Моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) как фактор воспаления при атерогенезе. Разработка пептидного ингибитора МСР-1.

Кухтина, Надежда Борисовна

Диссертации по медицине → Кардиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) как фактор воспаления при атерогенезе. Разработка пептидного ингибитора МСР-1.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Кухтина, Надежда Борисовна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.06

Автореферат диссертации по медицине на тему Моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) как фактор воспаления при атерогенезе. Разработка пептидного ингибитора МСР-1.

На правах рукописи

КУХТИНА НАДЕЖДА БОРИСОВНА

МОНОЦИТАРНЫЙ ХЕМОТАКСИЧЕСКИЙ БЕЛОК-1 (МСР-1) КАК ФАКТОР ВОСПАЛЕНИЯ Ш*И АТЕРОГЕНЕЗЕ. РАЗРАБОТКА ПЕПТИДНОГО ИНГИБИТОРА МСР-1.

14.00.06 - Кардиология 03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

□□3477224

003477224

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ.

Научные руководители: Академик РАН, РАМН

Доктор биологических наук

Чазов Евгений Иванович Красникова Татьяна Леонидовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Аронов Давид Меерович

Доктор медицинских наук, профессор

Мазуров Алексей Владимирович

Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Защита состоится 30 сентября 2009 года в ч. на заседании диссертационного совета (Д 208.073.01) по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ. Автореферат разослан 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.

В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Атеросклероз коронарных сосудов, проявляющийся клинически как ишемическая болезнь сердца (ИБС), представляет собой наиболее распространенную причину смерти у населения развитых стран. Атеросклероз - многофакторное заболевание, одним из патогенетических звеньев которого является воспаление. Накопление мононуклеарных лейкоцитов в стенке артерии приводит к локальной продукции цитокинов, активных форм кислорода, протеолитических ферментов и других факторов, которые могут вызвать размягчение атеросклеротической бляшки и возникновение острого коронарного синдрома. Для лечения больных ИБС с целью восстановления кровотока в стенозированных коронарных артериях широко применяют транслюминальную баллонную ангиопластику со стентированием. Воспалительная реакция, возникающая в ответ на повреждение сосуда при выполнении ангиопластики, способствует рестенозированию -повторному сужению просвета сосуда. Подавление миграции и пролиферативной активности клеток в области повреждения сосуда значительно повышает эффективность стентирования сосудов. Миграция лейкоцитов в очаг воспаления осуществляется под действием хемотаксических цитокинов -хемокинов, представляющих собой семейство гликопротеиновых молекул небольшой массы (8-10 кДа), классифицируемых по расположению в структуре консервативных цистеиновых аминокислотных остатков. Одним из основных хемокинов для моноцитов/макрофагов и активированных Т-лимфоцитов является моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1). Результаты исследований свидетельствуют о том, что МСР-1 - один из ведущих хемокинов при атерогенезе, так как ингибирование МСР-1 или его рецептора у экспериментальных животных приводит к значительному подавлению развития атеросклеротических повреждений. МСР-1 вырабатывается

моноцитами/макрофагами, эндотелиальными и гладкомышечными клетками. Он не обнаружен в нормальной сосудистой стенке, однако его экспрессия

значительна в атеросклеротических бляшках в богатых макрофагами областях, прилегающих к липидному ядру, и в зонах инфаркта миокарда.

В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, действие которых направлено на ограничение миграции лейкоцитов, в частности, антагонистов МСР-1. Исследуются противовоспалительные свойства ингибирующих МСР-1 моноклональных антител, мутантных рекомбинантных форм МСР-1, ингибиторов вирусной природы и коротких пептидов молекулярной структуры МСР-1. Пептиды представляют собой наиболее безопасные соединения, и разработка пептидных антагонистов МСР-1 является одним из наиболее перспективных направлений.

Цель исследования: изучение роли хемокина МСР-1 в атерогенезе и рестенозировании сосудов и разработка противовоспалительного пептидного препарата - фрагмента МСР-1, ингибирующего миграцию лейкоцитов.

Задачи исследования:

1. Проанализировать экспрессию хемокинов, цитокинов и факторов роста в атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ИБС. Исследовать клеточный состав атеросклеротических бляшек, оценить экспрессию клетками хемокиновых рецепторов.

2. Определить концентрацию хемокина МСР-1 в плазме крови больных со стабильной и нестабильной стенокардией.

3. Получить короткие пептидные фрагменты последовательности МСР-1. Протестировать полученные пептиды в моделях миграции лейкоцитов in vitro и in vivo. Выбрать целевой пептид с наиболее выраженными ингибиторными свойствами.

4. Проанализировать противовоспалительные свойства целевого пептида в моделях подкожного воспаления у грызунов и приматов, а также при баллонной ангиопластике сонных артерий крыс.

Научная новизна. Проведен анализ атеросклеротических бляшек коронарных артерий и интимы аорты больных ИБС, полученных в ходе

операций эндартерэктомии коронарных артерий и аортокоронарного шунтирования. Получены оригинальные данные об экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов, в частности, хемокина МСР-1 и новые данные об экспрессии хемокиновых рецепторов клетками, выделенными из атеросклеротических бляшек коронарных артерий больных ИБС.

Выявлено достоверное повышение концентрации МСР-1 в плазме крови больных ИБС с нестабильной стенокардией по сравнению с больными со стабильной стенокардией.

Протестировано 15 пептидных фрагментов аминокислотной последовательности МСР-1 по влиянию на миграцию лейкоцитарных клеток в условиях in vitro. На основе анализа выбран целевой пептид - фрагмент С-концевого домена 65-76 МСР-1 (РХ). Показано, что РХ препятствует накоплению лейкоцитов в области подкожного воспаления и подавляет формирование неоинтимы на ранних сроках после проведения баллонной ангиопластики сонных артерий у экспериментальных животных.

Впервые показано участие С-концевого домена хемокина МСР-1 в миграции клеток.

Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения работы данные, в частности, об экспрессии цитокинов/хемокинов и рецепторов хемокинов в атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека, способствуют более глубокому пониманию молекулярных механизмов атерогенеза. Получен новый пептидный фрагмент 65-76 С-концевой последовательности МСР-1 (РХ), подавляющий миграцию лейкоцитов in vitro и in vivo в очаг воспаления. Данный пептид может найти применение в терапии больных с хроническими воспалительными заболеваниями, а также в кардиологии у больных ИБС при возникновении острого коронарного синдрома (ОКС) и при стентировании коронарных артерий.

Внедрение результатов исследования в практику. Безопасность действия полученного пептида РХ (условное название «Инграмон») показана в

исследованиях на добровольцах. В настоящее время в НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ проводится клиническое исследование II фазы по протоколам: 1) «Применение препарата «Инграмон» при проведении стентирования коронарных артерий у пациентов со стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий», 2) «Применение препарата «Инграмон» у больных с ОКС без подъема сегмента ST на ЭКГ».

Апробация диссертационной работы состоялась 7 июля 2009 года на межинститутской конференции НИИ клинической кардиологии им. АЛ.Мясникова и НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 статей, 5 тезисов, получено 2 патента на изобретение. Статьи и тезисы опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего в себя источников. Диссертация изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 23 пациента с ИБС (II-III ФК). Группу с нестабильной стенокардией (НС) составили 12 пациентов, у которых длительность обострения заболевания не превышала 20 суток. В группу со стабильной стенокардией напряжения (ССН) включено 11 пациентов, у которых толерантность к физическим нагрузкам не менялась на протяжении как минимум 3 месяцев. Каждому пациенту выполняли многопроекционную коронароангиографию. Наличие гемодинамически значимого стеноза (50% и более), по крайней мере, в одной из магистральных коронарных артерий подтверждали у каждого пациента. Все пациенты получали аспирин (100 мг/сут) и плавике (75 мг/сут), ß-блокаторы, за исключением одного в группе с НС, ингибиторы АПФ принимали 6 пациентов в группе с НС и 7 пациентов в группе

с ССН, статины - 10 пациентов с НС и 8 - с ССН, нитраты назначали по показаниям. Больные ИБС с ССН и НС были сопоставимы по основным клинико-ангиографическим показателям (Таб. 1 и 2).

Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в исследование.

Показатель Нестабильная стенокардия (п = 12) Стабильная стенокардия напряжения (п = 11)

Мужской пол 12(100%) 8 (73%)

Возраст, годы 53,2 ±6,9 51,7± 13,7

Курение 5 (42%) 6 (55%)

Артериальная гипертензия 6 (50%) 5 (45%)

Уровень глюкозы в крови, ммоль/л 5,49 ± 0,72 5,18 ±0,95

Уровень холестерина в крови, ммоль/л 6,54 ± 0,79 5,64 ± 1,13

Таблица 2. Данные коронароангиографии.

Нестабильная стенокардия Стабильная стенокардия напряжения

Гемодинамически значимое поражение: одной коронарной артерии двух коронарных артерий трех коронарных артерий 6 (50%) 4 (33%) 2(17%) 6 (55%) 2(18%) 3 (27%)

Поражение ствола левой коронарной артерии 2(17%) 2(18%)

Среднее количество пораженных артерий 1,8 ±0,9 2,0 ±1,2

Образцы интимы коронарных сосудов и аорт человека. Образцы

интимы коронарных артерий и аорт человека получали в ходе операций эндартерэктомии коронарных артерий и аортокоронарного шунтирования пациентов, страдающих ИБС, ССН (хирургическое отделение ИКК РКНПК). Сегменты артерий заключали в среду для замораживания О.С.Т. Compound Tissue-Tek®, помещали в жидкий азот и хранили при температуре -70°С или отмывали в стерильном физиологическом растворе, погружали в раствор RNA-later® и хранили при 4°С.

Иммуногистохимический анализ. Готовили гистологические срезы толщиной 6 мкм. Окрашивание и визуализацию проводили по стандартной

методике для замороженных образцов. Визуализацию антигенов проводили с применением специфических мышиных антител к антигенам человеческих лейкоцитов CD45, CD68, CD11с и CD4. Контрольные срезы инкубировали с 10% раствором сыворотки. В качестве субстрата для визуализации антигенов использовали ДАБ и Н202. Для типирования лейкоцитов у яванских макаков использовали мышиные МкАт к антигенам человека CDllc (маркер моноцитов/макрофагов) и CD45 (общий лейкоцитарный антиген); у крыс для визуализации поверхностных клеточных антигенов использовали мышиные МкАт к фактору фон-Виллебранда (vWF) и к моноцитам/макрофагам (ED1). Клеточные ядра окрашивали гематоксилином Майера.

