Мониторинг эндогенной моноокиси углерода у человека и животных методами лазерного спектрального анализа

Шулагин, Юрий Алексеевич

Диссертации по медицине → Авиационная, космическая и морская медицина

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Мониторинг эндогенной моноокиси углерода у человека и животных методами лазерного спектрального анализа

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Шулагин, Юрий Алексеевич Москва 2005 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.32

Автореферат диссертации по медицине на тему Мониторинг эндогенной моноокиси углерода у человека и животных методами лазерного спектрального анализа

На правах рукописи

Шулагин Юрий Алексеевич

МОНИТОРИНГ ЭНДОГЕННОЙ МОНООКИСИ УГЛЕРОДА У ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ МЕТОДАМИ ЛАЗЕРНОГО СПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медико-биологических проблем РАН

Научные руководители: доктор медицинских наук

Павлов Борис Николаевич

доктор физико-математических наук Степанов Евгений Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Катунцев Владимир Петрович

доктор физико-математических наук Миляев Валерий Александрович

Ведущая организация: ГУП НИИ морской и промышленной

медицины Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится «__»_2005 года в......часов на заседании диссертационного совета К002.111.01 в Государственном научном центре РФ - Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, Москва, Хорошовское шоссе, д. 76а.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.

Автореферат разослан « »_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^{(Л&мсЗ— И.П. Пономарева

ЦоЧб з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследований

Актуальность определения содержания моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе, а также разработки методов и инструментальных средств для подобных измерений обусловлена тем, что СО является одним из эндогенных газообразных соединений, играющих значительную роль в жизнедеятельности организма. Особенности процессов ее образования в организме и транспорта от тканей и органов в выдыхаемый воздух в настоящий момент недостаточно хорошо изучены, а разработка подходов к использованию СО в качестве молекулы-биомаркера требует тщательных предварительных исследований. Для этих целей должны использоваться новые методы высокочувствительного, селективного инструментального анализа содержания СО.

В организме эндогенное СО образуется в результате ферментативно-управляемого катаболизма гем-содержащих соединений (Тиунов А. А., Кустов В. В., 1980; Vreman H. J., Stevenson D. К., 1995). Основная его продукция обусловлена гемолизом эритроцитарного гема в ходе эритропоэза, направленного на устранение стареющих клеток крови. Кроме того, некоторая доля эндогенного СО образуется при деградации миоглобина, нейроглобина, цитоглобина, цитохромов и ряда металлсодержащих ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, триптофанпирролаза, гуани-латциклаза, NO-синтаза и других. Также возможно образование относительно малого количества СО негемовой природы за счет перекисного окисления липидов, фотоокисления, а также активности ксенобиотиков и некоторых бактерий (Vreman H. J., Stevenson D. К., 1995) Результаты недавних биохимических исследований показывают, что СО в организме является не только конечным продуктом метаболических превращений упомянутых выше соединений, но и сигнальной молекулой (т.н. вторичным мессенджером), участвующей в механизме преобразования сигналов, регуляции клеточного метаболизма и в передаче информации (Марков X. М., 1996; Gazit V., Rozenberg В., Katz Y., 1996).

Во избежание избыточного накопления СО интенсивно выводится из организма. Для этих целей, помимо диффузии, транспорта в растворенном состоянии и конвективного газообмена, используется специальный механизм обратимого связывания этих молекул гем-содержащими белковыми структурами (гемоглобин, миоглобин, цитоглобин, нейроглобин, цитохром-аЗ,), кратковременного буферирования на них и транспорта по градиенту концентраций 02 - от клеток и тканей в легкие (Burmester Т., Welch В., Reinhardts, et al., 2000; Geuens Е., Brouns I., FlamezD. et al., 2003; Ham-danet D, Kigert L., Dewilde S. et al., 2003). Для выведения CO используется та же цепочка механизмов, с помощью которой пгуэтру-гпттяятгя трачгппрт- кислорода из легких и обеспечение дыхания клеток, толька ^i^jjfiiQjgнапРавлении- В

IJSd

клетках СО может быть связано цитоглобином, нейроглобином (Burmester Т, Welch В., Reinhardts, et al., 2000; Geuens Е., Breuns I., FlamezD. et al., 2003, Ham-danet D, Kigert L., Dewilde S. et al., 2003) или цитохромами-аЗ (в митохондриях) В мышечных тканях СО накапливается на миоглобине, а в крови - на гемо1лобине. За счет потока кислорода, проникающего с кровью в ткани и клетки, между этими системами буферирования СО происходит постоянный обмен, так что молекулы СО постепенно продвигаются в направлении от клеток к легким. В легких СО диффундирует из крови в воздушное пространство альвеол и затем за счет вентиляции при дыхании выводится в атмосферу. На заключительном этапе пребывания эндогенною СО в крови, т.е в альвеолярных капиллярах, темп его выделения в воздушное пространство легких находится в непосредственной зависимости от перфузии и эффективности доставки кислорода к альвеолярной мембране легких (Vreman H. J., Stevenson D. К., 1995). Эта эффективность может меняться за счет вариации как газодинамических, так и диффузионных характеристик используемых дыхательных смесей.

В организме можно выделить несколько наиболее важных процессов, в которых участвует эндогенное СО (Тиунов А. А., Кустов В. В., 1980; Vreman H. J., Stevenson D. К., 1995; Марков X. M., 1996; GazitV., RozenbergB, KatzY., 1996). Во-первых, CO является вторичным мессенджером для нейромедиаторов и гормонов, участвует в механизме регуляции тонуса кровеносных сосудов и, возможно, влияет на внутриклеточные механизмы формирования долговременной памяти. Во-вторых, СО разделяет с Ог общую систему транспорта и буферирования, что позволяет использовать его как маркер при исследовании механизмов и самого транспорта кислорода. В-третьих, основная функция молекул СО определяется их ролью в регуляции обновления клеток крови, т.е. СО может служить индикатором и маркером катаболизма.

Таким образом, для использования эндогенного СО в качестве биомаркера физиологических процессов существенным является то, что интенсивность выделения СО с выдыхаемым воздухом зависит от скорости продукции СО в организме, биохимических параметров среды в клетках и тканях организма и химического состава вдыхаемой газовой среды.

Благодаря этому использование высокочувствительного, высокоточного и селективного мониторинга эндогенного СО в выдыхаемом воздухе может быть актуально и перспективно для исследований:

• интенсивности метаболических и индуцированных процессов, связанных

с образованием СО;

• диффузионных и конвективных процессов переноса кислорода в легких;

• эффективности процессов переноса кислорода кровью от легких к тканям, включая перфузию и тканевую микроциркуляцию;

• интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов в условиях тканевой гипоксии.

Одним из важных и перспективных аспектов подхода, основанного на анализе СО в составе выдыхаемого воздуха, является неинвазивность возможных исследований некоторых важных параметров организма и базирующейся на них диагностики нормальных и патологических процессов.

Сложность анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе обусловлена тем, что чувствительность его анализа должна быть на уровне 10 мкг/м3. Поскольку выдыхаемый воздух является сложной газовой смесью, требуется высокая селективность анализа. Измерения СО желательно проводить в масштабе времени близком к реальному, не применяя накопления, обогащения и фильтрации газовой пробы. Применяемый метод должен обеспечивать возможность для долговременного и непрерывного мониторинга содержания СО.

Один из возможных подходов к решению данной проблемы, который был использован в данной работе, состоит в использовании лазерных технологий спектрального анализа, в частности, методов диодной лазерной спектроскопии, которая является признанным лидером в области высокочувствительного и высокоселективного газового анализа.

Цели и задачи исследований

Целью диссертации являлось исследование основных закономерностей выделения эндогенного СО с дыханием у человека и животных с помощью методов высокочувствительного лазерного анализа и разработка на этой основе новых методов неинвазивной биомедицинской диагностики.

В задачи исследования входили:

• Проведение разработки методов и средств высокочувствительного анализа и мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на использовании перестраиваемых диодных лазеров.

• Разработка методов и алгоритмов анализа данных мониторинга параметров дыхания, кровообращения и выделения эндогенного СО.

при выполнении различных физиологических тестов, таких как физическая нагрузка, гипервентиляция, задержка дыхания.

• Исследование содержания СО в выдыхаемом воздухе при некоторых заболеваниях.

• Оценка возможностей использования анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в целях биомедицинской диагностики.

Научная новизна

Впервые методы высокочувствительного лазерного анализа были применены для определения и долговременного мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, что позволило исследовать основные закономерности выделения этого вещества с дыханием и продемонстрировать диагностическую значимость лазерного анализа СО в биомедицинских приложениях.

Впервые получены следующие результаты:

Разработаны методы анализа эндогенного СО в различных экспериментальных условиях у человека и животных.

Установлены основные закономерности выделения эндогенного СО в норме и в покое. Определена средняя концентрация СО в выдыхаемом воздухе и альвеолярном воздухе, а также скорость выделения эндогенного СО в норме. Обнаружено наличие циркадного ритма в скорости выделения СО. Продемонстрировано влияние загрязнений атмосферного воздуха экзогенным СО на содержание моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе. Определена динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом у курильщиков.

Установлены закономерности и измерены основные параметры динамики выделения эндогенного СО у людей и лабораторных животных при дыхании гипероксическими и гипоксическими дыхательными газовыми смесями, а также у лабораторных животных при сочетанном влиянии гипероксии и гиперкап-нии и при дыхании газовыми смесями с добавлением аргона.

Определены закономерности и измерены параметры динамики выделения эндогенного СО при проведении различных физиологических тестов: физической нагрузки различной мощности и длительности, гипервентиляции различной глубины и задержек дыхания различной длительности. Для физической нагрузки продемонстрировано наличие корреляции изменений скорости выде-

ления СО с выдыхаемым воздухом с рН артериализованной крови и с концентрацией лактата в капиллярной крови. Для гипервентиляции обнаружено наличие корреляции скорости выделения СО с рН артериализованной крови.

Определены средние уровни выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом при ряде заболеваний органов дыхания. В частности, продемонстрировано снижение концентрации СО в выдохе при хроническом обструктивном бронхите, фиброзах легких, анемии и бронхиальной астме. В случае идеопати-ческой интерстициальной пневмонии обнаружено уменьшение скорости выделения СО, коррелирующее с уменьшением диффузионной способности легочной мембраны. Было продемонстрировано значительное увеличение выделения СО над нормой при поражениях печени.

Практическая значимость работы

Разработаны инструментальные методы и средства для автоматизированного мониторинга содержания СО и других параметров дыхания у человека и лабораторных животных.

Сформулированы требования к условиям проведения анализа эндогенного СО в выдыхаемом воздухе для целей биомедицинской диагностики.

Продемонстрирована возможность неинвазивного определения ряда важных физиологических параметров (скорости катаболизма гем-содержащих белков в организме, уровня гемоглобина, вариаций эффективности транспорта кислорода к тканям, вариаций кислотно-основного состояния в организме) с помощью анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе.

