутривенным введением калипсола в дозе 15 мг/кг массы тела и предварительной премедикацией реланиумом (1-2 мг/кг массы внутримышечно) в сочетании с 1 мл 1% раствора димедрола и 0,5 мл 0,1% раствора атропина; дополнительно производилось местное обезболивание рассекаемых тканей путем инфильтрирования их 0,25% раствором новокаина (5-7 мл). Забой животных производился на 1-е (16 - 18 часов) и 3-й (72 часа) сутки после операции путем внутривенного введения летальной дозы тиопентал-натрия. Все кролики 1-й серии были разделены на 3 группы: 1-ю составили 11 животных, которым перед оперативным вмешательством (за 40 -60 минут) внутривенно вводили перфторан из расчета 8 мл/кг, во 2-й группе 10 кроликам перед операцией интравенозно вливался полиглюкин по той же схеме, 3-я группа - 11 животных, пережатие ПДС осуществлялось без использования лекарственных средств. Кролики 2-й серии экспериментов подразделялись на 2 группы: в 1-ю вошли 11 животных, которым за 40 - 60 минут до операции внутривенно вводили полиглюкин в дозе 8 мл/кг, во 2-ю -10 кроликов, которым до оперативного вмешательства внутривенно вливали перфторан в дозе 8 мл/кг и полиглюкин из расчета 5 мл/кг на 20-ой минуте пережатия ПДС.

После забоя у животных производился забор кусочков печени, из которых после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина путем обезвоживания в спиртах восходящей концентрации изготавливались парафиновые блоки и срезы для гистологических препаратов по стандартным методикам. Микропрепараты окрашивались гематоксилином и эозином. Часть кусочков печени без предварительной фиксации замораживали в криостате и изготавливали срезы для последующей окраски на липиды Суданом III.

Для изучения процессов репаративной регенерации в ткани печени выполнялось описание гистологической картины паренхимы при увеличении объектива 9х и 40х. Кроме того, производился подсчет коэффициента митотической активности гепатоцитов - МИ, выраженного в промилле, из расчета на 5000 - 7000 клеток с использованием масляной иммерсии при увеличении 90x7x1,5. Определялось процентное содержание нормальных

гепатоцитов (НГ) и дегенерирующих печеночных клеток. К нормальным гепатоцитам относили клетки, имеющие ядро округлой или овальной формы, хорошо структурированное, с четкими ядрышками и неповрежденную мембрану; к дегенерирующим гепатоцитам - клетки с характерными для апьтеративных процессов изменениями ядра (кариопикноз, кариорексис) и цитоплазмы (гидропическая, крупнокапельная жировая дистрофия), а также клетки без ядер (Солопаева И.М., 1991). Вычислялось отношение нормальных гепатоцитов к дегенерирующим - так называемый коэффициент нормализации паренхимы (КНП), как суммарный объективный показатель, отражающий динамику нормальных и дегенерирующих клеток (Солопаева И.М., 1991).

Определялись относительные критерии внутриклеточной регенерации (гипертрофии) - абсолютная (Ъяд.) и относительная (Soth.) площади ядер гепатоцитов. Расчет Бяд. производился в 100 - 150 нормальных гепатоцитах с помощью анализатора телевизионного изображения "Интеграл 2 МТ", совмещенного с ЭВМ "Электроника 60М", в режиме "Маркер" при увеличении объектива 40х. За Soth. принималось отношение площади ядра к площади всей клетки.

С целью оценки влияния перфторана на процессы репаративной регенерации печени после ЧГЭ было выполнено исследование на 105 беспородных крысах обоего пола массой от 180 г до 250 г. Были произведены 2 серии экспериментов. В 1-й на 40 крысах изучалось действие перфторана на регенерацию неизменённой печени после ее ЧГЭ. Было выделено 2 группы: в 1-й 20 крысам была выполнена резекция печени, во 2-й - гемигепатэктомия с интраоперационным введением перфторана (1 мл на 100 г массы). Оперативное вмешательство выполнялось под эфирным наркозом с дополнительной анестезией брюшины 0,5% раствором новокаина.

Во 2-й серии опытов исследовалось влияние перфторана на восстановительные процессы в патологически измененной печени. С целью создания модели хронического гепатита (ХГ) 65 беспородным крысам обоего пола массой от 180 г до 250 г в течение 5 недель было выполнено 20 подкожных инъекций по 0,3 мл 65% раствора четыреххлористого углерода в растительном масле. Все животные были разбиты на 3 группы: 1-я - 25 крыс с индуцированным ХГ, 2-я - 20 животных с ХГ и гемигепатэктомией, 3-я - 20 крыс с ХГ, которым выполнялась гемигепатэктомия, и внутрибрюшинно однократно во время операции вводился перфторан в дозе 1 мл на 100 г массы тела.