Выделение РНК. Из образцов коронарных артерий и интимы аорт выделяли РНК с применением коммерческого набора для фенольной экстракции РНК «РИБО-золь-А» в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию полученной РНК определяли спектрофотометрически.

Реакция обратной транскрипции. Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием коммерческого набора «РЕВЕРТА». В качестве затравок для инициации реакции использовали смесь случайных гексануклеотидов. Инкубацию проводили в течение 30 минут при 37°С. Полученную кДНК хранили при -70°С до проведения анализа.

Полуколичественная иолимеразная цепная реакция в «реальном времени». При помощи ПЦР в «реальном времени» исследовали экспрессию мРНК генов MIP-la, MIP-ip, 1-309, ИЛ-4, 10, -13, IP-10, МСР-1, -2, -3, MIG, I-ТАС, RANTES, ФНО-а, SDF-1. Данные об экспрессии каждого гена цитокина/хемокина выражали по отношению к уровню экспрессии гена домашнего хозяйства р2-микроглобулина. ПЦР проводили с использованием коммерческого набора «АмплиСенс-200-1» и интеркалирующего красителя SybrGreen в термоциклере Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Австралия).

Выделение и иммунофенотнпирование клеток из образцов интимы аорты. Образцы сосудов больных с ИБС обрабатывали коллагеназой I типа

согласно описанному ранее методу (Bonanno Е et al., 2000). Полученную клеточную суспензию окрашивали при помощи коктейля МкАт, специфичных к антигенам зрелых лейкоцитов (linl), МкАт к CD4, CD8, CD11с, рецептору МСР-1 CCR2 и контрольными иммуноглобулинами. Связывание антител с клетками анализировали на поточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems) с использованием программного обеспечения CellQuest.

Измерение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с НС и ССН. Концентрацию МСР-1 измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора Biosource (США).

Выделение моноцитов/макрофагов из периферической крови.

Мононуклеарные клетки выделяли из венозной крови здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности Histopaque (Boyum, 1968). Обогащенную моноцитами суспензию клеток получали с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте перколла по описанному ранее методу (Al-Sumidaie et al., 1984). Полученная суспензия клеток (4 млн/мл) содержала 74 ± 10% моноцитов. Жизнеспособность клеток составляла не менее 96%.

Оценка миграции клеток in vitro в модифицированной микрокамере Бойдена. Изучение миграции клеток проводили с использованием микрокамеры Бойдена (Falk W et al., 1980). В качестве хемокина использовали МСР-1 (50 нг/мл для моноцитов и 100 нг/мл для клеток ТНР-1) (R&D Systems, США). Клетки и раствор хемокина разделяли мембраной с размером пор 5 мкм для моноцитов и 8 мкм для клеток ТНР-1. Время миграции составляло 1 час для моноцитов и 3 часа для ТНР-1. Промигрировавшие клетки фиксировали и окрашивали красителем Гимза. Мембрану сканировали на сканере HP ScanJet 5300С и анализировали с использованием программного обеспечения SigmaGel. Данные выражали в относительных единицах, представляющих собой

отношение клеточной миграции в опыте к контрольной величине, полученной при отсутствии хемоаттрактанта.

«Air pouch» (воздушный мешок) у мышей. В спинной области самцов гибридных мышей F,CBA/Lac * С57В1/6 (25 г, 7-9 нед., питомник «Столбовая»), создавали полость при помощи 2-кратного подкожного введения стерильного воздуха. На 7 сутки мышам вводили в полость 1 мл рекомбинантного мышиного МСР-1 (JE/CCL2) (100 нг/мл) или 1 мл раствора MCP-l(JE) + РХ, раствора ЛПС (1 мкг/мл) или ЛПС + РХ. Контрольным животным в полость вводили 1 мл стерильного физиологического раствора. Через 4 ч полости промывали раствором Версена, лаважную жидкость отбирали, подсчитывали количество клеток в камере Нойбауэра. Типирование моноцитов/макрофагов проводили при помощи МкАт (клон F4/80) и поточного цитофлюориметра. В экспериментах при подборе оптимальной ингибирующей дозы пептида в «воздушный мешок» инъецировали ЛПС в указанной выше концентрации. РХ вводили внутримышечно в диапазоне концентраций от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл.

Подкожное воспаление у крыс и приматов. В работе использовали самцов линейных крыс Wistar (масса 300-400 г, 2,5-3 мес., питомник «Столбовая») и самцов яванских макаков (Macacus fascicularis) (масса 2,5-3 кг, 2,5-3 года, ГУ НИИ Медицинской Приматологии РАМН). В спинную область животных подкожно вводили ЛПС: 2 мкг/кг для крыс и 3,3 мкг/кг для обезьян. РХ вводили внутримышечно крысам в концентрации 40 мкг/кг или двукратно внутривенно обезьянам (сразу после введения ЛПС и через 4 ч) в концентрации 33 мкг/кг. Контрольным животным вводили РХ, стерильный физиологический раствор или смесь аминокислот, входящих в состав РХ (33 мкг/кг). Препараты готовили через 24 ч, фиксировали и окрашивали красителем Гимза или МкАт. Количество клеток считали не менее чем в 10 полях зрения.

Баллонная ангиопластика общих сонных артерий крыс. Левую общую сонную артерию крыс Wistar деэндотелизировали при помощи 3 пассажей эмболоэктомического баллонного катетера Фогарти-2Р (Baxter, США).

Опытным животным вводили 1 раз в сутки внутримышечно 10 мкг РХ в 100 мкл физиологического раствора, контрольным - 100 мкл физиологического раствора. Через 4, 7, 14 и 28 суток после операции левую общую сонную артерию и контрапатеральный контрольный сосуд иссекали. Фрагменты сосудов погружали в среду для замораживания О.С.Т. Compound Tissue Teck®, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°С.

Морфометрический анализ. Морфометрический анализ гистологических срезов сонных артерий (измерение площади неоинтимы, медии и просвета сосуда) проводили с помощью программного обеспечения Optimas 6.1.

Анализ параметров клеточного иммунитета крыс. Общее количество лейкоцитов подсчитывали в камере Нойбауэра по стандартной методике после лизиса эритроцитов в 5% уксусной кислоте. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили при помощи цитофлюориметрии в потоке с использованием мышиных МкАт, специфичных к антигенам лимфоцитов крыс CD3, CD4, CD8, NKR-pl А, а также контрольных Ig мыши.

Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента и критерий Манна-Уитни с минимальным уровнем значимости р=0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ атеросклеротических бляшек коронарных артерий и аорт больных ИБС. Во всех проанализированных образцах бляшек обнаружены очаговые скопления мононуклеарных лейкоцитов. Для подтверждения результатов морфологического анализа образцы сосудов окрашивали МкАт к антигенам лейкоцитов. Иммуногистохимический анализ выявил участки скопления СЭ45+клеток (лейкоцитов), в том числе моноцитов/макрофагов (CD11с+) и CD4+ Т-клеток (Рис. 1).

а б в г

Рисунок 1. Иммуногистохимический анализ атеросклеротической бляшки коронарной артерии человека. Окрашивание срезов контрольными иммуноглобулинами (а), антителами (коричневый цвет) к CD11с (б), CD45 (в) и CD4 (г). Ядра окрашены гематоксилином Майера, хбОО.

При помощи ПЦР в реальном времени практически во всех исследованных образцах атеросклеротических бляшек коронарных артерий и интимы аорты без макроморфологических изменений выявили экспрессию мРНК индуцибельных (воспалительных) хемокинов MIG, 1-309, МСР-3, а также ИЛ-13 и SDF-1 (Рис. 2). Экспрессия конститутивного хемокина SDF-1 в интиме аорты и бляшках может быть обусловлена его участием в репарации поврежденной артериальной стенки (Xiao Q et al., 2007). Ранее ИЛ-13 рассматривали как противовоспалительный цитокин (Minty A et al., 1993). В настоящее время считают, что длительное действие ИЛ-13 оказывает провоспалительное действие из-за активации неспецифических факторов транскрипции, приводящих в свою очередь к усилению секреции хемокинов МСР-1, -2, -3, -5, MIP-1 а, -1 р и -2 (McCaffrey ТА et al., 2000).

В проанализированных образцах атеросклеротических бляшек, помимо указанных выше хемокинов и цитокинов, была обнаружена экспрессия хемокина МСР-1, MIP-ip, и провоспалительного цитокина ФНО-а, которые не были обнаружены в образцах «неизмененной» интимы аорты. Полученные нами результаты показали, что: 1) более чем в половине атеросклеротических бляшек коронарных артерий обнаружена мРНК хемокина МСР-1, 2) у пациентов с ИБС

интима артерий без макроморфологических изменений может являться участком развивающегося воспаления.

пнгимы аорт без макроскопических изменений (п=5)

атеросклерспнческие бляшки (п=11)

ФНО-а

МСР-3

БОРИ

РАГдТЕЭ

МСР-1

МСР-2

ИЛ-13

1-309

М1Р-1Р

мю

% образцов с экспрессией цитокина по отношению ко всем образцам в группе

Рисунок 2. Анализ экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов в интиме «неизмененных» артерий и артерий с атеросклеротическими бляшками (данные представлены как процент образцов с выявленной экспрессией цитокина по отношению ко всем образцам в группе).

Образцы атеросклеротических бляшек подвергались обработке коллагеназой с последующим иммунофенотипированием выделенных клеток (Рис. 3).

2 и и

ЬЬ1 СШ СБ4

Рисунок 3. Иммунофенотипирование клеток, выделенных из атеросклеротических бляшек (показаны результаты одного из 4 независимых экспериментов).

