Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Исследование взаимодействия мультипотентных мезенхимных стволовых клеток с опухолями методами флуоресцентного имиджинга

на правах рукописи

МЕЛЕШИНА АЛЕКСАНДРА ВИКТОРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ОПУХОЛЯМИ МЕТОДАМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИМИДЖИНГА

<^4,01.12 - онкология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 ь СЕН 2014

Санкт-Петербург - 2014

005552636

005552636

Работа выполнена на кафедре биомедицины Нижегородского государственного университета имени Н. И. Лобачевского

Научный руководитель: доктор медицинских наук, Загайнова Елена Вадимовна

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» Министерства образования и науки Российской Федерации, заведующая кафедрой биомедицины биологического факультета

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Орлова Рашнда Вахндовна

ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Правительства Российской Федерации, заведующая кафедрой онкологии

доктор биологичеких наук, профессор Комов Вадим Петрович Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, профессор кафедры биохимии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина" Российской академии медицинских наук, г. Москва

Защита состоится «_»_2014 г. в_часов_мин. на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68, тел.: (812)4399554, Эл.почта: oncll@rion.spb.ru).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68, и на сайте: www.niioncologii.ni

Автореферат разослан « »_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук

Бахидзе Елена Вилльевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время изучение роли стволовых клеток (СК) в развитии онкологических заболеваний идет по двум направлениям: фундаментальная наука исследует клеточную пластичность и генетические механизмы процесса, прикладная — возможности использования СК при лечении и профилактике онкозаболеваний. Стволовые и прогениторные клетки различного происхождения играют важную роль в развитии опухоли. Особенно интересны в этом отношении мультипогентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), которые могут быть получены из костного мозга, жировой ткани, скелетной мускулатуры, периферической и пуповинной крови, синовиальной оболочки суставов. Считается, что ММСК способны мигрировать в опухоль подобно тому, как они мигрируют в поврежденные ткани. Привлечение ММСК в опухоль было продемонстрировано в ряде исследований (Niess et al, 2011, Kéramidas et al., 2013, Yang et al., 2013). Наиболее вероятным механизмом привлечения и участия ММСК в канцерогенезе считается мобилизация их из ниш и распределение в опухоль в ответ на действие хемотаксических агентов, продуцируемых опухолевыми клетками. На различных экспериментальных моделях показано, что, с одной стороны, привлеченные СК способствуют развитию опухоли, участвуют в создании ниши для поддержания роста и жизнедеятельности опухолевых клеток, в образовании метастазов (GalcLerísi et al., 2010). С другой стороны, данные исследований других авторов свидетельствуют о том, что СК способны замедлять рост опухолей. Механизмы, лежащие в основе антипролиферативных и/или цитодифференцирующих свойств СК, по-видимому, связаны с подавлением регуляции Aid, NFkB и Wnt сигнальных путей (Loebinger, Janes, 2010). Таким образом, роль СК в онкогенезе остается предметом активных исследований. Новые знания важны как для понимания механизмов поддержания неопластического роста, так и поиска новых подходов к его ингибированию.

Для изучения участия СК в опухолевом росте и распределения в организме реципиента традиционно используют методы ex vivo — полимеразную цепную реакцию, проточную цитометрию, иммуногистохимический анализ, in situ гибридизацию. Однако в последнее время все шире используют методы высокоразрешающей визуализации (имиджинга) in vivo. Высокоразрешающий имиджинг позволяет контролировать поведение одной клетки с возможностью визуализации в живом организме (Weissleder, Mahmood, 2001). В современных биомедицинских исследованиях все чаще используют флуоресцентный имиджинг для высокоразрешающей визуализации. Этот метод становится особенно важным при изучении миграции СК и их последующей дифференцировки/пролиферации как на уровне целого организма, так и на субклеточном уровне. Для данного метода применяют особые контрастирующие агенты: флуоресцентные краски и белки, биолюминесцентные конструкты. На уровне целого организма используют установки для молекулярного флуоресцентного биоимиджинга, позволяющие получить информацию о распределении клеточных популяций in vivo, в режиме реального времени и отследить динамику изменений патологического процесса (Gao et al., 2013). При исследовании субклеточного распределения флуоресцирующих веществ эндогенного и экзогенного происхождения in vitro наиболее информативным является метод конфокальной лазерной

сканирующей микроскопии (Saton et al., 2008; Hogan et al.. 2009). Пространственное разрешение лазерной сканирующей микроскопии позволяет строить полноценные трехмерные изображения оптически прозрачных флуоресцирующих объектов (культур клеток), а также наблюдать структуру образцов биотканей на глубину до 500 мкм. Методика лазерной сканирующей микроскопии демонстрирует высокую чувствительность при визуализации структур, меченных цветными флуоресцирующими белками.

В связи с этим изучение участия СК в патогенезе опухолевого роста методами флуоресцентного биомиджинга представляет собой актуальную современную проблему.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — исследовать влияние мультипотентных мезенхимных стромальных клеток на развитие опухолей методами флуоресцентного биоимиджинга на уровне целого организма in vivo и субклеточной организации ex vivo.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить, охарактеризовать и получить линии стромальных клеток жировой ткани человека (СЬСЖТ), трансфицированных красным флуоресцентным белком Turbo FP635 (СКЖТ-ТигЬо FP635) и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека, трансфицированных геном люциферазы luc2 (ММСК-1ис2); выделить и охарактеризовать мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга GFP+ трансгенных мышей (ММСК- GFP+).

2. Исследовать влияние СКЖТ-ТигЬо FP635 на перевиваемый рак шейки матки, а также изучить распределение СКЖТ-ТигЬо FP635 в организме реципиента методами флуоресцентного имиджинга in vivo и лазерной сканирующей микроскопии.

3. Изучить влияние MMCK-GFP(+) на перевиваемую карциному легкого Льюис, распределение MMCK-GFP(+) в организме реципиента методами проточной цитометрии и лазерной сканирующей микроскопии.

4. Исследовать влияние ММСК-1ис2 на ортотопически перевитую и метастазирующую аденокарциному молочной железы методами двойного флуоресцентного и биолюминесцентного имиджинга in vivo и иммуногистохимического анализа. Проанализировать распределение MMCK-luc2 в организме реципиента.

Научная новизна

Впервые прослежено влияние СКЖТ-ТигЬо1'Р635 на развитие перевиваемого рака шейки матки в иммунодефицитных мышах методом флуоресцентного имиджинга и лазерной сканирующей микроскопии. In vivo (методом флуоресцентного имиджинга) идентифицировано распределение СКЖТ-ТигЬоРР635 в селезенке при системном введении. Методом лазерной сканирующей микроскопии выявлено накопление COCT-TurboFP635 на субклеточном уровне в костном мозге, легких и опухоли реципиента при внутривенном и локальном введении.

Впервые методами лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитометрии установлено, что при внутривенном введении исследуемые MMCK-GFP(+) отсутствуют в костном мозге и перевиваемой карциноме легкого Льюис у иммунокомпетентных мышей, но способны накапливаться в потенциальных нишах реципиента (селезенка, печень).