Забой животных производился на 2-е, 3-й, 7-е и 30-е сутки после оперативного вмешательства. В группе неоперированных животных с ХГ - на следующий день после окончания введения четыреххлористого углерода (1-е сутки), а затем на 2-е, 3-й, 7-е и 30-е сутки.

Перед забоем животных взвешивали. После изъятия печени ее также взвешивали и вычисляли относительную массу печени (Мотн.) - отношение массы печени к массе всего животного.

Гистологические препараты приготавливались по описанным ранее методикам и окрашивались гематоксилином и эозином и по ван Гизону. Часть

кусочков печени без предварительной фиксации замораживалась в криостате с последующим изготовлением срезов и окрашиванием Суданом III.

Помимо описания гистологической картины паренхимы печени, производился подсчет МИ, процентного содержания нормальных гепатоцитов, КНП, Бяд. и Soth. как описано ранее.

С целью исследования метаболических процессов в регенерирующей печени изучались уровни полиаминов в ней. Полиамины печени определялись по Л.Д. Ворончихиной и В.Т. Демьяновой (1985) совместно с ст. научным сотрудником Кировского НИИ гематологии и переливания крови, к.б.н. Демьяновой В.Т.

Полученные в ходе исследования морфометрические данные были подвергнуты статистической обработке. Степень достоверности различий средних величин определялась с помощью t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel 95 на ПЭВМ типа IBM Pentium.

Таблица 1.

Вид экспериме нта Серия эксперимента Животные Экспериментальные группы Количество животных

Пережатие пдс 1 -я серия - 20- минутное пережатие пдс Кролики 1-я группа - с перфтораном 11

2-я группа - с полиглюкином 10

3-я группа - без препаратов 11

2-я серия - 40-минутное пережатие ПДС Кролики 1-я группа - с полиглюкином 2- группа - с полиглюкином и перфтораном 11

10

Частичная гепатэктом ия 1-я серия -ЧГЭ неизменённой печени Крысы 1 -я группа - ЧГЭ без перфторана 20

2-я группа - ЧГЭ с перфтораном 20

2-я серия -ЧГЭ печени с ХГ Крысы 1-я группа - с индуцированным ХГ без резекции 25

2-я группа - с ХГ и ЧГЭ 20

3-я группа - с ХГ и ЧГЭ с перфтораном 20

Результаты исследования и их обсуждение

I. Анализ эффективности применения перфторана при острой окклюзии печеночно-двенадцатиперстной связки. При микроскопическом исследовании печени кроликов, которым выполнялось 20-минутное пережатие ПДС, наихудшая динамика отмечена у животных, которым окклюзия осуществлялась без инфузионной терапии, с увеличением числа и площади некрозов долек к 3-м суткам наблюдения. У У животных, которым до операции вводился полиглюкин, также

отмечена отрицательная динамика, однако менее выраженная: на 3-й сутки после операции преобладала гиалиново-капельная дистрофия с мелкими фокусами некрозов.

У кроликов с введением перфторана при наличии умеренно выраженной гиалиново-капельной дистрофии гепатоцитов центра долек на 1-е сутки, отмечена практически полная нормализация структуры паренхимы печени к 3-м суткам.

Так как одной из главных причин летальных исходов при длительной окклюзии ПДС у экспериментальных животных является глубокое прогрессирующее нарушение гемодинамики (Сухорукое В.П., 1990), а перфторан не обладает гемодинамическими свойствами (Кузнецова И.Н., 2001), то, в этой связи, с целью поддержки центральной гемодинамики, на 20-й минуте пережатия связки решено было вводить полиглюкин из расчета 5 мл/кг, обеспечив тем самым выживаемость животных при 40- минутном пережатии ПДС.

Анализ гистологической структуры печени кроликов в этой серии экспериментов показал, что на 1-е сутки после операции у животных, которым вводился полиглюкин, в большей части печеночных долек определялись признаки некробиоза и некроза гепатоцитов; местами они сливались между собой по типу центро-центральных и центро-портальныых. К 3-м суткам эксперимента морфологическая картина печени практически не изменилась, лишь в отдельных случаях уменьшились площади некрозов.