Из образцов бляшек (п = 4) были выделены лейкоциты, в основном Т-клетки (СОЗ+), 48-50% из которых являлись Т-хелперными клетками

(С03+С04+). Рецепторы хемокина МСР-1 ССЯ2 обнаружены на 12-40% Т-хелперов. Полученные данные могут свидетельствовать о хемотаксисе клеток в атеросклеротическую бляшку под действием МСР-1.

Для дополнительной оценки участия хемокина МСР-1 в патогенезе атеросклероза и ОКС мы определили концентрацию МСР-1 в крови больных ИБС с нестабильной стенокардией (НС) и у больных со стабильной стенокардией напряжения (ССН).

Измерение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с ИБС со стабильной и нестабильной стенокардией. По данным нашего исследования концентрация МСР-1 оказалась достоверно выше в плазме крови у пациентов с НС по сравнению с больными с ССН (Рис. 4).

Рисунок 4. Концентрация МСР-1 в плазме у пациентов с ИБС. * - р < 0,0001.

Выраженность межгрупповых различий позволяет предполагать, что определение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с ИБС в комплексе с другими показателями может использоваться для дифференциальной диагностики НС и ССН. На основании данных об участии МСР-1 в атерогенезе этот хемокин рассматривается как мишень для терапевтического воздействия. С этой целью в нашей работе совместно с сотрудниками лаборатории синтеза пептидов НИИЭК РКНПК (под рук. к.х.н. Беспаловой Ж.Д.) был получен ряд коротких пептидов - фрагментов структуры МСР-1.

Разработка и получение новых противовоспалительных препаратов пептидной природы на основе структуры хемокина МСР-Т. Структура МСР-1 была проанализирована с помощью компьютерных программ Peptide Companion, позволяющих предсказывать линейные эпитопы в белках, включая метод предсказания гидрофильных участков аминокислотной цепи, метод оценки поверхностной доступности и метод учета встречаемости различных сочетаний аминокислотных остатков в уже известных антигенных детерминантах. После проведенных расчетов было выбрано несколько потенциально «активных» фрагментов последовательности МСР-1 и осуществлён их синтез посредством автоматического твердофазного метода с использованием Fmoc-технологии.

Синтезированные пептиды тестировали in vitro по их влиянию на миграцию моноцитарных клеток в камере Бойдена. В результате был выбран пептидный фрагмент 65-76 С-концевой последовательности МСР-1 (РХ), обладавший максимальной ингибирующей активностью (РХ подавлял миграцию клеток ТНР-1 и моноцитов крови на 60% и 50% соответственно) (Рис. 5).

миграция, и о

м м га м и U за Z* it

ТНР-1 моношггы

Рисунок 5. Влияние пептида РХ на МСР-1-стимулированную миграцию промоноцитарных клеток ТНР-1 и моноцитов крови. Данные представлады как среднее трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. За '00% принята миграция клеток в присутствии МСР-1.

В первичной структуре МСР-1 С-концевая последовательность 65-76, соответствующая РХ, выделена красным цветом: H-Ala-Gln-Pro-Asp-Ala-Ile-Asn-Ala-Pro-Val-Thr-Cys-Cys-Tyr-Asn-Phe-Thr-Asn-Arg-Lys-Ile-Ser-Val-Gln-Arg-Leu-Ala-Ser-Tyr-Arg- Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Arg-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-Val-Ile-Phe-Lys-Thr-Ile-Val-Ala-Lys-Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys^-Val-Gln-Asp-Ser-Met-Asp-His-Lcu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Tlir-Pro-Lys-TIir-OH.

В предыдущих исследованиях утверждалось, что С-концевой домен хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции (Han КН et al., 1999), и пептиды из этой области не конкурируют с МСР-1 при взаимодействии с рецепторами клеток ТНР-1 (Steitz SA et al., 1998). Полученный нами пептид РХ значительно подавлял МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 и моноцитов крови. Ингибирующая активность РХ оказалась сопоставима с активностью пептида последовательности 51-62 МСР-1, который описан в литературе как наиболее эффективный пептидный ингибитор миграции моноцитарных клеток in vitro (Reckless J et al., 2001). Таким образом, мы впервые получили данные о возможном участии С-концевой части молекулы МСР-1 в клеточной миграции.

Для выявления ингибирующей активности РХ in vivo мы провели серию экспериментов с использованием нескольких моделей воспаления у экспериментальных животных.

Действие РХ на миграцию лейкоцитов в модели «air pouch» (воздушный мешок) у мышей. Введение рекомбинантного мышиного МСР-1 (JE) в воздушный мешок у мышей сопровождалось усилением миграции моноцитов в п^'ость мешка. Содержание клеток (тыс.) в лаваже в присутствии хемокинэ по сравнению с контролем составляло 210 ± 73 против 100 ± 56, соотвшл-венно. Одновременное введение МСР-1 и РХ приводило к снижению HHCja моноцитов в лаваже (96 ± 43 клеток) (Рис. 6а). Инъецирование в сформированный воздушный мешок ЛПС сопровождалось миграцией в полость мешка гранулоцитов, которые в контроле отсутствовали. Совместное введение

ЛПС и РХ приводило к снижению количества гранулоцитов в лаважной жидкости (п = 7 для каждой группы) и составляло в контрольной группе - 83 ± 43, с ЛПС - 1778 ± 870, с ЛПС + РХ - 970 ± 446 (Рис. 66).

ютащшты х 1000

плрл* Л Л +РХ коятроль Л Я+РХ

Рисунок 6. а. РХ ингибирует МСР-1(.1Е)-индуцированную миграцию моноцитов в «воздушный мешок» у мышей (п = 5 для каждой группы), б. РХ ингибирует ЛПС-индуцированную миграцию гранулоцитов в «воздушный мешок» у мышей (п = 7 для каждой группы). Концентрация рекомбинантного мышиного МСР-1 - 100 нг/мл, ЛПС - 1 мкг/мл, РХ - 1мкг/мл, * - р < 0,05. # - р = 0,056.

В следующей серии экспериментов подбирали минимальную ингибирующую дозу РХ. Для этого в «воздушный мешок» вводили ЛПС. РХ вводили внутримышечно в диапазоне доз от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл. Ингибирующий эффект РХ сохранялся в диапазоне концентраций: 0,001-0,010,1 мг/мл. Таким образом, минимальная ингибирующая концентрация РХ составила 1 мкг/мл (40 мкг/кг). При этом количество гранулоцитов в лаважной жидкости мешка снижалось практически одинаково ~ на 40-50% (Рис. 7).

100 80 60 40

0,004

0,04

лпс-

0,4

1од [РХ],мг/кг

Рисунок 7. Внутримышечное введение РХ подавляет стимулированный хемотаксис гранулоцитов в «воздушный мешок» у мышей (п=5 в каждой группе). За 100% принято среднее количество клеток у животных, которым не вводили РХ.

Таким образом, РХ эффективно подавлял миграцию моноцитарных и гранулоцитарных лейкоцитов в «воздушный мешок» у мышей при одновременном введении хемоаттрактанта и РХ в полость «воздушного мешка» и при внутримышечном введении РХ.

Действие РХ на миграцию лейкоцитов в очаг подкожного воспаления у крыс. В зоне ЛПС-индуцированного воспаления присутствовали фибробласты, гранулоциты и моноциты (Рис. 8в). Лейкоцитарные клетки отсутствовали при введении физиологического раствора (Рис. 8а) или РХ (Рис. 86). При введении ЛПС и РХ количество гранулоцитов и моноцитов снижалось приблизительно на 70 и 25%, соответственно (Рис. 8г). Количество фибробластов достоверно не отличалось ни в одной из групп.

Рисунок 8. Внутримышечное введение РХ подавляет подкожное воспаление у крыс. Представлены характерные результаты одного из трех независимых экспериментов (п = 4 для каждой из групп). Окрашивание по Романовскому-Гимза. Увеличение хЮО.

Действие РХ на развитие подкожного воспаления у приматов. У яванских макаков через 24 часа после инъекции Л ПС в очаге воспаления накапливались главным образом гранулоциты и единичные моноциты. Количество лейкоцитов в поле зрения в группе с введением ЛПС (п = 6) составляло 90 ± 10 против 50 ± 24 в группе с введением РХ (п = 5), т.е. РХ подавлял миграцию лейкоцитов в зону воспаления (Рис. 9 и 10). Количество фибробластов в группах достоверно не отличалось. Контрольная смесь аминокислот, составляющих РХ. никак не влияла на миграцию клеток.

в г д

Рисунок 9. Внутривенное введение РХ подавляет подкожное воспаление у приматов. Окрашивание препаратов красителем Гимза. Увеличение * 100.

' » 'V' * -jT Шт

* * * tSr .. 3/

V * ✓"' ШЛ^г/ 'K

f. jf

> N '

б. »«•

контроль ЛПС ЛПС + РХ

Рисунок 10. Внутривенное введение РХ подавляет подкожное воспаление у приматов. Иммуногистохимическое окрашивание МкАт (коричневый цвет) к антигенам лейкоцитов CD45 (а) и моноцитов CDI 1с (б). Увеличение х 100.

Таким образом, РХ обладает противовоспалительными свойствами, так как подавляет хемотаксис клеток в ответ на MCP-1(JE) и ЛПС у экспериментальных животных.

Экспериментальная баллонная ангиопластика сонных артерий крыс.

Баллонное повреждение левой общей сонной артерии выполняли доступом через наружную сонную артерию. Через 4 суток после баллонирования на месте поврежденного интимального слоя в сосудах крыс, получавших только физиологический раствор, наблюдали адгезировавшие клетки крови. В сосудах крыс, получавших РХ, на месте поврежденного интимального слоя первичные скопления клеток практически отсутствовали (Рис. 11).

Рисунок 11. 4-е сутки после баллонного повреждения сонной артерии крыс. а. Контрольная группа, б. Группа с РХ. Иммуногистохимическое окрашивание МкАт к Клеточные ядра окрашены гематоксилином Майера. Увеличение

600х.

Количество ядер клеток в неоинтиме, площадь неоинтимы и отношение площади неоинтимы к медии были достоверно ниже в группе с РХ по сравнению с контрольной группой. Площадь просвета сосуда и площадь медии не имели достоверных отличий (Рис. 12 и 13).