Впервые с использованием двойного (флуоресцентного и биолюминесцентного) имиджинга на модели ортотопически перевитой и метастазирующей аденокарциномы молочной железы человека у иммунодефицитных мышей определено, что ММСК-1ис2 при внутривенном или локальном введении определяются в легких, органах брюшной полости и опухоли. При внутривенном введении ММСК-1ис2 ингибируют формирование метастазов, а при локальном введении - не влияют на рост опухоли.

Научно-практическая значимость

Разработан научно-методический подход к прижизненному и динамическому исследованию влияния на злокачественную пролиферацию CK различного происхождения, несущих в качестве генетических меток различные контрастирующие агенты. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для уточнения механизмов пролиферации и цитодифференцировки под влиянием CK в условиях in vivo. Результаты работы могут быть использованы в научно-исследовательской работе профильных федеральных и региональных НИИ и отдельных лабораторий для улучшения результативности имиджинга клеток. Отдельные положения могут использоваться в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам «Экспериментальная онкология», «Клеточная биология», «Клеточная иммунология» студентам биологических и медицинских специальностей и слушателям курсов повышения квалификации в рамках перечисленных дисциплин.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология» (Москва, 2012), где отмечена грамотой за лучший доклад-16 -й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2012), где отмечена грамотой за лучший доклад; XI всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты (экспериментальная онкология)» (Нижний Новгород, 2012); V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2012); 17-й Сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2012); IV Съезде биофизиков России. Симпозиум III «Физика - медицине и экологии» (Нижний Новгород, 2012); SPIE Photonics West 2013 (США, 2013); 38th FEBS congress «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 2013); IV International Symposium «Topical problems of Biophotonics-2013» (Нижний Новгород, 2013); V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013); Форуме молодых ученых (Нижний Новгород, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК РФ - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 10.

Личное участие автора

Анализ литературы, планирование работы, сбор материала, отработка методик, постановка и выполнение экспериментов, обработка и интерпретация результатов выполнены непосредственно автором. Автор лично участвовал в апробации результатов исследования, подготовке и написании основных публикаций по выполненной работе.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах, включает 4 таблицы и 22 рисунка. Список литературы содержит 176 источников, из них 167 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Лабораторные животные. Эксперименты выполнены на иммунодефицитных мышах-самках линии nu/nu, GFP(+) трансгенных иммунокомпетентных мышах-самцах линии С57В16 и

обычных мышах-самцах линии С57В16. Все работы с лабораторными животными проводили в соответствии со следующими нормативными документами: 1. Правила лабораторной практики МЗиСР РФ от 23 августа 2010 г. № 708н. 2. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенных в "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей", ЕЭС, Страсбург, 1985 г. (Ланималогия, 1993, 1, с.29). 3. Требования Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000 г.) (Большаков О.П., Незнанов Н.Г., Бабаханян Р.В. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животныхУ/Ж. Качественная клиническая практика.-2002 г. - 1). 4. Рекомендации, содержащиеся в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министра здравоохранения СССР 755 от 12.08.1977 и Приказ Минсельхоза РФ 490 от 05.11.2008 "Об утверждении правил проведения лабораторных исследований в области ветеринарии".

Клеточные культуры.

1) 2 линии стволовых клеток человека: мезенхимные стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ), стабильно экспрессирующие ген красного флуоресцентного белка Turbo FP635 и мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга (ММСК) (ИБР РАН им. Н.К. Кольцова, г. Москва);

2) первичная культура мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (ММСК) GFP(+) трансгенных мышей линии C57BÎ6;

3) 2 линии клеток опухолей человека: аденокарцинома молочной железы MDA-МВ-231, меченая красным флуоресцентным белком Turbo FP650 (University of Michigan Medical School, Michigan, USA) и рак шейки матки Hela kyoto (ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва);

4) перевиваемая эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC.) из коллекции ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН (г. Москва).

Опухолевые модели. Были использованы 3 опухолевые модели:

1. перевиваемые опухоли:

- опухолевые клетки Heia Kyoto трансплантировали подкожно на левое бедро мышей линии nu/nu;

- эпидермоидную карциному легкого Льюис трансплантировали подкожно в область левого бедра мышам линии С57В16 и СРР(+)трансгенным мышам линии С57/В16;

2. ортотопически перевитая опухоль с метастазами в легкие:

- опухолевые клетки MDA-MB-231-Turbo FP650 инъецировали в область жировой подушки (на уровне брюшного соска) мышам линии nu/nu;

3. метастазирующая опухоль:

- опухолевые клетки MDA-MB-231-Turbo FP650 инъецировали внутривенно в хвостовую вену мышам линии nu/nu.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование стволовых клеток. СЮКТ и ММСК человека, ММСК-GFP(+) мыши были получены и культивированы по стандартным методикам (Zuk et al., 2001; Soleimani, Nadri, 2009). Для определения маркеров мезенхимных стволовых клеток проводили иммуноцитохимический анализ. СКЖТ 2-го пассажа трансфицировали геном красного флуоресцентного белка Turbo FP635, ММСК - геном люциферазы 1ис2.

Иммуноцитохимический анализ проводили с помощью проточного цитометра Cell Lab Quanta SC (Beckman Coulter, США). Для характеристики использовали стандартный для мезенхимных СК набор иммунофенотипических маркеров: CD34, CD45, HLA-DR-маркеры кроветворных клеток, CD105, CD44, CD54, CD73, CD90- маркеры мезенхимных СК.

Траисфекция и получение стабильной клеточной линии ММСК-1ис2. Для получения стабильной линии меченых мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга ММСК-1ис2 использовали технологию лентивирусной трансфекции. Плазмида pluc2-N и лентивирусный вектор pLVT-1 были предоставлены лабораторией молекулярных технологий (ИБХ РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва).

Проточную цитометрию осуществляли с помощью проточного цитометра FACS Calibur (BD, США) возбуждением флуоресценции (для идентификации флуоресценции GFP 488/506) лазером с длиной волны 488 нм и регистрацией сигнала в диапазоне длин волн 515-545 нм.

Флуоресцентный имиджинг in vivo проводили на установке для поверхностного флуоресцентного имиджинга (ИПФ РАН, г. Н. Новгород) и установке IVIS-Spectrum (Caliper Life Sciences, США).

Перед проведением измерений на установке для поверхностного флуоресцентного имиджинга животных наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией Золетила в концентрации 20 мг/мл и горизонтально фиксировали на подставке. В ходе измерений животное помещали в «черную» камеру и освещали широким световым пучком в узком спектральном диапазоне (для возбуждения флуоресценции белка Turbo FP635 использовали излучение на длине волны 585 нм с полосой 20 нм). Флуоресценцию, возбужденную на поверхности животного, регистрировали охлаждаемой CDD-камерой. Разделение флуоресценции и зондирующего излучения осуществляли интерференционным фильтром с полосой пропускания 628-672 нм. Время экспозиции CDD-камеры составляло 2 с. Для флуоресцентного имиджинга ш vivo на установке IVIS-Spectrum животных предварительно наркотизировали 2,5% изофлураном. Флуоресценцию белка Turbo FP650 возбуждали на длине волны 605 нм, принимали на 660 нм при экспозиции 5 с.