У кроликов с сочетанным введением препаратов (перфторан и ' полиглюкин) на 1-е сутки после пережатия ПДС гепатоциты находились в

состоянии разной степени выраженности гиалиново-капельной дистрофии, местами в периферических зонах долек степень дистрофии была сублетальной. К 3-м суткам после операции в гепатоцитах центра долек отмечалась «зернистая дистрофия», в периферических отделах долек наблюдалась лишь разной степени выраженности гиалиново-капельная дистрофия.

При оценке динамики морфометрических показателей репаративной регенерации печени кроликов при 20-минутном пережатии ПДС (табл.2) установлено, что митотический индекс гепатоцитов у животных, которым

Таблица 2.

Морфометрические показатели репаративной регенерации паренхимы печени кроликов при пережатии печеночно-двенадцатиперстной связки на 20 минут

Группа Сроки наблюдения Без препарата (3-я группа) Полиглюкин (2-я группа) Перфторан (1-я группа)

МИ (°/0о) Содержание НГ N 0,44 ± 0,050 0,44 ± 0,050 0,44 ± 0,050

1 -е сутки 0,43 ± 0,003 1,04 ±0,013 1,32 ±0,014

Р Р,<0.001 Р2<0.001 Р3<0.001

3-й сутки 0,21 ±0,004 0,82 ±0,011 ¡1,89 ±0,004

Р Р,<0.001 Р2<0.001 Р3<0.001

N 88,84 ±0,713 ¡88,84 ±0,713 88,84 ±0,713

1 -е сутки 60,67 ±3,216 ¡72,91 ±0,022 77,62 ±0,715

Р Р,<0.01 Р2<0.05 Р3<0.05

3-й сутки 48,59 ±0,175 ¡64,36 ±0,119 89,00 ±0,38

Р Р,>0.05 Р2<0.001 Р3<0.001

Абсолютная площадь ядер гепатоцитов N 26,4 ± 0,25 26,4 ± 0,25 26,4 ±0,25

1 -е сутки 24,6 ±0,51 26,3 ± 0,89 34,7 ±0,71

Р Р,<0.01 Р2<0.05 Р3<0.01

3-й сутки 23,73 ± 0,671 1 23,03 ± 0,403 | 33,07 ± 1,123

Р Р,<0.05 Р2<0.01 Р3<0.05

Примечание:

Рг достоверность различий между показателями у животных 1-й группы и интактными

Р2-достоверность различий между показателями животных 2-й и 1-й групп Р3-достоверность различий между показателями животных 1-й и 3-й групп п - число наблюдений N - норма

вводился перфторан в 1-е сутки после операции резко (достоверно) повышается по сравнению с нормой, при этом он статистически значимо больше, чем в контрольных группах. К 3-м суткам митотический индекс увеличивается, превышая аналогичные значения данного показателя у животных 1-й группы в 9 раз, 2-й группы - более чем в 2 раза.

Процентное содержание нормальных гепатоцитов у кроликов, которым вводился перфторан, в 1-е сутки после пережатия ПДС достоверно ниже нормы, но, в то же время, статистически значимо больше, чем у животных контрольных групп (Р<0,05). К 3-м суткам содержание нормальных гепатоцитов в этой группе нарастает и не отличается от исходных величин. В то же время сохраняется достоверность различий по данному показателю с контрольными группами, в которых отмечается отрицательная динамика.

Анализ абсолютной площади ядер гепатоцитов у кроликов 3-й группы показал, что ее величина достоверно выше нормы и аналогичных значений

этого показателя в остальных группах во все сроки наблюдения, при этом различие между 1-ми и 3-ми сутками в группе животных, которым вводился перфторан, недостоверно (Р>0,05).

При изучении морфометрических показателей регенераторного процесса в печени кроликов при 40-минутной окклюзии ПДС установлено, что все изучаемые показатели как клеточной (МИ, содержание НГ), так и внутриклеточной (S яд.) регенерации были достоверно выше у животных с сочетанным введением перфторана и полиглюкина по сравнению с контролем.

Таким образом, анализ морфометрических параметров клеточной и внутриклеточной регенерации паренхимы печени показал, что перфторан существенно улучшает состояние гепатоцитов, усиливая регенерационные процессы, что проявляется в значительном повышении митотической активности печеночных клеток, увеличении числа НГ, а также увеличении 5яд. и подтверждается данными световой микроскопии.