рН

—1

сутк| после повреждения

сутки после повреждения

Рисунок 12. Количество ядер клеток в неоинтиме и площадь неоинтимы после баллонного повреждения общих сонных артерий крыс. Белые столбцы -контрольная группа с получением физиологического раствора, серые - группа с получением РХ. * -р < 0.05.

нн *

сутки после повреждения

Рисунок 13. Площадь просвета сосуда и отношение площади неоинтимы к площади медии после ангиопластики сонной артерии крыс. Белые столбцы -контрольная группа с получением физиологического раствора, серые - группа с получением РХ. * - р < 0,05.

Через 7 суток в обеих группах животных люминальную поверхность сосуда покрывали расположенные в несколько слоев клетки, образующие неоинтиму (Рис. 14). В группе с получением РХ площадь неоинтимы, количество ядер клеток в неоинтиме и отношение площади неоинтимы к площади медии были достоверно ниже, а площадь просвета сосуда достоверно больше по сравнению с контрольной группой (Рис. 12 и 13).

а б

Рис. 14. Формирование неоинтимы через 7 суток после баллонирования сонной артерии крыс. Окрашивание красителем Гимза. а. Контроль, б. Группа с РХ. Увеличение 400х.

Через 14 и 28 суток после баллонного повреждения сонной артерии крыс в контрольной группе и группе с получением РХ наблюдали выраженную интимальную гиперплазию. Ни один из указанных выше показателей не имел достоверных отличий.

Общее количество лейкоцитов в периферической крови, а также относительное содержание популяций лимфоцитов: Т-клеток, в том числе Т-хелперов (СТ)3+/С041), цитотоксических лимфоцитов (С03+/С08т) и естественных киллеров (СОЗ /ЫКЯ-р! А+) достоверных отличий не имели на всех сроках после повреждения сосудов. Полученные данные свидетельствуют о том, что синтетический пептидный С-концевой фрагмент 65-76 МСР-1 РХ не

оказывает системного действия на параметры неспецифического и специфического иммунитета. По-видимому, он оказывает локальное действие, подавляя миграцию лейкоцитов в месте повреждения артерии. РХ достоверно подавляет формирование неоинтимы на ранних сроках, когда в данном процессе самыми активными участниками являются лейкоциты.

В целом, на основании экспериментов в моделях воспаления у экспериментальных животных нами было показано противовоспалительное действие разработанного пептида РХ. ВЫВОДЫ:

1. В атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ИБС выявлена экспрессия хемокина МСР-1. Лейкоциты, выделенные из образцов атеросклеротических бляшек, экспрессируют рецептор МСР-1 CCR2.

2. Концентрация МСР-1 в плазме крови пациентов с нестабильной стенокардией достоверно повышена по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией.

3. Синтетический пептид С-концевой последовательности (65-76) МСР-1 (РХ) ингибирует МСР-1-опосредованную миграцию моноцитов человека in vitro в камере Бойдена и в «воздушном мешке» у мышей.

4. РХ подавляет подкожное ЛПС-индуцированное воспаление у крыс и приматов.

5. РХ препятствует формированию неоинтимы после баллонного повреждения сонных артерий крыс на ранних сроках после вмешательства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Н.Б. Глазкова, Т.И. Арефьева, O.A. Антонова, Т.Л. Красникова. Действие ингибиторов митоген-активируемых киназ на хемотаксис клеток, стимулированный моноцитарным хемотаксическим белком-1. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2003, 89(1): 43-51.

2. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, A.M. Арефьева, Т.Л. Красникова. Зависимость хемотаксического ответа моноцитарных клеток, стимулированных

моноцитарным хемотаксическим белком-1, от состава подложки. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2003, 89(12): 1577-1581.

3. Сидорова М.В., Молокоедов A.C., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б., Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д., Бушуев В.Н. Пептидные фрагменты хемокина МСР-1, их структурные аналоги и их влияние на MCP-1-опосредованную миграцию моноцитарных клеток. Биоорганическая химия, 30(6): 582-93, 2004.

4. Т.Л. Красникова, Т.И. Арефьева, М. Г. Мелехов, Н. Б. Кухтина, М.В. Сидорова, A.C. Молокоедов, В.Н. Бушуев, Ж.Д. Беспалова, Е.И. Чазов. Пептид последовательности 66-77 моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) -ингибитор воспаления у экспериментальных животных. Доклады Академии наук, 2005,404, 4,551-554.

5. Arefieva T.I., Kukhtina N.B., Antonova O.A., Krasnikova T.L. MCP-1 -stimulated Chemotaxis of monocytic and endothelial cells is dependent on activation of different signaling cascades. Cytokine 2005, 31(6): 439-446.

6. М.В. Сидорова, A.C. Молокоедов, A.A. Азьмуко, Т.И. Арефьева, М.Г.Мелехов, Н.Б.Кухтина, Т.Л.Красникова, Ж.Д. Беспалова, В.Н. Бушуев. Пептидный фрагмент (66-77) моноцитарного белка -1 и его ретро-энантио-аналог ингибируют миграцию клеток in vivo и in vitro. Биоорганическая химия, 2006, 32,2,161-168.

7. С.И. Проваторов, Т.И. Арефьева, Н.Б. Кухтина, Т.К. Люкова, A.M. Арефьева, Т.Л. Красникова. Маркеры воспаления - моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) и С-реактивный белок - в крови пациентов с нестабильной стенокардией и стабильной стенокардией напряжения. Терапевтический Архив, 2006, 6, 66-69.

8. Чазов Е.И., Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д., Кухтина Н.Б., Мелехов М.Г., Арефьева Т.И., Сидорова М.В., Молокоедов A.C., Гвоздик Т.Е., Мартьянов Б.М., Поздеев В.В., Сергиенко В.Б., Бушуева Т.Л. Ингибирование миграции моноцитов и гранулоцитов in vivo пептидом последовательности 65-76

моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1). Доклады Академии наук, 2006;411:270-272.

9. Chazov El, Bespalova JD, Arefieva TI, Kukhtina NB, Sidorova MV, Provatorov SI, Krasnikova TL. The peptide analogue of MCP-1 65-76 sequence is an inhibitor of inflammation. Can J Physiol Pharmacol. 2007; 85(3-4): 332-40.

10. H. Б. Кухтина, П. П. Баштрыков, Беспалова Ж.Д., Сидорова М.В., Т. И. Арефьева, В.О.Соколов, Т. JI. Красникова. Влияние синтетического фрагмента 65-76 МСР-1 на формирование неоинтимы после баллонного повреждения у крыс. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2008, 94(1): 2736.

11. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, A.M. Арефьева, Р.С. Акчурин, T.J1. Красникова. Экспрессия хемокинов и цитокинов в атеросклеротических бляшках и интиме артерий у больных ИБС. Терапевтический архив, 2008, №4, с.63-69.

12. Kukhtina NB, Bashtrykov РР, Bespalova ZhD, Sidorova MV, Arefeva TI, Sokolov VO, Krasnikova TL. Effects of synthetic monocyte chemotactic protein - 1 fragment 65-76 on neointima formation after carotid artery balloon injury in rats. Neurosci Behav Physiol. 2009, 39:153-159.

13. ТЛ.Красникова, М.В.Сидорова, Т.И.Арефьева, Н.Б.Кухтина, А.А.Азьмуко, Ж.Д.Беспалова. Разработка нового противовоспалительного пептидного препарата - ингибитора моноцитарного хемотаксического белка-1. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2009, 95(5): 494-506.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

ДАБ - диаминобензидина тетрахлорид

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

КФК - креатинфосфокиназа

ЛПС - липополисахарид

МкАт - моноклональное антитело

НС - нестабильная стенокардия

ОКС - острый коронарный синдром

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СРБ - С-реактивный белок

ССН - стабильная стенокардия напряжения

ФК - функциональный класс

ФНО - фактор некроза опухоли

IP-10 - индуцированный ИФН-у белок-10

I-TAC - индуцированный ИФН-у Т-клеточный а-хемоаттрактант

MIG - индуцированный ИФН-у монокин

MIP - макрофагальный воспалительный белок

МСР-1 - моноцитарный хемотаксический белок-1

РХ - пептид-10

RANTES - хемокин, регулируемый при активации, экспрессируемый и

секретируемый нормальными Т-клетками

SDF - получаемый из стромальных клеток фактор

vWF - фактор фон-Виллебранда

Оглавление диссертации Кухтина, Надежда Борисовна :: 2009 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Атеросклероз — заболевание с хронической воспалительной компонентой

1.2. Рестеноз как осложнение эндоваскулярных способов реваскуляризации в отдаленном периоде

1.3. Участие цитокинов в атерогенезе. Влияние цитокинов на стабильность атеросклеротических бляшек

1.4. Семейство хемокинов. Характеристика моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1 )/ССЬ

1.5. Рецепторы хемокинов. Пути передачи внутриклеточных сигналов от хемокиновых рецепторов. Рецептор МСР

1.6. Роль МСР-1 в атерогенезе

1.7. Перспективные противовоспалительные лекарственные препараты и препараты для покрытия стентов при лечении ИБС и атеросклероза

Введение диссертации по теме "Кардиология", Кухтина, Надежда Борисовна, автореферат

Атеросклероз коронарных сосудов, проявляющийся клинически как ишемическая болезнь сердца (ИБС), является наиболее распространенной причиной смерти у населения развитых стран. Ряд клинических и экспериментальных данных позволяют рассматривать атеросклероз как хроническое воспалительное заболевание артериальной стенки. На всех этапах атерогенеза в интиме сосуда выявлено накопление «клеток воспаления», преимущественно моноцитов/макрофагов и Т-лимфоцитов. Активация этих клеток и их взаимодействие друг с другом приводит к локальной продукции, главным образом, макрофагами, цитокинов, активных форм кислорода, протеолитических ферментов и других факторов, приводящих к ремоделированию сосудистой стенки. В последние десятилетия для лечения больных ИБС, широко применяют транслюминальную баллонную ангиопластику со стентированием коронарных артерий. Наиболее значительным ограничением данных способов восстановления кровотока является рестеноз. Рестеноз - повторное сужение просвета сосуда в месте его повреждения, возникающее приблизительно у 7-30% больных. Воспалительная реакция, возникающая в ответ на повреждение сосуда, является пусковым механизмом формирования неоинтимы. Об этом свидетельствуют данные о накоплении моноцитов в участках рестеноза у человека, а также о том, что подавление миграции лейкоцитов предупреждает рестенозирование сосудов у экспериментальных животных. В настоящее время для улучшения результатов стентирования разрабатываются стенты, покрытые различными лекарственными препаратами. Широкое распространение получили стенты, покрытые рапамицином — антибактериальным препаратом с выраженным антипролиферативным и иммуносупрессорным действием.