Продемонстрирована возможность и эффективность предлагаемого подхода в исследованиях по спортивной и гипербарической физиологии. В частности, установлена связь динамики выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом и лактатом крови при физических нагрузках. Так же разработанные методы могут быть использованы для изучения воздействия на организм индифферентных газов, а также для контроля терапевтического воздействия на организм гипероксических и гипоксических газовых смесей.

Разработанные методы могут быть использованы при неинвазивной биомедицинской диагностике.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Применение методов диодной лазерной спектроскопии эффективно для высокочувствительного и высокоселективного анализа и долговременного мониторинга содержания эндогенной моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных в реальном времени.

2. Динамика выделения эндогенной моноокиси углерода с выдыхаемым воздухом является показателем физиологического состояния организма при проведении различных функциональных проб и воздействии измененных факторов газовой среды. Отклонения скорости выделения эндогенного СО от нормы могут использоваться для целей неинвазивной биомедицинской диагностики.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных, всесоюзных, всероссийских и региональных научных конференциях, симпозиумах и семинарах: Международной конференции SPIE "Биомедицинская оптика" (Лиль, Франция, 1994; Барселона, Испания, 1995; Сан-Хосе, США, 1995; Сан-Хосе, США, 1996), Международной конференции SPIE "Передовые технологии для мониторинга окружающей среды" (Денвер, США, 1996), Международной конференции SPIE "Биомедицинские датчики, визуализация и слежение" (Сан-Хосе, США, 1997), V Конференции по биологии при высоких давлениях (С.-Петербург, 1997), 7-ой Всероссийской школе по физиологии дыхания (Бологое, 1998), 11 Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии (Москва, 1998), Международной конференции по заболеваниям органов дыхания и астме (Сан-Диего, США, 1999), II Российской школе для практических врачей "Свободные радикалы и болезни легких" (Рязань, 1999), Конференции "Возможности и перспективы использования индифферентных газов в водолазной практике, биологии и медицине" (Москва, 1999), 11 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Берлин, Германия, 2001), 12 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Стокгольм, Швеция, 2002), 13 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Вена, Австрия, 2003), 14 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Глазго, Великобританя, 2004)

Диссертация была апробирована на заседании секции «Экологическая медицина и барофизиология» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН от 13.04.2005 г.

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано в 17 работ в открытой печати.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, приложения и списка литературы, изложена на 194-ти страницах печатного текста, включает 51 рисунок, 8 таблиц и список литературы из 171 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Исследование основных закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом у людей проводились на четырех группах испытуемых. Статистика по выделению эндогенного СО в норме изучалась на группе практически здоровых добровольцев общей численностью 120 человек. В нее входило 74 мужчины и 46 женщин в возрасте от 20 до 49 лет. Вторая группа испытуемых, участвовавших в исследованиях с использованием различных физиологических тестов, состояла из 11 практически здоровых мужчин в возрасте от 25 до 45 лет. Третья группа, принимавшая участие в исследованиях по гипербарической физиологии, состояла из 6 мужчин в возрасте от 35 до 45 лет, являвшихся профессиональными водолазами и имевших допуск по состоянию здоровья к работе в условиях гипербарии. Для исследований специфики выделения СО с выдыхаемым воздухом при различных заболеваниях привлекались пациенты Института пульмонологии МЗ РФ, имеющие клинически подтвержденную патологию органов дыхания. Исследования эндогенного СО в выдохе животных проводились на крысах линии «№1з1аг» весом 180-390 г.

В Табл. 1 представлена информация об объеме проведенных исследований, включающая перечень основных типов экспериментов, количество измерений и число испытуемых.

Исследования базировались на измерении в режиме мониторинга целого ряда физиологических параметров: концентрации СО, С02 и 02 в выдыхаемом воздухе, скорости потока выдыхаемого газа, частоты сердечных сокращений, насыщения артериальной крови При необходимости проводились измерения биохимических параметров: содержания лактата в крови, кислотно-основного состояния (КОС) крови. Для измерений этих параметров был разработан и использовался специальный программно-аппаратный комплекс, обеспечивавший автоматизированный многоканальный сбор регистрируемых данных.

Автоматизированный комплекс для мониторинга состава выдыхаемого воздуха и параметров дыхания и кровообращения включает в себя лазерный анализатор СО, анализаторы СЬ и С02, ультразвуковой измеритель потока газа. Комплекс имеет следующие технические параметры:

Лазерный анализатор СО. Время анализа - 5 с; чувствительность - 5 мкг/м3; точность определения концентрации СО - 3 %; объем аналитической кюветы - 1 л; селективность анализа -100 %; время непрерывного мониторинга - не ограничено

Таблица 1

Объем и объекты исследований

Тип исследований Число объектов обследования Число измерений

Выделение СО у человека в покое 120 чел. 364

Выделение СО у человека (циркадианный ритм) 6 чел. 72

Выделение СО у человека при курении 21 чел. 21

Выделение СО у человека при дыхании кислородом 25 чел. 25

Выделение СО у человека при дыхании гипоксической газовой смесью 8 чел. 8

Выделение СО у человека при физических нагрузках 15 чел. 60

Выделение СО у человека при гипервентиляции 10 чел. 10

Выделение СО у человека при задержках дыхания 30 чел. 150

Выделение СО у человека при гипербарических воздействиях 6 чел 144

Выделение СО у крыс при гипероксии 46 крыс 46

Выделение СО у крыс при гипероксии сочетанной с ги-перкапнией 16 крыс 16

Выделение СО при патологиях 76 чел. 76

Полярографический анализатор О2 (Beckman ОМ-11 и ОМ-14). Время анализа - 100 мс; чувствительность - от 0.1 %; точность - 1 % от полной шкалы измерений.

ИК анализатор С02 (Beckman LB-2). Время анализа - 100 мс; чувствительность - от 0.01 %; точность - 0.2 % всей шкалы измерения.

Ультразвуковой измеритель потока газа. Диапазон измерений - 0.00620 л/с; точность измерений ~1 %; инерционность - 2-10"3 с; сопротивление дыханию -не выше 50 Па; измерения в кислородно-азотно-аргоновой и кислородно-гелиевой средах в диапазоне давлений от 0.1 до 25 МПА при парциальном давлении кислорода от 0.01 до 0.1 МПА и произвольном процентном соотношении азотной и аргоновой составляющих газовой смеси.

В зависимости от типа исследований использовался on-line мониторинг усредненной концентрации анализируемых газов в выдыхаемом воздухе, on-line монито-

ринг содержания анализируемых газов в альвеолярном воздухе и газовый анализ проб выдыхаемого воздуха, отбираемых с применением различных маневров дыхания. Измерение объема легочной вентиляции позволяло из данных, получаемых для концентраций анализируемых газов, рассчитывать их скорости выделения и/или потребления. Все представленные статические динамические легочные объемы приводились к стандартным условиям BTPS, выделение СО, СО2 и потребление 02 - к условиям STPD.

В ряде экспериментов проводилось определение концентрации молочной кислоты и измерение КОС в капиллярной крови. Для анализа лактата применялся анализатор «Аккуспорт» (Барингер Маннхайм ГмбХ, Германия), основанный на использовании методов «сухой химии». Для анализа КОС применялся анализатор рН крови «ASID-BASE calculator 214» (Instrumentation Laboratory, Италия).

Были разработаны специальные методы и алгоритмы обработки данных, получаемых при мониторинге эндогенного СО, параметров дыхания и кровообращения Разработанные методы регистрации выделения эндогенного СО с выдохом у человека и животных применялись для:

• определения среднего количества СО, выделяемого за один выдох, с применением отбора пробы в изолированную емкость в том числе, при использовании маневра с задержкой дыхания;

• мониторинга концентрации СО в усредненном выдыхаемом воздухе для исследований выделения СО в покое, при дыхании искусственными дыхательными газовыми смесями и при выполнении физиологических тестов;

• мониторинга концентрации СО в альвеолярном воздухе;

• определения скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом;

• исследования выделений СО с выдыхаемым воздухом в условиях гипербарии.

Статистическую обработку результатов исследований выполняли с помощью программ "Exel-2000" и "Statistica-6.0" с расчетом средних значений, стандартных отклонений, доверительных интервалов, достоверности и корреляционного анализа.

Результаты исследований и их обсуждение

Выделение эндогенного СО с выдыхаемым воздухом в норме в покое

Были исследованы естественных вариаций скорости выделения эндогенного СО у человека в норме в покое. Распределение концентраций СО в выдыхаемом воз-

духе 120 испытуемых имеет максимум в диапазоне концентраций 0.8-1.0 мг/м3 и отличается от нормального. Минимальные значения составляют более 0.55 мг/м3, а максимальные достигают 2.4 мг/м3. Отличие распределения от нормального обусловлено влиянием вариаций содержания СО в городской атмосфере. При минимизации влияния экзогенной составляющей средняя концентрация эндогенного СО в выдыхаемом воздухе составила 0.79±0.22 мг/м3, в альвеолярном воздухе - 1.33±0.3 мг/м3, а скорость выделения эндогенного СО в покое - 0,51±0.18 мкмоль/мин. Эти значения соответствуют средней скорости образования СО в организме человека в результате катаболизма гем-содержащих структур (Coburn R.F., ForsterR.E., KaneP.B., 1965; Тиунов JI.A., Кустов В.В., 1980) и хорошо согласуются с результатами анализа другими методами (Vreman H. J., Stevenson D. К., 1995; Kharitonov SA, Barnes PJ , 2001). Круглосуточный мониторинг СО в выдыхаемом воздухе позволил обнаружить цир-кадные ритмы в скорости выделения СО с минимумом в полночь и максимумом в полдень. Снижение скорости выделения эндогенного СО в ночные часы, причина которого может быть связана как с циркадным ритмом процессов катаболизма (Mercke С., 1975), так и вариациями рН в организме (Окунева Г.Н., 1976), составляет более 30% от дневного уровня.

Вариации содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе при изменениях химического состава вдыхаемого воздуха

Влияние уровня СО во вдыхаемом воздухе на его содержание в выдыхаемом воздухе было исследовано для случая загрязнений атмосферного воздуха экзогенным СО и при курении. Определена динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом у курильщиков. В процессе курения уровень СО в легких поднимается до 50 мг/м3. Сразу после окончания курения сигареты дыхание атмосферным воздухом снижает эту величину до 30 мг/м3. Затем, в промежутке между курением сигарет, наблюдается участок снижения содержания СО с постоянной времени 30-40 мин, следующий до достижения уровня «смокинг статуса». Характерное время релаксации на этом участке позволяет связать этот процесс с очищением миоглобинного буфера от экзогенного СО. В случае дальнейшего отказа от курения наблюдается медленное снижение СО от уровня «смокинг статуса» до уровня выделения СО у некурящего человека. Постоянная времени этого процесса -500 мин близка к постоянной времени опустошения гемоглобинного буфера.

т = 147 мин

г= 100 мин

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 Время, мин

-20 0 20 40 60 90 100 120 140 160 160

Время мин

Рис.1. Динамика выделения СО при ступенчатом повышении содержания Ог во вдыхаемом воздухе. А - динамика при различном содержании СО в атмосферном воздухе, Б - вариации времен релаксации, обусловленные различием параметров респираторной системы и объема гемоглобинного буфера.

Динамика выделения эндогенного СО при гипероксии различного уровня у людей и крыс.

Типичная динамика выделения эндогенного СО у людей при гипероксии представлена на рис. 1. При переходе на дыхание чистым кислородом происходит резкое увеличение, в 6-8 раз, скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом. После достижения максимума наблюдается экспоненциальная релаксация. Установлено, что при гипероксии параметры регистрируемой кривой определяются несколькими факторами: а) содержанием СО и кислорода в атмосфере, б) скоростью вентиляции легких, в) диффузионной способностью легочной мембраны, г) уровнем гемоглобина крови.

На рис. 1А показаны релаксационные кривые для трех случаев, когда заметно отличаются уровни СО в атмосфере и в выдохе испытуемых при дыхании воздухом. Видно, что амплитуда эффекта в этом случае тоже существенно меняется, что отражает меру накопления СО на гемоглобинном буфере. При этом, характерное время релаксации для трех испытуемых было достаточно близким.

На рис. 1Б представлены нормированные кривые релаксации для трех случаев, когда испытуемые существенно отличались параметрами респираторной системы и объема гемоглобинного буфера. Времена релаксации этих процессов отличались су-

щественным образом, от 52 до 147 минут. Получаемые параметры релаксационных кривых могут быть использованы для неинвазивной оценки как диффузионной способности легочной мембраны, так и уровня гемоглобина в крови

Исследования выделения СО с выдыхаемым воздухом при гипероксии у крыс позволило продемонстрировать увеличение амплитуды эффекта с ростом содержания Оо во вдыхаемых газовых смесях от 50% до 100%. Сравнение результатов воздействия гипероксии и гипероксии, сочетанной с гиперкапнией, показало, что добавление во вдыхаемую смесь С02 увеличивает выделение СО, обусловленное гипероксией. Этот эффект может быть объяснен повышением эффективности доставки кислорода в ткани при гиперкапнии как за счет вазидилятаторного воздействия СО2, так и за счет снижения рН в организме. Экспериментально показано, что замена азота на аргон при дыхании у крыс газовой смесью содержащей 75 % 02, приводит к статистически достоверному увеличению суммарного количества выделяемого СО при гипероксии.

Также было исследовано влияние гипоксии на выделение эндогенного СО с выдыхаемым воздухом у человека. Мониторинг СО в выдыхаемом воздухе был применен в экспериментах по гипербарической физиологии для сопоставления динамики газообмена при кратковременных (3 часа) и длительных погружениях (3 суток).

Выделение эндогенного СО при различных физиологических нагрузках

Исследована динамика выделения СО под действием физических нагрузок различной мощности и длительности.

При относительно коротких нагрузках длительностью 1 -2 минуты, рис. 2А, непосредственно во время нагрузки наблюдается снижение содержания СО в выдыхаемом воздухе, что обусловлено усилением вентиляции легких. По окончании нагрузки наблюдается достаточно быстрое восстановление начального уровня, а при нагрузках за анаэробным порогом наблюдается превышение выделения СО над уровнем покоя до 30 %. Увеличенные концентрации СО над этим уровнем регистрируются в течение 10-15 минут после нагрузки. Амплитуда этого эффекта растет монотонно с увеличением нагрузки. При более длительных физических нагрузках эффект возрастания скорости выделения СО маскируется за счет повышенной вентиляции легких.

В динамике скорости выделения СО при физических нагрузках обнаружено несколько последовательных максимумов. Первый коррелирует с пиком потребления кислорода во время нагрузки, второй наблюдается через несколько минут после

1,4

I 1,2

0 а

1 1,0

0,8

s 7,40

& 7,36 I

а 7,32

• 1 ' • • • ........ 1 ' 1 ' ' ФН /'' ~\225Вт -"'V 1 1 1 А

— / /Л \ -

/ /l75BT*\V

\ / / 100Вт , , ' ' ' 1 т - 1 1-т-г Т т-т-г r-1-r

: NN. 100Вт

• 225ВЛ -

0 5 10 15 20

Время, мин

-5 0 5 10 15 20 25 Время, мин

Рис.2. Динамика эндогенного СО в выдыхаемом воздухе и рН артериализованной крови при физической нагрузке (А) и гипервентиляции (Б).

окончания нагрузки и связан с увеличенной продукцией СО2, а третий прослеживается через 6-8 минут после окончания нагрузки и может бьггь обусловлен выделением других кислых продуктов, например, лактата.

Сопоставление объемов избыточного потребления Ог (кислородного запроса) и количества выделенного СО, обусловленных физической нагрузкой различной длительности, показало, что при физической нагрузке 175 Вт кислородный запрос растет практически линейно с длительностью нагрузки, в то время как для СО наблюдается постепенное снижение объема суммарного выделения, причем уровень насыщения находится вблизи 25 мкмоль Как показывает моделирование процессов обмена СО между различными буферными системами в организме, такое ограничение может быть связано с конечным объемом миоглобинного буфера СО, который опустошается при физической нагрузке.

Исследована зависимость отношения объема избыточного выделения СО к объему кислородного запроса во время и после физической нагрузки от мощности последней. Во время физической нагрузки выделение СО прямо пропорционально

потреблению 02. После физической нагрузки выделение СО с увеличением мощности существенно опережает возрастание потребления 02, что можно объяснить подключением процессов анаэробного дыхания при возрастающих нагрузках и увеличением выделения С02 и таких метаболитов как лактат.

Полученные результаты свидетельствуют о существенной роли, которую кислотно-основное состояние (а следовательно напряжение С02 и содержание других кислых продуктов) в тканях организма играет в процесса обмена СО между различными системами буферирования этого соединения. На рис. 2 проказаны результаты одновременных измерений содержания СО в выдыхаемом воздухе и рН артериализо-ванной крови при физических нагрузках разной мощности и гипервентиляции различной интенсивности, которые приводят соответственно к снижению или повышению рН среды организма. Результаты представленные на рис. 2А и 2Б свидетельствуют о наличии отрицательной корреляции изменений содержания СО и рН' при снижении рН содержание СО в выдыхаемом воздухе возрастает, а при повышении рН -падает Экспериментально показано, что чем значительнее изменение рН, тем сильнее меняется содержание СО в выдыхаемом воздухе. В данной работе на испытуемых продемонстрировано, что избыточное выделение эндогенного СО после физической нагрузки коррелирует с повышением уровня лактата в крови.

Исследована динамика содержания СО в выдыхаемом воздухе при задержках дыхания. Результаты исследования показали, что скорость накопления СО в легких с увеличением продолжительности задержек дыхания снижается. При задержках более 30 секунд накопление СО в легких фактически приостанавливается. Это обусловлено снижением напряжения кислорода в крови и опустошением гемоглобинного буфера кислорода. Свободные химические связи на нем занимаются эндогенным СО, которое уже не может быть замещено в капиллярах легких кислородом из-за недостачи последнего. Продемонстрировано увеличение на 20% концентрации СО в пробе выдыхаемого воздуха при задержке дыхания в положениях лежа относительно результатов, получаемых в положении сидя. Эта разница связана с различным кровенаполнением легких в положениях лежа и сидя (Hirasuna J.G., Conn А.В., 1981).

В исследованиях на пациентах показано, что некоторые фармакологические препараты могут влиять на динамику выделения СО с выдыхаемым воздухом. Так,

пероральный прием нитроглицерина приводит к кратковременному повышению скорости выделения СО, что может быть связано с расширением тканевых капилляров и улучшением кровообращения в них. Последнее приводит к увеличению потока кислорода в расширенных капиллярах и более интенсивному выносу из них накопленного СО Подкожная инъекция липополисахарида (ЛПС) у крыс также приводит к двукратному увеличению содержания СО в выдыхаемом воздухе и резкому опустошению гемоглобинного буфера СО. Такой эффект может быть связан с острой воспалительной реакцией, сопровождаемой повышением температуры тела (Kluger M.J., 1991; Гурин В.Н. и соав., 1999 ) и оксидативным стрессом, вызываемыми ЛПС. Как следует из полученных результатов, изменение химизма среды к которому приводят эти процессы в тканях организма, способствует высвобождению СО, связываемого различными буферными системами.

Выделение эндогенного СО с выдыхаемым воздухом при ряде заболеваний

Были исследованы средние уровни эндогенного СО в выдыхаемом воздухе при некоторых заболеваниях. Продемонстрировано статистически достоверное снижение на 30-40 % концентрации СО в выдыхаемом воздухе относительно контрольного уровня при хроническом обструктивном бронхите(р<0.05), фиброзах легких(р<0.05), анемии и бронхиальной астме, которые сопровождаются снижением функции респираторной системы. Значительное (в несколько раз) увеличение скорости выделения СО над нормой зарегистрированы при поражениях печени (гепатите), что обусловлено существенным увеличением скорости гемолиза эритроцитов, сопровождающем это заболевание (Vreman H. J., Stevenson D. К., 1995).

При исследовании группы пациентов, страдающих идеопатической интерсте-циальной пневмонией, с контролем были сопоставлены не только результаты концентрационных измерений, но и данные по скорости выделения СО с дыханием, получаемые из концентрационных измерений при учете минутной вентиляции. Результаты статистической обработки полученных данных отражены на рис. 3. Так средняя величина концентрации СО в группе при этом заболевании снижена приблизительно на 30 % (р <0 001) При этом, сопоставление средних скоростей выделения дает для группы больных снижение более чем на 45 % (р<0.001). Таким образом, этот пара-

Е о. о.

а> §

0,6

3 га

0,2

0,0

- А

, 1 ,

•

г 0,6

-0,5

-0,4 ■3 с

-0,3 I

-0,2 о

-0,1 §

со

-0,0

Контр Пневм

Рис.3. Концентрации СО в выдыхаемом воздухе (А) и скорости выделения СО с выдохом (Б) для группы контроля и группы пациентов с идеопатической интерсти-циальной пневмонией

метр оказывается еще более чувствительным к наличию заболевания и может свидетельствовать о нарушении функции респираторной системы, в частности, об уменьшении диффузионной способности легочной мембраны. Обнаруженное в случае идеопатической интерстициальной пневмонии уменьшение скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом достаточно сильно коррелирует (11=0.81, р=0.014) с уменьшением диффузионной способности легочной мембраны.

Представленные результаты свидетельствуют о возможности и перспективности применений лазерного анализа эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в целях биомедицинской диагностики. В частности, анализ СО может быть использован для неинвазивной диагностики ряда важных физиологических параметров, среди которых скорость катаболизма гем-содержащих белков в организме, уровень гемоглобина в крови, параметры респираторной системы, эффективность транспорта кислорода к тканям, а также для исследований вариаций кислотно-основного состояния в организме, обусловленных изменением интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов.

ВЫВОДЫ

1. Методы диодной лазерной спектроскопии могут быть эффективно использованы для высокочувствительного и высокоселективного анализа и долговременного мониторинга содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных. При использовании для спектрального анализа СО в выдыхаемом воздухе перестраиваемых диодных лазеров реализуются следующие параметры: спектральный диапазон - 4.7 мкм, чувствительность

- 5 мкг/м3, динамический диапазон 5 мкг/м3 - 100 мг/м3, селективность анализа

- близкая к 100 %, время анализа - 5 с, объем аналитической кюветы - 1 л, время непрерывного мониторинга - не ограничено.

2. Лазерный анализ позволяет детектировать в режиме близком к режиму реального времени вариации содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, обусловленные изменением параметров дыхания (гипервентиляции и задержке дыхания), состава вдыхаемой газовой смеси (в условиях гипероксии, гипоксии, гиперкапнии, при гипербарическом воздействии, вариациях СО в атмосферном воздухе и добавлении индифферентных газов) и физической активности.

3. В норме концентрация эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека имеет максимум в диапазоне 0.8-1.0 мг/м3 и распределение ее отличается от нормального. Скорость выделения СО составляет 0,51±0,18 мкмоль/мин. Выделение СО имеет циркадный ритм с максимумом в дневные часы и минимумом в полночь, глубина модуляции при этом составляет -30 %. Загрязнение атмосферного воздуха экзогенным СО и/или курение вызывает увеличение содержания СО в выдыхаемом воздухе, величина которого может достигать более 30 мг/м3.

рактеристики: относительное увеличение выделения в максимуме —600 %, время релаксации (по уровню 0.5) составляет от 70 до 150 минут и определятся уровнем гемоглобина в крови и диффузионными характеристиками легочной мембраны. Максимальная амплитуда зависит от концентрации кислорода, а также от уровня содержания С02 и Аг во вдыхаемой гипероксической газовой смеси.

5. Динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом, обусловленная физической нагрузкой и гипервентиляцией, определяется объемом вентиляции, скоростью потребления кислорода и скоростью образования и/или выделения С02. Вариации скорости выделения СО коррелируют с изменением кислотно-основного состояния крови и содержанием молочной кислоты в крови. Концентрации и скорости выделения СО при физической нагрузке определяются мощностью и длительностью последней, диапазон их изменений составляет -280 %. При гипервентиляции концентрации и скорости выделения СО определяются объемом и длительностью гипервентиляции.

6. Кратковременная задержка дыхания (до 30 с) приводит к возрастанию концентрации СО в выдыхаемом воздухе, которое сменяется снижением скорости выделения при более длительных задержках. В норме относительное увеличение концентрации СО в выдыхаемом воздухе при задержке ~30 с составляет -160%. Уровень концентрации СО, досшгаемый при задержках 20-30 с зависит от положения тела испытуемого (лежа или сидя). Содержание СО в выдыхаемом воздухе, в том числе, динамика выделения при задержках дыхания, изменяется при патологиях органов дыхания и нарушениях катаболизма гем-содержащих белков, что может быть использовано для целей неинвазивной биомедицинской диагностики.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Detection of small trace molecules in human and animals exhalation by tunable diode lasers for applications in biochemistry and medical diagnostics // Proc. of SPIE "Medical Sensors II and Fiber Optic Sensors". Biomedical Optics, Europe, Lille. Sept.1994. 1994. Vol.2331. P.173-183 (соавт. Stepanov E.V., Kouznetsov A.I., Zyrianov P.V., Skrupskii V.A., Galagan M.E.).

2. Мониторинг выделения эндогенной окиси углерода с выдыхаемым воздухом у крыс при гипероксии // Журнал авиакосмической и экологической медицины. 1995. №1. С.49-53 (соавт. Скрупский В.А., Степанов Е.В.).

3. Endogenous СО dynamics monitoring in breath by tunable diode lasers // Proc. SPIE "Laser Diodes and Applications II". 1996. Vol.2682. P.247-256 (соавт. Stepanov E.V., Kouznetsov A.I., Skrupskii V.A.).

4. Monitoring of rapid blood pH variations by CO detection in breath with tunable diode laser // Proc. SPIE. 1997. Vol.2976. P.88-95 (соавт. Kouznetsov A.I., Stepanov E.V., Zyrianov P.V., Diachenko A.I., Gurfinkel Y.I.).

5. Hyperoxic, normoxic and hypoxic oxygen-argon gaseous mixture influence on humans under different barometric pressures and respiration time // Undersea and Hyperbaric Medicine. 1997. Vol.24. Supplement. P.56(18). (соавт. Pavlov B.N., Grigorev A.L., Smolin V.V., Komordin I.P., Sokolov G.M., Ramazanov R.R., Spirkov P.V., Soldatov P.E., Buravkova L.B., Diachenko A.I., Stepanov E.V.).

6. Применение лазерного анализа эндогенной моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе для мониторинга метаболизма при физической нагрузке в условиях гипербарии // Труды 11-ой Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии, Москва, июнь 1998. Москва. 1998. Т.2. С.223-225 (соавт. Степанов Е.В., Дьяченко А.И., Павлов Б.Н.).

7. Выделение эндогенной моноокиси углерода с дыханием при дозированной физической нагрузке и гипервентиляции // Труды 11-ой Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии, Москва, июнь 1998. Москва. 1998. T.l. С.254-256 (соавт. Дьяченко А.И., Павлов Б.Н., Степанов Е.В.).

8. Выведение эндогенной моноокиси углерода из организма при сочетанном воздействии гипероксии и гиперкапнии // Труды 11-ой Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии, Москва, июнь 1998. Москва. 1998. Т.2. С.341-343 Скрупский В.А., Степанов Е.В.).

9. Оксид азота и моноксид углерода при патологиях легких // В сборнике трудов Всероссийского научного общества пульмонологов: "Актуальные проблемы пульмонологии" // под ред. А.Г.Чучалина. Москва. 2000. С.738-

746. (соавт. Вознесенский Н.А., Степанов Е.В., Дулин К.С., Сахарова Г.М., Соодаева С.К., Чучалин А.Г., Ягмуров Б.Х.).

10. Влияние аргона на потребление кислорода человеком при физической нагрузке в условиях гипоксии, // Физиология человека. 2001. том 27. № 1. С. 147-154 (соавт. Дьяченко А.И., Б.Н.Павлов).

11. Изучение выделения эндогенной окиси углерода человеком в условиях дыхания газовой смесью в гермобъекте. // Материалы Российской конференции "Проблемы обитаемости в гермообъектах". Москва. 4-8 июня 2001. С. 202 (соавт. Степанов Е.В. Дьяченко А.И. Павлов Б.Н.).

12. Exhaled carbon monoxide is decreased in interstitial lung diseases (ILD) // Eur.Resp.Journ. 2001. V.18. Supplement 33. P.195S. (соавт. Avdeev S.N., Avdeeva O.E., Stepanov E.V., Cherniak A.V., Chuchalin A.G.).

13. Applicability of exhaled CO measurement for calculation of CO transfer parameters in healthy volunteers // Proc. 12th European Respiratopy Society Annual Congress, Stockholm, Sweden, 2002. // European Respiratory Journal. 2002. Vol.20. Sup.38. P.154S (соавт. Babarskov E., Stepanov E., Cherniack A., Aisanov Z., Chuchalin A.G.).

14. Endogenous carbon monoxide monitoring as a noninvasive technique of tissue gas exchange estimation of pulmonary transfer factor and oxide-base balance in high pressure environment // 8 Int. Meeting on High Pressure Biology, Moscow, Russia, June 2-6, 2003. P.57 (соавт. Stepanov E.V., Diachenko A.I., Pavlov B.N., Babarskov E.V., Buravkova L. В.).

15. Exhaled CO measurement for detection of lang diffusion disturbances // Eur.Resp.Journ. 2003. Vol.22. Suppl.45. P.1819 (соавт. Babarskov E.V., Stepanov E.V., Cherniak V., Aisanov Z.R.).

16. Исследования физиологических эффектов дыхания подогретыми кисло-родно-гслиевыми смесями. // Физиология человека. 2003. том 29. № 5. С. 69-73 (соавт. Павлов Б.Н, Дьяченко А.И.)

17. Лазерный анализ эндогенного СО в выдыхаемом воздухе // Труды ИОФАН, т.61, ст. 135-188, - М. Наука, 2005 (соавт. Степанов Е.В., Бабарсков Е.В., Чучалин А.Г., Дьяченко А.И., Павлов Б.Н.).

.. i 0839

РНБ Русский фонд

2006-4 7076

Подписано в печать 17 05 2005 г. Формат 60х84Л6 Заказ №26. Тираж 80 эю П л.1.25

Отпечатано в РИИС ФИАН с оригинал-макета заказчика 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел 132 511 28

Оглавление диссертации Шулагин, Юрий Алексеевич :: 2005 :: Москва

СПИСОК 4 СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ОКИСИ УГЛЕРОДА 15 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физические и химические свойства окиси углерода

1.2. Механизмы образования эндогенной окиси углерода в 18 организме

1.3. Физиологическая роль окиси углерода

1.4. Механизмы утилизации окиси углерода в организме

1.5. Механизмы транспорта окиси углерода

1.6. Аналитические методы для исследований эндогенного 46 СО в выдыхаемом воздухе

1.7. Экспериментальные исследования выделения эндогенно- 55 го СО в норме и при патологиях

1.8. Резюме по первой главе

ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И МОДЕЛЬ 62 ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННОГО СО С ВЫДЫХАЕМЫМ ВОЗДУХОМ

2.1. Общие закономерности выделения эндогенного СО

2.2. Перенос СО из крови в выдыхаемый воздух

2.3. Перенос СО из клеточных и тканевых систем буфериро- 65 вания на гемоглобин

2.4. Основные соотношения для динамики выведения СО

2.5. Оценка динамических параметров

2.6 Резюме по второй главе

ГЛАВА 3. МЕТОДЫ И ПРИБОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ 82 ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННОЙ ОКИСИ УГЛЕРОДА С ВЫДЫХАЕМЫМ ВОЗДУХОМ

3.1. Объекты и методы исследования

3.2. Лазерный анализатор окиси углерода в выдыхаемом воз- 85 Духе

3.3. Анализаторы С02 и

3.4. Измерение скорости потока газа в выдыхаемом воздухе с 91 помощью ультразвукового датчика потока

3.5. Определения параметров кровотока

3.6. Средства автоматизации измерений

3.7. Методы отбора и анализа проб выдыхаемого воздуха

3.8. Экспериментальные аналитические комплексы

3.9. Методы биохимического анализа лактата и кислотно- 104 основного состояния крови

3.10. Резюме по третей главе

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 107 МОНИТОРИНГА СО В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ ЧЕЛОВЕКА И ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

4.1. Естественные вариации скорости выделения эндогенного

4.2. Влияние изменений состава вдыхаемого воздуха

4.3. Динамика содержания СО в выдыхаемом воздухе при 131 проведении различных нагрузочных тестов

4.4. Применение лазерной методики детектирования эндо- 151 генного СО для клинической диагностики заболеваний

4.5. Резюме по четвертой главе

Введение диссертации по теме "Авиационная, космическая и морская медицина", Шулагин, Юрий Алексеевич, автореферат

Основные направления и актуальность исследований

Диссертация посвящена разработке методов определения содержания эндогенной моноокиси углерода (СО) в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на высокочувствительном лазерном спектральном анализе, исследованиям с помощью этих методов основных закономерностей выделения эндогенного СО живыми организмами и разработке на этой основе новых неинвазивных диагностических подходов, которые могут быть применены в физиологических и клинических исследованиях.

Актуальность определения содержания СО в выдыхаемом воздухе, а также разработок аналитических устройств, предназначенных для подобных измерений, обусловлена тем, что моноокись углерода является одним из эндогенных газообразных соединений, играющих значительную роль в жизнедеятельности организма. Особенности процессов ее образования в организме и транспорта от тканей и органов в выдыхаемый воздух в настоящий момент недостаточно хорошо изучены, а разработка подходов к использованию СО в качестве молекулы-биомаркера требует тщательных предварительных исследований. Для этих целей должны использоваться новые методы высокочувствительного, достаточно точного и селективного инструментального анализа содержания СО в выдыхаемом воздухе, которые стали доступными лишь в последнее время.

В организме эндогенное СО образуется в результате ферментативно-управляемого катаболизма (разложения) гем-содержащих соединений [1-3]. Основная его продукция обусловлена гемолизом эритроцитарного гема в ходе эритропоэза, направленного на устранение стареющих клеток крови. Кроме того, некоторая доля эндогенного СО образуется при деградации миоглобина, нейроглобина, цитоглобиа, цитохромов и ряда металлсодержащих ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, триптофанпирролаза, гуанилатциклаза, N0-синтаза и других. Также возможно образование относительно малого количе5 ства СО негемовой природы за счет перекисного окисления липидов, фотоокисления, а также активности ксенобиотиков и некоторых бактерий [3]. Результаты недавних биохимических исследований показывают, что СО в организме является не только конечным продуктом метаболических превращений упомянутых выше соединений, но и сигнальной молекулой (т.н. вторичным мессенджером), участвующей в механизме преобразования сигналов, регуляции клеточного метаболизма и в передаче информации [4,5].

Во избежание избыточного накопления, СО интенсивно выводится из организма. Для этих целей, помимо диффузии, транспорта в растворенном состоянии и конвективного газообмена, используется специальный механизм обратимого связывания этих молекул гем-содержащими белковыми структурами (гемоглобин, миоглобин, цитоглобин, нейроглобин, цитохром-аЗ), кратковременного буферирования на них и транспорта по градиенту концентраций Ог -от клеток и тканей в легкие [2,6-9]. Для выведения СО используется та же цепочка механизмов, с помощью которой осуществляется транспорт кислорода из легких и обеспечение дыхания клеток, только действующая в обратном направлении. В клетках СО может быть связано цитоглобином, нейроглобином [7-9] или цитохромами-аЗ (в митохондриях клеток). В мышечных тканях СО накапливается на миоглобине, а в крови - на гемоглобине. За счет потока кислорода, проникающего с кровью в ткани и клетки, между этими системами буферирования СО происходит постоянный обмен, так что молекулы СО постепенно продвигаются в направлении от клеток к легким. В легких СО диффундирует из крови в воздушное пространство легких и затем за счет вентиляции при дыхании выводится в атмосферу. На заключительном этапе пребывания эндогенного СО в крови, т.е. в альвеолярных капиллярах, темп его выделения в воздушное пространство легких находится в непосредственной зависимости от перфузии и эффективности доставки кислорода к альвеолярной мембране легких [3]. Эта эффективность может меняться за счет вариации как газодинамических, так и диффузионных характеристик используемых дыхательных смесей.

Необходимо выделить несколько наиболее важных процессов, в которых эндогенное СО участвует в организме [1,3-5]. Во-первых, СО является вторичным мессенджером для нейромедиаторов и гормонов, поскольку активизирует работу фермента гуанилат-циклазы, участвующей в образовании циклического гуанизинмонофосфата. Последним определяется уровень кальция в клетке, от которого в конечном счете зависит активность протеин-киназ и некоторых биохимических процессов. Кроме того, СО участвует в механизме регуляции тонуса кровеносных сосудов и возможно влияет на внутриклеточные механизмы формирования долговременной памяти. Во-вторых, СО разделяет с 02 общую систему транспорта и буферирования, что позволяет использовать его как маркер при исследовании механизмов и самого транспорта кислорода. В-третьих, существуют предположения, что СО выделяется при воспалительных процессах и поэтому может быть использовано как маркер работы антиокси-дантной системы. Наконец, в-четвертых, основная функция молекул СО определяется их ролью в регуляции обновления клеток крови, т.е. СО может служить индикатором и маркером катаболизма.

• интенсивности метаболических и индуцированных процессов, связанных с образованием СО;

• диффузионных и конвективных процессов переноса кислорода в легких;

• интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов в условиях тканевой гипоксии.

Следует особо отметить, что одним из важных и перспективных аспектов данного подхода, основанного на анализе химического состава выдыхаемого воздуха, является возможность неинвазивных исследований некоторых важных параметров организма и базирующейся на них диагностики нормальных и патологических процессов.

Сложность анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе обусловлена несколькими факторами. Во-первых, чувствительность газового о анализа СО должна быть на уровне 10 мкг/м . Во-вторых, поскольку выдыхаемый воздух является сложной газовой смесью, требуется высокая селективность анализа. Применяемый метод должен обеспечить измерение следовых концентраций СО в присутствии азота, кислорода, паров воды, СО2 и других компонентов выдыхаемого воздуха. В-третьих, измерения СО желательно проводить в масштабе времени близком к реальному, не применяя накопления, обогащения и фильтрации газовой пробы. В-четвертых, применяемый метод должен обеспечивать возможность для долговременного и непрерывного мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе с тем, чтобы можно было исследовать достаточно медленные физиологические процессы.

Один из возможных подходов к решению данной проблемы состоит в использовании лазерных технологий спектрального анализа, в частности, методов диодной лазерной спектроскопии, которая является признанным лидером в области высокочувствительного и высокоселективного газового анализа. Именно этот подход был применен и развит нами в данной работе.

Цели и задачи исследований

В задачи исследования входили:

Проведение разработки методов и средств высокочувствительного анализа и мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных, основанных на использовании перестраиваемых диодных лазеров.

• Исследование закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом в норме, при изменении состава вдыхаемой газовой смеси (вариации содержания СО в атмосфере, гипероксия, гипоксия, гиперкапния) и при выполнении различных физиологических тестов, таких как физическая нагрузка, гипервентиляция, задержка дыхания.

• Исследование содержания СО в выдыхаемом воздухе при некоторых заболеваниях.

Оценка возможностей использования анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в целях биомедицинской диагностики.

Научная новизна

Впервые получены следующие результаты:

Разработан автоматический диагностический комплекс для измерения параметров газообмена, включающий в себя лазерный анализатор СО, анализаторы О2 и СО2, ультразвуковой измеритель потока газа. Основные технические параметры комплекса: Анализатор СО: время анализа - 5 с; чувствительность

•з

5 мкг/м ; точность определения концентрации СО - 3 %; объем аналитической кюветы - 1 л; селективность анализа —100 %; время непрерывного мониторинга - не ограничено. Анализатор О2: время анализа - 100 мс; чувствительность -от 0.1 %; точность - 1 % от полной шкалы измерений. Анализатор СО2: время анализа - 100 мс; чувствительность - от 0.01 %; точность 0.2 % всей шкалы измерения. Ультразвуковой измеритель потока газа: диапазон измерений -0.006-20 л/с; точность измерений ~1 %; инерционность - 2-10' с; сопротивление дыханию - не выше 50 Па; измерения в кислородно-азотно-аргоновой и кислородно-гелиевой средах в диапазоне давлений от 0.1 до 25 МПА при парциальном давлении кислорода от 0.01 до 0.1 МПА и произвольном процентном соотношении азотной и аргоновой составляющих газовой смеси.

Разработаны методы регистрации выделения эндогенного СО в различных экспериментальных условиях на человеке и животных: метод отбора пробы в изолированную емкость для определения среднего количества СО, выделяемого за один выдох, в том числе, при использовании маневра с задержкой дыхания; метода мониторинга концентрации СО в усредненном выдыхаемом воздухе для исследований выделения СО в покое, при дыхании искусственными дыхательными газовыми смесями и при выполнении физиологических тестов; метод мониторинга концентрации СО в альвеолярном'воздухе; метод определения скорости выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом; метод исследования выделений СО с выдыхаемым воздухом в условиях гипербарии.

10 выдыхаемым воздухом. Продемонстрировано влияние загрязнений атмосферного воздуха экзогенным СО на содержание моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе. Определена динамика выделения СО с выдыхаемым воздухом у курильщиков.

Установлены закономерности и измерены основные параметры динамики выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом у людей и лабораторных животных при дыхании гипероксическими и гипоксическими дыхательными газовыми смесями, а также у лабораторных животных при сочетанном влиянии гипероксии и гиперкапнии и при дыхании газовыми смесями с добавлением аргона.

Определены основные закономерности и измерены основные параметры динамики выделения эндогенного СО при проведении различных физиологических тестов: физической нагрузки различной мощности и длительности, гипервентиляции различной глубины и задержек дыхания различной длительности. Для физической нагрузки продемонстрировано наличие корреляции изменений скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом с рН артериализован-ной крови и с концентрацией лактата в капиллярной крови. Для гипервентиляции обнаружено наличие корреляции изменений скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом с рН артериализованной крови.

Определены средние уровни выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом при ряде заболеваний органов дыхания. В частности продемонстрировано снижение концентрации СО в выдыхаемом воздухе при хроническом обструк-тивном бронхите, фиброзах легких, анемии и бронхиальной астме. В случае идеопатической интерстициальной пневмонии обнаружено уменьшение скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом, коррелирующее с уменьшением диффузионной способности легочной мембраны. Было продемонстрировано значительное увеличение выделения СО над нормой при поражениях печени.

Практическая ценность работы

Сформулированы требования к условиям проведения анализа содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе для целей биомедицинской диагностики.

Показана возможность и эффективность предлагаемого подхода в исследованиях по спортивной и гипербарической физиологии. В частности, установлена связь динамики выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом и лактатом крови при физических нагрузках. Так же разработанные методы могут быть использованы для изучения воздействия на организм индифферентных газов, таких как гелий, аргон и криптон, а также для контроля терапевтического воздействия на организм гипероксических и гипоксических газовых смесей.

Разработанные методы могут быть использованы для целей неинвазив-ной биомедицинской диагностике.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Применение методов диодной лазерной спектроскопии эффективно для высоко-чувствительного и высокоселективного анализа и долговременного мониторинга содержания эндогенной моноокиси углерода в выдыхаемом воздухе человека и лабораторных животных в реальном времени.

2. Динамика выделения эндогенной моноокиси углерода с выдыхаемым воздухом является показателем физиологического состояния организма при проведении различных функциональных проб и воздействии измененных факторов газовой среды. Отклонения скорости выделения эндогенного СО от нормы могут использоваться для неинвазивной биомедицинской диагностики.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных, всесоюзных, всероссийских и региональных научных конференциях, симпозиумах и семинарах: Международной конференции SPIE "Биомедицинская оптика" (Лиль, Франция, 1994; Барселона, Испания, 1995; Сан-Хосе, США, 1995; Сан-Хосе, США, 1996), Международной конференции SPIE "Передовые технологии для мониторинга окружающей среды" (Денвер, США, 1996), Международной конференции SPIE "Биомедицинские датчики, визуализация и слежение" (Сан-Хосе, США, 1997), V Конференции по биологии при высоких давлениях (С.-Петербург, 1997), 7-ой Всероссийской школе по физиологии дыхания (Бологое, 1998), 11 Международной конференции по авиакосмической медицине и биологии (Москва, 1998), Международной конференции по заболеваниям органов дыхания и астме, (Сан-Диего, США, 1999), II Российской школе для практических врачей "Свободные радикалы и болезни легких" (Рязань, 1999), Конференции "Возможности и перспективы использования индифферентных газов в водолазной практике, биологии и медицине" (Москва, 1999), 11 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Берлин, Германия, 2001), 12 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Стокгольм, Швеция, 2002), 13 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Вена, Австрия, 2003), 14 Ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Сообщества (Глазго, Великобри-таня, 2004).

Кроме того материалы диссертации были представлены на семинарах ИОФАН им. A.M. Прохорова, семинарах ФИАН им. П.Н. Лебедева, ГНЦ РФ

ИМБП РАН, Института пульмонологии РАМН, Московской медицинской академии, Берлинского технического университета, Берлинского университета им. Гумбольдта, Калифорнийского университета в Санта-Барбаре, Медико-биологического департамента Космического центра им. Дж.Кеннеди, НАСА, Семинаре по лазерной медицине Российской Лазерной Ассоциации и Общемосковском семинаре по проблемам физиологии дыхания и пульмонологии.

Публикации

Основные результаты исследований по теме диссертации опубликованы в 17-ти статьях и тезисах докладов на конференциях.

Структура диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Мониторинг эндогенной моноокиси углерода у человека и животных методами лазерного спектрального анализа"

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты данной диссертационной работы, основными целями которой являлись разработка методов высокочувствительного анализа и мониторинга содержания СО в выдыхаемом воздухе, основанных на использовании перестраиваемых диодных лазеров, исследование с помощью данного подхода основных закономерностей выделения эндогенного СО с дыханием у человека и малых животных и разработка неинвазивных методов биомедицинской диагностики, базирующихся на лазерном анализе состава выдыхаемого воздуха, позволяют сделать следующие выводы:

- 4.7 мкм, чувствительность - 5 мкг/мЗ, динамический диапазон 5 мкг/мЗ

- 100 мг/мЗ, селективность анализа - близкая к 100 %, время анализа - 5 с, объем аналитической кюветы - 1 л, время непрерывного мониторинга - не ограничено.

3. В норме концентрация эндогенного СО в выдыхаемом воздухе человека имеет максимум в диапазоне 0.8-1.0 мг/м3 и рапределение ее отличается от нормального. Скорость выделения СО составляет 0.51±0.18

157 мкмоль/мин. Выделение СО имеет циркадный ритм с максимумом в дневные часы и минимумом в полночь, глубина модуляции при этом составляет -30 %. Загрязнение атмосферного воздуха экзогенным СО и/или курение вызывает увеличение содержания СО в выдыхаемом воздухе, величина которого может достигать более 30 мг/м .

4. При дыхании гипероксическими газовыми смесями наблюдается резкое возрастание скорости выделения СО с выдыхаемым воздухом. Динамика процесса выделения СО при дыхании чистым кислородом имеет следующие характеристики: относительное увеличение выделения в максимуме --600 %, время релаксации (по уровню 0.5) составляет от 70 до 150 минут и определется уровнем гемоглобина в крови и диффузионными характеристиками легочной мембраны. Максимальная амплитуда зависит от концентрации кислорода, а также от уровня содержания С02 и Аг во вдыхаемой гипероксической газовой смеси.

6. Кратковременная задержка дыхания (до 30 с) приводит к возрастанию концентрации СО в выдыхаемом воздухе, которое сменяется снижением скорости выделения при более длительных задержках. В норме относительное увеличение концентрации СО в выдыхаемом воздухе при задержке -30 с составляет -160 %. Уровень концентрации СО, достигаемый при задержках 20-30 с зависит от положения тела испытуемого (лежа или сидя). Содержание СО в выдыхаемом воздухе, в том числе, динамика выделения при задержках дыхания, изменяется при патологиях органов дыхания и нарушениях катаболизма гем-содержащих белков, что может быть использовано для целей неинвазивной биомедицинской диагностики.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Шулагин, Юрий Алексеевич

1. Тиунов А.А., Кустов В.В. Продукты метаболизма при радиационном поражении. М.: Атомиздат, 1980. 104 с.

2. Страйер J1. Биохимия // в 3-х томах. М.: Мир. 1985.

3. Vreman H.J., Mahoney, Stevenson D.K. Carbon Monoxide and Carboxyhe-moglobin // Adv.Pediatrics. 1995. Vol.42. P.303-334.

4. Марков X.M. Окись азота и окись углерода новый класс сигнальных молекул // Успехи физиологических наук. 1996. Т.27. №4. С.30-41.

5. Gazit V., Rozenberg В., Katz Y. Nitric oxide and carbon monoxide a new generation of neuronal messengers // Harefuah. 1996. Vol.130. No.12. P.854-858.

6. Физиология человека // под. ред. Р. Шмидта и Г. Тевса // в 3-х томах. М.: Мир. 1996.

7. Burmester Т., Welch В., Reinhardt S., and Ilankeln Т. A vertebrate globin expressed in the brain // Nature. 2000. V.407, P.520-523.

8. Geuens E., Brouns I., Flamez D., Dewilde S., Timmermans, J. P., and Moens, L. A globin in the nucleus! // J.Biol.Chem. 2003. V.278. No.33. P.30417-30420.

9. I-Iamdanet D, Kigert L., Dewilde S., at. all. The Redox State of the Cell Regulates the Ligand Binding Affinity of Human Neuroglobin and Cytoglobin // J.Biol.Chem. 2003. V.278. No.61. P.61713-61721.

10. Физические величины, Справочник, Под ред. Григорьева И.С. и Мейли-ховаЕ.З. М: Энергоатомиздат, 1991, С.994.1 l.Coburn R.F., Forman H.J. Carbon monoxide toxicity. In Handbook of Physiology, vol 4, 1987, p 439.

11. Rodkey F.L., O'Neil J.D., Collison H.A., et al: Relative affinity of hemoglobin S and hemoglobin A for carbon monoxide and oxygen. // Clin. Chem. 1974. Vol.20.P.83.

12. Piantadosi C.A. Carbon monoxide, oxygen transport, and oxygen metabolism. // J. Hyperb. Med. 1987. Vol.2. No.l. P.27-44.

13. Graedel Т.Е., Crutzen P.J. The changing atmosphere. // Sci. Am. 1989. Vol.261. P.58-68.

14. Akiand G.G., Colome S.D., Dahms Т.Е., et al: Population exposure to carbon monoxide, in EPA 600/8-90/045F: Air Quality Criteria for Carbon Monoxide.

15. Research Triangle Park, NC, Environmental Criteria and Assessment Office, Office of Health and Environmental Assessment, Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. 1991. P. 8.1-8.115.

16. Грушко Я.М., Вредные неорганические соединения в промышленных выбросах в атмосферу. Справочник., JL, Химия, 1987.

17. Sjostrand Т. Endogenous formation of carbon monoxide in man. //«Nature», 1949. Vol. 164. P.580-581.

18. Maines M.D. The heme oxygenase system: A Regulator of Second Messenger Gases //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997.Vol.37. P.517-54

19. Landaw S., Callahan G.,Sohmid R., Catabolism of heme in vivo Comparison of simulation of bilirubin and carbon monoxide. // J. Clin. Invest. 1970, Vol.49. No.5.P.914-925.

20. Yoshida T, Noguchi M, Kikuchi G: The step of carbon monoxide liberation in the sequence of heme degradation catalyzed by the reconstituted microsomal heme oxygenase system. // Biol Chem. 1982. Vol.257. P.9345-9348.

21. Tenhunen R., Marver H., Frager W., Pimatone N., Cooper D., Schmid rR." Enzymatic degradation of heme oxigenative clevage requiring cytochrome P-450.//Biochemistry. 1972. Vol. ll.No.9. P.1716-1720.

22. Tenhunen R. The enzymatic conversion of heme to bilirubin in vivo. // Ann. Clin. Res. 1976. Vol.8. Suppl. No. 17. P.2-9.

23. Berk P.D., Rodkey F.L., Blaschke T.F., et al: Comparison of plasma bilirubin turnover and carbon monoxide production in man. // Lab Clin Med. 1974. Vol.83.P.29-37.

24. Sjostrand T.A. preliminary report on the in vitro formation of carbon monoxide in blood//Acta Physiol. Scand. 1951, Vol.22. No.2-3. P.142.

25. Maines M.D., Kappas A. The induction of heme oxidation in various tissues by trace metals: evidence for the catabolism of endogenous heme by hepatic heme oxygenase // Ann. Clin. Res. 1976. Vol.8. P.38-46.

26. Maines M.D. 1980. Regional distribution of the enzymes of heme biosynthesis and the inhibition of -aminolevulinate synthetase by manganese in the rat brain //Biochem. J. 190. P.315-321.

27. Maines M.D., Chung A-S., Kutty R.K. Inhibition of testicular HO activity by cadmium: a novel cellular response. //J. Biol. Chem. 1982. Vol.257. P.14116-14121.

28. Maines M.D., Mayer R.D., Ewing J.F., Mc-Coubrey W.K. Induction of kidney HO-1 (HSP32)mRNAand protein by ischemia: possible role of heme as both promoter of tissue damage and regulator of HSP32. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993. Vol.264. P.457-^62.

29. Maines M.D, Kappas A. The degradative effects of porphyrins and heme compounds on the components of the microsomal mixed function oxidase.//J. Biol. Chem. 1975. Vol.250. P.2363-2369

30. Wastman G. Carbon monoxide of cytochrome "C" and of ascorbic acid. // Asta Physiol. Scand. 1975, Vol.93. No.2.P.175-178.

31. Rodgers P. A., Vreman H.J., Dennery P. A., et al: Sources of carbon monoxide (CO) in biological systems and applications of CO detection technologies. // Semin. Perinatol. 1994. Vol.18. P.2-10.

32. Wolff D.G., Bidlack V.V.K. The formation of carbon monoxide during peroxidation of microsomal lipids. Biochem Biophys. Res.Commun. 1976. Vol.73. P.850-857.

33. Vreman H.J., Sanesi C.A., Dennery P.A., et al: Carbon monoxide (CO) is a product of lipid peroxidation. // Clin. Res. (abstract). 1991. Vol.39. P.l 09.

34. Sanvordeker D.K., Kostenbauder И.В. Mechanisms for riboflavin enhancement of bilirubin photodecomposition in vitro. // Pharmacol Sci. 1974. Vol.63. P.402-408.

35. Levine A.S., Bond J.H., Prentiss R.A., et al: Metabolism of carbon monoxide by the colonic flora of humans. // Gastroenterology. 1982. Vol.83. P. 633-637.

36. Furchgott R.F., Jothianandan D. Endothelium-dependent and -independent vasodilation involving cGMP: relaxation induced by NO, CO and light. // Blood Vessels 1991. Vol.28. P.52-61.

37. Brian J.E., Heistad D.D., Faraci F.M. Effect of carbon monoxide on rabbit cerebral arteries. Stroke 1994. Vol.24. P.639-644.

38. Christodoulides N., Durante W., Kroll K.H., Schafer A.I. Vascular smooth muscle cell heme oxygenases generate guanylyl cyclase-stimulatory carbon monoxide. // Circulation. 1995. Vol.91. P.2306-2309.

39. Shinomura Т., Nakao S-I., Mori K. Reduction of depolarization-induced glu-tamate released by heme oxygenase inhibitor: possible role of carbon monoxide in synaptic transmission. //Neurosci. Lett. 1994.Vol.166. P. 131-134

40. Hawkins R.D. Nitric oxide and carbon monoxide produce activity dependent long-term synaptic enhancement in hippocampus.// Science 1993. Vol.260. P.1946-1950.

41. Hawkins R.D., Zhuo M., Arancio O. Nitric oxide and carbon monoxide as possible retrograde messengers in hippocampal long-term potentiation. // J. Neurobiol. 1994. Vol.25. P.652-^65.

42. Lamar C.A., Mahesh V.B., Brann D.W. Regulation of gonadotropinreleasing hormone (GnRH) secretion by heme molecules: a regulatory role for carbon monoxide?//.Endocrinology. 1996. Vol.137. P.790-793.

43. Agarwal A., Kim Y., Matas A.J., Alam J., Nath K.A. Gas-generating systems in acute renal allograft rejection in the rat. // Transplantation. 1996. Vol.61. P.93-98.

44. Moncada S. Nitric oxide gas: mediator, modulator and pathophysiological entity//L. Lab. Clin. Med. 1992. V. 120. P. 187-191.

45. Verma A., Hirsch D. J., Glatt C.E., Carbon monoxide: A putativ neural messenger// Science. 1993. V. 259. P. 381-384.

46. Fenn W.O. The burning of CO in tissues. //Ann N Y Acad Sci. 1970. Vol.174. P.65-71.

47. Stannard J.N. An analysis of the effect of carbon monoxide on the respiration of frog skeletal muscle. //Am J Physiol. 1940. Vol.129. P.l 95-213.

48. Clark R.T., Stannard J.N., Fenn W.O. The burning of CO to CO; by isolated tissues as shown by the use of radioactive carbon. // Am. J. Physiol. 1950. Vol.161. P.40-46.

49. Luomanmaki K., Coburn R.F. Effects of metabolism and distribution of carbon monoxide on blood and body stores. // Am J Physiol. 1969. Vol.217. P.354-363.

50. Perutz M.F. Mechanisms regulating the reactions of human hemoglobin with oxygen and carbon monoxide // Annu. Rev. Physiol. 1990. Vol.52. P.l-25.

51. Gibson Q.H. The oxygenation of hemoglobin. In The Porphyrins, ed. D Dolphin, New York: Academic. 1978. Vol.5. P.153-203.

52. Collman J.P., Brauman J.I., Doxsee K.M. Carbon monoxide binding to iron porphyrins. // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P.6035-6039.

53. Иржак Л.И., Дыхательная функция крови в индивидуальном развитии млекопитающих. М. Л. Наука. 1964. 146 с.

54. Иржак Л.И., Гемоглобины и их свойства. М. Наука, 1975. 239 с.

55. Верболович П.А., Верболович В.П. Миоглобин и использование кислорода в живом организме. // В кн.: Полярографическое определение кислорода в биологических объектах. Киев. Наукова думка. 1974. с. 123136.

56. Lawrite R. Some observations on factores affecting myoglobin concentration in muscle // J. Agr. Sci. 1950. V.40. No.2. P.356-366.

57. Маньковская И.Н. Содержание и распределение миоглобина в мышечной ткани черноморских дельфинов, // Журн. Эволюционной биохимии и физиологии. 1975. т. 11. № 3. с. 363-368

58. Wittenberg J.B., Wittenberg В.А. Review myoglobin function reassessed. // The Journal of Experimental Biology. 2003. Vol.206. P.2011-2020.

59. Millikan G. A. Muscle hemoglobin. // Physiol. Rev. 1939. Vol.19. P.503-523.

60. Wittenberg B.A. and Wittenberg J.B. Transport of oxygen in muscle. // Ann. Rev. Physiol. 1989. Vol.51. P.857-878.

61. Takahashi E. and Doi K. Impact of diffusional transport on oxidative metabolism in the heart. // Jap. J. Physiol. 1998. Vol.48. P.243-252.

62. Wyman J. Facilitated diffusion and the possible role of myoglobin as a transport mechanism. //J. Biol. Chem. 1966. Vol.241. P. 115-121.

63. Murray J.D. On the molecular mechanism of facilitated oxygen diffusion by haemoglobin and myoglobin. // Proc. R. Soc. Lond. B. 1971. Vol.178. P.95-110.

64. Ленинджер АЛ. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. Перевод под ред. А.А. Баева и Я.М. Варшавского. «Мир». М. 1976. с. 425-458.

65. Wagner P.D. Determinants of maximal oxygen transport and utilization. // Ann. Rev. Physiol. 1996. Vol.58. P.21-50.

66. Roughton F.J. Transport of oxygen and carbon dioxide // Handbook of physiology . Sect. 3. Respiration. Washington, 1964. Vol.1. P.767-825.

67. Верболович П. А. Миоглобин и его роль в физиологии и патологии животных и человекаю МЕДГИЗ. 1961. М. 214.С.

68. Douglas C.G., Haldane J.S. and Haldane. J.B.S. The laws of combination of hemoglobin with carbon monoxide and oxygen. // J. Physiol. London. 1912. Vol.44. P.275-104.

69. Roughton, F.J.W. The equilibrium of carbon monoxide with human hemoglobin in whole blood. //Ann. N.Y. Acad. Sri. 1970. Vol.174. P. 177-187.

70. Allen ТА, Root WS: Partition of carbon monoxide and oxygen between air and whole blood of rats, dogs and men as affected by plasma pH. // J Appl. Physiol. 1957. Vol.10. P. 186.

71. Физиология дыхания / Отв. ред. И.С. Бреслав и Г.Г. Исаев. СПб. Наука. 1994. 680 е., с.301-319.

72. Коваленко Е. А. О теории динамики кислорода в тканях. // В кн.: Кислородные режимы организма и его регулирование. Киев-Канаев. "Наукова думка". 1966. с. 167-186.

73. Байерман К., Определение следовых количеств органических веществ, Мир, М., 1987, 462 С.

74. Разников В.В., Разникова М.О., Информационно-аналитическая масс-спектрометрия, М: Наука, 1992, 247 С.

75. Arenas R.V., Carney K.R., Overton Е.В., Portable, Multigas Monitors for Air Quality Evaluation, Part 1, Principles of Detection, Am.Lab., 1992, Vol.24, pp. 17-28.

76. Stone R.T., Stevenson D.K., Vreman H.J., An Automated End-Tidal Carbon Monoxide (ETCOc) Analyzer for Infant Breath Analysis, Pediatr.Res., 1993, Vol.33, p.239-245.

77. Vreman H.J., Mahoney J.J., Stevenson D.K., Electrochemical Measurement of Carbon Monoxide in Breath: Interference by Hydrogen, Atmospheric Environ., 1993, Vol.27A, No. 14. P.2193-2198.

78. Vreman H.J., Stevenson D.K., Oh W., Semiportable Electrochemical Instrument for Determining Carbon Monoxide in Breath. // Clin.Chem. 1994. Vol.40. No.lO.P.1927-1933.

79. Miller J.B., Bokdam M., McVeagh P., Miller J.J., Variability of Breath Hydrogen Excreation in Breast-Fed Infants During the First Tree Months of Life. // J.Pediatr. 1992. Vol.121. P.410-413.

80. Metz G., Gassull M.A., Leeds A.R., Blendis L.M., Jenkins D.J.A., A Simple Method of Measuring Breath Hydrogen in Carbohydrate Malabsorption by End-Expiratory Sampling.// Clin.Sci.Mol.Med. 1976. Vol.50. P.237-240.

81. Lambert W.E., Colome S.D., Wojciechowski S.L., Application of End-Expired Breath Sampling to Estimate Carboxyhemoglobin Levels in Community Air Polution Exposure Assessments. // Atmospheric Environ. 1988. Vol.22. P.2171-2188.

82. DeVries H.S.M., Harren F.J.M., Wyers G.P., Otjes R.P., Slanina J., Reuss J., Non-Intrusive, Fast and Sensitive Ammonia Detection by Laser Photothermal Deflection. //Atmospheric Environment. 1995. Vol.29, No.10. P.1069-1074.

83. DeVries H.S.M., Harren F.J.M., Reuss J., The Photothermal Deflection Technique (PDT); Fast Trace Gas Detection in the Atmosphere, In Springer Series in Optical Science, Springer. // Heidelberg. 1992. Vol.69, (edited by Bicanic D.D.). P.12-15.

84. Meyer P.L., Sigrist M.W., Atmospheric Pollution Monitoring Using C02 Laser Photoacoustic Spectroscopy and Other Techniques. // Rev.Scient.Instrum. 1990, Vol.61. P.1779-1807.

85. Harren F., Reuss J., Spectroscopy, Photoacoustic, in "Encycl. of Appl.Phys.", edited by G.L.Trigg, VCH. // Weinheim. 1997. Vol.19. P.413-435.

86. Zuckermann H., Harren F.J.M., Reuss J., Parker D.H., Dynamic of Acetalde-hyde Production during Anoxia and Post-Anoxia in Red Bell Paper Studied by Photoacoustic Techniques. // Plant.Physiol. 1997. Vol.113. P.925-932.

87. Bijnen F.G.C., Harren F.J.M., Hackestein J.H.P., Reuss J., Intracavity CO Laser Photoacoustic Trace Gas Detection: Cyclic CH4, H20, and C02 Emission by Cocroaches and Scarab Beetles. //Appl.Opt. 1996. Vol.35. P.5357-5368.

88. Preier H., Physics and Applications of IV-VI Compound Semiconductor Lasers. // Semicond. Sci. Technol. 1990, Vol.5. P.S12-S20

89. Tunable Diode Laser Applications, A.I.Nadezhdinskii, A.M.Prokhorov, Editors, Proc. SPIE, Vol. 1724, 1992, 275 p.

90. Степанов E.B., Лазерная спектроскопия и анализ микрокомпонентов выдыхаемого воздуха: Дис. . докт. физ-мат. наук, М., 2003. 293 С.

91. Carlisle С.В., Cooper D.E., Prier Н., Quantum Noise-Limited FM Spectroscopy with a Lead-Salt Diode Laser. //Appl.Opt. 1989. Vol.28. P.2567-2576.

92. Fried A., Drummond J.R., Henry В., Fox J., Versatile Integrated Tunable Diode System for High Presision: Application for Ambient Measurements of OCS //Appl.Opt. 1991. Vol.30. P. 1916-1932.

93. Werle P., Tunable Diode Laser Absorption Spectroscopy: Recent Findings and Novel Approaches. // Infr.Phys.Techn. 1996. Vol.37. No.l. P.59-66.

94. E.V.Stepanov, K.L.Moskalenko, Gas Analysis of Human Exhalation byTun-able Diode Laser Spectroscopy. // Optical Engineering. 1993. Vol.32. No.2. P.361-367.

95. Е.В.Степанов, В.А.Миляев, Ю.Г.Селиванов, Лазерная ортомолекулярная медицинская диагностика. //Успехи физических наук. 2000. том.170. №4. с. 458-462.

96. Степанов E.B., Лазерный анализ изотопического отношения углерода 13С/12С в С02 выдыхаемого воздуха. // Квантовая электроника. 2002. т.32. №11. с.981-986.

97. Тиунов Л.А., Кустов В.В., Токсикология окиси углерода, Изд.2-е, доп. и пер., М. 1980.288 с.

98. Coburn R.F, Williams W.J, Kahp S.B, Endogenous carbon monoxide production in patients with hemolytic anemia. // J.Clin.Invest. 1966. Vol.45. No.4. P.460-468.

99. Колосова T.C., Тиунов Л.А. Влияние гипоксии на выделение некоторых газообразных продуктов жизнедеятельности у белых крыс. // Космическая биология и медицина. 1973. №.3. С. 17-21.

100. Bensinger Т.А., Brouillard R.P. and Conrad M.E. Endogenous production of carbon monoxide as measured simultaneously in blood and gas phase. // Br J Haematol 1975. Vol.29. No.3. P.487-494.

101. Rodkey F.L. Biological oxidation of 14C-methylene chloride to carbon monox-ide and carbon dioxide by the rat. // Toxicol Appl Pharmacol. 1977. Vol.40. No.l.P.33-38.

102. Vreman H.J., Mahoney, D.K.Stevenson, Carbon Monoxide and Carboxyhe-moglobin. //Adv.Pediatrics. 1995. Vol.42. P.303-334

103. Berlin N.I., Carbon Monoxide Production: A Tool for Assessing Antihemo-lytic Therapy. //J.Lab.Clin.Med. 1992. Vol.120. P.361-362.

104. Stevenson D.K., Vreman H.J., Carbon Monoxide and Bilirubin Production in Neonates. // Pediatrics. 1997. Vol.100. No.2. P.252-254.

105. Yamaya M., Sekizawa K., Ishizuka S., Monma M., Mizuta K., Sasaki H., Increased Carbon Monoxide in Exhaled Air of Subjects with Upper Respiratory Tract Infections. //Am.J.Respir.Crit.Care.Med. 1998. Vol.158. No.l. P.311-314.

106. Zayasu K., Sekizawa K., Okinaga S., Yamaya M., Ohrui Т., Sasaki H., Increased Carbon Monoxide in Exhaled Air of Asthmatic Patients. // Am.J.Respir.Crit.Care.Med. 1997. Vol.156. No.4. Pt.l. P.l 140-1143.

107. American Thoracic Society. Single-breath carbon monoxide diffusing capacity (transfer factor). Recommendations for a standard technique-1995 update. //Am J Respir Crit Care Med. 1995. Vol.152. P.2185-2198.

108. Шулагин Ю.А., Степанов E.B., Чучалин А.Г., Бабарсков Е.В., Дьяченко А.И., Павлов Б.Н., Лазерный анализ эндогенного СО в выдыхаемом воздухе, Труды ИОФАН, М. Наука, 2005, т.61, с.135-188.

109. Coburn, R.F., R.E. Forster, and Р.В. Kane. Considerations of the physiological variables that determine the blood carboxyhemoglobin concentration in man. //J. Clin. Invest. 1965. V.44. P.l 899-1910

110. Foster R. E. Exchange of gases between alveolar air and pulmonary capillary blood: pulmonary diffusing capacity // Physiol.Rev. 1957. V.37. P. 391.

111. Коваленко E.A. О теории динамики газов в организме. В кн.: Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М. «Наука», 1973, с. 192-212.

112. Кузнецов А.И., Логачев А.П., Степанов Е.В. Анализ выдыхаемого человеком воздуха методами диодной лазерной спектроскопии // Известия АН СССР. 1990. №10. С.1909-1914.

113. Stepanov E.V., Moskalenko K.L. Gas Analysis of Human Exhalation by Tunable Diode Laser Spectroscopy // Optical Engineering. 1993. Vol.32. No.2. P.361-367.

114. Степанов E.B., Миляев B.A. Применение перестраиваемых диодных лазеров для высокочувствительного анализа газообрзных биомаркеров в выдыхаемом воздухе // Квантовая электроника. 2002. Т.32. №11. С.987-992.

115. Шотов А.П. Физические исследования узкозонных полупроводников и разработка инфракрасных перстраиваемых диодных лазеров // Вестник Академии Наук СССР. 1986. No.6. С.3-9.

116. Зырянов П.В., Кузнецов А.И., Степанов Е.В., Глушко А.Н., Автоматизированная система управления для диодной лазерной спектроскопии и ее аналитических приложений // Труды ИОФАН. М.: Наука. 2005, т.61, с.79-106.

117. Шкундин C.3., Лашин В.Б. Фазовый способ акустической анемометрии // Метрология. 1990. № 7. с.39-43

118. Шулагин Ю.А., А.И.Дьяченко, Б.Н.Павлов, Влияние аргона на потребление кислорода человеком при физической нагрузке в условиях гипоксии, // Физиология человека. 2001. том 27. № 1. С. 147-154

119. Stepanov E.V., Kouznetsov A.I., Shulagin Yu.A., Skrupskii V.A. Endogenous CO Dynamics Monitoring in Breath by Tunable Diode Lasers // Proc. SPIE "Laser Diodes and Applications II". 1996. Vol.2682. P.247-256.

120. Скрупский B.A., Степанов E.B., Шулагин Ю.А. Мониторинг выделения эндогенной окиси углерода с выдыхаемым воздухом у крыс при гипе-роксии // Журнал авиакосмической и экологической медицины. 1995. №1. С.49-53.

121. Kouznetsov A.I., Stepanov E.V., Zyrianov P.V., Shulagin Y.A., Diachenko A.I., Gurfinkel Y.I. Monitoring of rapid blood pFI variations by CO detection in breath with tunable diode laser // Proc. SPIE. 1997. Vol.2976. P.88-95.

122. Mercke С., Carallin-Stahl Е., Lund В. Diurnal Variations in Endogenous Production of Carbon Monoxide // Acta.Med.Scan. 1975. Vol. 198. P. 161 -164.

123. Lambertsen C.J. The compressed gas atmosphere. Oxigen toxicity. Physiological effects // In: Fundamentals of hyperbaric medicin. Washington. 1966. P. 3-29.

124. Кисляков Ю.Я., Бреслав И.С. Дыхание, динамика газов и работоспособность при гипербарии. JL: Наука. 1988. С.86-116.

125. Babarskov E.V., Shulagin Yu.A., Stepanov E.V., Cherniak V., Aisanov Z.R. Exhaled CO Measurement for Detection of Lang Diffusion Disturbances // Eur.Resp.Journ. 2003. Vol.22. Suppl.45. P.1819.

126. Павлов Б.Н, Дьяченко A.M., Шулагин Ю.А. и сотр. Исследования физиологических эффектов дыхания подогретыми кислородно-гелиевыми смесями. // Физиология человека. 2003. том 29. № 5. С. 69-73.

127. Avdeev S.N., Shulagin Yu.A., Avdeeva O.E., Stepanov E.V., Cherniak A.V., Chuchalin A.G. Exhaled carbon monoxide is decreased in interstitial lung diseases (ILD) // Eur.Resp.Journ. 2001. V.18. Supplement 33. P.195S.

128. Foster R.E. Exchange of gases between alveolar air and pulmonary capillary blood: pulmonary diffusing capacity // Physiol.Rev. 1957. V.37. P. 391.

129. Coburn R.F., Brakemore W., Forster R. Endogenous carbon monoxide production in man // J.Clin.Invest. 1963. V.42. N.7. P. 1172-1178.

130. Коваленко E.A., Черняков И.Н. Кислород тканей при экстремальных факторах полета// Проблемы космической биологии. Т.21. М.: Наука. 1972.

131. В. J. Clark and R. F. Coburn Mean myoglobin oxygen tension during exercise at maximal oxygen uptake //J of Appl. Physiol. 1975. V.39. N.l. P.135-144.

132. Gnaiger E., Lassnig В., Kuznetsov A., Rieger G. and Margreiter R. Mitochondrial oxygen affinity, respiratory flux control and excess capacity of cytochrome с oxidase // Journ.Experiment.Biology. 1998. No.201, P. 11291139.

133. Прудников А.П., Брычков Ю.А., Маричев О.И. Интегралы и ряды. М.: Наука. 1981.798 с.