Внутриклеточная концентрация полиаминов считается достоверным показателем уровня анаболической активности тканей. Содержание путресцина и спермидина прямо коррелирует с интенсивностью биосинтеза белка (Rüssel D.H., 1997), однако при развитии деструктивных процессов в органах и тканях организма имеют место противоположно направленные взаимопревращения полиаминов (катаболические и анаболические), которые приводят к образованию спермидина из спермина и путресцина из спермидина (Pegg А.Е., 1986).

Полученные данные относительно содержания полиаминов печени кроликов после 20-минутной ишемии (табл.3) свидетельствуют о том, что на 1-е сутки после операции общий уровень полиаминов 1-й и 3-й групп одинаков, примерно одинаковы и показатели по отдельным фракциям. Основываясь на результатах исследований, полученных при изучении морфологии и морфометрии печени, можно сказать, что в контрольной группе животных преобладают катаболические процессы, обусловливающие взаимопревращения полиаминов, в то время как повышение

содержания путресцина и полиаминов в группе с введением перфторана, по-видимому, отражает биосинтетическую направленность метаболизма печеночной ткани после высокотравматичного хирургического вмешательства. Более низкие показатели всех фракций и общего уровня полиаминов в группе кроликов, которым вводился полиглюкин, позволяет предположить как бы промежуточное положение данной группы, когда введение препарата препятствует развитию выраженных деструктивных изменений в ткани органа-мишени, но, в то же время, в силу свойств полиглюкина, не позволяет инициировать процессы репаративной регенерации печени. Снижение к 3-м суткам эксперимента всех показателей у животных, которым вводился перфторан, дает возможность сделать вывод об отчетливой тенденции к нормализации метаболизма ткани печени под влиянием эмульсии В 2-й и 3-й группах отмечено некоторое увеличение общего уровня полиаминов, при этом в группе кроликов без введения

препарата данное увеличение наблюдалось за счет роста концентрации спермидина и путресцина при одновременном снижении содержания спермина. В то же время в группе животных, которым вводился полиглюкин, подъем общего уровня полиаминов был обусловлен ростом концентрации спермина Это позволяет сделать предположение о меньшей интенсивности катаболических взаимопревращений полиаминов у кроликов этой группы по сравнению с животными 3-й группы.

Таблица 3.

Влияние перфторана на уровень полиаминов печени (нмоль/г ткани, М±т) кроликов при 20-минутном пережатии печёночно-двенадцатиперстной связки

Сроки наблюден Группы п Сперми Сперми Путресци Общи й Спермиди

ия н дин н урове нь н/ Спермин

Интактн 10 269,6 ± 263,7 ± 99,0 ± 632,2 1,02 ±

ые 24,25 18,48 14,07 ± 50,86 0,088

1 -е сутки 1-я (ПФ) 5 294,9 ± 302,7 ± 196,3 ± 798,8 1,04 ±

18,00 31,18 20,63 ±57,9 0,128

2-я (ПГ) 5 205,4 ± 257,2 ± 141,5 ± 604,1 1,18 ±

20,09 51,34 27,82 ± 82,7 0,225

3-я (Б/П) 6 346,9 ± 46,30 277,6 ± 39,91 166,4 ± 28,68 790,9 ± 114,67 0,8 ± 0,078

Р, > 0,05 Р, > 0,05 Р, < 0,01 Pi< Р, > 0,05

Р2< Р2> Р2 > 0,05 0,05 Р2 > 0,05

0,01 0,05 Р, > 0,05 Р2< Р3> 0,05

Р3 > 0,05 Р3 > 0,05 0,05 Рз> 0,05

3-й сутки 1-я (ПФ) 6 243,6 ± 194,9 ± 110,9 ± 548,6 0,88 ±

53,64 27,16 12,33 ± 62,73 0,101

2-я (ПГ) 5 301,7 ± 42,49 250,2 ± 37,28 141,2± 25,04 693,1 ± 12,23 0,8 ±0,109

3-я (Б/П) 5 297,8 ± 325,0 ± 204,4 ± 827,2 1,07 ±

19,20 50,96 35,12 ± 107,73 0,163

См. продолжение.

Продолжение таблицы 3.