Миграция лейкоцитов в очаг воспаления осуществляется под действием хемотаксических цитокинов — хемокинов. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что одним из основных хемокинов в атерогенезе является моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1). МСР-1 - хемоаттрактант для моноцитов/макрофагов и активированных Т-лимфоцитов. МСР-1 вырабатывается моноцитами/макрофагами, эндотелиальными клетками (ЭК) и гладкомышечными клетками (ГМК). Он не обнаружен в нормальной сосудистой стенке, однако его экспрессия значительна в атеросклеротических бляшках в богатых макрофагами областях, прилегающих к липидному ядру, и в зонах инфаркта миокарда. Формирование атеросклеротических поражений было подавлено в экспериментах с использованием мышей, дефицитных по гену МСР-1 или его рецептору ССЯ2. Баллонное повреждение артерий приводит к быстрой индукции синтеза МСР-1 ГМК, в свою очередь нейтрализация МСР-1 с помощью специфичных антител подавляет рост неоинтимы после баллонирования у экспериментальных животных. Таким образом, МСР-1 стимулирует формирование неоинтимы и может вносить существенный вклад в развитие стенозирующих осложнений после проведения чрескожной транслюминальной ангиопластики.

В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, в частности антагонистов МСР-1, действие которых направлено на ограничение миграции лейкоцитов. Исследуются противовоспалительные свойства ингибирующих МСР-1 моноклональных антител, мутантных рекомбинантных форм МСР-1, ингибиторов вирусной природы и др. Препараты пептидной природы на сегодняшний день являются наиболее безопасными, поэтому разработка пептидных антагонистов МСР-1 представляет собой одно из наиболее перспективных направлений.

Целью работы явилось изучение роли хемокина МСР-1 в атерогенезе и рестенозировании сосудов и разработка противовоспалительного пептидного препарата - фрагмента МСР-1, ингибирующего миграцию лейкоцитов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать экспрессию хемокинов, цитокинов и факторов роста в атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ИБС.

Исследовать клеточный состав атеросклеротических бляшек, оценить экспрессию клетками хемокиновых рецепторов.

2. Определить концентрацию хемокина МСР-1 в плазме крови больных со стабильной и нестабильной стенокардией.

Научная новизна. Проведен анализ атеросклеротических бляшек коронарных артерий и интимы аорты больных ИБС, полученных в ходе операций эндартерэктомии коронарных артерий и аортокоронарного шунтирования. Получены оригинальные данные об экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов, в частности, хемокина МСР-1 и новые данные об экспрессии хемокиновых рецепторов клетками, выделенными из атеросклеротических бляшек коронарных артерий больных ИБС.

Протестировано 15 пептидных фрагментов аминокислотной последовательности МСР-1 по влиянию на миграцию лейкоцитарных клеток в условиях in vitro. На основе анализа выбран целевой пептид — фрагмент С-концевого домена 65-76 МСР-1 (РХ). Показано, что РХ препятствует накоплению лейкоцитов в области подкожного воспаления и подавляет формирование неоинтимы на ранних сроках после проведения баллонной ангиопластики сонных артерий у экспериментальных животных.

Впервые показано участие С-концевого домена хемокина МСР-1 в миграции клеток.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Сердечно-сосудистые заболевания представляют собой одну из сновных причин инвалидности и преждевременной смерти жителей экономически развитых стран. По данным Hansson GK (2005) доля этих заболеваний в структуре смертности составляет 40-60%, в Северной Америке составляет приблизительно 38% от общего количества смертей. Среди европейцев сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее частой причиной смерти у мужчин в возрасте моложе 65 лет и второй по частоте причиной смерти у женщин. В России также отмечается существенное увеличение смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, доля которых в структуре преждевременной смертности у мужчин составляет приблизительно 60% и до 70% у женщин.

Одним из главных заболеваний сердечно-сосудистой системы является ишемическая болезнь сердца (ИБС). Приблизительно половина всех случаев летальных исходов (40-60% по разным данным), связанных с сердечнососудистыми заболеваниями, обусловлена ИБС. В подавляющем большинстве (до 98%) случаев в основе ИБС лежит атеросклероз коронарных артерий.

Заключение диссертационного исследования на тему "Моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) как фактор воспаления при атерогенезе. Разработка пептидного ингибитора МСР-1."

ВЫВОДЫ:

2. Концентрация МСР-1 в плазме крови пациентов с ИБС при нестабильной стенокардии достоверно повышена по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией.

4. РХ подавляет подкожное ЛПС-индуцированное воспаление у крыс и приматов.

7. Заключение

Проведенное исследование способствуют более глубокому пониманию роли хемокина МСР-1 в атерогенезе, представлению о некоторых механизмах развития воспаления и атерогенеза. Установлено, что у больных ИБС при НС концентрация МСР-1 в плазме крови достоверно повышается. Анализ экспрессии цитокинов, хемокинов и факторов роста в атеросклеротических бляшках свидетельствует о том, что участком развивающегося воспаления может являться интима артерий пациентов с ИБС без макроморфологических изменений. Выявлены внутриклеточные протеинкиназы, активирующиеся в ответ на МСР-1 в моноцитах периферической крови и ЭК. Анализ активации внутриклеточных протеинкиназ на ЭК проведен впервые. Авторы разработали, синтезировали и протестировали новый пептидный фрагмент РХ, обладающий противовоспалительными свойствами, который является потенциальным кандидатом для использования при лечении хронических воспалительных заболеваний, а также при использовании направленной фармакотерапии при установке стентов, покрытых лекарственными препаратами, больным ИБС. Такое лекарственное средство способно подавлять развитие гиперплазии неоинтимы на ранних сроках. Разработанный препарат пептидной природы РХ не оказывает системного действия на параметры неспецифического и специфического иммунитета. РХ обладает высокой устойчивостью к деградации в плазме крови, эффективно подавляет миграцию моноцитарных и гранулоцитарных лейкоцитов. Применение синтетического пептидного С-концевого фрагмента 65-76 МСР-1 РХ в качестве ингибитора миграции лейкоцитов при проведении ангиопластики наряду с традиционной терапией могло бы способствовать снижению частоты возникновения рестеноза.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Кухтина, Надежда Борисовна

1. Антонов A.C., Крушинский A.B., Николаева^ М:А., Флегель Х.Г.

2. Первичная культура эндотелиальных клеток из пупочной вены человека: идентификация и характеристика растущей и конфлуентной культуры. Цитология, 1981; 33: 1154-1159.

3. Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И., Арефьева А.М., Акчурин P.C., Красникова Т.Л;. Экспрессия хемокинов и цитокинов в атеросклеротических бляшках и интиме артерий у больных ИБС. Терапевтический архив, 2008; 80(4): 63-9.

4. Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможности терапии. Предисловие акад. Е.И. Чазова -М., Спорт и культура, 1999.

5. Самко А.Н., Савченко АЛ. Некоторые современные направления коронарной ангиопластики. Кардиология, 1993; 9: 62-67.

6. Флоря В.Г., Беленков Ю.Н. Ремоделирование сосудов как патогенетический компонент заболеваний сердечно-сосудистой системы. Кардиология 1996; 12: 72-78.

7. Abi-Younes S, Sauty A, Mach F, Sukhova GK, Libby P, Luster AD. The stromal cell-derived factor-1 chemokine is a potent platelet agonist highly expressed in atherosclerotic plaques. Circ Res. 2000; 86(2): 131-8.

8. Adam LP, Hathaway DR. Identification of mitogen-activated protein kinase phosphorylation sequences in mammalian h-Caldesmon. FEBS Lett., 1993; 322(1): 56-60.

9. Adams P.C., Lam J.Y., Badimon L., Chesebro-J.H., Fuster Y. Interactions of platelets and vessels wall in the development of restenosis after coronary angioplasty. AnnN Y Acad Sci, 1987; 516: 602-620.

10. Ait-Oufella H, Taleb S, Mallat Z, Tedgui A. Cytokine network and T cell immunity in atherosclerosis. Semin Immunopathol., 2009; (3): 56-62.

11. Al-Sumidaie AM, Jones DL, Young HL. Characterisation of the under-agarose method for quantifying migration of highly purified human monocytes. J Immunol Methods. 1984; 75(1): 129-40.

12. Apostolou I, von Boehmer H. In vivo instruction of suppressor commitment in naive T cells. J Exp Med., 2004; 199(10): 1401-8.

13. Arefleva T.I., Kukhtina N.B., Antonova O.A., Krasnikova T.L. MCP-1 -stimulated chemotaxis of monocytic and endothelial cells is dependent on activation of different signaling cascades. Cytokine, 2005; 31(6): 439-446.

14. Ashida N, Arai H, Yamasaki M, Kita T. Distinct signaling pathways for MCP-1-dependent integrin activation and chemotaxis. J Biol Chem., 2001; 276(19): 16555-60.

15. AukrustP, Damas JK, Gullestad L, Freland SS. Chemokines in myocardial failure — pathogenic importance and potential therapeutic targets. Clin Exp Immunol., 2001; 124(3): 343-5.

16. Aukrust P, Otterdal K, Yndestad A, Sandberg WJ; Smith C, Ueland T, 0ie E, Damas JK, Gullestad L, Halvorsen B. The complex role of T-cell-based immunity in atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep., 2008; 10(3): 236-43.

17. Barlic J, Murphy PM. Chemokine regulation of atherosclerosis. J Leukoc Biol., 2007; 82(2): 226-36.

18. Bass DA. Behavior of eosinophil leukocytes in acute inflammation. II. Eosinophil dynamics during acute inflammation. J Clin Invest., 1975; 56(4): 870-9.