Сразу после умерщвления мышей методом дислокации шейного позвонка выполняли анализ флуоресценции ex vivo во всех органах. При количественном анализе сигнала флуоресценции в программе Living Image 4.2. определяли суммарную интенсивность флуоресценции и усредненную по ее площади.

Биолюминесцентные изображения in vivo и in vitro получали на установке IVIS-Spectrum. Для измерения биолюминесцентного сигнала in vitro клетки MMCK-luc2 вносили в 96-луночный планшет в количестве 20 ООО клеток на лунку с серией разведений 1:2. D-люциферин добавляли в концентрации 150 мкг/мл. Измерения проводили в динамике до тех пор, пока сигнал не выходил на плато. D-люциферин вводили внутрибрюшинно в дозе 150 мг/кг. Изображения получали спустя 3 мин после введения субстрата серийно, каждые 2 мин, в течение 20 мин. Сразу после умерщвления выполняли анализ биолюминесценции во всех органах ex vivo. Сигнал биолюминесценции количественно обрабатывали в программе Living Image 4.2.

Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию проводили на установке JICM (LSM 510 МЕТА 23, Carl Zeiss, Германия) на основе моторизованного инвертированного микроскопа (Axiovert 200М), оснащенной спектральным модулем для детектирования спектров эпифлуоресценции в видимом диапазоне с разрешением 10 нм. Регистрацию флуоресцентных изображений осуществляли при однофотонном возбуждении аргоновым лазером на длине волны 488 нм (для возбуждения флуоресценции GFP) мощностью 1-2 мВт на образце и на длине волны 543 нм (для возбуждения флуоресценции Turbo FP635) мощностью 12 мкВт на образце. Для идентификации флуоресценции GFP (488/506) регистрировали спектры флуоресценции в интервале 490-600 нм, для Turbo FP635 (588/635) в интервале 597-694 нм. Изображения, полученные на конфокальном микроскопе, обрабатывали в компьютерной программе Zeiss LSM Image browser (version 4.0.0.91).

Гистологические препараты исследуемых органов готовили по стандартной методике с окраской гематоксилином и эозином (Саркисов, Перов, 1996). Иммуногистохимический анализ исследуемых тканей проводили с использованием первичных антител Firefly Luciferase Antibody (fíLuc) (LSBio, Германия). Для детектирования первичных антител использовали ImmPress Reagent Anti-Rabbit Ig Peroxidase (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Визуализацию осуществляли с помощью микроскопа Х71 Olympus (Япония).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных пакетов Microsoft Excel 2010 и Statistica 6.0. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Оценку результатов проводили также с применением методов непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически достоверными, если уровень значимости был р<0,05.

Схемы экспериментов.

1. Изучение влияния СКЖТ-Turbo FP63S на перевиваемый рак шейки матки в иммунодефицитных мышах. Введение СКЖТ-Turbo FP635 на ранних стадиях роста рака шейки матки осуществляли для проверки участия СКЖТ-Turbo FP635 в создании неопластической сосудистой сети и стромы опухоли (локальное введение - для моделирования взаимодействия тканеспецифичных CK с опухолью в области формирования узла, внутривенное - для моделирования взаимодействия опухоли с CK, мигрирующими из других ниш). На стадии сформированной опухоли (зрелая система кровообращения и строма) СКЖТ-Turbo FP635 вводили для проверки влияния их на дальнейшее развитие опухоли: усиление роста, инвазия и образование метастазов. Помимо

б

этого изучали распределение СКЖТ-ïurbo FP635 по органам животных (костный мозг, легкие, селезенка, печень, почки).

СКЖТ-ТигЬо FP635 (1,5x106) вводили мышам линии nu/nu на разных стадиях роста рака шейки матки - одновременно с трансплантацией опухолевых клеток (0 день) и через 8 дней после трансплантации опухолевых клеток. СКЖТ-Turbo FP635 вводили локально (в сайт имплантации опухолевых клеток) и внутривенно (в хвостовую вену) (рис. 1). Контролем служили животные с привитой опухолью без введения СКЖТ-ТигЬо FP635 (п=3).

Рис. 1. Схема эксперимента. Группы животных: 1. ранняя стадия роста опухоли (0 дней) и внутривенное введение СКЖТ-Turbo FP635 (п=3); 2. ранняя стадия роста опухоли и локальное введение СКЖТ-Turbo FP635 (п=3); 3. стадия сформированной опухоли (8 дней) и внутривенное введение СКЖТ-ТигЬо FP635 (п=3).

2.Изучение влияния ММСК-СЕР(+) на перевиваемую карциному легкого Льюис у иммунокомпетентных мышей.

Изучали возможность трансплантированных ММСК от йРР(+) трансгенных мышей замещать собственные ММСК линейных мышей, не несущих ген йРР, для наблюдения роста эпидермоидной карциномы легкого Льюис под влиянием ММСК-ОРР(+). Кроме того изучали распределение ММСК-ОРР(+) по органам животных (костный мозг, легкие, селезенка, печень).

ММСК-вРР(+) были трансплантированы мышам линии С57/В16. Для эффективного замещения собственных ММСК на ММСК-СРР(+) проводили предварительную миелоабляцию облучением. Облучение лабораторных животных мышей линии С57/В16 проводили с помощью излучателя РУМ17 с фильтром Си05+1А1 (ИБР РАН им. Н.К. Кольцова, г. Москва). Величина поглощенной дозы - 5Гр. На следующие сутки после миелоабляции животным прививали эпидермоидную карциному легкого Льюис и внутривенно трансплантировали смесь клеток ММСК-ОРР(+) (1x106) и ОРР(-) костномозговых гемопоэтических клеток (Iх 10), необходимых для репопуляции костного мозга реципиента и поддержки кроветворения (рис. 2).

3.Изучение влияния ММСК-1ис2 на ортотопически перевитую и метастазирующую аденокарциному молочной железы у иммунодефицитных мышей.

Возможность ММСК-1ис2 способствовать росту ортотопически перевитой аденокарциномы молочной железы и развитию метастазов изучали при локальном введении ММСК-1ис2 (в сайт формирующейся ортотопически перевитой опухоли).

Влияние ММСК-1ис2 на метастатический потенциал опухолевых клеток изучали при внутривенном введении ММСК-1ис2 (в хвостовую вену) животным

с метастазирующей аденокарциномой молочной железы. Помимо этого внимание уделяли распределению ММСК-1ис2 как по областям формирующихся опухолей и метастатических очагов, так и по органам животных (легкие, селезенка, печень, почки).

ММСК-1ис2 в количестве 1хЮ6 вводили внутривенно мышам линии пи/пи с метастазирующей опухолью на 10 день после трансплантации опухолевых клеток. ММСК-1ис2 в количестве 0,5x106 вводили локально животным с ортотопически перевитой опухолью на 13-й и 15-й дни после трансплантации опухолевых клеток (рис. 3). Контролем служили животные с метастазирующей опухолью без введения ММСК- 1ис2 (п=5) и животные без введения каких-либо клеток (п=3).