Р, > 0,05 Р, > 0,05 Р| > 0,05 Р|> Р| > 0,05

Р2> Р2> Р2 > 0,05 0,05 Р2 > 0,05

0,05 0,05 Рз < 0,05 Р2> Рз> 0,05

Р, > 0,05 Р3 < 0,05 0,05

Рз<

0,05

Примечание: Р, - достоверность различий между ПФ и N Р2 - достоверность различий между ПФ и ПГ Рз - достоверность различий между ПФ и Б/П п - количество животных

Так как 40-минутное пережатие ПДС является критическим у данного вида экспериментальных животных и без мощной противошоковой терапии несовместимо с жизнью, несомненно, что в 1-е сутки после пережатия ПДС преобладают катаболические процессы в ткани печени. В этой связи необходимо подчеркнуть, что у кроликов контрольной группы уровень путресцина печени (188,9+34,45 нмоль/г ткани) был достоверно выше по сравнению с исходными данными (99,0±14,07 нмоль/г ткани) (Р<0,05), в то время как у животных с сочетанным введением препаратов (131,5±13,85 нмоль/г ткани) - недостоверно. Это свидетельствует о меньшей выраженности деструктивных процессов в органе при сочетанном введении перфторана и полиглюкина, нежели при изолированной инфузии последнего. На 3-й сутки показатели полиаминов у кроликов контрольной группы существенной динамики не претерпели, что может говорить о недостаточно выраженной репаративной регенерации в органе, тогда, как по снижению у животных основной группы до нормальных величин содержания спермидина и, что особенно важно, путресцина, при одновременном значительном подъеме уровня спермина, можно судить о замедлении катаболических взаимопревращений полиаминов в русле так называемого «цикла путресцина» (Pegg А.Е., 1986) и более выраженной динамике процессов репаративной регенерации печени при сочетанном использовании исследуемых кровезаменителей.

2. Влияние перфторана на процессы репаративной регенерации после обширной резекции в эксперименте. Анализ морфологической картины печени крыс после частичной гепатэктомии свидетельствует о менее выраженных альтеративных изменениях паренхимы в ранние сроки после операции и более быстрой нормализации структуры органа при интраоперационном введении перфторана. При резекции неизменённой

печени через 7 суток у крыс этой группы отмечалось практически полное восстановление структуры печени, в то время как у животных, которым была выполнена только резекция, сохранялась жировая инфильтрация гепатоцитов периферических зон долек.

Это обусловлено интенсификацией под влиянием перфторана процессов как клеточной (повышение митотической активности гепатоцитов), так и внутриклеточной регенерации (увеличение площади ядер гепатоцитов), что в конечном итоге приводит к более быстрому восстановлению числа нормальных гепатоцитов (табл 4). Относительная масса печени у животных основной группы была во все сроки наблюдения достоверно выше, чем у крыс контрольной группы, а на 3-й и 7-е сутки после операции - статистически значимо больше, чем в норме.

Таблица 4.

Морфометрические показатели репаративной регенерации паренхимы

печени экспериментальных крыс

Группа Сроки наблюдения 1 -я группа (Ы + резекция) 2-я группа ^ + резекция + ПФ)

N 0,04 ± 0,002 0,04 ± 0,002

МИ (°/00) 2-е сутки 14,33 ±0,110 18,94 ± 1,240

Р Р,< 0,001 Р2< 0,001

3-й сутки 6,77 ± 0,060 8,21 ±0,400

р Р,< 0,001 Р2< 0,05

7-е сутки 0,21 ±0,002 3,22 ±0,101

Р Р,< 0,001 Р2< 0,001

30-е сутки 0,88 ± 0,046 5,88 ±0,085

Р Р,< 0,001 Р2< 0,001

N 88,20 ± 0,450 88,20 ± 0,450

Содержание 2-е сутки 42,17 ± 1,745 63,76 ± 1,196

НГ Р Р,< 0,001 Р2< 0,01

3-й сутки 50,39 ±0,123 74,00 ± 1,350

Р Р,< 0,01 Р2< 0,001

7-е сутки 64,38 ± 0,588 81,97 ± 1,111

Р Р|< 0,05 Р2< 0,05

30-е сутки 80,30 ± 0,292 86,74 ±0,241

Р Р,> 0,05 Р2< 0,01

N 40,6 ± 0,46 40,6 ± 0,46

Абсолютная 2-е сутки 51,4 ±0,37 68,0 ± 1,06

площадь ядер Р Р,< 0,001 Р2< 0,001

гепатоцитов 3-й сутки 41,1 ±0,16 65,9 ±0,15

Р Р,< 0,001 Р2< 0,001

7-е сутки 45,8 ± 0,32 60,2 ± 0,59

Р Р,< 0,001 Р2< 0,001

30-е сутки 40,6 ±0,41 51,8 ±0,60

Р Р,< 0,001 Р2< 0,001

Примечание:

Рг достоверность различий между показателями у животных 2-й группы и интактными

Р2-достоверность различий между показателями животных 2-й и 1-й групп п - число наблюдений N - норма

Аналогичная тенденция прослеживается в серии экспериментов с патологически измененной печенью. При анализе микроскопической картины печени у животных контрольных групп отмечалось постепенное уменьшение степени альтерации печеночных клеток. В группе оперированных животных динамика изменений гистологической картины после резекции была аналогична таковой в группе неоперированных крыс, однако процессы восстановления здесь протекали с большей скоростью. Еще большая скорость процессов репаративной регенерации наблюдалась у животных, которым во время операции вводился перфторан: к 30-м суткам морфологическая структура печени у них не отличалась от нормы. В 1-й (ХГ) и 2-й (ХГ и ЧГЭ) группах к этому сроку наблюдения определялись остаточные явления хронического токсического гепатита в виде разной степени тяжести жировой дистрофии отдельных клеток, при этом в группе крыс с гемигепатэктомией выраженность этих признаков была существенно меньше. В целом динамика восстановительных процессов в 3-й группе (ХГ, ЧГЭ, ПФ) более интенсивная: уже к 7-м суткам наблюдалась нормализация структуры печени у большинства животных. Это подтверждается данными морфометрии: в первые 7 суток после ЧГЭ МИ гепатоцитов и абсолютная площадь их ядер у крыс с интраоперационным введением перфторана были в 1,5-2 раза, а на 30-е сутки МИ - в 5 раз выше, чем у животных, которым эмульсия во время операции не вводилась. Активизация процессов репаративной регенерации под влиянием перфторана обусловила более быструю нормализацию паренхимы печени животных основной группы, при этом процентное содержание НГ и коэффициент нормализации паренхимы печени у крыс этой группы возрастали прогредиентно, а не волнообразно, как в контрольных группах.

В настоящее время твердо установлено, что в растущих и регенерирующих тканях общий уровень полиаминов и, соответственно, его фракций (прежде всего, путресцина и спермидина) значительно возрастает и чем выше содержание полиаминов, тем интенсивнее протекают анаболические процессы (Берлинских Н.К. и Запеток С.П., 1987).

Представленные данные о влиянии перфторана на уровень полиаминов печени экспериментальных крыс (табл. 5) свидетельствуют о том, что имеется тесная взаимосвязь между динамикой процессов репаративной регенерации печени после ЧГЭ и содержанием полиаминов в органе, при этом пик концентрации последних у животных 1-й группы приходится на 2-е сутки

после операции, что совпадает с данными морфометрических исследований. В тоже время анаболические процессы в печени у крыс 2-й группы еще более усиливаются на 3-й сутки послеоперационного периода, что подтверждается увеличением содержания спермидина и путресцина. Важным подтверждением того, что пик анаболических процессов в печени крыс, которым во время операции вводился перфторан, приходится на 3-й сутки является тот факт, что относительная масса печени у этих животных почти в 2 раза превышает данный показатель у крыс контрольной группы и, соответственно, значительно больше исходных величин. На 7-е сутки при примерно одинаковом общем уровне полиаминов концентрация путресцина в печени животных второй группы достоверно выше, чем в первой группе, что говорит о большей интенсивности восстановительных процессов под влиянием перфторана. Это подтверждается и данными световой микроскопии: к 7-м суткам отмечено практически полное восстановление паренхимы органа, в то время как в контроле имеют место весьма выраженные явления деструкции ткани печени.

При резекции печени с хроническим гепатитом в силу, с одной стороны, волнообразного характера восстановительного процесса и, с другой стороны, травматичности самого оперативного вмешательства на патологически измененном органе, в ранние сроки послеоперационного периода (1-я неделя) в печени преобладают катаболические процессы. Использование перфторана позволяет снизить степень послеоперационного повреждения клеток и активизировать процессы клеточной и внутриклеточной регенерации, что говорит о безусловной анаболической направленности его действия и подтверждается данными полиаминового теста.

Учитывая длительный и выраженный эффект воздействия перфторана на процессы репаративной регенерации (в частности, к 30-м суткам митотическая активность гепатоцитов после ЧГЭ с интраоперационным введением перфторана была в 5-7 раз выше, чем у оперированных животных без введения эмульсии), исследована его способность к активации цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени в условиях резекции органа. Через 48 часов после операции длительность гексеналового сна (доза гексенала - 30 мг/кг) у крыс, которым вводился перфторан, составила 17±2,9 мин., а у животных контрольной группы - 60±7,5 мин. (Р<"0,001). Это свидетельствует об отчетливом индуцирующем влиянии ПФЭ на цитохром Р-450-зависимую монооксигеназную систему регенерирующей печени.

Таким образом, целесообразно выделить следующие свойства эмульсии, лежащие в основе влияния перфторана на восстановительные процессы в печени после окклюзии ПДС и ЧГЭ:

- способность к индукции цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы печени;

- мембранотропные свойства - способность к стабилизации клеточных и внутриклеточных мембран;

- антиоксидантный эффект;

- способность к поддержанию энергетического потенциала клетки в критических ситуациях за счет поддержания функциональной активности митохондрий;

- способность к стимуляции биосинтеза полиаминов.

►

СХЕМА ДЕЙСТВИЯ ПЕРФТОРАНА НА ПЕЧЕНОЧНУЮ

КЛЕТКУ

ПЕРФТОРАН

ИНДУКЦИЯ ЦИТОХРОМ Р-450-МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИС'1 ьмы

ПОДДЕРЖКА АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ

СТИМУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ПОЛИАМИНОВ

СТАБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

I

1

ПОВЫШЕНИЕ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ УСИЛЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ

I

УСКОРЕНИЕ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПАРЕНХИМЫ ПЕЧЕНИ

Таблица 5.

Влияние перфторана на уровень полиаминов печени (нмоль/г ткани, М±т) экспериментальных крыс.

Сроки наблюдения Группы N Спермин Спермидин Путресцин Общий уровень Спермидин/ Спермин

Интактные 10 497,7 ±26,97 472,4 ±38,25 194,6 ± 13,95 1164,6 ±56,19 0,96 ±0,075

2-е сутки 1-я группа 5 336,6 ±48,23 625,6 ±87,31 410,8 ±41,07 1373,0 ± 155,01 1,96 ±0,167

2-я группа 5 277,0 ± 35,45 509,8 ± 63,70 391.8 ±48,61 1178,6 ± 147,84 2,43 ± 0,285

Р, < 0,001 Р2 > 0,05 Pi > 0,05 Р2 > 0,05 Р, < 0,01 Р2> 0,05 Pi > 0,05 Р2> 0,05 Р, < 0,001 Р2 > 0,05

3-е сутки 1-я группа 5 299,9 ± 53.85 368,3 ± 58,02 156,4 ± 10,12 824,6 ± 81,20 1,27 ±0,110

2-я группа 6 391,9± 52,12 621,4 ±78,47 426,7 ± 59,02 1440,0 ± 179,60 1,62 ±0,108

Р] > 0,05 Р2>0,05 Р, > 0,05 Р2< 0,05 Р, <0,01 Р2 < 0,05 Pi > 0,05 Р2 < 0,05 Р,< 0,001 Р2 < 0,05

7-е сутки 1-я группа 6 357,6 ±23,58 371,8 ± 57,82 94,1 ±21,48 823,5 ±99,17 1,03 ±0,110

2-я группа 1 6 408,6 ±21,05 428,4 ±35,39 212.0 ±30,98 1049,1 ±83.69 1,05 ±0,049

Р, <0,05 Р2> 0,05 Pi > 0,05 Р2 > 0,05 Pi > 0,05 Р2 < 0,05 Р, > 0,05 Р2 > 0,05 Р, > 0,05 Р2> 0,05

30-е сутки 1-я группа 5 415,1 ±25,18 278,6 ± 10,22 55,2 ± 9,40 748,9 ± 228,04 0,66 ± 0,085

2-я группа 5 497,9 ± 30,25 269,3 ± 25,95 50,1 ± 7,83 817,2 ± 31,13 0,55 ± 0,070

Pi > 0,05 Р2 > 0,05 Р, < 0,001 Р2 > 0,05 Р, < 0,001 Р2 > 0,05 Р, < 0,001 Р2 > 0,05 Pi<0,01 Р2 > 0,05

Примечание: 1-я группа - частичная гепатэктомия; 2-я группа - частичная гепатэктомия с введением перфторана Рг достоверность различий между показателями интактных крыс и животных 2-й группы. Р2- достоверность различий между показателями у животных 1-й и 2-й групп, п - кол-во животных

Выводы

1.Временная окклюзия печеночно-двенадцатиперстной в течение 20 минут вызывает выраженные деструктивные изменения ткани печени, имеющие тенденцию к ухудшению в динамике, при этом повышение уровня полиаминов органа обусловлено катаболическими взаимопревращениями последних.

2.Применение перфторана - отечественного препарата класса перфторуглеродных эмульсий - при 20-минутной окклюзии печеночно-двенадцатиперстной связки в условиях его профилактического введения положительно влияет на репаративную регенерацию печени: возрастают митотический индекс гепатоцитов, коэффициент нормализации паренхимы, абсолютная и относительная площади ядер печеночных клеток, биосинтез полиаминов.

3.Использование перфторана в сочетании с полиглюкином при 40-минутном пережатии печеночно-двенадцатиперстной связки предотвращает развитие грубых альтеративных изменений в печени (некрозов), усиливает процессы репаративной регенерации, снижает выраженность катаболических взаимопревращений полиаминов.

4.Интраоперационное введение перфторана крысам при выполнении частичной гепатэктомии усиливает восстановительные процессы в печени: повышается митотическая активность гепатоцитов, показатели внутриклеточной регенерации, увеличивается биосинтез полиаминов, что ведет к практически полному восстановлению структуры оставшейся части органа к 7-м суткам после оперативного вмешательства.

5.У лабораторных животных с хроническим гепатитом использование перфторана при частичной гепатэктомии способствует более быстрой нормализации морфофункциональных показателей печени.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка морфометрических критериев репаративной регенерации печени при её резекции в условиях применения перфторана // Актуальные аспекты госпитальной хирургии. - Ижевск, 1997. - С. 145. (Соавт.: Журавлев В А., Распутин П.Г., Головин Р.В.)

2. Морфологическая характеристика печени с индуцированным хроническим гепатитом при репаративной регенерации после гемигепатэктомии и введения перфторана // 1-й съезд патологоанатомов России (21-24 января 1997 г.). - М„ 1997.-С. 125-126. (Соавт.: Яволов С.П., Порошина Т.А., Распутин П.Г.)

3. Структурные изменения органов иммунной системы при хроническом гепатите и применении перфторана после гемигепатэктомии // 1-й съезд патологоанатомов России (21-24 января 1997 г.). - М., 1997.-С. 127-128. (Соавт.: Яволов С.П., Порошина Т.А., Распутин П.Г., Стражникова Г.А., Вожегова Н.П.)

4. Морфометрическая характеристика регенерационной способности патологически измененной печени при резекции в условиях применения перфторана // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине. Тез. Всеармейской науч. конф. -СПб., 1997. - С.44-45. (Соавт.: Журавлев В.А., Распутин П.Г., Косых A.A.)

5. Оптимизация инфузионной терапии с использованием перфторана при длительной тепловой ишемии печени в эксперименте // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине. Тез. Всеармейской науч. конф. - СПб., 1997. - С. 46-47. (Соавт.: Журавлев В.А., Распутин П.Г., Косых A.A.)

6. Анализ восстановительных процессов в патологически измененной печени при резекции и применении перфторана в эксперименте // Патоморфологические особенности некоторых заболеваний: Сб. научных трудов к 80-летию со дня рождения проф. Головина Д.И. СПб. - Киров, 1998 - С. 94-97. (Соавт.: Распутин П.Г., Петров М.В.)

7. Опыт использования перфторана в хирургии печени // Перфторорганические соединения в биологии и медицине: Сб. научных трудов. - Пущино, 1999. - С. 142-143. (Соавт.: Распутин П.Г., Журавлев В.А., Сухорукое В.П., Черемисинов О.В., Зубков И.В.)

8. Морфометрический анализ репаративной регенерации печени больных с очаговой патологией при применении перфторана // Актуальные вопросы клинической патоморфологии: Сб. научных трудов. - СПб, 2000. - С. 118. (Соавт.: Распутин П.Г.)

9. Оценка стимуляции регенерации печени крыс перфтораном в эксперименте // Актуальные вопросы патологической анатомии. Материалы V межрегиональной научно-практической конференции патологоанатомов Урала и Западной Сибири: Сб. научных трудов. - Челябинск, 2001. - С. 100 -103.

Ю.Перфторуглеродные эмульсии усиливают резорбцию соединительной ткани печени после частичной гепатэктомии при хроническом гепатите у экспериментальных животных // Вятский медицинский вестник. - 2003.- № 1. - С. 30 - 33.(Соавт.: Зубков И.В., Косых A.A., Распутин П.Г.)

Р13071

РНБ Русский фонд

2006-4 9113

Сдано в набор 27.06.2005. Подписано в печать 27.06.2005. Печ.л. 1. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ЗАО "Инициал" г.Киров, ул.К.Маркса, 48