19. Beall CJ, Mahajan S, Kuhn DE, Kolattukudy PE. Site-directed mutagenesis of monocyte chemoattractant protein-1 identifies two regions of the polypeptide essential for biological activity. Biochem J., 1996; 313 (2): 633-40.

20. Boehme SA, Sullivan SK,.Crowe PD, Santos M, Conlon PJj Sriramarao P, Bacon KB. Activation of mitogen-activated protein kinase regulates eotaxin-induced eosinophil migration. J Immunol., 1999; 163(3): 1611-8.

21. Bonanno E, Mauriello A, Partenzi A, Anemona L, Spagnoli LG. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry, 2000; 39(2): 158-65.

22. Bondeva T, Pirola L, Bulgarelli-Leva G, Rubio I, Wetzker R, Wymann MP. Bifurcation of lipid and protein kinase signals of PI3Kgamma to the protein kinases PKB andMAPK. Science, 1998; 282(5387): 293-6.

23. Boring L, Gosling J, Cleary M, Charo IF. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature, 1998; 394(6696): 894-7.

24. Bottomley MJ, Salim K, Panayotou G. Phospholipid-binding protein domains. Biochim Biophys Acta., 1998; 1436(1-2): 165-83.

25. Boyura A. Isolation of leucocytes from human blood. A two-phase system for removal of red cells with methylcellulose as erythrocyte-aggregating agent. Scand J Clin Lab Invest Suppl., 1968; 97: 9-29.

26. Briner TJ, Kuo MC, Keating KM, Rogers BL, Greenstein JL. Peripheral T-cell tolerance induced in naive and primed mice by subcutaneous injection of peptides from the major cat allergen Fel d I. Proc Natl Acad Sci USA, 1993; 90(16): 7608-12.

27. Buffon A, Biasucci LM, Liuzzo G, D'Onofrio G, Crea F, Maseri A.

28. Widespread coronary inflammation in unstable angina. N Engl J Med., 2002; 347(1): 5-12.

29. Cambien B, Pomeranz M, Millet MA, Rossi B, Schmid-AIIiana A. Signal transduction involved in MCP-1-mediated monocytic transendothelial migration. Blood, 2001; 97(2): 359-66.

30. Chan TO, Rittenhouse SE, Tsichlis PN. AKT/PKB and other D3 phosphoinositide-regulated kinases: kinase activation by phosphoinositide-dependent phosphorylation. Annu RevBiochem., 1999; 68: 965-1014.

31. Cho HJ, Shashkin P, Gleissner CA, Dunson D, Jain N, Lee JK, Miller Y, Ley K. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics, 2007; 29(2): 149-60.

32. Clowes A.W., Reidy M.A., Clowes M.M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I: Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Lab Invest, 1983; 49: 327-333.

33. Clowes A.W., Schwartz S.M. Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res, 1985; 56: 139-145.

34. Coso OA, Chiariello M, Yu JC, Teramoto H, Crespo P, Xu N, Miki, T, Gutkind JS. The small GTP-binding proteins Racl and Cdc42 regulate the activity ofthe JNK/SAPK signaling pathway. Cell, 1995; 81(7): 1137-46.

35. Czepluch FS, Zweigle B, Waltenberger J. Chemotaxis analysis of circulating monocytes in patients with a recent acute coronary syndrome. Atherosclerosis, 2008; 204(1): 304-8.

36. Daugherty A, Rateri DL. T lymphocytes in atherosclerosis: the yin-yang of Thl and Th2 influence on lesion formation. Circ Res., 2002; 90(10): 1039-40.

37. Dawson TC, Kuziel WA, Osahar TA, Maeda N. Absence of CC chemokine receptor-2 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis, 1999; 143(1): 205-11.

38. De Meyer GR, Bult H. Mechanisms of neointima formation—lessons from experimental models. Vase Med., 1997; 2(3): 179-89.

39. Egashira K. Clinical importance of endothelial function in arteriosclerosis and ischemic heart disease. Circ J., 2002; 66(6): 529-33.

40. Egashira K. Molecular mechanisms mediating inflammation in vascular disease: special reference to monocyte chemoattractant protein-1. Hypertension, 2003; 41(3): 834-41.

41. Falk E, Schwartz SM, Galis ZS, Rosenfeld ME. Neointimal cracks (plaque rupture?) and thrombosis in wrapped arteries without flow. Arterioscler Thromb Vase Biol., 2007; 27(1): 248-9.

42. Falk W, Goodwin RH Jr, Leonard EJ. A 48-well micro chemotaxis assembly for rapid and accurate measurement of leukocyte migration. J Immunol Methods, 1980; 33(3): 239-47.

43. Fanger GR, Gerwins P, Widmann C, Jarpe MB, Johnson GL. MEKKs, GCKs, MLKs, PAKs, TAKs, and tpls: upstream regulators of the c-Jun amino-terminal kinases? Curr Opin Genet Dev., 1997; 7(1): 67-74.

44. Fanning AS, Anderson* JM. Protein modules as organizers of membrane structure. Curr Opin Cell Biol., 1999; 11(4): 432-9.

45. Farb A, Burke AP, Tang AL, Liang TY, Mannan P, Smialek J, Virmani R. Coronary plaque erosion without rupture into a lipid core. A frequent cause of coronary thrombosis in sudden coronary death. Circulation, 1996; 93(7): 1354-63.

46. Fine JS, Byrnes HD, Zavodny PJ, Hipkin RW. Evaluation of signal transduction pathways in chemoattractant-induced human monocyte chemotaxis. Inflammation, 2001; 25(2): 61-7.

47. Fuster V. Understanding the coronary disease process and the potential for prevention: a summary. Prev Med., 1999; 29(6): S9-10.

48. Galis ZS, Khatri JJ. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis: the good, the bad, and the ugly. Circ Res., 2002; 90(3): 251-62.

49. Gartner T, Kiihnel H, Raab G, Raab M, Strebhardt K, Rubsamen-Waigmann H. A strong protein-tyrosine kinase activity is associated with a baculovirus-expressed chicken tkl gene. Eur J Biochem., 1992; 208(1): 91-100.

50. Gashler A, Sukhatme VP. Early growth response protein 1 (Egr-1): prototype of a zinc-finger family of transcription factors. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 1995; 50: 191-224.

51. Geissmann F, Jung S, Littman-DR. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity, 2003; 19(1): 71-82.

52. Gerthoffer WT, Yamboliev IA, Pohl J, Haynes R, Dang S, McHugh J.

53. Activation of MAP kinases in airway smooth muscle. Am J Physiol., 1997; 272(2): L244-52.

54. Gimbrone MA Jr, Buchanan MR. Interactions of platelets and leukocytes with vascular endothelium: in vitro studies. AnnN Y Acad Sci., 1982; 401: 171-83.

55. Glagov S. Intimal hyperplasia, vascular modeling, and the restenosis problem. Circulation, 1994; 89(6): 2888-91.

56. Gosling J, Slaymaker S, Gu L, Tseng S, Zlot CH, Young SG, Rollins BJ, Charo IF. MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B. J Clin Invest., 1999; 103(6): 773-8.

57. Glass CK, Witztum JL. Atherosclerosis the road ahead. Cell, 2001; 104(4): 503-16.

58. Go Hedge J, McCann M, Mangan, S, Lam A, Karan M. Osteoprotegerin and osteopontin are expressed at high concentrations within symptomatic carotid atherosclerosis. Stroke, 2004; 35(7): 1636-41.

59. Haivorsen B, Otterdal K, Dahl TB, Skjelland M, Gullestad B, 0ie E, Aukrust P. Atherosclerotic plaque stability—what determines the fate of a plaque? Prog Cardiovasc Dis., 2008; 51(3): 183-94.

60. Handel TM, Domaille PJ. Heteronuclear (1H, 13C, 15N) NMR assignments and solution structure of the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). dimer. Biochemistry. 1996; 35(21): 6569-84:

61. Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med., 2005; 352(16): 1685-95.

62. Hansson GK, Libby P, Schönbeck U, Yan ZQ; Innate and adaptive immunity in the pathogenesis of atherosclerosis. Circ Res., 2002; 91(4): 281-91.

63. Haque NS, Fallon JT, Pan JJ, Taubman MB, Harpel PC. Chemokine receptor-8 (CCR8) mediates human vascular smooth muscle cell Chemotaxis and metalloproteinase-2 secretion. Blood, 2004; 103(4): 1296-304.

64. Haudenschild CC. Pathobiology of restenosis after angioplasty. Am J Med., 1993; 94(4A): 40S-44S.

65. Hayashi Y, Sawa Y, Nishimura M, Tojo SJ, Ichikawa H, Satoh H, Yamaguchi T, Suhara.H, Ohtake S, Matsuda H. P-selectin monoclonal antibody may attenuate the whole body inflammatory response induced by cardiopulmonary bypass. ASAIO J., 2000; 46(3): 334-7.

66. Hehrlein C., Zimmermann M.,.PiII J;, Kubler W., von Hodenberg E. The role of elastic recoil after balloon angioplasty of rabbit arteries and its prevention by stent implantation. Eur Heart J, 1994; 15: 277-280.

67. Heriaar E, Brown Z. p38 MAPK signalling cascades in inflammatory disease. MolMed Today, 1999; 5(10): 439-47.

68. Herrman J.P., Serruys P.W. Thrombin and antithrombotic therapy in interventional cardiology. Tex Heart Inst J, 1994; 21: 138-147.

69. Holmes WE, Lee J, Kuang WJ, Rice GC, Wood WI. Structure and functional expression of a human interleukin-8 receptor. Science, 1991; 253(5025): 1278-80.

70. Honye J:, Mahon D.J., Jain A., White C.J., Ramee S.R., Wallis J.B., Zarka A., Tobis J.M. Morphological effects of coronary balloon angioplasty in vivo assessed by intravascular ultrasound imaging. Circulation, 1992; 85: 1012-1025.

71. Hoyne GF, O'Hehir RE, Wraith DC, Thomas WR, Lamb JR. Inhibition of T cell and antibody responses to house dust mite allergen by inhalation of the dominant T cell epitope in naive and sensitized mice. J Exp Med., 1993; 178(5): 1783-8.