овя>ч»н»«

V _____...

Рис. 2. Схема эксперимента. Группы животных: 1 (опытная) - облученные животные: прививка опухоли и трансплантация костномозговых клеток (п = 12); 2 (контрольная) - необлученные животные: прививка опухоли, но без введения каких-либо клеток (п = 3).

С?- Ф

»пцдермадаоА кэрцмиомы лепюго Лыомс

Момфомльнм /»ирмак Проточки цитомегрм«

Рис. 3. Схема эксперимента. Группы животных: 1) животные с метастазирующей опухолью без введения ММСК- 1ис2 (п=5) 2) животные с метастазирующей опухолью и внутривенным введением ММСК-1ис2 (п=4) 3) животные с ортотопически перевитой опухолью и локальным введением ММСК- 1ис2 (п=4).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение влияния СКЖТ-ТигЬо FP635 на перевиваемый рак шейки матки в иммунодефицитных мышах.

Клеточная культура. СКЖТ были выделены и охарактеризованы. Показано, что СКЖТ имеют фенотип мезенхимных СК (экспрессируют маркеры мезенхимных СК - CD 105, CD90, CD73, CD 44, CD 54, не экспрессируют маркеры кроветворных клеток - CD 34, CD45, HLA-DR). Для трансфекции использовали СКЖТ 2-го пассажа. Эффективность трансфекции СКЖТ геном красного флуоресцентного белка Turbo FP635 составила 75%.

Динамика изменений роста опухолей. Экспериментальным животным разными способами и на разный срок вводили СКЖТ-ТигЬо FP635. После измерения линейного размера опухолей и полученных данных флуоресцентного имиджинга стало ясно, что экзогенное введение СКЖТ-ТигЬо FP635 существенно не влияет на рост опухолей.

жепыы

«s ^

Мониторинг распределения СЮКТ-ТигЪо FP635 методом поверхностного флуоресцентного in vivo имиджинга. В контрольной группе животных (с привитой опухолью без введения СКЖТ-ТигЬо FP635) в процессе всего наблюдения роста опухолей не наблюдали локальной флуоресценции ни в области опухолевого узла, ни в органах-нишах. Динамику накопления СКЖТ-Turbo FP635 в опухоли и органах ш vivo отслеживали по наличию красной флуоресценции.

В первой группе (ранняя стадия роста опухоли и внутривенное введение СКЖТ-ТигЬо FP635) скопление СКЖТ-ТигЬо FP635 отмечено у всех животных в области селезенки. Флуоресценция в области селезенки была детектирована на 9 сутки и сохранялась до 14 суток (рис. 4А). В опухолях этой группы животных данным методом скопления СКЖТ-ТигЬо FP635 не обнаружено.

Во второй группе животных (ранняя стадия роста опухоли и локальное введение СКЖТ-ТигЬо FP635) была видна флуоресценция в месте инъекции клеток, которая постепенно затухала и к 3 суткам не визуализировалась совсем. Локального скопления СКЖТ-ТигЬо FP635 не выявлено, время наблюдения составило 14 суток (рис. 4Б).

В третьей группе животных (сформированная опухоль и внутривенное введение СКЖТ-ТигЬо FP635) на 5 сутки было детектировано скопление СКЖТ-ТигЬо FP635 в области селезенки. Отмечали нарастание флуоресценции в последующие дни (вплоть до 10 суток) аналогично первой группе. Локальных скоплений СКЖТ-ТигЬо FP635 в опухолевом узле и других органах выявлено не было.

Мхш « е,1

Л ^ V k Â

> i Ч X щ 1 4 Ш m

о,-, V цщ % m

I

Í

yfy'

M СЯ

II

Рис. 4. Мониторинг распределения СКЖТ-ТигЬо FP635 методом поверхностного флуоресцентного имиджинга: А - первая группа (ранняя стадия роста опухоли, системное введение СКЖТ-ТигЬо FP635). Сплошной линией указано место инъекции опухолевых клеток, пунктирной - место инъекции СКЖТ-ТигЬо FP635, стрелками - локализация СКЖТ-Turbo FP635; Б - вторая группа (ранняя стадия роста опухоли, локальное введение СКЖТ-Turbo FP635). Квадратом указано место инъекции опухолевых клеток, пунктирной линией -место инъекции СКЖТ-Turbo FP635, пунктирной стрелкой - флуоресценция места инъекции СКЖТ-ТигЬо FP635.

Мониторинг распределения СКЖТ-ТигЬо FP635 методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ). Для верификации результатов, полученных методом поверхностного флуоресцентного имиджинга in vivo, был использован метод ЛСМ.

Для получения контрольного спектра белка Turbo FP635 на установке ЛСМ анализировали спектральные характеристики культуры СКЖТ, экспрессирующей этот белок, для дальнейшего сравнения со спектрами тканей исследуемых органов (рис. 5А). Спектр очищенного плазмидного белка имел максимум флуоресценции при 635 нм (Shcherbo et al., 2007), однако спектр клеток, трансфицированных генным вектором этого белка, при возбуждении на

длине волны 543 нм имел два выраженных пика: на 613 нм и 635 нм (рис. 5Б). Появление дополнительного пика, вероятно, могло быть связано либо с мутацией белка при культивировании СКЖТ-ТигЬо РР635, либо с наложением спектров клеточных автофлуорофоров.

Рис. 5. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия СКЖТ-Turbo FP635. А - флуоресцентное изображение клеток

(возбуждение

флуоресценции 543 нм, регистрация 650-710 нм); Б - соответствующий им спектр флуоресценции в диапазоне 597-694 нм, увеличение 40х.

!..

i«u>Mmf<n<nnmm ■

В контрольной группе была оценена интенсивность собственной флуоресценции органов и опухоли при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 543 нм. Выявлено, что в коже, мышцах, сердце, мозге, легких и кишечнике автофлуоресценция в данной области спектра крайне низкая. В опухоли также не было обнаружено фоновой флуоресценции.

Вместе с тем, в селезенке, почках и печени автофлуоресценция выражена (рис. 6), но спектральные характеристики тканей органов отличаются от спектра СКЖТ-ТигЬо FP635 и не имеют 2-х заметных пиков на 613 нм и 635 нм (рис. 7). Вероятно, это связано с присутствием большого количества эндогенных порфириновых структур, максимум возбуждения которых лежит в районе 400 - 500 нм, а спектр эмиссии имеет два пика - 635 нм и 690 нм.

Наличие СКЖТ-ТигЬо FP635 в органах анализировали по визуализации клеточных скоплений с флуоресценцией и спектром, соответствующим флуоресценции Turbo FP635.

В опытных группах, где животным вводили СКЖТ-ТигЬо FP635, также отмечена выраженная автофлуоресценция селезенки, почек и печени при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 543 нм. Учитывая данные in vivo флуоресцентного имиджинга о наличии нарастающей флуоресценции в селезенке у животных с системным введением СКЖТ-ТигЬо FP635, была предпринята попытка выделить пики на 613 или 635 нм, но автофлуоресцентный сигнал перекрывал флуоресценцию в данной области спектра.

В опытных группах скопления СКЖТ-ТигЬо FP635 были обнаружены в тканях с низким уровнем автофлуоресценции: опухоль, костный мозг и легкие (рис. 6). Это свидетельствовало о распределении СКЖТ-ТигЬо FP635 в этих нишах.

В опухолях обнаружены небольшие скопления СКЖТ-ТигЬо FP635 у животных второй группы. У животных других опытных групп таких скоплений не выявлено.

В костном мозге были детектированны яркие скопления СКЖТ-Turbo FP635 у животных второй группы (рис. 6). В костном мозге животных первой и третьей групп наблюдалась только слабая фоновая флуоресценция. В легких

животных третьей группы были найдены скопления СКЖТ-ТигЬо FP635, в остальных случаях отмечалась лишь фоновая флуоресценция (рис. 7).

группа 1 группа 2 группа 3 контроль

Рис. 6. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия тканей органов ex vivo: флуоресцентные изображения печени, почек, селезенки, легких, костного мозга, опухоли (возбуждение флуоресценции 543 нм, регистрация 650-710 нм); 1 группа -животные с внутривенным введением СКЖТ-Turbo FP635 на ранней стадии роста опухоли, 2 группа - животные с локальным введением СКЖТ-ТигЬо FP635 на ранней стадии роста опухоли, 3 группа - животные с внутривенным введением СКЖТ-Turbo FP635 на стадии сформированной опухоли, контроль -животные с привитой опухолью без введения СКЖТ-ТигЬо FP635.

селезенка

легкое К

эстный мозг • ,;,t V. ■

опухоль ■ ■

[лmit волшы флтореспгвпнв.вм

s s

Л таняпщиыфго^ггаркяии. ni

Рис. 7. Спектры флуоресценции тканей животных 1-ой группы в диапазоне 597-694: А - легкого, Б селезенки. Сплошной линией указаны

спектры флуоресценции тканей животных, пунктирной - спектр СКЖТ-ТигЬо РР635.

Таким образом, при исследовании влияния СКЖТ-ТигЬо FP635 на перевиваемый рак шейки матки у иммунодефицитных мышей, ш vivo (методом флуоресцентного имиджинга) удалось идентифицировать распределение CIOKT-TurboFP635 в селезенке при внутривенном введении, а исследование на субклеточном уровне (методом ЛСМ) выявило распределение СКЖТ-TurboFP635 в костном мозге, легких и опухоли реципиента при внутривенном и локальном введении.

2. Изучение влияния MMCK-GFP(+) на перевиваемую карциному легкого Льюис в иммунокомпетентных мышах

Клеточная культура. MMCK-GFP(+) были выделены и культивированы. Установлено, что при длительном культивировании происходит «угасание» первоначально ярко флуоресцирующих клеток, при этом MMCK-GFP(+) к 3 пассажу теряют до 70% первоначальной флуоресценции (рис. 8).

Проточная цитометрия. Костномозговые клетки опытных облученных животных были выделены через 7, 12 и 15 суток после трансплантации. В ходе анализа распределения клеток костного мозга опытных облученных и

контрольных необлученных животных по уровню сигнала не было выявлено достоверных различий. Флуоресценция, характерная для ММСК-ОРР(+), не была обнаружена ни в одном из случаев (рис. 9). Таким образом, присутствие ММСК-ОРР( ь) в костном мозге опытных облученных животных не выявлено.

А Б__В

1ИИ _

Рис. 8. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. А - флуоресцентное изображение первичной культуры ММСК-ОРР(+); Б - флуоресцентное изображение ММСК-ОРР(+) 3-го пассажа. Красным выделены ММСК-ОРР(+). Возбуждение флуоресценции 488 нм, регистрация 490-600 нм, размер кадра 320x320 мкм. В - спектры флуоресценции первичной культуры ММСК-СРР(+) (фиолетовая кривая) и ММСК-ОРР(+) 3-го пассажа (синяя кривая).

Рис. 9. Проточная цитометрия. Распределение популяций клеток КМ по уровню флуоресценции в зеленой области спектра: черная кривая - необлученного животного контрольной группы; синяя, красная и зеленая кривые - облученных животных после 7,12 и 15 дней трансплантации ММСК-ОРР(+)

соответственно.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Для получения контрольного спектра белка вРР на установке ЛСМ анализировали спектральные характеристики культуры ММСК-ОРР(+). Данный спектр использовали для дальнейшего сравнения со спектрами тканей исследуемых органов. Полученный спектр клеток имел ярко выраженный пик на длине волны 506 нм и полностью соответствовал спектру белка ОРР^Ьает е1 а1, 2004).

Наличие ММСК-вРР(+) в тканях органов анализировали по визуализации клеточных скоплений с флуоресценцией и спектром, соответствующим флуоресценции вРР.

У опытных облученных животных после введения ММСК-вРР(+) в легких были обнаружены отдельные ММСК-ОРР(+): достаточно часто встречающиеся в поле зрения на 7-й день после инъекции и разрозненные к 12-му и 15-му дням эксперимента (рис. 10А). Спектральные характеристики выделенных на рис. 10А областей флуоресценции представлены на рис. 10Б, где присутствие белка вРР характеризуется пиком на длине волны 506 нм. ММСК-ОГР (+) располагались диффузно (по 1-3 в поле зрения), клеточных скоплений обнаружено не было.

В селезенке опытных животных на 7-й день после трансплантации обнаружены небольшие скопления ММСК-ОРР (+). К 12-му дню их количество

увеличилось. На 15-й день удалось зафиксировать лишь диффузно распределенные остатки экстраклеточного белка ОРР (рис. 10А).

В печени на 7-й день после трансплантации скоплений ММСК-ОРР(+) не выявлено. Локальные скопления ММСК-ОРР(+) обнаружены на 12-й день и часто встречались в поле зрения. К 15-му дню отмечено уменьшение их количества (рис. 10А).

В опухолях скоплений ММСК-ОРР(+) на 7-й день после трансплантации обнаружено не было (рис. 10 А). Небольшие скопления остатков экстраклеточного белка ОБР найдены на 12-й и 15-й дни после трансплантации (рис. 10 А).

Интенсивность собственной флуоресценции в тканях органов контрольных необлученных животных оценивали при тех же условиях и настройках, что и у опытной облученной группы. В легких, селезенке, печени и опухоли была отмечена слабая флуоресценция (рис. 10А), однако ее спектр кардинально отличался от спектра ММСК-ОРР(+) (рис. 10Б).

Таким образом, при исследовании влияния ММСК-ОРР(+) на перевиваемую эпидермоидную карциному легкого Льюис в иммунокомпетентных мышах методами ЛСМ и проточной цитометрии установлено, что на сроке до 15-ти дней роста опухоли при внутривенном введении исследуемые ММСК-ОРР(+) отсутствуют в опухоли и костном мозге, но вместе с тем способны распределяться в организме реципиента и накапливаться в потенциальных нишах (селезенка, печень). А Б легкое селезенка

Рис. 10. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия тканей органов ex vivo: А-флуоресцентные изображения тканей легких, селезенки, печени, опухолей контрольных и опытных животных на 7, 12 и 15 дни после трансплантации MMCK-GFP(+). Красным выделены места локализации MMCK-GFP(+). Возбуждение флуоресценции 488 нм, регистрация 490-600 нм, размер кадра 320x320 мкм; Б- характеристики флуоресценции тканей органов контрольных и опытных животных на 7, 12 и 15 дни после трансплантации MMCK-GFP(+). Черные кривые соответствуют спектрам флуоресценции тканей органов животных контрольной группы; синие, красные и зеленые кривые - спектрам тканей органов животных после 7, 12 и 15 дней трансплантации MMCK-GFP(+) соответственно.

3. Изучение влияния ММСК-1ис2 на ортотопически перевитую и метастазирующую аденокарциному молочной железы в иммунодефицитных мышах

Клеточная культура. ММСК были выделены и охарактеризованы. Показано, что ММСК имеют фенотип мезенхимных СК (экспрессируют СО 105, С090, С073, СО 44, СО 54, не экспрессируют - СО 34, С045, НЬА-ОЯ). В результате лентивирусной трансфекции создана линия ММСК-1ис2, стабильно экспрессирующая данный биолюминесцентный маркер. При добавлении к клеткам субстрата О-люциферина отмечено, что культура сохраняет биолюминесцентные свойства в течение длительного периода времени (рис. 11).

А _ Б

Рис. 11. Характеристика культуры ММСК-1ис2: А-биолюминесцентное изображение планшета с ММСК-1ис2;

Б-зависимость интенсивности биолюминесценции от

количества меченых клеток. О-люциферин, 150 мг/кг.

Мониторинг образования метастазов в легких методом флуоресцентного имиджинга. Автофлуоресценцию тканей животных контрольной группы (без введения опухолевых и стволовых клеток) приняли за базовый уровень. Формирование метастазов в легких отслеживали по появлению красной флуоресценции в области грудной клетки.

В группах животных с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСК-1ис2) на разных сроках наблюдали формирование метастазов в области грудной клетки. В группе с ортотопически перевитой опухолью красная флуоресценция не выявлена, следовательно, спонтанных метастазов в легких не было.

В группе с метастазирующей опухолью без введения ММСК-1ис2 у 3-х животных отмечали появление метастазов по флуоресцентному сигналу на 6-й неделе после введения опухолевых клеток, который сохранялся вплоть до 8-й недели (рис. 12Б). Интенсивность флуоресцентного сигнала значительно превышала уровень базовой флуоресценции и к 8-й неделе наблюдалась у 4-х животных из 5-ти. Однако у одного животного метастазы регистрировались уже на 4-й неделе после введения опухолевых клеток и на 7-й неделе уровень флуоресценции в области грудной клетки был на порядок выше.

В группе с метастазирующей опухолью и введением ММСК-1ис2 у трех животных на всем сроке наблюдали базовую флуоресценцию, сопоставимую с уровнем у контрольных животных (рис. 12А). При этом лишь у одного животного из группы отмечали образование метастазов по красной флуоресценции на 7-й неделе, которая сохранялась до 8-Й недели после введения опухолевых клеток.

В группе с ортотопически перевитой опухолью и ММСК-1ис2 у всех животных в течение первых двух недель наблюдали умеренную флуоресценцию в месте инъекции опухолевых клеток. На 13-й день формировались опухолевые узлы и интенсивность флуоресценции нарастала. В

течение 8-ми недель объем опухолей и их флуоресценция увеличивались, но спонтанные метастазы в легких не образовались.

При осмотре изолированных органов ex vivo на 8й неделе метастазы по интенсивному флуоресцентному сигналу были обнаружены только в легких животных с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСК-1ис2), что подтвердило данные имиджинга in vivo.

При макроскопическом осмотре показано, что у 1-го животного группы с метастазирующей опухолью и введением ММСК-1ис2 метастазы не обнаруживались совсем, у 3-х животных наблюдали единичное количество. В группе с метастазирующей опухолью без введения ММСК-1ис2 у всех животных наблюдали от 2-х и более метастазов. Метастатические очаги в группе животных с ортотопически перевитой опухолью и ММСК-1ис2 не выявлены.

При гистологическом анализе срезов легочных тканей животных групп с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСК-1ис2) в зонах флюоресценции были найдены метастазы, что подтвердило данные ex vivo имиджинга. В легочной ткани животных группы с ортотопически перевитой опухолью и ММСК-1ис2 метастазы выявлены не были.

Мониторинг распределения ММСК-1ис2 методом биолюминесцентного имиджинга. В контрольных животных после внутрибрюшинного введения Б-люциферина в процессе всего наблюдения люминесценции обнаружено не было.

Люминесцентный сигнал в области легких и брюшной полости у животных групп с метастазирующей опухолью и введением ММСК-1ис2 и с ортотопически перевитой опухолью и введением ММСК-1ис2 на всем сроке

Рис. 12. Мониторинг образования метастазов в легких опухолевыми клетками МОА-МВ-231-ТигЬоРР650 методом

флуоресцентного имиджинга: А животных с

метастатической опухолью без введения ММСК-1ис2 Б-

животных с

метастатической опухолью и введением ММСК-1ис2, контроль - животных без введения каких-либо клеток. Стрелками указаны

метастатические очаги, образованные МОА-МВ-231-ТигЬоРР650.

4 неделя б неделя 7 неделя 8 неделя

А

4 неделя 6 неделя 7 неделя 8 неделя

Б

наблюдения свидетельствовал о распределении, накоплении и, возможно, пролиферации ММСК-1ис2 в соответствующих зонах.

У половины животных группы с метастазирующей опухолью и введением MMCK-luc2 через 5 часов после инъекции наблюдали скопления ММСК-1ис2 в области легких. На сроке от 2-х до 4-х недель сигнал в легких увеличивался, при этом также отмечали перераспределение части популяции ММСК-1ис2 в область брюшной полости. На сроке от 5-ти до 8-ми недель скопления ММСК-1ис2 как в области легких, так и в брюшной полости сохранялись лишь у половины животных группы (рис. 13). В группе с ортотопически перевитой опухолью и введением ММСК у всех животных сразу после введения наблюдали скопление ММСК-1ис2 в области инъекции. На сроке до 4-х недель сигнал в этой области либо снижался, либо пропадал совсем. На 4-й неделе у 3-х животных из 4-х наблюдали перераспределение популяции ММСК-1ис2 в область легких и брюшной полости. Однако к 8-й неделе скопления ММСК-1ис2 в соответствующих областях либо практически не обнаруживались, либо пропадали.

Оценка биолюминесценции изолированных органов животных обеих групп ex vivo подтвердила наличие скоплений ММСК-1ис2 в легких, а также органах брюшной полости: печени и почках.

Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимический анализ был выполнен на срезах легочной ткани с метастазами животных групп с метастазирующей опухолью (с введением и без введения ММСК-1ис2). Анти-ffLuc+ окрашивание было обнаружено только в легких животных с метастазирующей опухолью и введением MMCK-luc2. ММСК-1ис2 локализовались в области метастазов и легочной ткани, прилегающей к метастатическим очагам, однако это были лишь единичные клетки. Легкие животных с метастазирующей опухолью и без введения ММСК-1ис2 были негативны по окрашиванию на ffLuc (рис. 14).

'-"» Рис. 13. Мониторинг

: распределения ММСК-1ис2

методом биолюминесцентного

-« имиджинга у животных с

т метастатической опухолью и

»введением ММСК-1ис2.

~ Стрелками показаны места

! часов 'Заиш 4 ■ едели 5 неделя 8 неделя локализации ММСК-1ис2.

Рис. 14. Иммуногистохимическое окрашивание легочной ткани с метастазами: А-животных с метастазирующей опухолью и введением ММСК-1ис2, Б -животных с метастазирующей опухолью без введения ММСК-1ис2.0крашивание антителами к Шис, х40, размер кадра 316x237 мкм. Стрелками показаны места локализации МСК-1ис2.

Таким образом, при изучении влияния ММСК-1ис2 на ортотопически перевитую и метастазирующую аденокарциному молочной железы в иммунодефицитных мышах с использованием двойного (флуоресцентного и биолюминесцентного) имиджинга in vivo определено, что при внутривенном и локальном введениях MMCK-Iuc2 распределяются в легких, органах брюшной полости и опухоли. Кроме того, при внутривеном введении ММСК-1ис2 оказывают подавляющее действие на формирование метастазов, при введении в сайт формирующейся ортотопически перевитой опухоли не влияют на ее рост.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему моменту существует большое количество данных, показывающих противоположные эффекты СК на рост опухолей, поэтому изучение влияния СК на опухолевый рост является актуальной проблемой. Для исследования участия СК в развитии опухоли и наблюдения распределения их в организме реципиента в основном используют традиционные методы, поэтому не менее актуальным является изучение данной проблемы с помощью методов флуоресцентного биоимиджинга.

Проведенная нами работа позволяет расширить понимание механизма развития опухолей под влиянием СК в условиях in vivo, а также дополнить данные о распределении СК в организме реципиента. Полученные нами результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение.

В данной работе были получены и охарактеризованы 3 линии стволовых клеток: СКЖТ-Turbo FP635, MMCK-Iuc2, MMCK-GFP(+).

Впервые в данной работе было исследовано влияние CIOKT-TurboFP635 на перевиваемый рак шейки матки в иммунодефицитных мышах методом флуоресцентного имиджинга и лазерной сканирующей микроскопии. In vivo (методом флуоресцентного имиджинга) удалось идентифицировать распределение СКЖТ-ТигЬоРРбЗ 5 в селезенке при системном введении, а исследование на субклеточном уровне (методом лазерной сканирующей микроскопии) выявило распределение COCT-TurboFP635 в костном мозге, легких и опухоли реципиента при внутривенном и локальном введении.

Впервые было изучено влияние MMCK-GFP(+) на перевиваемую карциному легкого Льюис в иммунокомпетентных мышах методами лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитометрии. Установлено, что при внутривенном введении исследуемые MMCK-GFP(+) отсутствуют в опухоли и костном мозге, но вместе с тем распределяются в организме реципиента и накапливаются в потенциальных нишах (селезенка, печень).

Впервые получены данные о влиянии ММСК-1ис2 на ортотопически перевитую и метастазирующую аденокарциному молочной железы в иммунодефицитных мышах с использованием двойного (флуоресцентного и биолюминесцентного) имиджинга in vivo. Определено, что при внутривенном и локальном введениях ММСК-1ис2 распределяются в легкие, органы брюшной полости и опухоль. Кроме того, при внутривенном введении ММСК-1ис2 оказывают подавляющее действие на формирование метастазов, при локальном введении - не влияют на рост опухоли.

Полученные нами результаты в целом показали, что в раке шейки матки скопление СКЖТ-ТигЬо FP635 было обнаружено только у животных с локальным введением. Мы предположили, что это, вероятно, связано с моделированием взаимодействия СКЖТ-ТигЬо FP635 с клетками окружающих опухолевых тканей (в частности, с участием в построении кровеносных сосудов

17

опухоли). Однако данное введение СКЖТ-ТигЬо FP635 на рост опухолей не повлияло. В перевиваемой карциноме легкого Льюис при системном введении MMCK-GFP(+) были обнаружены лишь скопления остатков белка GFP, поэтому мы не могли уверенно говорить о присутствии MMCK-GFP(+) в опухоли. В метастатической аденокарциноме молочной железы MMCK-Iuc2 были обнаружены, однако это были лишь единичные клетки. Важно отметить, что мы выявили подавляющее действие ММСК-1ис2 на формирование метастазов. Возможно, данное действие могло быть связано с подавлением регуляции Akt, NFkB и Wnt сигнальных путей стволовыми клетками (Loebinger et al., 2010).

При исследовании взаимодействия СК различного происхождения с опухолями во всех исследуемых нами моделях было выявлено, что первичным органом локализации СК при внутривенном введении являлись легкие. Согласно литературным данным, в подобных экспериментальных моделях легкие животных действительно выступают в качестве пункта миграции, где системно введенные СК накапливаются в первые дни после инъекции, а затем перераспределяются в организме реципиента (Kidd et al., 2009). При исследовании влияния СКЖТ-ТигЬо FP635 на перевиваемый рак шейки матки мы обнаружили часть популяции СКЖТ-ТигЬо FP635 и их потомков, которые не покинули ткани легких и на 14-й день эксперимента. В сравнении с первым исследованием, при изучении влияния MMCK-GFP(+) на перевиваемую карциному легкого Лыоис мы показали, что максимальное количество ММСК-GFP(+) регистрировалось в легких на 7-й день после трансплантации, а затем их количество уменьшалось. При исследовании влияния ММСК-1ис2 на метастатическую аденокарциному молочной железы скопления ММСК-1ис2 в области легких наблюдали уже через 5 часов после инъекции, а в течение 2-4-х недель скопления ММСК-1ис2 увеличивались, что свидетельствовало об их накоплении и возможно - активной пролиферации. В дальнейшем мы наблюдали перераспределение ММСК-1ис2 в организме. Важно отметить, что при локальном введении ММСК-1ис2 также мигрировали в легкие и перераспределялись в органы брюшной полости, но позднее - лишь на 4-ой неделе.

Полученные нами результаты подтвердили известные ранее данные о селезенке как о нише для СК при системном введении. Во всех 3-х исследованиях мы наблюдали распределение стволовых клеток различного происхождения в селезенку на разных сроках: от 7-ми дней до 2-х недель. •

Донорские СК нами также были обнаружены в печени животных, что согласуется с результатами, полученными другими авторами (Wolfe/ al., 2005). Максимальное количество донорских MMCK-GFP(+) в печени было детектировано на 12 день, а ММСК-1ис2 обнаруживали и на 8-й неделе после введения СК. Присутствие СКЖТ-ТигЬо FP635 в печени выявлено не было, что, вероятно, связано с выраженной автофлуоресценцией тканей.

В костном мозге при системном введении СК обнаружены нами не были. Вероятно, отсутствие MMCK-GFP(+) в костном мозге опытных животных связано с достаточно ранними сроками наблюдения (до 15 дней), на которых восстановление костного мозга уже началось, но активная пролиферация клеток еще не наступила. Неожиданным результатом работы оказалось то, что в костном мозге животных с локальным введением были обнаружены СЮКТ-Turbo FP635. Возможно, это произошло из-за перераспределения введенных

СКЖТ-ТигЬо БР635 (в опухоль на мышце бедра) и миграции их через системный кровоток в костный мозг.

ВЫВОДЫ

1. Выделены, охарактеризованы и получены линии СКЖТ-ТигЬо FP635 и MMCK-luc2; выделены и охарактеризованы MMCK-GFP(+). Показано, что СКЖТ и ММСК экспрессируют спектр маркеров, характерных для мезенхимных СК (CD105, CD90, CD73, CD 44, CD 54) и не экспрессируют маркеры кроветворных клеток (CD 34, CD45, HLA-DR).

2. При исследовании влияния CK)KT-TurboFP635 на перевиваемый рак шейки матки в иммунодефицитных мышах in vivo (методом флуоресцентного имиджинга) идентифицировано распределение СКЖТ-Тиrb о F Р 6 3 5 в селезенку при внутривенном введении, а исследование на субклеточном уровне (методом JICM) выявило распределение CIOKT-TurboFP635 в костный мозг, легкие и опухоль реципиента при внутривенном и локальном введении.

3. При исследовании влияния MMCK-GFP(+) на перевиваемую карциному легкого Лыоис в иммунокомпетентных мышах методами ЛСМ и проточной цитометрни установлено, что при внутривенном введении исследуемые MMCK-GFP(+) отсутствуют в опухоли и костном мозге, но вместе с тем распределяются в организме реципиента и накапливаются в потенциальных нишах (селезенка, печень).

4. При исследовании влиянии ММСК-1ис2 на ортотопически перевитую и метастазирующую аденокарциному молочной железы с использованием двойного флуоресцентного и биолюминесцентного имиджинга in vivo определено, что при внутривенном и локальном введениях ММСК-1ис2 распределяются в легкие, органы брюшной полости и опухоль. Кроме того, при внутривенном введении ММСК-1ис2 оказывают подавляющее действие на формирование метастазов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Ютешнин М.С., Турчин И.В., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Лукьянов С.А., Загайнова Б.В. (2012). Исследование взаимодействия мезенхимных стволовых клеток и опухоли методами флуоресцентного биоимиджинга. Современные технологии в медицине, 4, 7-16.

2. Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Ширманова М.В., Балалаева И.В., Киселева Е.В., Загайнова Е.В. (2013). Исследование миграции трансплантированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в организме опухоленосотеля. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, VIII(2), 56-63.

3. Клементьева Н.В., Ширманова М.В., Серебровская Е.О., Фрадков А.Ф., Мелешина А.В., Снопова Л.Б., Проданец Н.Н., Лукьянов С.А., Загайнова Е.В. (2013). Биолюминесцентный имиджинг опухолевых клеток in vivo с применением оптимизированной люциферазы светляка LUC2. Современные технологии в медицине, 5(3), 6-15.

4. Meleshina A.V., Cherkasova E.I., Sergeeva Е., Turchin I.V., Kiseleva E.V., Dashinimaev E.B., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V. Tumor-stem cells interactions by fluorescence imaging. Proc. SPIE, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues, 2013, Vol. 8587, 8587- IS - (8P).

Тезисы конференций:

1. Мелешина A.B., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б. Изучение взаимодействия мезенхимных стволовых клеток меченых Turbo FP635 и модели экспериментальной опухоли методами флуоресцентной микроскопии и in vivo имиджинга. XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология»; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов, изд-во М.:МАКС Пресс, 2012, 303.

2. Мелешина A.B., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Загайнова Е.В. Флуоресцентный биоимиджинг и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия в изучении взаимодействия опухоли и меченых стволовых клеток. Биология -— наука XXI века: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых: Сборник тезисов, 2012, 428-429.

3. Мелешина A.B., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Загайнова Е.В. Исследование взаимодействия опухоли и стволовых клеток с использованием генетического маркирования и флуоресцентного биоимиджинга. Российский биотерапевтический журнал, 2012, 2(11), 34.

4. Мелешина A.B., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Загайнова Е.В. Исследование модели «опухоль-стволовая клетка» методами флуоресцентного биоимиджинга и лазерной сканирующей микроскопии. V Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине», Сборник материалов, 2012, 2, 188-190.

5. Мелешина A.B., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Клешнин М.С., Турчин И.В., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Ширманова М.В., Загайнова Е.В.

Возможность использования оптических флуоресцентных методов для изучения модели «Опухоль-стволовая клетка». IV Съезд биофизиков России, Симпозиум III «Физика - медицине и экологии», Материалы докладов, 2012, 1597.

6. Cherkasova Е., Meleshina A., Shirmanova М., Sergeeva Е., Kiseleva Е., Dashinimaev Е., Zagaynova Е. Tumor-mesenchimal stem cells interaction investigation by fluorescence bioimaging. 4th International Confress on Stem Cells and Tissue Formation, 2012, 1508.

7. Meleshina A., Cherkasova E., Sergeeva E., Turchin I., Kiseleva E., Dashinimaev E., Shirmanova M., Zagainova E. Fluorescent bioimaging in the study of the different models 'stem cells-tumor' interaction. 38th FEBS congress, The FEBS Journal, 2013, 280, 446.

8. Meleshina A.V., Cherkasova E.I., Sergeeva E.A., Kiseleva E.V., Dashinimaev E.B., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V. Fluorescent imaging modalities for mesenchymal stem cell-tumor tropism. IV International Symposium «Topical problems of biophotonics -2013», 2013, 331-332.

9. Мелешина A.B., Черкасова Е.И., Ширманова M.B., Клементьева Н.В., Киселева Е.В., Загайнова Е.В. Исследование влияния мезенхимных стволовых клеток на формирование метастазов опухоли с использованием люминесцентного имиджинга. Стволовые клетки и регенеративная медицина: V Всероссийская научно-практическая конференция: Сборник тезисов, изд-во М. :МАКС Пресс, 2013,48.

10. Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Ширманова М.В., Сергеева Е.А., Турчин И.В., Киселева Е.В., Дашинимаев Э.Б., Загайнова Е.В. Изучение миграционной активности стволовых клеток в различных моделях патогенеза опухоли. Форум молодых учёных. Тезисы докладов. Том 1.-Нижний Новгород: Изд-во ННГУгш. Н.И. Лобачевского, 2013, 28-30.

Подписано к печати 26.08.2014. Формат 60х907|6 Бумага офсетная №1. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ Л'°40

Отпечатано в типографии ИП Синицын А.Е. 603 155 г. Нижний Новгород, ул. Провиантская,8