72. Huo Y, Weber C, Forlow SB, Sperandio M, Thatte J, Mack M, Jung S, Littman DR, Ley K. The chemokine KC, but not monocyte chemoattractant protein1, triggers monocyte arrest on early atherosclerotic endothelium. J Clin Invest., 2001; 108(9): 1307-14.

73. J., Fuster V., Israel D. The role of platelets, thrombin and hyperplasia in restenosis after coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol, 1991; 17: 77B-88B.

74. Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, Hansson GK. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Arteriosclerosis, 1986; 6(2): 131-8.

75. Kaji M, Ikari M, Hashiguchi S, Ito Y, Matsumoto R, Yoshimura T, Kuratsu Ji, Sugimura K. Peptide mimics of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) with an antagonistic activity. J Biochem., 2001; 129(4): 577-83.

76. Kakuta T, Currier JW, Haudenschild CC, Ryan TJ, Faxon DP. Differences in compensatory vessel enlargement, not intimal formation, account for restenosis after angioplasty in the hypercholesterolemic rabbit model. Circulation, 1994; 89(6): 2809-15.

77. Karpus WJ, Kennedy KJ. MlP-lalpha and MCP-1 differentially regulate acute and relapsing autoimmune encephalomyelitis as well as Thl/Th2 lymphocyte differentiation. J Leukoc Biol., 1997; 62(5): 681-7.

78. Kasibhatla S, Brunner T, Genestier L, Echeverri F, Mahboubi A, Green DR. DNA damaging agents induce expression of Fas ligand and subsequent apoptosis in T lymphocytes via the activation of NF-kappa B and AP-1. Mol Cell., 1998; 1(4): 543-51.

79. Keeley EC, Mehrad B, Strieter RM. Chemokines as mediators of neovascularization. Arterioscler Thromb Vase Biol., 2008; 28(11): 1928-36.

80. Kimura T., KaburagiS., TamuraT. Remodeling of human coronary arteries undergoing coronary angioplasty or atherectomy. Circulation, 1997; 96: 475-483.

81. Klemke RL, Cai S, Giannini AL, Gallagher PJ^ de Lanerolle P, Cheresh

82. DA. Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase. J Cell Biol., 1997; 137(2): 481-92.

83. Kolodgie FD, Narula J, Burke AP, Haider N, Farb A, Hui-Liang Y, Smialek J, Virmani R. Localization of apoptotic macrophages at the site of plaque rupture in sudden coronary death. Am J Pathol., 2000; 157(4): 1259-68.

84. Krug A, Uppaluri R, Facchetti F, Dorner BG, Sheehan KC, Schreiber RD, Cella M, Colonna M. IFN-producing cells respond to CXCR3 ligands in the presence of CXCL12 and secrete inflammatory chemokines upon activation. J Immunol., 2002; 169(11): 6079-83.

85. Majesky M.W., Schwartz S.M., Glowes M.M., Clowes A.W. Heparin regulates smooth muscle S phase entry in the injured rat carotid artery. Circ Res, 1987;61:296-300.

86. McCaffrey TA, Fu C, Du B, Eksinar S, Kent KC, Bush H Jr, Kreiger K, Rosengart T, Cybulsky MI, Silverman ES,. Collins T. High-level expression of Egr-1 and Egr-1 -inducible genes in mouse and human atherosclerosis. J Clin Invest., 2000; 105(5): 653-62.

87. McNamara C.A., Sarembock I.J., Gimple L.W., Fenton J.W.d., Coughlin S.R., Owens G.K. Thrombin stimulates proliferation of cultured rat aortic smooth muscle cells by a proteolytically activated receptor. J Clin Invest, 1993; 91: 94-98.

88. Mehrad B, Keane MP, Strieter RM. Chemokines as mediators of angiogenesis. Thromb Haemost., 2007; 97(5): 755-62.

89. Menten P, Wuyts A, Van Damme J. Monocyte chemotactic protein-3. Eur Cytokine Netw., 2001; 12(4): 554-60

90. Minty A, Chalón P, Dërocq JM, Dumont X, Guillemot JC, Kaghad M, Labit C, Leplatois P, Liauzun P, Miloux B, et al. Interleukin-13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and immune responses. Nature, 1993; 362(6417): 248-50;

91. Murdoch.C, Finn A. Chemokine receptors and their role in inflammation and; infectious diseases. Blood, 2000; 95(10): 3032-43.

92. Murdoch G, Finn A. Chemokine receptors and their role in vascular biology. J Vase Res., 2000; 37(1): 1-7.

93. Murphy PM, Baggiolini M, Charo IF, Hébert GA, Horuk R; Matsushima K, Miller LH, Oppenheim JJ, Power GA. International union of pharmacology. XXII. Nomenclature for chemokine receptors. Pharmacol Rev., 2000; 52(1): 145-76.

94. Murphy PM; Tiffany HL. Cloning of complementary DNA encoding a functional human interleukin-8 receptor. Science, 1991; 253(5025): 1280-3.

95. Nair KS, Zingde SM. Adhesion of neutrophils to fibronectin: role of the cd66 antigens. Cell Immunol., 2001; 208(2): 96-106.

96. Naruko T., Ueda M., Becker A.E., Tojo O., Teragaki M., Takeuchi K., Takeda T. Angiographie-pathologie correlations after elective percutaneous transluminal coronary angioplasty. Circulation, 1993; 88(1): 1558-1568.

97. Nathan C. Points of control in inflammation. Nature, 2002; 420(6917): 846-52.

98. Neptune ER, Iiri T, Bourne-HR. Galphai is not required for Chemotaxis mediated by Gi-coupled receptors. J Biol Chem., 1999; 274(5): 2824-8.

99. Nugent HM, Edelman ER. Endothelial implants provide long-term control of vascular repair in a porcine model of arterial injury. J Surg Res., 2001; 99(2): 228-34.

100. Olsen NJ, Stein CM. New drugs for rheumatoid arthritis. N Engl J Med., 2004; 350(21): 2167-79.

101. Orsini MJ, Krymskaya VP, Eszterhas AJ, Benovic JL, Panettieri RA Jr, Penn RB. MAPK superfamily activation in human airway smooth muscle: mitogenesis requires prolonged p42/p44 activation. Am J Physiol., 1999; 277(3): L479-88.

102. Ohashi N, Matsumori A, Furukawa Y, Ono K, Okada M, Iwasaki A, Miyamoto T, Nakano A, Sasayama S. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in neointimal hyperplasia after vascular injury. Arterioscler Thromb Vase Biol., 2000 Dec; 20(12): 2521-6.

103. Packard RR, Libby P. Inflammation in atherosclerosis: from vascular biology to biomarker discovery and risk prediction. Clin Chem., 2008; 54(l):24-38.

104. Paolini JF, Willard D, Consler T, Luther M, Krangel MS. The chemokines IL-8, monocyte chemoattractant protein-1, and 1-309 are monomers at physiologically relevant concentrations. J Immunol., 1994; 153(6): 2704-17.

105. Park DW, Lee CW, Yun SG, Kim YH, Hong MK, Kim? JJ; Park SW, Park

106. SJ. Prognostic impact of preprocedural C reactive protein- levels on 6-month angiographic and 1-year clinical outcomes after drug-eluting stent implantation. Heart., 2007; 93(9): 1087-92.

107. Pintucci G, Moscatelli D, Saponara F, Biernacki PR, Baumann FG, Bizekis C, Galloway AC, Basilico C, Mignatti P. Lack of ERK activation and cell migration^ in FGF-2-deficient endothelial cells. FASEB J., 2002; 16(6): 598-600.

108. Poole JC, Florey HW. Changes in the endothelium of the aorta and the behaviour of macrophages in experimental atheroma of rabbits. J Pathol Bacteriol., 1958; 75(2): 245-51.

109. Pollman MJ, Hall JL, Gibbons GH. Determinants of vascular smooth muscle cell apoptosis after balloon angioplasty injury. Influence of redox state and. cell phenotype. CircRes., 1999; 84(1): 113-21.

110. Ranjbaran H, Sokol SI, Gallo A, Eid RE, Iakimov AO, D'Alessio A, Kapoor JR, Akhtar S, Howes CJ, Asian M, Pfau S, Pober JS, Tellides G. Aninflammatory pathway of IFN-gamma production in coronary atherosclerosis. J Immunol., 2007; 178(1): 592-604.

111. Reckless J, Grainger DJ. Identification of oligopeptide sequences which inhibit migration induced by a wide range of chemokines. Biochem J., 1999; 340(3): 803-11.

112. Reckless J, Tatalick LM, Grainger DJ. The pan-chemokine inhibitor NR58-3.14.3 abolishes tumour necrosis factor-alpha accumulation and leucocyte recruitment induced by lipopolysaccharide in vivo. Immunology, 2001; 103(2): 24454.

113. Reidy M.A., Clowes A.W., Schwartz S.M. Endothelial regeneration. V. Inhibition of endothelial regrowth in arteries of rat and rabbit. Lab Invest, 1983; 49(5): 569-75.

114. Reidy M.A., Colleen I., Lindner V. Migration of arterial wall cells. Expression of plasminogen activators and inhibitors in injured rat arteries. Circ Res, 1996; 78: 405-414.

115. Rensing B.J., Hermans W.R.M., Beatt K.J. Quantitative angiographic assessment of elastic recoil after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Am J Cardiol, 1990; 66: 1039-1044.

116. Reynaert H, Colle I, Noppen M, Naegels S, Urbain D. A new type of partially covered metal stent for treatment of a high esophagotracheal fistula. Endoscopy, 1999; 31(6): S45-6.

117. Rodríguez-Frade JM, Vila-Coro AJ, de Ana AM, Albar JP, Martínez-A C, Mellado M. The chemokine monocyte chemoattractant protein-1 induces functionalresponses through dimerization of its receptor CCR2. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999; 96(7): 3628-33.

118. Rollins BJ. Chemokines. Blood, 1997; 90(3): 909-28.

119. Rollins BJ, Stier P, Ernst T, Wong GG.The human homolog of the JE gene encodes a monocyte secretory protein. Mol Cell Biol., 1989; 9(11): 4687-95.

120. Ross R. Atherosclerosis is an inflammatory disease. Am Heart Ji, 1999; 138(5): 419-20.

121. Ross R, Glomset JA. The pathogenesis of atherosclerosis (first of two parts). N Engl J Med., 1976; 295(7): 369-77.

122. Ross R, Glomset JA. The pathogenesis of atherosclerosis (second of two parts). N Engl J Med., 1976; 295(8): 420-5.

123. Schneider A, Panzer U, Zahner G, Wenzel U,.Wolf G, Thaiss F, Helmchen U, Stahl RA. Monocyte chemoattractant protein-1 mediates collagen deposition in experimental glomerulonephritis by transforming growth factor-beta. Kidney Int., 1999; 56(1): 135-44.

124. Schober A, Zernecke A. Chemokines in vascular remodeling. Thromb Haemost, 2007; 97(5): 730-7.

125. Schwartz R.S.,Campbell G.R., Campbell J.H. Replication of smooth muscle cells in vascular deasease. Circ Res., 1986; 58: 427-444.

126. Schwartz S.M., deBlois D., Er O.B. The intima. Soil for atherosclerosis and restenosis. Circ Res, 1995; 77: 445-465.

127. Serbina> NV, Pamer EG. Monocyte emigration from bone marrow during bacterial infection requires signals mediated by chemokine receptor CCR2. Nat Immunol., 2006; 7(3): 311-7.

128. Servant G, Weiner OD, Herzmark P, Balla T, Sedat JW, Bourne HR.

129. Polarization of chemoattractant receptor signaling during neutrophil chemotaxis. Science, 2000; 287(5455): 1037-40.

130. Shi Y., O'Brien J.E. Jr., Fard A., Zalewski A. Transforming growth factor-beta 1 expression and myofibroblast formation during arterial repair. Arterioscler ThrombVasc Biol, 1996; 16(10): 1298-1305.

131. Shyamala V, Khoja H. Interleukin-8 receptors R1 and R2 activate mitogen-activated protein kinases and induce c-fos, independent of Ras and Raf-1 in Chinese hamster ovary cells. Biochemistry, 1998; 37(45): 15918-24.

132. Silverman ES, Collins T. Pathways of Egr-1-mediated gene transcription in vascular biology. Am J Pathol., 1999; 154(3): 665-70.126i

133. Sotsios Y, Whittaker GC, Westwick J; Ward SG. The CXC chemokine stromal cell-derived factor activates a Gi-coupled phosphoinositide 3-kinase in T lymphocytes. J Immunol., 1999; 163(11): 5954-63.

134. Stamatovic SM, Keep RF, Mostarica-Stojkovic M, Andjelkovic AV. CCL2 regulates angiogenesis via activation of Ets-1 transcription factor. J Immunol., 2006; 177(4): 2651-61.

135. Steitz SA, Hasegawa K, Chiang SL, Cobb RR, Castro MA, Lobl TJ, Yamada M, Lazarides E, Cardarelli PM. Mapping of MCP-1 functional domains by peptide analysis and site-directed mutagenesis. FEBS Lett., 1998; 430(3): 158-64.

136. Stephens LR, Eguinoa A, Erdjument-Bromage H, Lui M, Cooke F, Coadwell J, Smrcka AS, Thelen M, Cadwallader K, Tempst P, Hawkins PT. The G beta gamma sensitivity of a PI3K is dependent upon a tightly associated adaptor, plOl. Cell, 1997; 89(1): 105-14.

137. Sugden PH, Clerk A. Regulation of mitogen-activated protein kinase cascades in the heart. Adv Enzyme Regul., 1998; 38: 87-98.

138. Sullivan SK, McGrath DA, Liao F, Boehme SA, Farber JM, Bacon KB: MIP-3 alpha induces human eosinophil migration and activation of the mitogen-activated protein kinases (p42/p44 MAPK). J Leukoc Biol., 1999; 66(4): 674-82.

139. Swirski FK, Libby P, Aikawa E, Alcaide P, Luscinskas FW, Weissleder R, Pittet MJ. Ly-6Chi monocytes dominate hypercholesterolemia-associated monocytosis and give rise to macrophages in atheromata. J Clin Invest., 2007; 117(1): 195-205.

140. Tacke F, Alvarez D, Kaplan TJ, Jakubzick C, Spanbroek R, Llodra J, Garin A, Liu J, Mack M, van Rooijen N, Lira SA, Habenicht AJ, Randolph GJ.

141. Monocyte subsets differentially employ CCR2, CCR5, and CX3CR1 to accumulate within atherosclerotic plaques. J Clin Invest., 2007; 117(1): 185-94.

142. Tanaka S, Green SR, Quehenberger O. Differential expression of the isoforms for the monocyte chemoattractant protein-1 receptor, CCR2, in monocytes. Biochem Biophys Res Commun., 2002; 290(l):73-80.

143. Taubman MB, Rollins BJ, Poon M, Marmur J, Green RS, BerkBC, Nadal-Ginard B. JE mRNA accumulates rapidly in aortic injury and in platelet-derived growth factor-stimulated vascular smooth muscle cells. Circ Res., 1992; 70(2): 31425.

144. Tedgui A, Ma Hat Z. Cytokines in atherosclerosis: pathogenic and regulatory pathways. Physiol Rev., 2006; 86(2): 515-81.

145. Thelen M, Peveri P, Kernen P, von Tscharner V, Walz A, Baggiolini M. Mechanism of neutrophil activation by NAF, a novel monocyte-derived peptide agonist. FASEB J., 1988; 2(11): 2702-6.

146. Thelen M; Uguccioni M', Bosiger J. PI 3-kinase-dependent and independent chemotaxis of human neutrophil leukocytes. Biochem Biophys Res Commun., 1995; 217(3): 1255-62.

147. Togni M, Windecker S, Cocchia R, Wenaweser P, Cook S, Billinger M, Meier B, Hess OM. Sirolimus-eluting stents associated with paradoxic coronary vasoconstriction. J Am Coll Cardiol., 2005; 46(2): 231-6.

148. Tsou CL, Peters W, Si Y, Slaymaker S, Aslanian AM, Weisberg SP, Mack M, Charo IF. Critical roles for CCR2 and MCP-3 in monocyte mobilization from bone marrow and recruitment to inflammatory sites. J Clin Invest., 2007; 117(4): 902-9.

149. Valente AJ, Rozek MM, Schwartz CJ, Graves DT. Characterization of monocyte chemotactic protein-1 binding to human monocytes. Biochem Biophys Res Commun., 1991; 176(1): 309-14.

150. Van Domburg RT, Saia F, Lemos PA. Coronary artery bypass surgery and percutaneous transluminal coronary angioplasty in patients with multivessel disease. Minerva Cardioangiol., 2003; 51(5): 599-608.

151. Vanhaesebroeck B, Waterfield MD. Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases. Exp Cell Res., 1999; 253(1): 239-54.

152. Violaris AG, Melkert R, Herrman JP, Serruys PW. Role of angiographically identifiable thrombus on long-term luminal renarrowing after coronary angioplasty: a quantitative angiographic analysis. Circulation, 1996; 93(5): 889-97.

153. Virmani R, Burke A, Farb A. Coronary risk factors and plaque morphology in men with coronary disease who died suddenly. Eur Heart J., 1998; 19(5): 678-80.

154. Virmani R, Burke AP, Farb A. Plaque rupture and plaque erosion. Thromb Haemost., 1999; 82 Suppl 1: 1-3.

155. Virmani R, Kolodgie FD, Farb A, Burke AP. Pathology of Transmyocardial Angiogenesis and Arteriogenesis. Curr Interv Cardiol Rep., 1999; 1(3): 215-221.

156. Wain JH, Kirby JA, Ali S. Leucocyte chemotaxis: Examination of mitogen-activated protein kinase and phosphoinositide 3-kinase activation by Monocyte-Chemoattractant Proteins-1, -2, -3 and -4. Clin Exp Immunol., 2002; 127(3): 436-44.

157. Welt FG, Ed elm an ER, Simon" DI, Rogers G. Neutrophil, not macrophage, infiltration precedes neointimal thickening in balloon-injured arteries. Arterioscler Thromb Vase Biol., 2000; 20(12): 2553-8.

158. Yakubenko VP, Belevych N, Mishchuk D, Schurin A, Lam SC, Ugarova TP. The role of integrin alpha D beta2 (CDlld/CD18) in monocyte/macrophage migration. Exp Cell Res., 2008; 314(14): 2569-78.

159. Yamagami S, Tokuda Y, Ishii K, Tanaka H, Endo N. cDNA cloning and functional expression of a human monocyte chemoattractant protein 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun., 1994; 202(2): 1156-62.

160. Yamasaki M, Arai H, Ashida N, Ishii K, Kita T. Monocyte chemoattractant protein 1 causes differential signalling mediated by proline-rich tyrosine kinase 2 in THP-1 cells. Biochem J., 2001; 355(3): 751-6.

161. Yen H, Zhang Y, Penfold S, RolIins B,T. MCP-1-mediatedchemotaxis requires activation of non-overlapping signal transduction pathways. JLeukoc Biol., 1997;-61(4): 529-32.

162. Yutani C., Imakita M., Ishibashi-Ueda H., Tsukamoto Y., Nishida N., Ikeda Y. Coronary atherosclerosis and interventions: pathological sequences and restenosis. Pathol Int, 1999; 49(4): 273-90.

163. Zalewski A., Shi Y. Vascular myofibroblasts. Lessons from coronary repair and remodeling. Arterioscler Thromb Vase Biol, 1997; 3: 417-22.

164. Zernecke A, Shagdarsuren E, Weber G. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vase Biol., 2008; 28(11): 1897-908:

165. Zhou X, Nicoletti A, Elhage R, Hansson GK. Transfer of CD4(+) T cells aggravates atherosclerosis in immunodeficient apolipoprotein E knockout mice. Circulation, 2000; 102(24): 2919-22.

Оглавление диссертации Кухтина, Надежда Борисовна :: 2009 :: Москва

Введение диссертации по теме "Кардиология", Кухтина, Надежда Борисовна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Кухтина, Надежда Борисовна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций