"Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе

Часовских, Наталия Юрьевна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:"Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Часовских, Наталия Юрьевна Томск 2009 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.16

Автореферат диссертации по медицине на тему "Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе

На правах рукописи

Часовских Наталия Юрьевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск - 2009

003474588

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук

Рязанцева Наталья Владимировна Новицкий Вячеслав Викторович

Лишманов Юрий Борисович

Шкурупий Вячеслав Алексеевич

Масная Наталья Владимировна

Ведущая организация: ГУ НИИ физиологии СО РАМН

Защита состоится «_» _ 2009 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан « » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

На современном этапе развития зарубежной и отечественной медико-биологической науки накоплен большой объем знаний о механизмах повреждения и адаптации клеточных систем при патологических процессах разного генеза. В центре внимания исследователей находятся ключевые механизмы регуляции апоптоза, который представляет собой активную форму клеточной гибели и является физиологическим механизмом устранения избыточных и/или функционально аномальных клеток. Известно, что развитие различных болезней (злокачественные новообразования, сердечно-сосудистые, пейродегенеративные, острые и хронические воспалительные процессы, сахарный диабет и др.) связано с нарушениями механизмов реализации апоптоза, приводящими к его излишнему активированию или ингибированшо [Bredesen D.E., 2000; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. Наряду с этим важным звеном патогенеза данных заболеваний является дисбаланс окислительного метаболизма [Зенков Н.К. и соавт., 2001].

Развитие окислительного стресса при ряде патологий обусловлено резкой интенсификацией процессов свободно-радикального окисления и/или снижением резерва антиоксидантной защиты, что приводит к значительному накоплению активных форм кислорода (АФК) [Скулачев В.П., 1996]. Последние вызывают окислительную модификацию белковых и липидных молекул, повреждение ДНК, нарушение структуры мембран и др. [Дубинина Е.Е., 2001; Zhu Н. et al., 2001; Mathers J. et al., 2004]. Вместе с тем известно, что АФК являются внутриклеточными мессенджерами, участвующими в регуляции различных клеточных процессов, в частности - апоптоза [Safa О., 2001; Sorescu D., 2001; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007].

Влияние АФК на про- и антиапоптотические мишени и механизмы осуществляется непосредственно или через внутриклеточные редокс-зависимые сигнал-передающие системы [Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. При этом в клетке может происходить одновременная активация нескольких молекулярных путей, взаимодействующих между собой [Wajant Н., 2002; Schultz D.R., Harrington W.G., 2003].

2006]. Под контролем редокс-чувствительных транскрипционных факторов находится синтез белков семейства Вс1-2, являющихся ключевыми регуляторами апоптоза. В частности, р53 активирует экспрессию Bid, PUMA и Noxa [Oda Е. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002], NF-кВ управляет генами, кодирующими белки Bcl-XL, IAP, Al, отвечающие за угнетение процесса апоптоза [Kucharczak J. et а!., 2003]. Вместе с тем ряд исследований свидетельствуют о проявлениях редокс-чувствительными элементами сигнальной транедукции как про-, так и антиапоптотической активности [Perkins N.D., 2004; Harada С., Nakamura К., 2006], зависящей от особенностей индуцирующих сигналов, комбинации возможных путей их передачи и типа клеток.

Данное обстоятельство затрудняет возможность идентификации механизмов развития заболеваний, сопровождающихся развитием окислительного стресса и сопряженных с дизрегуляцией летальной программы клеток. Необходимость разработки и внедрения селективных технологий управления апоптозом ставит перед фундаментальной наукой задачу идентификации редокс-чувствительных молекулярных мишеней и обосновывает целесообразность проведения комплексного исследования фундаментальных механизмов нарушения программированной гибели клеток в условиях окислительного стресса.

Цель исследования: установить редокс-чувствительные молекулярные механизмы апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Установить особенности реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов, состояния рецепторного и митохондрий-опосредованного путей инициации апоптоза при окислительном стрессе.

2. Оценить характер изменепий МАР-киназных элементов (JNK, р38) системы сигнальной транедукции в мононуклеарных клетках крови с использованием селективных ингибиторов (SP600125, ML3403) in vitro при окислительном стрессе.

3. Оценить роль транскрипционных факторов NF-кВ и р53 в механизмах регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при дисбалансе окислительного метаболизма.

4. Выявить особенности экспрессии мРНК и оценить содержание белков семейства Вс1-2 с про- и антиапоптотической активностью при окислительном стрессе.

5. Установить общие закономерности и особенности дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалительном процессе, сопровождающемся нарушением окислительного метаболизма.

Научная новизна.

Впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов проведено исследование редокс-чувствительных молекулярных механизмов реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении.

Впервые при культивировании in vitro мононуклеарных лейкоцитов крови с 1 мМ Н202 показано, что нарастание продукции активных форм кислорода в клетках сопровождается увеличением содержания апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, опосредованным активацией митохондриалыюго и повышенной готовностью клеток к TNFa-рецепторному пути инициации апогггоза. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма усиливается фосфорилирование редокс-чувствительных JNK и р38 МАР-киназ, являющихся важным элементом системы сигнальной транедукции апоптогенных сигналов. Впервые в эксперименте с использованием селективных ингибиторов МАР-киназ показано, что JNK влияет на продукцию IL-8, но не участвует (также как р38) в регуляции синтеза IL-10 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Факторы транскрипции NF-кВ и р53 через механизмы фосфорилирования МАР-киназами и/или непосредственного действия АФК влияют на экспрессию генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза (увеличение экспрессии проапоптотического протеина Вах и антиапоптотичекого Bc1-Xl). Получены приоритетные данные об изменении содержания про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2 в мононуклеарных клетках крови при экспериментальном окислительном стрессе. Изменение соотношения ключевых белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2 сопряжено с последовательной активацией редокс-чувствительных элементов сигнальной транедукции (МАР-киназ и факторов транскрипции). Установлены однотипные молекулярные механизмы

дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 1 мМ перекисью водорода, и остром воспалительном процессе. Выявлено, что редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем являются мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы клеток.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют существующие представления о фундаментальных механизмах дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлена роль редокс-чувствительных МАР-киназ р38, ХИК и факторов транскрипции р53, ОТ-кВ в изменении баланса про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2. Полученные знания носят фундаментальный характер и могут служить основой для разработки молекулярной технологии воздействия на оксидант-опосредованную модуляцию активности ключевых регуляторов апоптоза. Идентифицированные в ходе исследования редокс-чувствительные молекулярные мишени могут быть использованы в разработке подходов селективного управления апопгозом клеток при патологических процессах, патогенез которых сопряжен с развитием окислительного стресса, а также с нарушением реализации летальной программы клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1. Усиление программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса сопряжено с активацией митохондрий-опосредованного и повышенной готовностью клеток к ТОТа-рецепторному пути инициации апоптоза.

2. В реализацию летальной программы мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе вовлечены редокс-чувствительные элементы внутриклеточной сигнальной трансдукции (МАР-киназы р38 и ЛЧК, факторы транскрипции №ЧсВ и р53).

3. В изменении баланса ключевых белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе участвуют факторы транскрипции ОТ-кВ и р53, контролирующие экспрессию соответствующих генов.

4. Дизрегуляция апоптоза представляет собой один из компонентов патогенетических изменений при воспалении, сопровождающемся дисбалансом окислительного метаболизма.

Апробация и внедрение результатов работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), III Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2007).

Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ в рамках проекта «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ -«Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150), «Разработка технологии селективного управления внутриклеточными редокс-зависимыми сигнальными системами» (№ 09-04-99026), а также выполнены в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» (государственные контракты № 02.442.11.7276 от 20.02.2006, № 02.445.11.7419 от 09.06.2006), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственные контракты № 02.512.12.0013 от 01.08.2008, № 02.512.11.2285 от 10.03.2009). Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии («Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии») для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из mix 8 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна монография в соавторстве.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 219 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 471 источник, из них - 122 отечественных и 349 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 46 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Регуляцию апоптоза при окислительном стрессе мы рассматривали с позиции существования типовых неспецифических механизмов изменения летальной программы клеток. Для того чтобы понять особенности влияния окислительного стресса на реализацию апоптоза, проводимое нами исследование (в соответствии с поставленными целью и задачами) было разделено на два последовательных этапа.

На первом этапе исследования предстояло выяснить, приводит ли дисбаланс окислительного метаболизма к нарушению реализации летальной программы клеток. Для этого проводили оценку выраженности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях оксилительного стресса, состояния ключевых путей инициации программированной гибели клеток (рецепторный, митохондрий-опосредованный, ядерный).

На втором этапе исследования предполагалось проверить гипотезу о вовлечении редокс-чувствительных элементов сигнальной транедукции в механизмы нарушения летальной программы клеток при окислительном стрессе. Для определения роли митоген-активированных прогеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза клеток при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125), определяли наличие общих и фосфорилированных форм МАР-киназ, транскрипционных факторов р53 и NF-kB, фосфорилированного р53. Для определения участия протеинов семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза измеряли внутриклеточное содержание про- (Вах, Bad) и антиапоптотических (Bcl-2, Bcl-XL) представителей данного семейства белков (табл. 1). Затем оценивали экспрессию генов белков-регуляторов апоптоза, находящихся под транскрипционным контролем р53 и NF-kB.

Для верификации молекулярных мишеней, ответственных за редокс-зависимую модуляцию апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, проводилось манипулирование in vitro мононуклеарными лейкоцитами крови, полученными у здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями.

В исследование были включены 46 здоровых доноров в возрасте от 18 до 50 лет (мужчины - 20, женщины - 26) и 49 больных (25 мужчин и 24 женщины в возрасте от 18 до 50 лет, средний возраст - 32±3 лет) с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит). Критериями исключения из программы исследования для здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями

являлись: возраст моложе 18 и старше 50 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, злокачественные новообразования, алкогольная и наркотическая зависимости; отсутствие информированного согласия.

Пациенты были обследованы при госпитализации в терапевтическое и хирургическое отделения ММЛПУ Городская больница №1 (главный врач -С.М. Кирютенко), госпитальные клиники ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач - Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелев), клиники Военно-медицинского института МОРФ (зав. кафедрой терапии и усовершенствования врачей - канд. мед. наук, доцент Т.С. Агеева).

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл).

Исследование проводилось на базе Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководители - д-р мед. наук, проф. Н.В. Рязанцева, акад. РАМН В.В. Новицкий), лаборатории фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) (зав. лабораторией -канд. мед. наук M.JI. Филипенко).

Мононуклеарные лейкоциты выделяли из крови путем центрифугирования на слое фиколла ("Pharmacia" Швеция) плотностью 1,077 и инкубировали в течение 18 ч при температуре 37°С в полной питательной среде. Для определения роли митоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125 («Biosource», США) соответственно). Для индукции окислительного стресса в клеточные культуры добавляли перекись водорода в различных концентрациях (10 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 500 мкм и 1 мМ). Методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием цнтомстра Epics XL («Beckman Coulter», Франция) оценивали уровень внутриклеточной продукции АФК, количество апоптотически измененных клеток, содержание мононуклеарных лейкоцитов со сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом и число TNFRl-презентирующих клеток. Оценку реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проводили с использованием ФИТЦ-меченного аннексииа V («ANNEX1N V FITC» («Beckman Coulter», Франция)), обладающего сродством ' к мембранно-связанному фосфатидилсерину [Van Engeland М., 1998]. Для подтверждения наличия в

Таблица 1

Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в соответствии с проведенными методами исследования

Методы исследования

Группы обследованных (условия эксперимента)

Здоровые доноры

- О

> 2 С <п к

о ■ч-

> "

.3 | м

Й о. о

2 о ° Й

м К и

Й ю и

« Ё

к и

В я

§ I м

к 5

Больные с острым воспалением

- я 3 Э

I ^

я к я о

я в м е ё -

а « „

й « ^ §

Ч 2

я " ш о

Й в

о =3

ю а

к «

к ж о

4> К К

Л й

X в-

к « ®

е- е

й о

о ко о ■У я и

Оценка апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в аннексиновом тесте с использованием проточной лазерной цигофлуориметрии

Не определяли

Определение уровня АФК в клетках с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии_

Оценка уровня митохондриального трансмембранного потенциала с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии

Не опреде-

Определение количества ТКЬ'Я1 -презента рующих клеток с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии

Не опреде-

Определение содержания общих и фосфо-форм МАР-киназ (ЖК, р38) и фосфорилированного р53 методом весгерн-блоттинга

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4 5 б

Исследование содержания факторов транскрипции (р53 и NF-kB) и белков-регуляторов апоптоза (Bad и Bcl-XL) с использованием метода вестерн-блоттинг 4 4 Не определяли 4 Не определяли

Исследование содержания белков-регуляторов апоптоза (Вах и Вс1-2) с использованием метода вестерн-блоттинг 4 4 4 4 4

Оценка экспрессии мРНК генов белков-регуляторов апоптоза (bad, Ъах, bcl-2, bcl-XL) с использованием метода ПЦР в реальном времени 12 12 Не определяли 7 Не определяли

Исследование содержания IL-8, IL-10 и TNFa в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов методом иммуноферментного анализа 11 11 22 22 22

Определение количества апоптотически измененных клеток TUNEL-методом Не определяли Не определяли Не определяли 10 Не определяли

исследуемой культуре клеток с апоптотическими изменениями применяли TUNEL-метод («Webstain», США). Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран (Д\|/) регистрировали с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Уровень активных форм кислорода в клетках оценивали с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией - дихлорфлюоресцеина ди ацетата («Sigma», США). Содержание мононуклеарных лейкоцитов, презентирующих на своей поверхности мембранную форму рецептора к фактору некроза опухоли-а 1-го типа (TNF-RI), определяли с помощью стандартных моноклональных антител к TNF-RI, меченных ФИТЦ («immunotech», Франция).

Продукцию мононуклеарными лейкоцитами TNFa оценивали с помощью иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем тест-систем («Протеиновый контур», Россия). В супернатантах интактных, перекись-стимулированных и культивированных с ингибиторами МАР-киназ культур мононуклеарных лейкоцитов определяли содержание IL-8 и IL-10, используя метод иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией к набору («Biosurce», USA) на

микропланшетном фотометре Multiscan EX («ThermoLabSistems», Финляндия). Концентрации TNFa, IL-8 и IL-10 вычисляли по калибровочной кривой.

Для определения содержания активных и неактивных форм МАР-киназ р38, JNK, транскрипционных факторов (NF-kB, р53 и фосфо-формы р53) и белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Вах, Bad) был использован метод вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты получали путем лизиса клеток. Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении 120 В. Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлознуго мембрану («Bio-Rad», США). Перенос белков осуществлялся электрофоретически в течение 90 мин при силе тока 60 мА. Нитроцеллюлозные блоты инкубировали с первичными антителами к активным и общим формам МАР-киназ (JNK 1 и 2, р38, фосфо JNK 1 и 2, фосфо р38), факторам транскрипции (р53 («Biosource», США), NF-kB («Biosource», США)), к фосфо-форме р53 («Biosource», США) и белкам-регуляторам (Вах («Biosource», США), Bcl-XL («Sigma», США), Bad («Biosource», США), Bcl-2 («Biosource», США)) в разведении 1:200. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США).

Для количественного определения экспрессии РНК генов bcl-2, Ьах, bcl-XL и bad использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Выделение РЖ из мононуклеаров крови осуществляли с применением гуанвдин изотиоционата с последующей фенол-хлороформной экстракцией [Chomczynski P., Sacchi N., 1987]. Оценку качества выделенного препарата РНК проводили по итогам электрофоретического разделения. Возможные примеси геномной ДНК удаляли при помощи переосаждения в 2,5 М LiCl. Следующим шагом синтезировали ДНК на матрице РНК при участии обратной транскриптазы. Полученный фрагмент ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием SYBR Green I («Molecular Probe», США) на амплификаторе 1Q5 («Bio-Rad», США). Амплификацию проводили с использованием режима, предполагающего предварительную денатурацию образцов (95°С, 2 мин) с последующими сорока циклами, включающими денатурацию (95°С, 15 сек) и отжиг (60°С, 45 сек). Праймеры, позволяющие специфично амплифицировать фрагменты кДНК генов bcl-2, bcl-XL, Ьах и bad, были предоставлены лабораторией фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Для

определения относительного количества кДНК в образце использовали критерий с1с1С1.

При оценке полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980]. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибка среднего или медиана, первый и третий квартили. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием Ь критерия Стъюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона. Для оценки достоверности различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни. Наличие связи между изученными показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1999].

ОСОБЕННОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ АИОИТОЗА МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

Интенсификация окислительных реакций при различных патологических состояниях может оказывать влияние на процессы реализации апоптоза (как в сторону активации, так и в сторону ингибирования), выступая в качестве дополнительного патогенетического механизма развития сердечно-сосудистых, онкологических заболеваний, воспалительных и нейродегенеративных процессов. Особый интерес исследователей в этом плане привлекает роль изменений редокс-статуса клетки в модуляции ее программированной гибели [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Вместе с тем особенности функционирования отдельных систем передачи апоптогенных сигналов (вне- и внутриклеточных) в условиях изменения окислительного метаболизма требуют детального изучения.

При выборе методологии исследования мы руководствовались следующими позициями. С одной стороны, известно, что окислительный стресс выступает в качестве одного из важнейших патогенетических

факторов развития различных заболеваний (воспалительные процессы любого генеза, злокачественные новообразования, сердечно-сосудистая и бронхо-легочная патологии, неврологические и психические заболевания, интоксикации разного генеза и др.). При этом механизмы генерации АФК носят типовой универсальный характер [Дубинина Е.Е., 2001]. В качестве примера патологического процесса, сопровождающегося дисбалансом окислительного метаболизма, нами был выбран острый воспалительный процесс у больных внебольничной пневмонией и острым аппендицитом.

С другой стороны, изучение роли какого-либо определенного молекулярного механизма требует создания экспериментальной модели, существенным плюсом которой является возможность анализа изолированной цепи событий, приводящих к патологическим изменениям [Веденов А.А., 1988]. В связи с этим в программу исследования был включен экспериментальный блок, основанный на моделировании окислительного стресса in vitro с использованием Н202.

Добавление в культуральную среду Н2О2 в различных конечных концентрациях является одним из наиболее распространенных способов моделирования окислительного стресса in vitro [Abe J. et al., 1997; Griendling K.K. et al., 2000; Chen K., Vita J.A. et al., 2001; Ding В., 2007].

Задачей экспериментального раздела исследования явилась оценка уровня внутриклеточной продукции АФК и количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов при различных концентрациях перекиси водорода. При этом оптимальной для моделирования окислительного стресса in vitro считалась концентрация Н2О2, при которой внутриклеточный уровень АФК, превышая контрольные значения и вызывая интенсификацию процессов апоптоза, не приводил к возрастанию числа некротизированных клеток в культуре.

Оценка содержания АФК в клетках при добавлении в культуральную среду перекиси водорода в диапазоне концентраций от 10 до 500 мкМ не выявила значимых отклонений исследуемого показателя от аналогичного параметра в контроле (р>0,05) (рис. 1). Полученные нами данные свидетельствуют о сохранении баланса между анти- и прооксидантными системами мононуклеарных лейкоцитов при воздействии указанных концентраций перекиси водорода. Известно, что устойчивость клеток к воздействию Н202 обеспечивается глутатионпероксидазной и каталазной ферментативными системами [Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006].

Добавление перекиси водорода в конечной концентрации 1 мМ в культуру мононуклеарных лейкоцитов приводило к повышению

внутриклеточной продукции АФК в 2,5 раза (р<0,05) (рис. 1), что свидетельствует о нарушении баланса между про- и антиоксидантными системами клетки и может служить признаком дисбаланса окислительного метаболизма.

Помимо окислительного стресса, носящего как адаптивный, так и дезадаптивнын характер, апоптоз является одним из фундаменальных механизмов регуляции клеточного гомеостаза. В связи с этим чрезвычайно интересна взаимозависимость и участие АФК в регуляции клеточного саморазрушения [Зенков Н.К. и соавт., 2001].

14 12 10 8 6 4 2 0

—АФК

* апоптотически измененные клетки

- в - клетки со сниженным трапсмембраиным потенциалом митохондрий

Рис.1. Уровень активных форм кислорода, содержание апоптотических клеток и клеток

со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий в общей популяции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в условиях культивирования in vitro с различными концентрациями перекиси водорода и у больных острыми воспалительными

заболеваниями

Примечание: 1 - интактная культура мононуклеарных лейкоцитов; 2 - инкубирование клеток с 10 мкМ Н2О2; 3 - инкубирование клеток с 50 мкМ Н2О2; 4 - инкубирование клеток с 100 мкМ Н2О2; 5 - инкубирование клеток с 500 мкМ Н2О2; 6 - инкубирование клеток с 1 мМ Н2О2; 7 - мононуклеарные лейкоциты крови, полученные у больных внеболъничной пневмонией; 8 - мононуклеарные лейкоциты крови, полученные у больных острым аппендицитом

Показано, что ранним признаком апоптогенных изменений может служить изменение локализации фосфатидилсерина, а точнее - его перемещение с внутренней стороны клеточной мембраны на внешнюю. Исходя из факта присутствия фосфотидилсерина на поверхности мембраны апоптозных клеток, их регистрация может осуществляться с помощью соединения, обладающего сродством к нему, - ФИТЦ-меченного аннексина V [Van Engeland М. et al., 1998]. Именно такой методологический подход был использован в нашем исследовании.

Добавление в культуральную среду малых концентраций перекиси водорода (10-500 мкМ) не вызывало достоверных изменений количества апоптотически измененных клеток (р>0,05) (рис. 1). Выраженная индукция летальной программы была обнаружена в культуре мононуклеарных клеток, подверженной воздействию 1 мМ перекиси водорода.

Выявленные при экспериментальном окислительном стрессе изменения подтверждают факт участия АФК в индукции и передаче апоптотического сигнала.

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с Нг02 в концентрации, превышающей 1 мМ, приводило к возрастанию в культуре числа некротизированных клеток, определяемых при окраске трепановым синим. Данное обстоятельство заставило нас исключить дальнейшее исследование влияния перекиси водорода в концентрации выше 1 мМ на процесс апоптоза.

Как известно, реализация апоптогенной программы представляет собой три последовательных стадии: инициации, эффекторная и деградации [Thornberry N.A., Lazebnik Y., 1998; Kroemer G., Reed J., 2000]. Исследование различных путей инициации апоптоза способствует более глубокому пониманию механизмов его регуляции при окислительном стрессе, поэтому в ходе настоящего исследования оценивались основные варианты запуска программированной гибели клеток: митохондриальный, рецепторный (TNFa-опосредованный) и ядерный (р53-опосредованный).

В настоящее время накоплено большое количество данных, подтверждающих взаимосвязь между генерацией АФК, функцией митохондрий и реализацией апоптоза [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Показано, что митохондрии могут выступать в качестве мишеней регуляторных молекул при передаче апоптогенного сигнала, а также в роли источника АФК, являющихся сигнальными молекулами данных каскадов [Green D.R., Reed J.C., 1998; Zhu Н„ Bunn H.F., 2001].

Митохондриалъный путь инициации программы апоптоза включает изменения электронного транспорта и клеточного редокс-баланса, потерю митохондриального трансмембранного потенциала, взаимодействие про- и антиапоптотпческих белков семейства Вс1-2, выход апоптогенных факторов (цитохром с, AIF, Smac/DIABLO) [Liu X. et al., 1996; Antonsson В., 2001; Du С. et al., 2000; Wu G. et al., 2000; Joza N. et al., 2001; Li L.Y. et al., 2001; Cory S. et al., 2002]. Последнее возможно только при повышении проницаемости ее наружной мембраны. В связи с этим нами в качестве показателя, характеризующего вовлеченность митохондриального пути в реализацию апопотоза при окислительном стрессе, оценивалась целостность митохондриальных мембран по показателю трансмембранного потенциала. Он является электрохимическим градиентом протонов, создаваемым цепью переноса электронов на внутренней мембране митохондрий. Рассеивание Avj/ может происходить за счет открытия неселективных пор пермеабилизационного перехода между наружной и внутренней мембранами митохондрий [Susin S.A. et al., 1998].

Проведенное нами исследование показало, что добавление в культуральную среду Н202 в диапазоне концентраций от 10 до 500 мкМ не вызывало изменений уровня митохондриального трансмембранного потенциала мононуклеарных лейкоцитов (р>0,05), число аннексин-положительных клеток также не изменялось (рис. 1). В соответствии с гипотезой J.J. Lemasters et al. [1998], уменьшение Aij/ в результате повышения проницаемости наружной митохондриальной мембраны является критическим фактором для развития апоптоза. Оказалось, что число клеток со сниженным трансмембрашшм потенциалом после воздействия 1 мМ перекиси водорода превышало аналогичные значения в контроле в 6,8 раза (р<0,05) (рис. 1), свидетельствуя об активации программированной гибели клеток по митохондриальному пути в условиях окислительного стресса.

Предположение об индукции апоптоза по митохондриальному пути в условиях окислительного стресса подтверждалось наличием положительной корреляции между увеличением числа апоптотически измененных клеток и возрастанием количества мононуклеарных лейкоцитов со сниженным Avj* при окислительном стрессе in vitro (r=0,78, р<0,05). Полученые результаты позволяют сделать вывод о том, что в условиях усиленной внутриклеточной продукции АФК передача сигнала апоптоза сопряжена с дисфункцией митохондрий, выражающейся в повышении проницаемости их мембран и снижении Д\(/.

Другой важнейший путь запуска программы апоптоза. реализуемый в условиях окислительного стресса, - рецепторный [Самуилов В.Д. и соавт., 2000]. Его наиболее распространенный нарианч - индукция легальной про; рам мы клеток с помощью су переем ейства TNF-реценторов [Ярилин А.А., 2001], Данное семейство включает Fas {С95, APÜ-1), TNF-R1, DR3/WSI-1, DR4/TRA1L-R1, DR5/TRAIL-R2 и DR6, «домены смерти» которых находятся в ни то плаз магическом участке и обеспечивают активацию каспазного каскада [Garg А.К.., Aggarwal В.В., 2002].

Проведенная ними оценка содержания клеток, несущих на своей поверхности TNFRI выявила увеличение (в 4.7 раза) количества TNFR I-презентирующих клеток в случае воздействия на культуру мононуклеарных лейкоцитов in vitro i мМ перекиси водорода (р<0,05) (рис. 2), Полученные данные свидетельствуют о повышенной готовности клеток к запуску апоптотической программы по рецепторному пути в условиях окислительного стресса,

А В

П Ин lamïrair 4VJIJ.Ï ура HMÏfti) н pi I мл k.4LU I "i1 ■ Кмкуйи^щканиес t и '•' i'cpff big ..J , ^ .

s Мочонуилмгнчс jKÄettWTW, ЛйЦучваНЫС ¡f &1>1ЩНЫ К SHCGOUHKMlKlA 11N еичишчсй □ M (Ulf I К JI^JIIH I Ji; ЙШИГЬ1. [|алу,[СН u це j- (Ч|ЛЦШ к ÜC1 |I J\J ЛIliL |1 . .

Рис.2. Содерж ание TNFRi—презентирующих клеток (A) и уровень TNFa и cynepimmawnax культур мононуклеарпш лейкоцитов кропи (В) при жеперименпишьном окислительном стрессе и у бальных острыми воспалится ъными заболечаниял ч i

Поскольку запуск TNF-опосредованного апоптоза обусловливается взаимодействием данного цитокина с соответствующим ли га н лом, для нас представляло интерес исследование продукции клетками TNF«, запускающего внутриклеточный каска,'; активации каспаз. Основными

продуцентами TNFa являются моноциты и макрофаги, а также лимфоциты, естественные киллеры и гранулоциты крови [Фрейдлин И.С., 2001].

Оценка содержания TNFa в супернатантах культуры мононуклеарных лейкоцитов у здоровых доноров продемонстрировала, что добавление в культуральную среду перекиси водорода в концентрации 1 мМ не приводило к выраженному увеличению продукции TNFa клетками (р>0,05). Выявленное отсутствие изменений продукции TNFa в условиях окислительного стресса может свидетельствовать о нарушении вовлеченности редокс-сигнальных систем в наработку данного цитокина. Вместе с тем полученные результаты свидетельствуют о повышенной готовности клеток к реализации рецептор-опосредованного пути запуска апоптоза в условиях окислительного стресса in vitro.

Известно, что одной из мишеней АФК в клетке являются нуклеиновые кислоты. Возникающие при этом повреждения ДНК, обусловливающие активацию гена р53, могут приводить к запуску ядерного пути апоптоза [Чумаков П.М., 2000]. Данные, свидетельствующие о вовлеченности р53 в редокс-зависимые пути инициации апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах, представлены в следующих главах.

Активация либо иншбирование программированной гибели клеток, как ведущего механизма ограничения пролиферации клеточных популяций, может лежать в основе развития ряда патологических состояний. С другой стороны, в качестве ведущего патогенетического фактора для большого числа заболеваний выступает окислительный стресс - универсальный механизм повреждения клеток, при котором механизмы генерации АФК являются однотипными. Отличительные особенности образования внутриклеточных АФК можно выявить только на начальных стадиях развития болезни [Дубинина Е.Е., 2001]. Острое воспаление является одним из примеров патологических процессов, характеризующихся как дисбалансом окислительного метаболизма, так и нарушениями реализации апоптоза. При воспалении усиление процессов свободно-радикального окисления сопровождается увеличением наработки АФК, играющих важную роль в регуляции редокс-чувствительных сигнальных систем клетки, экспрессии воспалительных медиаторов, программ выживания или гибели клетки.

Излишняя активация апоптотической гибели клеток может приводить к истощению защитных сил организма, в то время как ее ингибирование - к хронизации воспалительного процесса. Основные эффекторные молекулы воспалительной реакции - АФК, обеспечивая микробицидное, фугицидное и

цитотоксическое действие, могут изменять жизнедеятельность всех клеток организма. В связи с этим в проведенном нами исследовании влияние дисбаланса окислительного метаболизма на программированную гибель мононуклеарных лейкоцитов оценивали на модели острого воспаления (внеболышчная пневмония и острый аппендицит).

Анализ уровня АФК в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у пациентов с острым воспалением, показал увеличение значений указанного параметра по сравнению с таковым в клетках у здоровых доноров в 2,1 раза (р<0,05) (рис. 1). Известно, что воспалительный процесс в тканях сопровождается значительной продукцией АФК, и прежде всего наиболее стабильной их формы - перекиси водорода [Крыжановский Г.Н., 2002]. Образованная при «дыхательном взрыве» перекись водорода может проникать в рядом расположенные клетки, вызывая в них увеличение продукции АФК за счет разобщения окислительного фосфорилирования. Распространяясь таким образом на значительные расстояния в отсутствие прямых межклеточных контактов, Н2О2 приводит к изменениям структуры и функции клеток крови, в частности, к зарегистрированному нами повышению продукции АФК мононуклеарными лейкоцитами крови, полученными у больных острыми воспалительными заболеваниями.

В результате исследования количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови у пациентов с внебольничной пневмонией и острым аппендицитом, было продемонстрировано повышение данного показателя в 7,3 и 7,7 раза, соответственно, по сравнению с нормой (р<0,05) (рис. 1). Влияние окислительного стресса на развитие апоптоза мононуклеарных лейкоцитов подтверждалось наличием положительной корреляции между повышением уровня АФК и возрастанием количества аннексин-положительных мононуклеарных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе (г=0,84, р<0,05) и острых воспалительных заболеваниях (г=0,71, р<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение внутриклеточной продукции АФК является одним из ведущих факторов интенсификации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при воспалении.

Помимо окислительного стресса, апоптоз, как эго показано выше, также относится к типовым универсальным механизмам дизрегуляции клеточного гомеостаза, лежащим в основе развития большого числа распространенных заболеваний, в том числе воспалительных процессов.

Оценка выраженности апоптоза в культуре мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови у пациентов с внебольничной

пневмонией, показала увеличение данного показателя до 9,98(8,79-11,33)% по сравнению с контролем (р<0,05) (рис. 1). Количество апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, полученных у больных острым аппендицитом (10,46(9,83-10,94)%), также достоверно превышало их содержание в норме (р<0,05).

Отсутствие различий показателей апоптотической активности мононуклеарных лейкоцитов у больных острым аппендицитом, определенных с использованием лазерной проточной цитофлуориметрии и TUNEL-мстода (р>0,05), подтверждает адекватность примененного нами аннексинового теста для характеристики реализации летальной программы клеток.

Относительное содержание апоптотическнх клеток в культурах мононуклеарных лейкоцитов у больных острым воспалением (внебольничная пневмония и острый аппендицит) оказалось достоверно ниже их количества при окислительном стрессе in vitro (р<0,05) (рис.1). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что острый воспалительный процесс характеризуется нарушением редокс-гомеостаза и сопровождается активацией процессов апоптотической гибели мононуклерных лейкоцитов крови.

Оценка количества мононуклеарных лейкоцитов со сниженным Avj/ показала, что данная величина при остром воспалении в 5,6 раза превышала аналогичный параметр в контроле (р<0,05) и не отличалась от таковой в случае экспериментального окислительного стресса (р>0,05) (рис. 1).

Таким образом, нарушения баланса окислительного метаболизма мононуклеарных лейкоцитов, как в случае индукции окислительного стресса перекисью водорода, так и в случае острого воспаления (внебольничная пневмония и острый аппендицит) сопровождаются возрастанием числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий.

Численность TNFRl-экспрессирующих клеток, выделенных из крови у больных острыми воспалительными заболеваниями, превышала в 4,5 раза соответствующие параметры в интакгной культуре (р<0,05). По полученным данным, индуцируемый добавлением в культуральную среду перекиси водорода окислительный стресс и острый воспалительный процесс сопровождаются повышением готовности клеток к реализации TNF-опосредованного программированного механизма летальной программы клеток. Подтверждением этому служат результаты проведенной нами оценки продукции TNFa мононуклеарными лейкоцитами крови при

остром воспалении. Анализ уровня продукции TNF-a показал, что величина этого показателя повышалась по сравнению с контролем в культурах мононуклеарных лейкоцитов крови, полученных у больных острым воспалением (р<0,05) и достоверно превышала таковую при окислительном стрессе in vitro (р<0,05).

В целом, проанализировав данные, характеризующие особенности реализации апоптоза при окислительном стрессе, полученные на первом этапе настоящего исследования, можно утверждать, что возрастание уровня АФК в мононуклеарных лейкоцитах крови сопряжено с активацией митохондриальпого и ядерного вариантов запуска апоптотической гибели, а также с повышенной готовностью инициации рецепторного пути (рис. 1).

Следующий этап нашего исследования был посвящен изучению молекулярных редокс-чувствительных механизмов данного явления, позволяющему идентифицировать молекулярные мишени для коррекции нарушений апоптоза при окислительном стрессе.

В настоящее время выявлено большое число сигнальных путей, регулируемых АФК. Среди них в наибольшей степени изучены механизмы, основанные на фосфорилировании и дефосфорилировании белков специфическими киназами и фосфатазами [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. В частности, универсальными трансмиттерами сигналов от множества трансмембранных рецепторов к внутриклеточным компартментам являются МАР-киназы. К числу последних относятся митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38, фосфорилирующие ответственные за реализацию летальной программы клеток белки-мишени, среди которых важное место занимают факторы транскрипции NF-kB и р53 (Gallo К.А., Johnson G. L., 2002). Активируемые киназами NF-kB и р53, в свою очередь, контролируют синтез ключевых белков-регуляторов апоптоза. Выбор про- или антиапоптогенной функции данными элементами сигнальной трансдукции зависит от особенностей инициирующих сигналов, комбинации возможных путей их передачи и типов клеток.

РОЛЬ МАР-КИНАЗ В РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Различные воздействия на клетку - цитокины, гормоны, факторы роста и др. - обусловливают активацию определенных элементов системы сигнальной трансдукции [Гусев Н.Б., 2000]. Ее важнейшими звеньями являются протеинкиназы, активирующие друг друга по каскадному принципу. Особая роль в реализации клеточного ответа принадлежит

редокс-чувствительным MAP (Mitogen-activated protein) киназам (МАРК). Данные киназы представлены тремя семействами: р38 (протеннкиназа 38 к/Да), JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinasc/Stress activated protein kinase) и ERK (Extracellular signal-regulated kinase). Последние ответственны за выживание и пролиферацию клеток, в то время как активация кнназ семейств р38 и JNK7SAPK связана с инициацией апоптоза [Xia Z., Dickens M. et al, 1995; Потехнна E.C., Надеждина E.C. 2002; Gallo K.A., Johnson G.L., 2002; Владимирская Е.Б., 2004].

JNK и p38 протеинкиназы фосфорилируют проапоптотические белки-мишени, связанные с регуляцией программированной клеточной гибели и функционированием соответствующих факторов транскрипции [Влаопулос С., Зумиурлис B.C., 2004]. Вместе с тем, ряд исследований свидетельствуют о наличии антиапоптотической активности JNK и р38 [Zechner D. et al., 1998; Craig R. et al., 2000; Hoover H.E. et al., 2000; Andreka P. et al., 2001], зависящей от природы индуцирующего сигнала, сопутствующих условий стимуляции и типов клеток. В связи с этим возникает необходимость более подробного изучения роли стресс-активируемых протеинкиназ JNK и р38 в реализации легальной программы клеток при окислительном стрессе.

Активация JNK играет ведущую роль в запуске летальной программы клеток в ответ на стресс (воздействие воспалительных цитокинов IL-1 и TNF-a, свободных радикалов и др.) [Srivastava R.K., 1999]. Наиболее подвержен стрессовым воздействиям (в частности, при повреждении белков) механизм активации JNK, связанный с ингибированием JNK-инактивирующих фосфатаз [Влаопулос С., 'Зумиурлис B.C., 2004]. Вместе с тем INK может оказывать и антиапоптогенное действие: выявлена активация процессов NO-индуцированного апоптоза за счет экспрессии доминант-негативной JNK1 либо дошшант-негативной МКК4 [Andreka Р. et al., 2001]. Показано предотвращение апоптоза кардиомиоцитов (в условиях ишемии) ингибированием JNK1 [Hreniuk D. et al., 2001].

JNK может индуцировать апоптоз путем фосфорилирования и активации фактора транскрипции р53 по Thr8 [Влаопулос С., Зумиурлис B.C., 2004]. Известно, что редокс-чувствительная киназа JNK играет важную роль в митохондриальном пути реализации апоптоза [Tournier С. et al., 2000; Aoki H. et al., 2002; Baines C.P., Molkentin J.D., 2002]. Установлено, что JNK-киназа может проникать в митохондрии, где фосфорилирует и активирует проапоптотические белки Вах и Bad, а также инактивирует антиапопготические белки семейства Bcl-2 [Fan M. et al.,

2000; Tournier С. et al., 2000; Chawla-Sarkar M. et al., 2003; Harada C., Nakamura K., 2006]. Так, H. Aoki et al. [2002] показали, что активированные JNK и MKK4, локализованные в митохондриях, индуцируют высвобождение цитохрома с и усиливают апоптоз кардиомиоцитов. В литературе имеются сведения о том, что JNK, независимо от каспазы-8, непосредственно активирует расщепление Bid, облегчая таким образом реализацию митохондриального нути клеточной смерти [Deng J. et al., 2003]. Наконец, JNK киназа прямо фосфорилирует два дополнительных про-апоптотических белка Bim и Bmf, облегчая тем самым их транслокацию в митохондрии [Lei К., Davis R.J., 2003].

Роль р38 в реализации программированной гибели также неоднозначна. Установлено, что трансфекция МКК6 - элемента р38 киназного каскада - вызывает фосфорилирование шаперона а-В-кристаллина, усиливая антиапоптотический эффект [Zechner D. et al., 1998; Craig R. et al., 2000; Hoover H.E. et al., 2000]. По данным С. Communal et al. [2000], ингибирование p38 приводит к увеличению апоптотической активности кардиомиоцитов.

Вместе с тем результаты большого числа исследований свидетельствует о вовлеченности р38 в индукцию летальной программы клеток. Ингибирование р38 блокирует апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный ишемией, в культуре и in vivo [Zhu W. et al., 1999; Kang YJ. et al., 2000; Sharov V.G. et al., 2003]. Активация p38 способствует экспрессии и митохондриальной трансдукции одного из важнейших апоптогенных белков - Вах, опосредуя свое влияние через фосфорилирование р53 [Kim S.J. et al., 2002; Mayr M. et al., 2002].

Таким образом, стресс-активируемые киназы, с одной стороны, являются неотъемлемым элементом системы регуляции летальной программы, а с другой, - играют ключевую роль в процессах пролиферации и дифференцировки клеток. Однако условия и факторы, способствующие проявлению апоптогенной функции MAP киназ (в том числе окислительный стресс), требуют детального изучения.

Для выяснения роли JNK, р38 в регуляции программы апоптоза при окислительном стрессе в нашей лаборатории было проведено двухэтапное исследование. На начальном этапе применялся широко распространенный подход к изучению функций МАР-киназ, основанный на оценке результатов эксперимента при их избирательном блокировании. В нашем исследовании регистрировалась активность процесса апоптоза в культурах клеток, инкубируемых с селективными ингибиторами JNK и р38

(SP600125 и ML3403, соответственно) в присутствии 100 мкМ либо 1 мМ Н202(рис. 3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что добавление ингибитора JNK (так же как и ингибитора р38) в культуру мононуклеарных лейкоцитов крови препятствовало увеличению числа аннексин-положительных клеток прн окислительном стрессе in vitro и снижало их содержание у пациентов с острым воспалением.

Min-Max СИ] 25%-75%

а б и г д е ж

Рис. 3. Содержание апоптотических клеток в общей популяции мононуклеарных лейкоцитов крови, при окислительном стрессе в условиях культивирования in vitro с ингибиторами МАР-киназ

Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование с 1 мМ Н2СЬ п ингибитором ML3403; г - культивирование с 1 мМ Н202 и ингибитором SP600125; д - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительным! заболеваниями; е - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro с ML3403; ж - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro с SP600125

Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали, что ннгибирование МАР-киназ р38 и ЖК препятствует реализации программированной клеточной гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Полученные данные могут служить доказательством того, что в условиях окислительного стресса мононуклеарных лейкоцитов МАР-киназы ЖК и р38 выступают в качестве проапоптогенных регуляторных молекул. Это предположение согласуется с приводящимися в литературе

сведениями о защитной роли ингибиторов р38 и JNK в случае сердечной дисфункции и апоптоза кардиомиоцитов, индуцированного ишемией [Meldrum D.R. et al., 1998; Barancik M. et al., 2000; Schneider S. et al., 2001]. Так, апонтоз кардиомиоцитов, индуцированный ишемией и доксорубицином в культуре, снижался при ингибировашш р38 МАРК [Zhu W. et al., 1999; Kang Y.J. et al., 2000; Sharov V.G. et al., 2003]. V.L.Gabai et al. [2000] показали, что ингибирование JNK в H9c2 мнонитах блокировало апоптоз, вызванный окислительным стрессом.

При обсуждении результатов, полученных в экспериментах с ингибиторами МАР-киназ, возникают следующие вопросы: каковы молекулярные механизмы проапоптогенного эффекта МАР-киназ в условиях изменения редокс-статуса клетки; сопряжена ли данная функция JNK и р38 с увеличением содержания в мононуклеарных лейкоцитах их активных (фосфорилированных) форм, которые могут оказывать воздействие на другие мишени - элементы сигнальной системы (факторы транскрипции, белки-регуляторы апоптоза); чем может быть обусловлено это увеличение -изменением общего содержания кии аз при окислительном стрессе за счет увеличения их экспрессии, либо только активацией процесса фосфорилирования?

Результаты проведенной методом вестерн-блоттинга оценки содержания в мононуклеарных лейкоцитах общих и фосфорилированных форм JNK и р38 показали, что при окислительном стрессе, индуцированном добавлением 1мМ Н202 в культуру клеток, полученных у здоровых доноров, общее содержание JNK (JNK1 и JNK2) и р38 не изменялось по сравнению с контролем. Аналогичные результаты были получены и в клинике острого воспаления - общий уровень JNK и р38 в мононуклеарных лейкоцитах в этом случае соответствовал норме. Вместе с тем содержание фосфорилированных форм МАР-киназ (p-JNK и р-р38) увеличивалось по отношению к контролю при инкубации мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с 1мМ Н202, и в клетках крови у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями (рис. 4, 5). Полученные данные свидетельствуют о том, что при окислительном стрессе увеличение уровня р-JNK и р-р38 обусловлено АФК-зависимой активацией процесса фосфорилирования и не связано с изменением активности экспрессии данных ферментов в клетке.

АФК могут влиять на активность .INK и р38 посредством различных реакций [Brumell J.H., 1996; Турпанов К.Т., 2002; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В частности, АФК активируют белки МАРК Kinase Kinase (в

частности, белок ASK,!- Apoptosis signal-regulating kinase i. активирующий как JNK, так и p38), которые запускают сигнальный каскад [Tobiumc К., et аЦ 2001; Matsuzawa A., Ichijo Н„ 2005]. .INK удерживается в неактивной форме глугатнои-З-транеферазой класса Pi (GSTPi). Под действием Н2Ог происходит диссоциация этого комплекса и активация киназы JNK [Mathers J, et ai.. 2004; Мепыцикова К,Б. и соавт., 2006]. Гидроксиноненаль -конечный продукт перскисного окисления липидов - образует адцукт с JNK, вызывая ее активацию [Дубинина Е.Е., 2001], АФК инактивируют фосфатазы, отщепляйщие фосфатные труппы от специфических ферментов, вызывая тем самым их инактивацию [Klein J.A, Ackerman S.L., 2003; Влаолулос С., Зумпурлис B.C., 2004]. Повышенный уровень АФК часто коррелирует с активацией фосфоршшрования JNK и р38 [Haines С.Р. et ai., 2005: Gautam D.K. et ai., 2005; Teraishi F. et al, 2005; Cho S.D. et ai., 2006j, что подтверждается результатами настоящего исследования.

инпзктиые клетки здоровы* клетки, инкубиронанные клетки, выделенные у

доноров vilrijc < НгОг больных вкв§ольничкой

пневмонией

Рис. 4. Содержание общих и фосфо-форм рЗН МАРК в мононукяеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе (содержание белки р38 в ингпактной культуре здоровых доноров принято ча 100%)

При окислительном стрессе МАР-киназы опосредованно влияют на реализацию программы алоптоза, участвуя в регуляции продукции ряда ЦИТОКИНОВ. В указанном аспекте нами было рассмотрено влияние ЙЖ и р38 на продукцию !Ь-8 и 1!_-10 мононуклеарными лейкоцитами при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении. С одной стороны, продукция 11-8, обусловленная ОТ-кВ-зависимоЙ индукцией промотора гена 1Ь-8, может служить косвенным признаком активации данного транскрипционного фактора, предположительно участвующего в

апоптозе; IL-10 интересовал нас в силу своего антиалоптогенного действия. С другой стороны, данные цитокины обладают про- И антивоспалительным эффектами (IL-8 и IL-10 соответственно), что еще более обосновывает целесообразность оценки их продукции в случае острого воспаления,

% 180 -----

ингэктные кпетки клатки. нн*уб*фо&энные клвт■:.'. выделенные у здоров Hi доноров In vitro с 1 ММ №02 Вольных в небольничной

пневмонией

Рис. 5. Содержание общих и фосфо-форм JNKV2 в моионуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vilro и остром воспалении (содержание JNK1/2 и интакттй культуре у здоровых доноров принято за 100%)

Как свидетельствует проведенное исследование, содержание про воспалительно го цитокина IL-8 в супернатантах исследованных культур мононуклеаров превышает контрольные значения в случае окислительного стресса ill vitro и при остром воспалении. Ре до кс-чувствительна я хиназа JNK (в отличие от р38) влияет на продукцию IL.-8, что подтверждается экспериментом с использованием селективного ингибитора SP600I25; ингибитор р38 МАРК ML3403 не обладает таким эффектом (рис. 6),

Представленные результаты вполне согласуются с данными литературы, в соответствии с которыми ингибитор JNK SP600125 блокирует экспрессию мРНК IL-8 и уменьшает продукцию данного цитокина различными клетками (эндотслиоциты, альвеолоциты А549, бронхиальные эпителйоциты человека) [Li L,F. et а)., 2003; Saafian В. el al„ 2006]. Для экспрессии воспалительных медиаторов — пито кино в, метал лоп роте и 11 аз и адгезивных молекул - необходима активация JNK в присутствии АФК [Kathleen A., Johnson G. L, 2002; Влаопулос С.. Зумпурлис B.C., 2004].

Регуляция IL-8 МАР-кшшами отличается в зависимости от природы стимулов [Shapiro L„ Diiiarello С.А., 1995: Li L.F. et ai., 2003: Kim M.S. et ai.,

2005; Harimaya A. et al., 2007] и типа клетки [Hashimoto S. et al., 1999; Li J. et al., 2002; Oudin S., Pugin J., 2002; Li L.F. et al., 2003; Aydin M. et al., 2007]. Окислительный стресс, вызванный экзогенной Н202, индуцирует синтез IL-8 в эпителиальных н эндотелиальных клетках [Lakshminarayanan V. et al., 1997; Shimada Т. et al., 1999]. Этот факт подтверждают и результаты проведенного нами эксперимента. После культивирования мононуклеарных лейкоцитов крови, полученной у здоровых доноров, с 1 мМ Н202 определялось, как было показано выше, повышенное содержание 1L-8 в супернатантах клеток (рис. 6).

абвгдежз

Min-Max CZj 25%-75% а медиана

Рис. 6. Содержание ILS в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов при ингибировании МАР-киназр38 и JNK в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование клеток с 1 мМ ibCb и ингибитором JNK SP600125; г - культивирование клеток с 1 мМ Н2О2 и ингибитором р38 ML3403; д - нитактная культура клеток у больных острым аппендицитом; е - интактная культура клеток у больных внеболышчной пневмонией; ж -инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором JNK. SP600125; з - инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором рЗВ ML3403

Роль р38 МАР-киназы в регуляции синтеза IL-8 неоднозначна. Так, по данным ряда авторов, ингибитор р38 МАРК (SB 203580) значительно снижает продукцию данного цитокина, опосредуя свое действие через NF-kB [Kim M.S. et al., 2005; Saatian B. et al., 2006; Harimaya A. et al., 2007]. Напротив, L.F. Li et al. (2003) показали, что интбирование p38 МАРК не вызывает снижение экспрессии и секреции IL-8, предположив, что регуляция данных процессов

осуществляется через активацию АР-1, NF-kB, зависящую от JNK и NIK (NF-kB-inducing kinase).

Еще одним важным цитокином, продуцируемым мононуклеарными лейкоцитами крови при острых воспалительных заболеваниях, сопровождающихся окислительным стрессом, является интерлейкин-10. Известно, что IL-10 способен подавлять апоптоз [Go N.F. et al., 1990]. Имеются многочисленные сведения о способности этого цитокина ингибировать апоптоз B-лимфоцитов, активированных Т-клеток [Pawelec G. et al., 1996; Cohen S.B. et al., 1997; Рубцова И.Е. и соавт., 2004].

Результаты проведенного нами исследования свидетельствуют об отсутствии изменений содержания IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов как в случае окислительного стресса in vitro так и при острых воспалительных заболеваниях.

Для выяснения роли р38 и JNK МАР-киназ в регуляции синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса мы использовали их селективные ингибиторы (ML3403 и SP600125, соответственно). В результате настоящего исследования было показано, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма ни р38, ни JNK не влияют на продукцию ILIO мононуклеарами. Отсутствие изменений синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса и при ингибировании МАР-киназ наводит на мысль об отсутствии участия обозначенных редокс-сигнальных систем в продукции данного цитокина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что роль киназ JNK и р38 в регуляции апоптоза и продукции клетками IL-8 и IL-10 в условиях острого воспаления весьма неоднозначна. Факт возрастания продукции IL-8 может свидетельствовать об активации в условиях воспалительного процесса JNK транскрипционных факторов (в частности, NF-kB). Последний в ряде случаев может выполнять как про-, так и антиапоптогенную функцию. Отсутствие возрастания продукции антиапоптотического цитокина IL-10 может являться одним из условий для активации летальной программы клеток. Кроме того, в рассмотренных условиях имеет место отчетливый дисбаланс между продукцией про- и антивоспалительных цитокинов (IL-8 и IL-10, соответственно) в пользу первых.

В целом, рассмотренные в данной главе результаты исследования свидетельствуют об участии МАР-киназ JNK и р38 в реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе в условиях in vitro и в клинике острого воспаления.

Регуляторное влияние данных МАР-киназ может быть опосредовано другими редокс-чувствительными элементами внутриклеточных систем сигнальной трансдукции, в частности транскрипционными факторами. Среди последних важнейшую роль в инициации/блокировании летальной программы клеток играют р53 и NF-kB, влияющие на баланс про- и антиапоптогенных белков-регуляторов.

УЧАСТИЕ РЕДОКС-ЧУВСТВИТЕЛЬИЫХ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Известно, что АФК влияют на жизнеспособность клетки, изменяя экспрессию генов за счет транскрипционных факторов, которые связываются с регионами генов-мишеней и изменяют их транскрипцию. Находясь в цитоплазме в неактивном состоянии, данные факторы не могут влиять на генетическую информацию. Сигнальное событие (непосредственное воздействие АФК, фосфорилирование киназами и др.) приводит к транслокации белковых субъединиц транскрипционного фактора в ядро [Wenger R.H., 2000].

Одним из важнейших редокс-регулируемых транскрипционных факторов является р53. Под контролем р53 находится огромное число генов, белковые продукты которых в ответ на различные стрессорные воздействия индуцируют апоптоз, клеточное старение или арест деления клетки [Моргункова А. А., 2005]. Другим транскрипционным фактором, активирующимся в условиях окислительного стресса, является NF-kB. Данный протеин играет существенную роль в регуляции иммунного ответа, воспалительной реакции, а также в контроле клеточного деления и апоптоза [Pähl H.L., 1999; Bonizzi G., Karin M„ 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006].

Механизмы взаимодействия транскрипционных факторов NF-kB и р53 относятся к числу наиболее противоречивых вопросов в оценке влияния геногоксического стресса на жизнедеятельность клетки. Несмотря на накопленный к настоящему времени фактический материал о роли NF-kB и р53 в жизнедеятельности клетки, существуют значительные пробелы в оценке исходов активации данных транскрипционных факторов в зависимости от природы индуцирующего сигнала и сопутствующих условий стимуляции. Неоднозначность влияния данных транскрипционных факторов на реализацию апоптоза затрудняет понимание их участия в возникновении нарушений летальной программы

клеток при окислительном стрессе. Данное обстоятельство явилось предпосылкой для проведения нами исследования роли NF-kB и р53 в реализации прогаммированной гибели при дисбалансе окислительного метаболизма.

Методом вестерн-блоттинга нами было зарегистрировано появление р53 в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров, после воздействия на клетки перекиси водорода в концентрации 1мМ; примечательно, что данный белок отсутствовал в контроле и в клетках, полученных у больных пневмонией. По данным литературы, р53 имеет короткий период полужизни и, в зависимости от типа клеток и природы стрессового сигнала, инактивируется в течение 6-20 мин MDM2 убиквитин-лигазой [Doman D. et al., 2004]. Отсутствие р53 в мононуклеарах, выделенных из периферической крови у больных внебольничной пневмонией, несмотря на высокий уровень внутриклеточной продукции АФК, может быть обусловлено, на наш взгляд, образованием комплекса p53-MDM2 в результате более продолжительного, по сравнению с экспериментальной моделью, нарушения окислительного баланса в организме.

Результаты исследования свидетельствуют, что при культивировании мононуклеарных лейкоцитов с селективными ингибиторами JNK и р38 в условиях эксприментального окислительного стресса имеет место снижение содержания фосфо-формы белка р53 (рис. 7). Следует заметить, что применение как ингибитора JNK (SP600125), так и р38 (ML3403) предотвращало запуск апоптогенной программы, индуцированной окислительным стрессом. Таким образом, полученные данные подтверждают факт участия редокс-чувствительных киназ JNK и р38 в р53-опосредованном апоптозе. С позиции р53 могут быть объяснены выявленные нами особенности реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе.

Известно, что р53 необходим для реализации митохондриального пути апоптоза [Juin P. et al., 2002; Moll U.M. et al., 2005]. Он способствует снижению трансмембранного митохондриального потенциала и выходу цитохрома с в цитоплазму, так как связывает антиапоптотические протеины Вс1-2 и Bcl-XL [Prives С., Hall P.A., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. Как свидетельствуют данные литературы, р53 способен осуществлять транскрипционный контроль апоптотических протеинов семейства Вс1-2 (мультидоменный Вах, только-ВНЗ протеины: PUMA, Noxa, Bid) [Nakano К., Vousden K.H., 2001; Oda E. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002].

100 80 60 40

20 0

клетки, инкубированные клетки, инкубированные с клетки, инкубированные с

in vitro с 1 мМ НгОг 1 мМ Н2°2 и ML3403 1 мМ Н2О2 и SP600125

Рис. 7. Содержание фосфо-формы р53 в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров в условиях окислительного стресса при ингибировании

МАР-киназр38 uJNK (уровень фосфо-формы р53 в культуре мононуклеарных лейкоцитов в условиях инкубирования с 1мМ Н2О2 принят за 100%)

Транскрипционный фактор NF-kB сформирован из нескольких субъединиц (чаще всего из p50/ReIA(p65) частиц) [Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. Анализ содержания р65 субъединицы в мононуклеарных лейкоцитах показал, что данный белок появляется в клетках, полученных у здоровых доноров, после воздействия на них 1 мМ Н202 и присутствует в мононуклеарных лейкоцитах, выделенных из крови у больных внебольничной пневмонией. Индукция NF-kB происходит при высвобождении р65 частицы из комплекса с ингибитором за счет фосфорилирования последнего IkB-киназным комплексом. Подобный «классический» вариант активации наблюдается при воздействии воспалительных цитокинов, таких как TNF-a и 1L-1, под влиянием бактериальной инфекции и липополисахаридов [Haddad J., 2002]. Также активация NF-kB может быть опосредована каскадом TNFa-TNFRl-TRADD-RIP-NIK-KHHa3a-NF-kB и атипичными индукторами (УФ-излучение, гипоксия/реоксигенация, перекись водорода, лекарственные вещества) [Mukhopadhyay А. et al., 2000; Bui N.T. et al., 2001; Bonizzi G., Karin M., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. В нашем случае при добавлении экзогенной перекиси водорода в культуру клеток, полученных у здоровых доноров и больных острым воспалением, в мононуклеарных

лейкоцитах происходило появление активной формы NF-kB. Полученные результаты позволяют предполагать доминирующую роль АФК в индукции данного транскрипционного фактора при дисбалансе окислительного метаболизма. Возможно, активирующие сигналы при остром воспалении (TNF-a, бактериальные липополисахариды), наряду с АФК, приводят к высвобождению NF-kB из комплекса с ингибитором. Однако показано, что р65 субъединица вызывает индукцию генетической транскрипции IkB частицы, которая может связаться с NF-kB и вернуть его в неактивное состояние [Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Viatour P. et al., 2005]. Подобная негативная регуляция функции NF-kB может объяснять одинаковый уровень данного транскрипционного фактора в клетках при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении.

Таким образом, в нашей работе продемонстрирована редокс-зависимая активация NF-kB — фактора, ответственного за выживание клеток и пролиферацию [Kucharczak J. et al., 2003; Perkins N.D., 2004], и р53, индуцирующего апоптоз [Schmitt С.А. et al., 2002; Soussi T., 2005; Levine A. et.al., 2006], на что указывало появление р53 и незаингибированной формы NF-kB в мононуклеарных лейкоцитах крови под действием 1 мМ перекиси водорода. Однако, как свидетельствуют полученные ранее данные, результирующим вектором актвации р53 и NF-kB является повышение апоптотической реакции клеток, что свидетельствует о неэффективности антисуицидальной регуляции NF-kB. Показано, что указанные транскрипционные факторы конкурируют между собой за один пул генов-коактиваторов, поэтому недостаток транскрипционной активности NF-kB связывают с ее повышением для р53 [Mattson М.Р., Meffert M.K,, 2006].

В литературе существует ряд гипотез, объясняюнщх отсутствие антиапоптотического эффекта активации NF-kB. Так, по данным N.D. Perkins, T.D. Gilmore [2006], функция NF-kB из антиапоптотической может трансформироваться в проапоптотическуто в зависимости от природы индуцирующего сигнала. Существует другая гипотеза, объясняющая проапототическую роль NF-kB под действием ряда стимулов (например, УФ-излучение, доксорубицин). Показано, что высвобождение RelA субъединицы из комплекса с ингибитором является лишь первым этапом функционирования NF-kB. Вторая фаза заключается в перемещении транскрипционного фактора из цптоплазмы в ядро, при котором может происходить модификация NF-kB, приводящая к изменению его транскрипционного потенциала [Chen L.F., Greene W.C.,

2004]. Однако итоговый результат транскрипционной активности NF-kB и р53 определяется во многом особенностями ответа генов-мишеней [Но W.C-. et al„ 2005]. В связи с этим следующим шагом нашего исследования явилась оценка экспрессии м-РНК и содержания белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе.

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Среди генов, являющихся мишенями NF-kB и р53, важную роль в регуляции летальной программы клеток играют гены, кодирующие белки семейства Вс1-2 с про- и антиапоптотической функцией. Баланс системы этих белков определяет исход индукции программированной гибели. Данное соотношение может определяться как активацией экспрессии соответствующих генов, так и посттрансляционной модификацией протеинов [Wenger R.H., 2000; Chen L. et al., 2005]. Чтобы выяснить, вовлечены ли указанные механизмы в дизрегуляцию апоптоза клеток при окислительном стрессе, нами было проведено исследование, результаты которого отражены в данной главе.

Про- и антиапоптогенные белки регулируют реализацию программы апоптоза, а модуляция баланса различных активирующих и шггибирующих взаимодействий данных протеинов играет определяющую роль в судьбе клетки. В связи с этим при изучении молекулярных механизмов регуляции летальной программы в условиях окислительного стресса особый интерес для нас представляло исследование экспрессии и содержания про- и антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-XL, Вах, Bad). Мы исходили из предпосылок, что взаимодействие данных протеинов определяется состоянием редокс-зависимых сигнальных систем клеток, включающих в том числе МАР-киназы и факторы транскрипции NF-kB и р53. Если МАР-киназы могут непосредственно фосфорилировать белки-регуляторы апоптоза, действуя на посттрансляционном уровне, то транскрипционные факторы изменяют экспрессию соответствующих генов-мишеней. Исходя из данного предположения, в нашем исследовании определялись экспрессия м-РНК и содержание белков в мононуклеарных лейкоцитах при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении. Кроме того, для оценки роли редокс-чувствительных МАР-киназных систем сигнальной трансдукции в механизмах нарушения баланса про- и антиапоптогенных белков при окислительном стрессе, было исследовано

содержание Вс!-2 и Вах в мононуклеарных лейкоцитах, инкубированных с селективными ингибиторами SP600125 и ML3403.

Полученные методом ПЦР в реальном времени данные свидетельствуют о повышении по сравнению с контролем (р<0,05) уровня экспрессии мРНК гена bcl-XL в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении (табл. 2).

Таблица 2

Уровень экспрессии мРНК (усл.ед.) генов bcl-2, bcl-XL и bax в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров, при экспериментальном окислительном стрессе и у больных внебольничной пневмонией (Me(Ql-Q3))

Регистрируемый показатель Ингактные клетки Клетки, инкубированные с 1мМ н2о2 Клетки, полученные у больных внебольннчной пневмонией

bax 0,39(0,23-0,63) 1,64(1,02-1,96) р,<0,05 1,21(1,02-1,45) pi<0,05 р2>0,05

bcl-XL 0,50(0,35-0,60) 1,79(1,52-2,27) р,<0,05 0,89(0,69-1,64) pi<0,05 рр-0,05

bcl-2 1,67(1,37-2,96) 3,23(2,63-3,71) pi>0,05 2,77(1,79-4,13) pi>0,05 рг>0,05

Примечание:

р] - достоверность различий по сравнению с аналогичными показателями в интактной культуре мононуклеарных лейкоцитов; щ - по сравнению с окислительным стрессом ш \'Иго.

Известно, что ген Ьс1-Хь кодирует антиапоптотический белок семейства Вс!-2 и является мишенью ОТ-кВ [КисЬагсгак X е1 а!., 2003]. В связи с этим логично было бы ожидать, что активация ОТ-кВ приводит к индукции антисуицидальных генов-мишеней. Вместе с тем, как свидетельствуют представленные выше данные, несмотря на адекватную стимуляцию ОТ-кВ-зависимого антиапоптотического ответа, мононуклеарные лейкоциты вступают на путь программированнной гибели в условиях увеличения внутриклеточной АФК-продукции. При этом исследование содержания Вс1-Хь в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров (интактная культура, экспериментальный окислительный стресс) и у пациентов с острым воспалением не выявило различий (рис. 8). Полученные данные, вероятно, правомерно объяснить постгрансляционной модификацией Вс1-Хь приводящей к изменению его нативной структуры и функции. В частности, возможна модификация

указанного бедка в результате фосфорилирования или взаимодействия с регуляторными ВНЗ-протеинами [Willis S.K. et at, 2005].

Анализ уровня экспрессии мРНК гена Ьс1-2 и содержания антианонтотическш о белка Вс]-2 в мононукдеарных лейкоцитах не выявил каких-либо достоверно значимых различий пи сравнению с контролем в случае воздействия Н:0> на клетки здоровых доноров и в случае острого воспаления. А

зео

150 100

200 150 з: 100

Рис .<? Содержании Ваг (А). НЫ-2 (В) и Bel -Xt. (С) в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении (содерж ание белков в интактной культуре здоровых доноров принято за 100%)

Описанные результаты исследования являются косвенным доказательством отсутствия редокс-чувствителыюго механизма регуляции активности ßcl-2 или подавления функции данного белка при дисбалансе оки с лиге л ьио; о метаболизма. Для того, чтобы проверить данное предположение, мы оценивали внутриклеточное содержание В с]-2 при окислительном стрессе в присутствии ингибиторов МАР-кииаз SP600125 и ML3403. Оказалось, что уровень белка Вс1-2 а мононуклеарных лейкоцитах крови, полученной у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, возрастал как при действии ингибитора SP600125, так и ML3403. Это свидетельствовало в пользу того, что ШАРК-опосредованные

шщщш I

200 (so ^ 100 j 50 ; 8

_L. —t—

! ■

и йнгактные клегки. полученные у здоройых доноров:

в клетки, инхубироавяные tn vi !го с 1 мМ Нг02;

' клетки, выделенные у больных вн ебол ьничн ой пно вмон ней

редокс-чувствительные механизмы препятствуют увеличению содержания антиапоптотического Вс1-2 в клетках при окислительном стрессе.

Исходя из полученных данных, отсутствие адекватного увеличения содержания в клетках антисуицидальных белков Bcl-XL и Вс1-2 в ответ на апоптогенный стимул при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении может быть причиной зарегистрированного нами повышения количества аннексин-положительных мононуклеарных лейкоцитов.

Следующим этапом нашего исследования было изучение содержания и экспрессии генов проапоптотических белков в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе. Оценка уровня мРНК гена Ьах продемонстрировала статистически достоверное возрастание содержания мРНК гена Ьах относительно контрольного значения (р<0,05) в мононуклеарных лейкоцитах у больных с острым воспалением, а также в условиях экспериментального окислительного стресса. Вместе с тем, значимые различия экспрессии мРНК Ьах при окислительном стрессе in vitro и внебольничной пневмонии (р>0,05) отсутствовали.

Известно, что ген Ьах является мишенью транскрипционного фактора р53 [Sax J.K. et al., 2002]. С нашей точки зрения, увеличение экспрессии указанного гена свидетельствует об эффективной трансактивационной функции р53 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Отсутствие различий экспрессии Ьах при окислительном стрессе in vitro и в случае острого воспаления позволяет предположить схожий механизм активации р53 в обеих ситуациях, несмотря на отсутствие белка р53 (за счет образования комплекса p53-MDM2) в клетках, полученных у больных внебольничной пневмонией.

Анализ внутриклеточного содержания проапоптотического протеина Вах, проведенный методом вестерн-блоттинга, показал, что в мононуклеарных клетках крови у пациентов с острым воспалением величина исследованного параметра превышала контрольные значения. Инкубация мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с 1 мМ перекисью водорода приводила к возрастанию уровня Вах по сравнению с нормой, который, однако, не отличался от соответствующего параметра в группе больных острым воспалением. Добавление в культуральную среду ингибиторов МАР-киназ SP600125 и ML3403 снижало содержание белка Вах в мононуклеарных лейкоцитах у больных с острым воспалением. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении

редокс-чувствительных механизмов в регуляцию содержания проапототического белка Вах при окислительном стрессе.

Поскольку важную роль в регуляции взаимоотношений между анти-и проапоптотическими белками семейства Вс1-2 играет группа ВНЗ-только протеинов (Bad, Bim, tBid, PUMA, Noxa и др.), нами также была проведена оценка экспрессии мРНК гена bad и содержания белка Bad в моноиуклеарных лейкоцитах в условиях окислительного стресса. Данный белок, а также мРНК гена bad, не были выявлены в мононуклеарных лейкоцитах у здоровых доноров (интактные культуры), при индукции окислительного стресса перекисью водорода и в случае острого воспаления. Полученные данные указывают на отсутствие активации транскрипции гена bad при окислительном стрессе.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о повышении экспрессии мРНК генов как анти-, так и проапоптотических белков (Bc1-Xl и Вах, соответственно) в мононуклеарных лейкоцитах у здоровых доноров (при добавлении в культуральную среду 1 мМ перекиси водорода) и у больных с внебольничной пневмонией. При этом изменения уровня мРНК гена bcl-2, обладающего антисуицидальной активностью, отсутствовали во всех случаях, а экспрессия мРНК гена bad в нашем иследовании обнаружена не была. Поскольку ген bcl-xL является мишенью ядерного фактора NF-kB, а ген Ьах - транскрипционного фактора р53, нами было высказано предположение, что в условиях окислительного стресса происходит активация данных транскрипционных факторов, выполняющих анти- и проапоптотические функции, соответственно. Проведенное нами исследование содержания белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2 свидетельствует о возрастании содержания проапоптотического протеина Вах в мононуклеарных лейкоцитах крови как в случае экспериментального окислительного стресса, так и при остром воспалении. Отсутствие изменений внутриклеточного уровня антиапоптотических Bcl-XL и Вс1-2 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма может обусловливаться как посттрансляционными модификациями данных белков, так и регулирующим влиянием МАР-киназных каскадов (в случае Вс1-2) (рис. 9).

Рис 9. Роль элементов внутриклеточной сигнальной трансдукции в механизмах дизрегуляции апоптоза при окислительном стрессе (по данным литературы и результатам собственных исследований (выделено))

важную роль в реализации летальной программы клеток играют МАРКИ пазы и р38. Активация факторов транскрипции ЫРчсВ и р53 (за счет их фосфорилирования МАР-киназами и/или воздействия АФК) приводит к

изменению уровня экспрессии генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза семейства Вс1-2. Последние играют решающую роль в выборе клеточного ответа при окислительном стрессе. Данные протеины могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, под влиянием вышестоящих компонентов редокс-чувствнтельных сигнальных систем, а также окислительной модификации. Наряду с этим, АФК выступают в роли вторичных мессенджеров, опосредующих активацию ключевых белков-регуляторов апоптоза.

Идентифицированные нами редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем, участвующих в модуляции программы апоптоза при окислительном стрессе, могут выступать в качестве мишеней для терапевтической коррекции нарушений летальной программы. Полученные данные в дальнейшем послужат основой для разработки способов управления программированной гибелью клетки при патологиях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма, с применением молекул, опосредованно регулирующих функцию про- и антиапоптогенных сигнальных систем. Это позволит повысить эффективность существующих методов патогенетической терапии большого числа социально-значимых заболеваний, характеризующихся дизрегуляцией клеточной гибели.

ВЫВОДЫ

1. В условиях экспериментального окислительного стресса, индуцированного воздействием на мононуклеарные лейкоциты крови 1 мМ Н202, увеличение числа апоптотически измененных клеток сопряжено с активацией митохондриального и TNFa-опосредованного рецепторного путей запуска летальной программы клеток.

2. В процессе реализации летальной программы мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе in vitro участвуют редокс-чувствнтельные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем (МАР-киназы р38 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53).

3. В условиях дисбаланса окислительного метаболизма в мононуклеарных лейкоцитах активация апоптогенной системы сигнальной трансдукции, осуществляемой с участием редокс-чувствительных МАР-киназ JNK и р38, сопряжена с увеличением уровня их фосфо-форм.

4. При окислительном стрессе in vitro селективное ингибирование редокс-чувствитедьной киназы JNK SP600125 приводит к снижению продукции мононуклеарными лейкоцитами IL-8. В условиях дисбаланса

окислительного метаболизма МАР-киназы р38 и JNK не участвуют в регуляции продукции IL-10.

5. Активация фактора транскрипции р53 в условиях окислительного стресса в клетках обусловлена его фосфорилированием МАР-киназами и/или непосредственным эффектом АФК.

6. При окислительном стрессе in vitro в мононуклеарных лейкоцитах увеличивается содержание проапоптотического белка Вах, не изменяется содержание антиапоптотических белков Вс1-2 и Вс1-Хь проапоптотический белок Bad в клетках отсутствует.

7. Механизмы изменения экспрессии генов bcl-XL и Ьах при окислительном стрессе связаны с активацией транскрипционных факторов р53 и NF-kB.

8. При остром воспалителительном процессе (острый аппендицит, внебольничная пневмония), сопровождающемся нарушениями окислительного метаболизма, молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза сопряжены с активацией МАР-киназ, факторов транскрипции, нарушением баланса про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2.

9. Редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем (МАР-киназы р38, JNK, факторы транскрипции и белки семейства Вс1-2) являются молекулярными мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы при окислительном стрессе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Состояние митохондриального пути апоптоза лимфоцитов крови при хронических вирусных гепатитах / О.Б. Жукова, Л.С. Литвинова, В.В. Новицкий, И.О. Наследникова, Н.Ю. Часовских // Тезисы докладов 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины».- Астрахань, 5-10 мая 2006,- Астрахань,- 2006,- С. 126.

2. Цитокины и противовирусный иммунитет / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, В.В. Белоконь, А.П. Зима, О.Б. Жукова, И.О. Наследникова, Л.С. Литвинова, Ю.В. Колобовникова, Н.Ю. Часовских // Успехи физиологических наук. - 2006. - Т. 37, № 4. - С. 34-44.

3. Влияние рекомбинантных форм интерлейкинов-5, -3 и эотаксина на апоптоз эозинофильных гранулоцитов / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Л.С. Литвинова, С.Б. Ткаченко, Ю.В. Колобовникова, О.Б. Жукова, Е.С. Григорьева, Е.В. Суворова, E.H. Кнутарева, Т.Т. Радзивил, Н.Ю. Часовских

// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2007. — Т. 143, № 4.-С. 370-373.

4. Модуляция программируемой гибели лимфоцитов периферической крови при хронической вирусной инфекции / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева,

B.В. Новицкий, Т.Т. Радзивил, Л.С. Литвинова, Н.Ю. Часовских // Цитология. - 2007. - Т. 49, № 1. - С. 26-31.

5. Изменение реакции лимфоцитов крови на апоптозмодулирующие факторы при вирусной инфекции / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Т.Т. Радзивил, Л.С. Литвинова, Н.Ю. Часовских // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - Т. 128, № 6. - С.44-48.

6. Стресс-активируемая протеинкиназа JNK - молекулярная мишень для коррекции дизрегуляции апоптоза при патологических состояниях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др. // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения, больных в многопрофильном лечебном учреждении» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007.- Вестник Российской военно-медицинской академии (приложение). - Санкт-Петербург. - 2007. -

C. 497.

7. Ингибиторование мигоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK как молекулярный механизм коррекции нарушений программированной гибели клеток при воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др.// Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения, больных в многопрофильном лечебном учреждении» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007.- Вестник российской военно-медицинской академии (приложение). - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 497-498.

8. Часовских, Н.Ю. Влияние окислительного стресса на реализацию апопототической программы мононуклеаров периферической крови в условиях in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова // Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. -Санкт-Петербург, 2007. - С. 139.

9. Часовских, Н.Ю. Роль протеинкиназ Р38 и JNK (C-Jun NH2-terminal kinases) в дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова / Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург - 2007. - С. 140.

10. Часовских, Н.Ю. TNFR-1 опосредованный и митохондриальный пути запуска апоптотической программы в условиях окислительного стресса in vitro / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова // Материалы межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» - г. Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 141.

11. Митохондриальный, TNF- и р53-опосредованные пути реализации апоптотической программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Н. Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Е.В. Кайгородова и др. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» - г. Абакан, 17-19 мая 2007. - Абакан, 2007,- С. 29-30.

12. Часовских, Н.Ю. Молекулярные механизмы реализации апоптотической программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» г. Томск, 17-18 мая 2007,- Томск, 2007,- С. 208-209.

13. Кайгородова, Е.В. Роль митоген-активируемых протеинкиназ JNK(C-Jun NH2-terminal kinases) и p38 в регуляции апоптоза мононуклеаров периферической крови в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении / Е.В. Кайгородова, Н.Ю. Часовских // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» Томск, 17-18 мая 2007.- Томск. - 2007.- С. 182-183.

14. Дизрегуляция летальной программы мононуклеаров в условиях окислительного стресса / Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Ю.В. Стариков и др. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - г. Новосибирск, 7-9 ноября 2007. - Медико-фармацевтический журнал. -Новосибирск, 2007. - С.85.

15. Роль протеинкиназ JNK и р38 в реализации программы апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса in vitro / Н. Ю.Часовских, Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова и др. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» - Новосибирск, 7-9 ноября 2007. - Медико-фармацевтический журнал. - 2007. - С. 84-85.

16. Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Н.Ю. Часовских и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. - №3,- С. 251-254.

17. Роль митогенактивированных протеинкиназ JNK и р38 в регуляции апоптоза мононуклеаров крови в условиях окислительного стресса in vitro /

Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, НЛО. Чаеовеких и др. // Бюллетень экспериментальной биологин и медицины. — 2008. - №5,- С. 505-509.

18. Редокс-завнсимая регуляция апоптоза: адаптивная роль активных форм апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Чаеовеких и др. // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. - 2008. - Т. 94, № 6. - С. 710-718.

19. Чаеовеких, Н.Ю./ Роль протеинкиназ JNK и р38 в регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе И Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - № 3. - С.38-42.

20. Регулягорная роль оксида азота в апоптозе нейтрофилов / Е.А. Степовая, Т.В. Жаворонок, Ю.В. Стариков, В.А. Бычков, Н.Ю. Чаеовеких и др.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - № 12. -С. 646-650.

21. Чаеовеких, Н.Ю. Аиоптоз и окислительный стресс / Н.Ю. Чаеовеких, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2009. - 148 с.

22. Белки семейства Вс1-2 участвуют в редокс-зависимой дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при воспалении / Н.Ю. Чаеовеких, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий и др. // Иммунология. - 2009. - Т. 30,№2.-С. 98-101.

23. Роль факторов транскрипции р53 и NF-кВ в редокс-зависимой дизрегуляции апоптоза / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Н.Ю. Чаеовеких и др. // Вестник РАМН. - 2009. - № 4. - С. 3-10.

24. Роль редокс-зависимых сигнальных систем в регуляции апоптоза при окислительном стрессе / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Н.Ю. Чаеовеких и др. // Цитология. - 2009. - Т. 51, № 4. - С. 329-334.

25. Митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38 являются редокс-завнеимыми молекулярными мишенями нарушения апоптоза при окислительном стрессе ! Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Е.В. Кайгородова, Н.Ю. Чаеовеких, Е.Г.Старикова // Успехи физиологических наук. - 2009. — Т. 40, №2.-С. 3-11.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат УФ-нзлучение - ультрафиолетовое излучение ANT — транслокатор адениловых нуклеотидов IkB - ингибитор kappa В VDAC - порин-вольтаж зависимый канал

Подписано в печать 15.06.2009 г. Формат 60х841/16. Бумага офсетная № 1. Печать ризография. Печ. л. 2,88; усл. печ. л. 2,67; уч.-изд. л. 3,07. Тираж 100. Заказ № 490.

Типография «Иван Фёдоров» 634009, г. Томск, Октябрьский взвоз, 1 Тел.: (382-2)-51-32-95, тел./факс: (382-2)-51-24-20 E-mail: mail@if.tomsk.ru

Оглавление диссертации Часовских, Наталия Юрьевна :: 2009 :: Томск

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Молекулярные основы взаимоотношений окислительного стресса и апоптоза (обзор литературы).

1.1. Окислительная регуляция и дизрегуляция клеток.

1.2. Феномен программированной клеточной гибели.

1.3. Регуляция апоптоза.

1.3.1. Редокс-чувствительные механизмы регуляции апоптоза.

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Часовских, Наталия Юрьевна, автореферат

Актуальность исследования.

На современном этапе развития зарубежной и отечественной медико-биологической науки накоплен большой объем знаний о механизмах повреждения и адаптации клеточных систем при патологических процессах разного генеза. В центре внимания исследователей находятся ключевые механизмы регуляции апоптоза, который представляет собой активную форму клеточной гибели и является физиологическим механизмом устранения избыточных и/или функционально аномальных клеток. Известно, что развитие различных болезней (злокачественные новообразования, сердечно-сосудистые, нейродегеперативные, острые и хронические воспалительные процессы, сахарный диабет и др.) связано с нарушениями механизмов реализации апоптоза, приводящими к его излишнему активированию или ингибированию [65; 179]. Наряду с этим важным звеном патогенеза данных заболеваний является дисбаланс окислительного метаболизма [45].

Развитие окислительного стресса при ряде патологий обусловлено резкой интенсификацией процессов свободно-радикального окисления и/или снижением резерва антиоксидантной защиты, что приводит к значительному накоплению активных форм кислорода (АФК) [99]. Последние вызывают окислительную модификацию белковых и липидных молекул, повреждение ДНК, нарушение структуры мембран и др. [42; 141; 469]. Вместе с тем известно, что АФК являются внутриклеточными мессенджерами, участвующими в регуляции различных клеточных процессов, в частности -апоптоза [74; 338].

Влияние АФК на про- и антиапоптотические мишени и механизмы осуществляется непосредственно или через внутриклеточные редокс-зависимые сигнал-передающие системы [65]. При этом в клетке может происходить одновременная активация нескольких молекулярных путей, взаимодействующих между собой.

Индуцирующие апоптоз сигналы стимулируют множество киназ, включая митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38. Последние воздействуют на белки-мишени, связанные с функционированием факторов транскрипции и регуляцией программированной клеточной гибели: р53, NF-кВ, АР-1 и др. [65; 248]. Под контролем редокс-чувствительных транскрипционных факторов находится синтез белков семейства Вс1-2, являющихся ключевыми регуляторами апоптоза. В частности, р53 активирует экспрессию Bid, PUMA и Noxa [173; 353], NF-кВ управляет генами, кодирующими белки Bcl-XL, IAP, А1, ответственные за угнетение процесса апоптоза [448]. Вместе с тем ряд исследований свидетельствуют о проявлениях редокс-чувствительными элементами сигнальной трансдукции как про-, так и антиапоптотической активности [266; 376], зависящей от особенностей индуцирующих сигналов, комбинаций возможных путей их передачи и типа клеток.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

2. Оценить характер изменений МАР-киназных элементов (JNK, р38) системы сигнальной трансдукции в мононуклеарных клетках крови с использованием селективных ингибиторов (SP600125, ML3403) in vitro при окислительном стрессе.

Научная новизна.

Впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов проведено исследование редокс-чувствительных молекулярных механизмов реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса стресса in vitro и при остром воспалении.

Впервые при культивировании in vitro мононуклеарных лейкоцитов крови с 1 мМ Н2Ог показано, что нарастание продукции активных форм кислорода в клетках сопровождается увеличением содержания апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, опосредованным активацией митохондриального и повышенной готовностью клеток к TNFa-рецепторному пути инициации апоптоза. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма усиливается фосфорилирование редокс-чувствительных JNK и р38 МАР-киназ, являющихся важным элементом системы сигнальной трансдукции апоптогенных сигналов. Впервые в эксперименте с использованием селективных ингибиторов МАР-киназ показано, что JNK влияет на продукцию IL-8, но не участвует (также как р38) в регуляции синтеза антиапоптогенного IL-10 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Факторы транскрипции NF-кВ и р53 через механизмы фосфорилирования МАР-киназами и/или непосредственного действия АФК, влияют на экспрессию генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза (увеличение экспрессии проапоптотического протеина Вах и антиапоптотичекого Bcl-XL). Получены приоритетные данные об изменении содержания про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2 в мононуклеарных клетках крови при экспериментальном окислительном стрессе. Изменение соотношения ключевых белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2 сопряжено с последовательной активацией редокс-чувствительных элементов сигнальной трансдукции (МАР-киназ и факторов транскрипции). Установлены однотипные молекулярные механизмы дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 1 мМ перекисью водорода, и остром воспалительном процессе. Выявлено, что редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем являются мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы клеток.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют существующие представления о фундаментальных механизмах дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлена роль редокс-чувствительных МАР-киназ р38, JNK и факторов транскрипции р53, NF-kB в изменении баланса про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2. Полученные знания носят фундаментальный характер и могут служить основой для разработки молекулярной технологии воздействия на оксидант-опосредованную модуляцию активности ключевых регуляторов апоптоза. Идентифицированные в ходе исследования редокс-чувствительные молекулярные мишени могут быть использованы в разработке подходов селективного управления апоптозом клеток при патологических процессах, патогенез которых сопряжен с развитием окислительного стресса, а также с нарушением реализации летальной программы клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1. Усиление программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса сопряжено с активацией митохондрий-опосредованного и повышенной готовностью клеток к TNFa-рецепторному пути инициации апоптоза.

2. В реализацию летальной программы мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе вовлечены редокс-чувствительные элементы внутриклеточной сигнальной трансдукции (МАР-киназы рЗ 8 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53).

3. В изменении баланса ключевых белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе участвуют факторы транскрипции NF-kB и р53, контролирующие экспрессию соответствующих генов.

Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии («Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии») для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них 8 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна монография в соавторстве.

Заключение диссертационного исследования на тему ""Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе"

169 Выводы

1. В условиях экспериментального окислительного стресса, индуцированного воздействием на мононуклеарные лейкоциты крови 1 мМ НоОо, увеличение числа апоптотически измененных клеток сопряжено с активацией митохондриального и TNFa-опосредованного рецепторного путей запуска летальной программы клеток.

2. В процессе реализации летальной программы мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе in vitro участвуют редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем (МАР-киназы р38 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53).

3. В условиях дисбаланса окислительного метаболизма в мононуклеарных лейкоцитах активация апоптогенпой системы сигнальной трансдукции, осуществляемой с участием редокс-чувствительных МАР-киназ JNK и р38, сопряжена с увеличением уровня их фосфо-форм.

4. При окислительном стрессе in vitro селективное ингибирование редокс-чувствительной киназы JNK SP600125 приводит к снижению продукции мононуклеарными лейкоцитами IL-8. В условиях дисбаланса окислительного метаболизма МАР-киназы р38 и JNK не участвуют в регуляции продукции IL-10.

6. При окислительном стрессе in vitro в мононуклеарных лейкоцитах увеличивается содержание проапоптотического белка Вах, не изменяется содержание антиапоптотических белков Bcl-2 и Bc1-Xl, проапоптотический белок Bad в клетках отсутствует.

7. Механизмы изменения экспрессии генов Ьс1-Хь и Ьах при окислительном стрессе связаны с активацией транскрипционных факторов р53 и NF-kB.

8. При остром восиалителительном процессе (острый аппендицит, внебольничная пневмония), сопровождающемся нарушениями окислительного метаболизма, молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза сопряжены с активацией МАР-киназ, факторов транскрипции, нарушением баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2.

9. Редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигнал передающих систем (МАР-киназы р38, JNK, факторы транскрипции и белки семейства Bcl-2) являются молекулярными мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы при окислительном стрессе.

Заключение

Эндогенная и экзогенная регуляция апоптоза, уравновешивающего эффекты клеточной пролиферации, элиминации поврежденных, функционально неполноценных и инфицированных клеток, является актуальным аспектом теоретических исследований современной медицины. Факторы, оказывающие влияние на запуск и регуляцию программы клеточной гибели, весьма многочисленны и разнообразны.

В связи с этим особый интерес представляет получение новых знаний фундаментального характера об участии редокс-чувствительных сигнальных систем в дизрегуляции летальной программы клеток, направленных на разработку способов терапевтической коррекции нарушений апоптоза при патологических процессах и состояниях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма. С этих позиций нами было предпринято комплексное исследование, направленное на идентификацию редокс-чувствительных молекулярных мишеней дизрегуляции апоптоза при окислительном стрессе. В качестве объекта исследования была использована экспериментальная модель окислительного стресса (культивирование мононуклеарных лейкоцитов крови с 1 мМ перекисью водорода).

Исходя из позиции, что воспаление является одним из типовых патологических процессов, сопряженных с развитием окислительного стресса, в программу нашего исследования был также включен фрагмент выявления молекулярных механизмов нарушения апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при острых воспалительных процессах (внебольничная пневмония, острый аппендицит).

Как известно, прежде всего при различных стрессовых воздействиях ответная реакция клетки направлена на мобилизацию ресурсов для предотвращения негативных последствий и адаптации. АФК являются неотъемлемым элементом сигнальной трансдукции, участвуя в экспрессии ряда генов и обеспечивая процессы пролиферации и дифференцировки.

Длительное стрессовое воздействие вызывает истощение антиоксидантной системы и избыточное накопление АФК, приводящее к срыву адаптационных резервов клетки. Высокие концентрации АФК запускают механизмы апоптотической либо некротической гибели клеток, выбор которых определяется силой и характером инициирующего воздействия, состоянием систем репарации и антиоксидантной защиты. При этом клеточная стратегия при изменении редокс-статуса во многом определяется состоянием сигналпередающих систем.

Нами показано, что усиление программированной клеточной гибели мононуклеарных клеток крови характерно как для окислительного стресса in vitro, так и для острых воспалительных заболеваний (табл. 3, 4). Данный факт подтверждается наличием положительной корреляционной связи между возрастанием АФК-продукции и увеличением количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе (г—0,84, р<0,05) и острых воспалительных заболеваниях (г=0,71, р<0,05). Усиление программированной гибели клеток, сопряженное с возрастанием в них АФК, свидетельствует о вовлеченности редокс-чувствительных механизмов в регуляцию апоптоза.

В свою очередь запуск летальной программы клеток может осуществляться за счет активации вне- и внутриклеточных путей ее инициации. В частности, взаимозависимыми процессами являются продукция АФК, реализация апоптогенной программы и функция митохондрий. С одной стороны, митохондрии выступают в качестве мишеней регуляторных молекул в каскадах апоптогенных реакций, с другой, - являются источником АФК (сигнальных молекул в данных каскадах). Митохондриальный путь запуска апоптоза включает в себя изменения электронного транспорта и клеточного редокс-баланса, взаимодействие про-и антиапоптотических белков семейства Вс1-2, открытие пор пермеабилизационного перехода между наружной и внутренней мембраной митохондрий, формирование каналов в наружной мембране, потерю митохондриального трансмембранного потенциала, а также выход апоптогенных факторов (цитохром с, Smac, AIF и др.).

В проведенном нами исследовании увеличение числа мононуклеарных клеток со сниженным значением трансмембранного потенциала митохондрий было зарегистрировано при окислительном стрессе in vitro и у пациентов с внебольничной пневмонией и острым аппендицитом (табл. 3, 4). Редокс-зависимое снижение А\|/ коррелировало с увеличением числа апоптотически измененных клеток при их инкубировании in vitro с 1 мМ Н202 (г=0,78, р<0,05) и остром воспалении (г=0,69, р<0,05), выступая в качестве элемента активации апоптогенных механизмов в условиях дисбаланса окислительного метаболизма.

Другой путь инициации программированной клеточной гибели, также запускаемый в условиях избытка АФК, - рецепторный, позволяющий избирательно уничтожать клетки с определенной специфичностью рецепторов. Внеклеточные апоптогенные сигналы передаются с помощью мембраносвязанных или растворимых рецептор-специфических лигапдов. Формирование лиганд-рецепторного комплекса приводит к кластеризации внутриклеточных частей рецептора, взаимодействию с внутриклеточными адаптерными молекулами, преобразующими сигнал к апоптозу. Известно, что классическим вариантом специфических рецепторов для инициации апоптоза является суперсемейство TNF-рецепторов. Действительно, как нами было показано (табл. 5), окислительный стресс в условиях эксперимента и при остром воспалении приводит к увеличению количества TNFR1— положительных клеток в культурах мононуклеарных лейкоцитов. Это является весомым доказательством возможности запуска летальной программы мононуклеарных лейкоцитов по TNFa-опосредованному пути при нарушении окислительного метаболизма.

Избыточная АФК-продукция способна вызывать повреждение ДНК с последующей активацией гена р53, приводящей к различным эффектам: запуску ядерного пути апоптоза, репарации ДНК, аресту клеточного деления и старению клетки. При этом, согласно количественной модели, реализация того или иного варианта клеточного ответа зависит от уровня экспрессии р53. Нами было показано, что процесс усиления апоптотической гибели за счет ядерного пути ее запуска при окислительном стрессе характеризуется активацией р53 (в частности, при воздействии перекиси водорода в мононуклеарных лейкоцитах появляется не связанная форма р53 и увеличивается содержание фосфорилированного р53) (рис. 32, 34).

Активация различных путей запуска программы апоптотической гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса обусловлена изменением функционального состояния редокс-чувствительных систем внутриклеточной регуляции апоптоза (рис. 46). К числу последних относятся митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38, фосфорилирующие ответственные за реализацию летальной программы клеток белки-мишени, в том числе факторы транскрипции NF-kB, АР-1 и р53.

Активация JNK при стрессовых воздействиях приводит к инициации программы апоптоза клеток. Данная функция JNK связана с фосфорилированием и активацией транскрипционного фактора р53. Киназа р38 также вызывает фосфорилирование р53, помимо этого активируя фактор Nf-кВ и MEF2C. Активируемые киназами транскрипционные факторы, в свою очередь, контролируют синтез ключевых белков-регуляторов апоптоза. Однако в ряде случаев МАР-киназы JNK и р38 выполняют антиапоптотическую функцию, зависящую от характера инициирующих сигналов, взаимодействия сигнальных апоптогенных путей и типов клеток. Неоднозначность роли стресс-активируемых протеинкиназ JNK и р38 в реализации летальной программы клеток при окислительном стрессе явилась основанием для ее детализации.

В связи с этим для нас значительный интерес представляла оценка реализации программы апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе в присутствии селективных ингибиторов киназ JNK и р38 (SP600125 и MDL3403, соответственно). Было установлено, что последние предотвращают увеличение числа апоптотических клеток, характерное для перекись-индуцированного окислительного стресса, и снижают их содержание в культурах клеток, полученных у пациентов с острым воспалением (табл. 6, рис. 25). На основании этого нами было высказано предположение, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма в мононуклеарных лейкоцитах МАР-киназы JNK и р38 выполняют апоптогенную функцию.

Идентификация молекулярных механизмов данного явления сопряжена с решением вопроса о том, связана ли функция JNK и р38 в мононуклеарных лейкоцитах с возрастанием уровня их активных (фосфорилированных) форм, активирующих другие элементы апоптогенной сигнальной системы (факторы транскрипции, белки-регуляторы апоптоза). Действительно, было установлено, что содержание фосфорилированных форм JNK и р38 при окислительном стрессе in vitro и в случае острых воспалительных заболеваний увеличивается (по сравнению с контролем) (рис. 26-29).

Вместе с тем при окислительном стрессе, индуцированном добавлением 1мМ Н202 в культуру интактных клеток, а также в клинике острого воспаления общее содержание JNK (подклассы JNK1 и JNK2) и р38 не изменялось по сравнению с контролем. Это позволило нам сделать вывод о том, что возрастание уровня фосфо-форм редокс-чувствительных киназ JNK и р38 обусловлено активацией процесса их фосфорилирования в условиях избыточной продукции АФК и не связано с увеличением экспрессии данных ферментов в клетке.

АФК-индуцируемая активность JNK и р38 МАРК участвует в формировании клеточного ответа на стресс, и различные эффекты данных киназ могут опосредованно влиять на реализацию летальной программы. В указанном контексте особый интерес представляло участие JNK и р38 МАРК в продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. В частности, выявлено участие редокс-чувствительной JNK в увеличении содержания IL-8 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов у больных острым воспалением и в случае экспериментального окислительного стресса (табл. 7). Возрастание продукции IL-8 при окислительном стрессе, обусловленное NFkB-зависимой индукцией промотора гена IL-8, может служить косвенным признаком активации данного транскрипционного фактора, также участвующего в апоптозе.

Важнейшими про- и антиапоптогенными сигнальными молекулами, активирующимися МАР-киназами или АФК непосредственно, являются транскрипционные факторы. В частности, активное участие в реализации летальной программы принимает р53, также действующий как эффекторный проапоптогенный белок. При экспериментальном окислительном стрессе в мононуклеарных лейкоцитах крови у здоровых доноров были обнаружены появление не связанного с ингибитором р53, а также активация его фосфорилирования. Последнее может предотвращаться селективными ингибиторами МАР-киназ, свидетельствуя тем самым об участии р53 в редокс-чувствительных механизмах запуска апоптоза. В частности, р53 способен трансактивировать гены, кодирующие проапоптотический белок семейства Bcl-2 Вах. Помимо этого, перемещение р53 к митохондриям, где он связывает антиапоптотические протеины (Bcl-2, BcI-XL), приводит к снижению трансмембранного митохондриалыюго потенциала и выходу апотогенных факторов в циозоль. Другие протеины, активируемые с помощью р53 (Noxa, PUMA и Bid), инактивируют антиапоптотические белки семейства Bcl-2, способствуя запуску апоптоза.

Редокс-чувствительный транскрипционный фактор NF-kB участвует в регуляции иммунного ответа, воспалительной реакции, а также в контроле клеточного деления и апоптоза. NF-kB осуществляет транскрипционный контроль антиапоптотических генов Bcl-XL, X-IAP, c-IAPl и c-IAP. Установлено, что свободная форма р65 субъединицы NF-kB появляется в мононуклеарных клетках при индукции окислительного стресса перекисью водорода, а также в случае острого воспаления (рис. 37). Данный факт свидетельствует о высвобождении NF-kB из комплекса с ингибитором IkB (первый этап активации транскрипционного фактора) в условиях повышенной продукции АФК.

Кроме того, установлено, что при экспериментальном окислительном стрессе в мононуклеарных лейкоцитах крови появляются не связанные с ингибитором р53 и NF-kB, обладающие взаимоисключающими функциями при регуляции апоптоза. Вместе с тем, результирующим эффектом активации р53 и NF-kB является повышение апоптотической реакции клеток. Как известно, начальная фаза функционирования факторов транскрипции -высвобождение из комплекса с ингибитором. Далее транскрипционный фактор перемещается из цитоплазмы в ядро, при этом возможны модификации, приводящие к изменению его транскрипционного потенциала. Исходя из этого, анализ транскрипционной активности NF-kB и р53 может осуществляться на основе оценки ответа генов-мишеней. Одним из генов, являющихся мишенью NF-kB, считается bcl-XL (кодирующий белок с антиапоптотической функцией), а мишенью р53 - ген проапоптотического белка Вах, относящийся, как и Bcl-XL к семейству Bcl-2.

Оказалось, что при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении в мононуклеарных лейкоцитах повышен уровень экспрессии мРНК гена bcl-XL. Данный факт позволяет сделать вывод об индукции антиапоптотических генов-мишеней при активации NF-kB. Несмотря на это, избыточная продукция АФК мононуклеарными лейкоцитами была сопряжена с активацией их летальной программы и содержание белка Bcl-XL в условиях окислительного стресса относительно контроля не изменялось (рис. 41, 42). Последнее обстоятельство нашло объяснение с позиции посттрансляционной модификации Bcl-XL, приводящей к изменению его нативной структуры и функции. Кроме того, при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении обращало на себя внимание отсутствие изменения уровня экспрессии мРНК гена bcl-2 и содержания белкового продукта данного гена в мононуклеарных лейкоцитах по сравнению с контролем. Было установлено, что возрастание содержания антиапоптотического Bcl-2 в клетках в условиях окислительного стресса блокируется МАРК-опосредованными механизмами (рис. 44).

Оценка уровня экспрессии мРНК гена Ьах выявила увеличение исследованного параметра при окислительном стрессе in vitro и в случае острого воспаления по сравнению с таковым в интактной культуре (табл. 9). Поскольку ген Ьах является мишенью транскрипционного фактора р53, полученные данные подтверждают эффективность трансактивационной функции р53 в условиях избыточной продукции АФК. Отсутствие различий экспрессии Ьах при окислительном стрессе in vitro и при остром воспалении может свидетельствовать о едином механизме активации р53 в обоих случаях, несмотря на отсутствие белка р53 (возможно, за счет его связывания с MDM2) в мононуклеарных лейкоцитах у больных внебольничной пневмонией. Уровень проапоптогенного белка Вах в условиях окислительного стресса также возрастал (рис. 41). По нашим данным, в этот процесс вовлечены редокс-чувствительные МАРК-опосредовапные механизмы. Известно, что Вах содействует запуску программированной клеточной гибели, благодаря своей способности олигомеризоваться и формировать поры в мембранах. Отсутствие адекватного увеличения содержания в клетках антисуицидальпых белков Bcl-XL и Bcl-2 при возрастании уровня проапоптотического белка Вах в ответ на апоптогенный стимул при экспериментальном окислительном стрессе может быть причиной повышения количества аннексин-положительных мононуклеарных лейкоцитов.

В целом, в ходе проведенного нами исследования оценены редокс-чувствительные элементы сигнальной трансдукции апоптогенных сигналов мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма важную роль в реализации летальной программы клеток играют МАР-киназы JNK и р38. Активация факторов транскрипции NF-кВ и р53 (за счет их

Рис. 46. Роль элементов внутриклеточной сигнальной трансдукции в механизмах дизрегуляции апоптоза при окислительном стрессе (по данным [173; 155; 263; 297; 316; 448] и результатам собственных исследований выделено)) фосфорилирования МАР-киназами и/или воздействия АФК) приводит к изменению уровня экспрессии генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза семейства Вс1-2. Последние играют решающую роль в выборе клеточного ответа при окислительном стрессе. Данные протеины могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, под влиянием вышестоящих компонентов редокс-чувствительных сигнальных систем, а также окислительной модификации. Наряду с этим, АФК выступают в роли вторичных мессенджеров, опосредующих активацию ключевых белков-регуляторов апоптоза.

Полученные результаты свидетельствуют о схожести молекулярных механизмов реализации апоптоза при моделировании окислительного стресса в условиях in vitro и в случае острого воспаления, что позволяет интерпретировать их как типовые нарушения. Однако получение обобщающих положений о закономерностях реагирования компонентов клеточных систем при типовых патологических процессах важно не только для понимания законов их развития, но и для разработки методологии коррекции, осуществляемой на клеточном и молекулярном уровнях. Последнее зависит от знания молекулярных механизмов дисбаланса про- и антиапоптогенных факторов, являющихся мишенью действия различных повреждающих агентов.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Часовских, Наталия Юрьевна

1. Агол, В. И. Генетически запрограммированная смерть клетки / В. И. Агол // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - № 6. - С. 20-24.

2. Активированные кислородные метаболиты в монооксигеназных реакциях / В. В. Ляхович, В. А. Вавилин, Н. К. Зенков и др. // Бюллетень СО РАМН.-2005.-Т. 118, №4.-С. 7-13.

3. Андреев, А. Ю. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях / А. Ю. Андреев, Ю. А. Кушнарева, А. А. Старков // Биохимия. 2005. - Т. 70, вып. 2. - С. 246-264.

4. Антиоксиданты и атеросклероз: Критический анализ проблемы и направление дальнейших исследований / В. 3. Панкин, А. К. Тихазе, А. И. Каминный и др. // Патогенез. 2004 - № 1. - С. 71 -86.

5. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию / М. Ф. Никонова, М. М. Литвина, М. И. Варфоломеева и др. // Иммунология. 1999. - № 2. - С. 20-23.

6. Барышников, А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин. М.:Эдиториал УРСС, 2002. - 320 с.

7. Белецкий, И. П. Генная терапия на основе системы Fas-аптиген-Fas-лиганд / И. П. Белецкий, О. В. Сорокина, Л. В. Никонова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 1999. № 4. - С. 40-46.

8. Белецкий, И. П. Пути передачи цитотоксического сигнала рецепторами семейства TNF-Rs (обзор) / И. П. Белецкий, А. Б. Мошникова, О. В. Прусакова // Биохимия. 2002. - Т. 67, вып. 3. - С. 343-353.

9. Белушкина, Н. Н. Молекулярные основы апоптоза / Н. Н. Белушкина, А. Хасан Хамад, С. Е. Северин // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 1998. — № 4. — С. 15-23.

10. Белушкина, Н. Н. Молекулярные основы патологии апоптоза / Н. Н. Белушкина, С. Е. Северин // Архив патологии. 2001. - № 1. - С. 51-59.

11. Бимодальное действие экзогенной перекиси водорода на нейтрофилы человека: цитотоксический эффект и модуляция кислородного взрыва в ответ на агоиист / Е. А. Пучнина, А. Н. Леденев, В. Р. Музыкантов и др. // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 2. - С. 694-700.

12. Болдырев, А. А. Дискриминация между апоптозом м некрозом под влиянием окислительного стресса / А. А. Болдырев // Биохимия. 2000. -Т. 5, вып. 7.-С. 981-991.

13. Болдырев, А. А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса / А. А. Болдырев М.: Изд-во Диалог-МГУ, 1999. - 364 с.

14. Болдырев, А. А. Новые подходы к исследованию жизни и смерти нейрональной клетки / А. А. Болдырев, М. О. Юнева // Соросовский Образовательный Журнал. 2004. - Т. 8, № 2. - С. 7-14.

15. Болдырев, А. А. Окислительный стресс / А. А. Болдырев// Соросовский Образовательный Журнал. 2001. — Т. 7, № 4. — С. 21-28.

16. Брюне, Б. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути / Б. Брюне, К. Сандау, А. фон Кнетен // Биохимия. 1998. - Т. 63, № 7. - С. 966-975.

17. Бурлакова, Е. Б. Блеск и нищета антиоксидантов / Е. Б. Бурлакова // Наука и жизнь. 2006. - № 2. - С. 37-43.

18. Веденов, А. А. Моделирование элементов мышления/ А. А. Веденов М.: Наука - 1988. - 108 с.

19. Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторовперекисного окисления липидов, роль активных форм кислорода и азота / И. В. Заббарова, К. Б. Шумаев, А. Ф. Ванин и др. // Биофизика. -2004.-Т. 49.-С. 659-665.

20. Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю. А. Владимиров // Соросовский Образовательный Журнал. — 2000. Т. 6, № 12. - С. 13-19.

21. Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю. А. Владимиров //Вестник РАМН. 1998. -№ 7. - С. 43-51.

22. Владимирская, Е. Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста / Е. Б. Владимирская, А. А. Масчан, А. Г. Румянцев // Гематология и трансфузиология. 1997. - Т. 42, № 5. - С. 4-9.

23. Владимирская, Е. Б. Биологические основы точечной терапии при онкологических заболеваниях / Е. Б. Владимирская // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2004. - Т. 3, № 4. -С. 5-13.

24. Влаопулос, С. JNK: ключевой модулятор внутриклеточной сигнальной системы / С. Влаопулос, В. С. Зумпурлис // Биохимия. 2004. -Т. 69, вып. 8.-С. 1038-1050.

25. Войков, В. JT. Био-физико-химические аспекты старения и долголетия // Успехи геронтологии. 2002. - Т. 3, вып. 9. - С. 261-268.

26. Войков, В. Л. Благотворная роль активных форм кислорода / В. Л. Войков //"МИС-РТ" 2001. - Сборник № 24 - с. 1.

27. Гамалей, И. А. Перекись водорода как сигнальная молекула / И. А. Гамалей, И. В. Клыбин // Цитология. 1996. - Т. 38, № 12. - С. 123312470.

28. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц М.: Практика - 1999. - 459 с.

29. Гольдштейн, Н. Активные формы кислорода как жизненно необходимые компоненты воздушной среды / Н. Гольдштейн // Биохимия. — 2002. Т. 67, вып.2. - С. 194-204.

30. Гордеева, А. В. Одноклеточные альтруисты / А. В. Гордеева, Ю.

31. A. Лабас // Природа. 2005. - № 6. - С. 27-34.

32. Гуревич, К. Г. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функции / К. Г. Гуревич, Н. JI. Шимановский // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2000. № 4. — С. 16-22.

33. Гусев, Н. Б. Протеинкиназы: строение, классификация, свойства и биологическая роль / Н. Б. Гусев // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 6, № 12. - С. 4-13.

34. Гусев, Н. Б. Структура, свойства и возможная физиологическая роль малого белка теплового шока с молекулярной массой 20 кДа / П. Б. Гусев, О. В. Букач // Биохимия. 2005. - Т. 70, вып. 6. - С. 762-772.

35. Гусев, Н. Б., Богачева Н. В. Структура и свойства малых белков теплового шока и их взаимодействие с белками цитоскелета / Н. Б. Гусев, Н.

36. B. Богачева // Биохимия. -2002. Т. 67, вып. 5. - С. 613-623.

37. Дамбаева, С. В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека / С. В. Дамбаева, Д. В. Мазуров, Б. В. Пинегин // Иммунология. -2001.-№6.-С. 58-61.

38. Дас, Д. К. Превращение сигнала гибели сигнал выживания при редокс-сигнализации / Д. К. Дас, IT. Молик // Биохимия. 2004. - Т. 69, вып. 1.-С. 16-24.

39. Доманский, А. В. Окислительные процессы, индуцируемые органической гидроперекисью в эритроцитах человека:хемолюминесцентные исследования / А. В. Доманский, Е. А. Лапшин, И. Б. Заводник // Биохимия. 2005. - Т. 70, вып. 7. - С. 922-932.

40. Дорохов, Е. В. Апоптоз в нервных клетках и его роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний / Е. В. Дорохов, Н. Н. Белушкина // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.-2006,-№3,-С. 46-51.

41. Дубинина, Е. Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е. Е. Дубинина // Вопросы медицинской химии. — 2001. — Т. 47, № 6. -С. 561-581.

42. Жукова О.Б., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Апоптоз и вирусная инфекция / О. Б. Жукова, Н. В. Рязанцева, В. В. Новицкий. Томск: Изд-во ТГУ, 2006.- 142 с.

43. Залесский, В. Н. Механизмы цитотоксических эффектов активных молекул кислорода и развитие апоптоза / В. II. Залесский, Н. В. Великая К.: Витус, 2004 — 25 с.

44. Зенков, Н. К. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты / Н. К. Зенков, В. 3. Ланкин, Е. Б. Меныцикова. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика». - 2001. - 343 с.

45. Зоров, Д. Б. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота / Д. Б. Зоров, С. Ю. Банникова // Биохимия. 2005. - Т. 70, вып. 2. — С. 265-272.

46. Игонин, А. А. Сепсис: молекулярные механизмы системного воспаления в качестве модели для изучения перспективных терапевтических мишеней / А. А. Игонин, В. Г. Кукес, М. А. Пальцев // Молекулярная медицина. 2004. - № 2.-С. 3-11.

47. Казначеев, К. С. Механизмы развития цитокининдуцированного апоптоза / К. С. Казначеев // Гематология и трансфузиология. 1999. - Т. 44, № 1. — С. 40-43.

48. Карнозин-содержащий комплекс Биокуратор в косметике / Э. И. Мухтаров, Н. А. Михайлова, С. Э. Мухтарова и др. // Сырье и упаковка. -2004.-Т. 46, №7-С. 12-15.

49. Компоненты неферментативной антиоксидантной системы у больных инсулин-независимым сахарным диабетом / И. В. Луста, А. В. Ситожевский, И. В. Хавалкин, Е. А. Ивановский // Биоантиоксидант. — Тюмень: Изд. Тюменского Гос. ун-та, 1997. С. 99-100.

50. Крыжановский, Г. Н. Дизрегуляционая патология. / Г. Н. Крыжановский // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 2002. — № 3. С. 2-19.

51. Крыжановский, Г. Н. Дизрегуляционная патология / Г. Н. Крыжановский // Патогенез. 2004. - №1. — С. 21-29.

52. Кузнецов, С. В. Причины гибели животных при отравлении перекисью водорода / С. В. Кузнецов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1993.-№ 6.-С. 596-598.

53. Кулинский, В. И. Активные формы кислорода и окислительная модификация макромолекул / В. И. Кулинский //Соросовский образовательный журнал. 1999. - №1. - С. 2-7.

54. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин М.: Высшая школа, 1980.- 296 с.

55. Лебедев, В. В. Супероксидная теория патогенеза и терапии иммунных расстройств/ В. В. Лебедев // Вестник РАМН. 2004. - С. 34-40.

56. Лильин, Е. Т. Роль гипоксии как пускового механизма апоптоза при некоторых неврологических заболеваниях у детей / Е. Т. Лильин, И. Н. Иваницкая // Вопросы современной педиатрии. — 2003. — Т. 2, № 5. — С. 74-79.

57. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика / под ред. Дж. Натвиг и др. М.: Медицина, 1980. - 280 с.

58. Лушников, Е. Ф. Гибель клетки (апоптоз) / Е. Ф. Лушников, Л. Ю. Абросимов. -М.: Медицина, 2001. 192 с.

59. Лю, Б. Н. Кислородно-перекисная концепция апоптоза и возможные варианты его механизма / Б. Н. Лю // Успехи современной биологии.-2001.-Т. 121, № 5.-С. 488-501.

60. Маеда, X. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке / X. Маеда, Т. Акаике //Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7. -С. 1007-1019.

61. Мазуренко, Н. Н. Роль вирусов папиллом в канцерогенезе шейки матки // Актуальные вопросы клинической онкологии. — 2003 Т.5, № 1. — С. 34-42.

62. Маянский, А. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский. Новосибирск: Наука, 1989. - 221 с

63. Маянский, Н. А. Каспазонезависимый механизм апоптоза нейтрофилов: апоптогенный эффект TNF-a / Н. А. Маянский // Иммунология. -2002.-№ 1.-С. 15-17.

64. Меньшикова, Е. Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меныцикова, В. 3. Ланкин, Н. К. Зенков. М. : Слово, 2006.-556 с.

65. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели / М. Бра, Б. Квинан, С. А. Сузин и др. // Биохимия. 2005. - Т. 70, вып. 2. - С. 284-293.

66. Моргункова, А. А. Семейство генов р53: контроль клеточной пролиферации и программа развития организма / А. А. Моргункова // Биохимия.-2005.-Т. 70, вып. 9.-С. 1157- 1176.

67. Мураков, С. В., Митохондриальные мегапоры в жизни клетки / С. В. Мураков, Н. Д. Воспельникова // Вопр. биол. и фарм. химии. 2006. - № 2. -С. 42-50.

68. Невницкий, Л. А. Программированная гибель клеток и апоптоз: значение для развития и функционирования иммунной системы / Л. А. Невницкий // Вестник РАМН. 1998. - № 6. - С. 43-50.

69. Новиков, В. С. Программированная клеточная гибель / Под ред. В. С. Новикова. СПб., 1996. - 276 с.

70. Новицкий, В. В. Молекулярные основы дизрегуляции программированной гибели лимфоцитов при хронической вирусной инфекции / В. В. Новицкий, Н. В. Рязанцева, О. Б. Жукова // Бюллетень сибирской медицины. — 2006. — № 2. С. 23-31.

71. Оксид азота в неопластическом процессе / С. Я. Проскуряков, А. Г. Конопляников, А. И. Иванииков и др. // Вопросы онкологии. 2001. - Т. 47, № З.-С. 257-269.

72. Октябрьский, О. Н. Редокс-регуляция клеточных функций / О. Н. Октябрьский, Г. В. Смирнова // Биохимия. 2007. - Т. 72, вып. 2. - С. 158174.

73. Особенности состояния мембран и метаболизма эритроцитов у больных раком легкого / Е. А. Степовая, В. В. Новицкий, В. Е. Гольдберг и др. // Вопросы онкологии. 2004. - Т.50, № 1. - С. 63-67.

74. Пальцев, М. А. Введение в молекулярную медицину. М., Медицина, 2004. - 496 с.

75. Панасенко, О. М. Образование свободных радикалов при распаде гидропероксида в присутствии миелопероксидазы или активированных нейтрофилов / О. М. Панасенко, А. В. Чеканов // Биохимия. 2005. - Т. 70, вып. 9.-С. 1209-1217.

76. Пасечник, А. В. Апоптоз нейтрофилов как параметр воспалительной реакции при патологии / А. В. Пасечник, В. А Фролов // Вестник РУДН, серия Медицина. 2004. - Т. 25, № 1. - С. 103.

77. Пасечник, И. Н. Окислительный стресс и критические состояния у хирургических больных / И. Н. Пасечник // Вестник интенсивной терапии. 2004. — №3. - С. 27-30.

78. Перекисное окисление и стресс / В. А. Барабой, И. И. Брехман, В. Г. Глоткин, Ю. Б. Кудряшов. СПб.: Наука, 1992. - 150с.

79. Перекисное окисление липопротеинов крови человека, индуцированное гипохлорит-анионом / С. А. Евгипа, О. II. Панасенко, В. И. Сергиенко и др. // Биол. мембраны. 1992. -Т.9, № 9. - С.946-953.

80. Перекись водорода в субтоксических концентрациях активирует фосфоинозитидный обмен в эндотелиальных клетках человека / В. Р. Музыканотов, Е. А. Пучнина-Артюшенко, Е. В. Чекнева и др. // Биол. мембраны. 1992. - Т.9, № 2. - С. 133.

81. Пероксид водорода, образуемый внутри митохондрий, участвует в передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке / О. Ю. Плетюшкина, Е. К. Фетисова, К. Г Лямзаев и др. // Биохимия. — 2006. — Т. 71, вып. 1. — С. 7584.

82. Петрович, Ю. А. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса / Ю. А. Петрович, Д. В. Гуткин // Патол. физиолог, и эксперимен. терапия. 1989. - № 5. - С. 85-92.

83. Петухов, В. И. Роль Fas-опосредованного апоптоза в реализации противоопухолевого эффекта а-интерферона при хроническом миелолейкозе / В. И. Петухов // Гематология и трансфузиология. 2000. - Т. 45, № 4. - С. 29-33.

84. Потапнев, М. П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М. П. Потапнев // Иммунология. — 2002. — № 4. С. 237-243.

85. Потехина, Е. С. Митоген-активируемые протеинкиназные каскады и участие в них 81е20-подобных протеинкиназ / Е. С. Потехина, Е. С. Надеждина // Успехи биологической химии. 2002. - Т. 42. - С. 235-256.

86. Проскуряков, С. Я. Некроз-активная, управляемая форма программируемой клеточной гибели / С. Я Проскуряков, В. JI. Габай // Биохимия. 2002. - Т. 67, вып. 4.-С.467- 491.

87. Реброва, Т. Ю. Вклад системы антиокислительных ферментов в реализацию кардиопротекторного эффекта опиоидов при окислительном стрессе / Т. Ю. Реброва, JI. Н. Маслов, С. В. Там // Вопросы медицинской химии.-2001.-№3.-С. 55-58.

88. Роль иммунофенотипических и цитогенетических изменений лимфоцитов крови в механизмах хронизации вирусной инфекции / Н. В. Рязанцева, О. Б. Жукова, В. В. Новицкий и др. // Эпидимиология и вакцинопрофилактика. 2003. - № 6. — С. 23-27.

89. Роль НАД(Ф)Н-оксидазы в регуляции уровня пролиферативного ответа лимфоцитов на митоген / О. М. Перминова, В. В. Сенюков, Н. Н. Вольский и др. // Иммунология. №6 - 2005 - С. 42-51.

90. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А. П. Шепелев, И. В. Корниенко, А. В. Шестопалов, А. Ю. Антипов // Вопросы медицинской химии. 2000. - № 2. -С. 54-59.

91. Роль системы Fas/FasL в индукции апоптоза гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах / Е. В. Дмитриева, Е. Ю. Москалёва, Е. А. Коган и др.// Архив патологии 2003. - № 3. - С. 43-46.

92. Роль СОД в патогенезе бокового амиотрофического склероза / М. Н. Захарова, И. А. Завалишин, А. А. Болдырев и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. 1999. - Т. 127. - С. 460-462.

93. Самуилов, В. Д. Программируемая клеточная смерть / В. Д. Самуилов, А. В Олескин, Е. М. Лагунова // Биохимия. 2000. - Т. 65, вып. 8. -С. 1029-1046.

94. Система Fas-FasL в норме и при патологии / С. Г. Аббасова, В. М. Липкин, Н. Н. Трапезников и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999. - № 3. - С. 3-14.

95. Скулачев, В. П. Кислород в живой клетке: Добро и зло / В. П. Скулачев // Соросовский Образовательный Журнал. — 1996. — № 3. — С. 4-16.

96. Скулачев, В. П. Н202 — сенсоры легких и кровеносных сосудов и их роль в антиокисдантной защите организма / В. П. Скулачев // Биохимия. -2001.-Т. 66, вып. 10.-С. 1425-1429.

97. Скулачев, В. П. Явления запрграммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода / В. П. Скулачев // Соросовский Образовательный Журнал. 2001. -Т. 7, № 6. - С. 410.

98. Состояние системы перекисного окисления липидов у больных ишемической болезнью сердца / В. А. Барсель, И. С. Щедрина, В. Д. Вахляев и др. // Кардиология. 1998. - № 5. - С. 18-20.

99. Степанов, Ю. М. Система Fas/Fas-лиганд / Ю. М. Степанов, А. А. Фильченков, Н. Е. Кушлинский Дн.: ДИА, 2000 - 48 с.

100. Талаева, В. В. Механизмы взаимодействия клеток крови и сосудистой стенки в реализации воспалительного и иммунного ответов / В. В. Талаева // Укр. Ревматологический журнал. 2001. — № 3. — С. 45-53.

101. Ткаченко, А. Г. Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от стрессорных воздействий супероксидных радикалов / А. Г. Ткаченко, М. В. Федотова // Биохимия. 2007. - Т. 72, вып. 1. - С. 128-136.

102. Тодоров, И. Н. Митохондрии: окислительный стресс и мутации митохондриальной ДНК в развитии патологий, процессе старения и апоптозе / И. Н. Тодоров // Рос. хим. журнал. 2007. - №1. - С. 97-103.

103. Тронов, В. А. Репарация ДНК и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека, индуцированные перекисью водорода / В. А. Тронов, Е. М. Константинов // Биохимия. 2000. — Т. 65, вып. 11. — С. 15161524.

104. Тронов, В. А. Роль экстизионных механизмов репарации ДНК в индукции апоптоза / В. А. Тронов, Е. М. Константинов // Биохимия. 2002. -Т. 67, вып. 7. - С. 882-889.

105. Турпаев, К. Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов / К. Т. Турпаев // Биохимия. 2002. -Т. 67, вып. 3. - С. 339352.

106. Фильченков, А. А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций / А. А. Фильченков // Биохимия. — 2003. — Т. 68, вып. 4. — С. 453-463.

107. Фрейдлин, И. С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции / Фрейдлин И. С. // Иммунология. 2001. -№5.-С. 4-15.

108. Фукузава, К. Увеличение образования оксида азота и супероксида под действием сукцината а-токоферола, его способность вызывать апоптоз и противораковые свойства / К. Фуказава, Е. Когуре // Биохимия. 2004. - Т. 69, вып. 1. - С. 64-73.

109. ПЗ.Хансон, К. П. Программированная клеточная гибель (апоптоз) молекулярные механизмы и роль в биологии и медицине / К. П. Хансон // Биохимия. 1997. - Т. 61, вып. 7. - С. 402-412.

110. Хегай, М. Д. Перекисное окисление липидов и гликозилированиебелков в аорте кроликов с аллоксановым диабетом при инсулинокоррекции / М. Д. Хегай, С. Е. Зайчик // Патол. физиология и эксперим. терапия. — 1995. — № 4. — С. 6-7.

111. Чекановская, JI. А. Влияние препарата гамма-плант на продукцию ФНО-а, ИЛ-1 b и ИЛ-6 мононуклеарами периферической крови человека in vitro / Л. А. Чекановская, А. В. Генералов // Вопр. мед. химии. -2001.-№2.-С. 73-82.

112. Чеснокова, Н. П. Механизмы структурной и функциональной дезорганизации биосистем под влиянием свободных радикалов / Н. П. Чеснокова, Е. В. Понукалина, М. Н. Бизенкова // Фундаментальные исследования. 2007. - № 4. - С. 7-18.

113. Чумаков, П. М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью / П. М. Чумаков // Биохимия. 2000. - Т.65, вып. 1. - С. 34-47.

114. Шемарова, И. В. Роль протеинкиназных каскадов в передаче стрессовых сигналов в клетках низших эукариот/ И. В. Шемарова // Цитология. 2006. - Т. 48, №2. - С. 95-113.

115. Шоф, Н. Ф, Каган, В. Е. Использование окислительного стресса и механизма передачи сигналов при лечении новообразований, устойчивых к химиотерапии / Н. Ф. Шоф, В. Е. Каган // Биохимия. — 2004. — Т. 69, вып.1. — С. 48-56.

116. Ярилин, А. А. Апоптоз и его место в иммунных процессах / А. А. Ярилин // Иммунология. 1996. - № 6. - С. 10-23.

117. Ярилин, А. А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме / А. А. Ярилин // Патологическая физиология и экспериментальная терапия — 1998. № 2. - С. 38-48.

118. Ярилин, А. А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. Б. Б. Мороза.-М., 2001.-С. 13-56.

119. A conserved domain in Вак, distinct from BH1 and BH2, mediates cell death and protein binding functions / T. Chittenden, C. Flemington, A. B. Houghton et al. // EMBO J. 1995. - Vol. 14. - P. 5589-5596.

120. A JNK-dependent pathway is required for TNFa-induced apoptosis / Y. Deng, X. Ren, L. Yang et al. // Cell. 2003. - Vol. 115. - P. 61-70.

121. A novel assay for discovery and characterization of pro-apoptotic drugs and for monitoring apoptosis in patient sera / K. Biven, H. Erdal, M. Hagg et al. // Apoptosis. 2003. - Vol. 8. - P. 263-268.

122. A novel, high conductance channel of mitochondria linked to apoptosis in mammalian cells and Bax expression in yeast / E. V. Pavlov, M. Priault, D.Pietkiewicz et al. // J. Cell Biol. 2001. - Vol. 155. - P. 725-732.

123. A transactivation-deficient mouse model provides insights into Trp53 regulation and function / G. S. Jimenez, M. Nister , J. M. Stommel et al. // Nat. Genet. 2000. - Vol. 26. - P. 37-43.

124. Accelerated neutrophil apoptosis in mice lacking Al-a, a subtype of the bcl-2-related Al gene / A. Hamasaki, F. Sendo, K. Nakayama et al. // J. Exp. Med.- 1998.-Vol. 188.-P. 1985-1992.

125. Activated T cell death in vivo mediated by pro-apoptotic Bcl-2 family member, Bim / D. A. Hildeman, Y. Zhu, Т. C. Mitchell et al. // Immunity. 2002. -Vol. 16.-P. 759-767.

126. Activation of nuclear factor kB and Bcl-xL survival gene expression by nerve growth factor requires tyrosine phosphorylation of IkB / N. T. Bui, A. Livolsi, J. F. Peyron et al. // J. Cell. Biol. 2001. - Vol. 152. - P. 753-764.

127. Activation of the NADPH oxidase in human fibroblasts by mechanical intrusion of a single cell with an ultramicroelectrode / S. Arbault, P. Pantano, N. Sojic et al. // Carcinogenesis. 1997. - Vol. 18, N 3. - P. 569-574.

128. Adams, J. M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis / J. M. Adams//Genes Dev.-2003.-Vol. 17.-P. 2481-2495.

129. AIF deficiency compromises oxidative phosphorylation / N. Vahsen, C. Cande, J. J. Briere et al. // J. EMBO. 2004. - Vol. 23. - P. 4679-4689.

130. Alarcon-Vargas, D. p53-Mdm2—the affair that never ends / D. Alarcon-Vargas, Z. Ronai // Carcinogenesis. 2002. - Vol. 23. - P. 541547.

131. Analysis and clinical significance of ETV6 rearrangement in myelodysplastic syndromes patients / В. T. Ding, N. J. Guo, J. Z. Sun et al. // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2007. - Vol. 28, N. 12. - P. 804-807.

132. Analysis of p53-regulated gene expression patterns using oligonucleotide arrays / R. Zhao, K. Gish, M. Murphy et al. // Genes Dev. 2000. -Vol. 8.-P. 981-993.

133. Analysis of the pathways of nitric oxide utilization in mitochondria / E. Cadenas, J.J. Poderoso, F. Antunes et al. // Free Radic Res. 2000. — N. 6. - P. 747-756.

134. Andreka, P. Cytoprotection by Jun kinase during nitric oxide-induced cardiac myocyte apoptosis / P. Andreka, J. Zang, C. Dougherty // Circ. Res. -2001.-Vol. 88.-P. 305-312.

135. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure / M. Van Engeland, L. J. W. Nieland, F. C. S. Ramaekers et al. // Cytometry. 1998. - Vol. 31, N 1. - P. 1-9.

136. Antioxidant and cytoprotective responses to redox stress / J. Mathers, J. A. Fraser, M. McMahon et al. // Biochem. Soc. Symp. 2004. -Vol. 71. - P. 157-176.

137. Antioxidants, reactive oxygen and nitrogen species, gene induction and mitochondrial function / M. J. Jackson, S. Papa, J. Bolanos et al. //Mol. Aspects Med. 2002. - Vol. 23. - P. 209-285.

138. Antonsson, В. Вах and other pro-apoptotic Bcl-2 family "killer-proteins" and their victim the mitochondrion / B. Antonsson // Cell Tissue Res. -2001.-Vol. 306,N3.-P. 347-361.

139. Apaf-1 is a transcriptional target of p53 in DNA damage-induced apoptosis / A. I. Robles, N. A. Bemmels, A. B. Foraker, С. C. Harris // Cancer Res. -2001.-Vol. 61.-P. 6660-6664.

140. Apoptosis and interferons: Role of interferon-stimulated genes as mediators of apoptosis / M. Chawla-Sarkar, D. J. Lindner, Y.-F. Liu et al. // Apoptosis. 2003. - Vol. 8. - P. 237-249.

141. Apoptosis regulator Bcl-w is essential for spermatogenesis but appears otherwise redundant / C. G. Print, K. L. Loveland, L. Gibson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95.-P. 12424-12431.

142. Appella, E. Post-translational modifications and activation of p53 by genotoxic stresses / E. Appella, C. W. Anderson // Eur. J. Biochem. 2001. - Vol. 268.-P. 2764-2772.

143. Armant, M. IL-2 and IL-7 but not IL-12 protect natural killer cells from death by apoptosis and upregulate bcl-2 expression / M. Armant, G. Delespesse, M. Sarfati // Immunology. 1995. - Vol. 85, №2.-P. 331-337.

144. Ashkenazi, A. Death receptors: signaling and modulation / A. Ashkenazi, V. M. Dixit // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 1305-1308.

145. ASK1 is required for sustained activations of JNK/p38 MAP kinases and apoptosis / K. Tobiume, A. Matsuzawa, T. Takahashi et al. // EMBO Rep. -2001.-Vol. 2. -P. 222-228.

146. Association of В ax and Bak homo-oligomers in mitochondria. Bax requirement for Bak reorganization and cytochrome с release / V. Mikhailov, M. Mikhail ova, K. Degenhardt et al. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P.5367-76.

147. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-l/(Fas/CD95) / J. Dhein, H. Walczak, C. Baumler et al. //Nature.- 1995. -N 2. P. 438-441.

148. Babior, В. M. NADPH Oxidase: An Update/ В. M. Babior// Blood. -1999.-Vol. 93.-P. 1464-1476.

149. Bad-deficient mice develop diffuse large В cell lymphoma / A. M. Ranger, J. Zha, H. Harada et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. -P. 9324-9329.

150. Baines, C. P. Stress signaling pathways that modulate cardiac myocyte apoptosis / C. P. Baines, J. D. Molkentin // J. Mol. Cell. Cardiol. 2005. - Vol. 38. -P. 47-62.

151. Bax and Bak can localize to the endoplasmic reticulum to initiate apoptosis / W. X. Zong, C. Li, G. Hatzuvassiliou et al. // J. Cell Biol. — 2003. — Vol. 162.-P. 59-69.

152. Bax and Bak coalesce into novel mitochondria-associated clusters during apoptosis / A. Nechushtan, C. L. Smith, I. Lamensdorf et al. // J. Cell Biol. -2001.-Vol. 153.-P. 1265-1276.

153. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells / B. Antonsson, S. Montessuit, B. Sanchez et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 11615-11623.

154. Bax oligomerization in mitochondrial membranes requires tBid (caspase-8-cleaved Bid) and a mitochondrial protein / X. Roucou, S. Montessuit, B. Antonsson et al. // Biochem. J. 2002. - Vol. 368.-P. 915-921.

155. Bcl-2 and Bax regulate the channel activity of the mitochondrial adenine nucleotide translocator / C. Brenner, H. Cadiou, H. L.Vieira et al. // Oncogene. 2000. - Vol. 19. - P. 329-336.

156. Bcl-2 and Bcl-X(L) block thapsigargin-induced nitric oxide generation, c-Jun NH(2)-terminal kinase activity, and apoptosis / R. K. Srivastava, S. J. Sollott, L. Khan et al. // Mol. Cell Biol. 1999. - Vol. 19, N. 8. - P. 56595674.

157. Bcl-2 familt members and functional electron transport chain regulate oxygen-deprivation-induced cell death / D. S. McClintock, M. T. Santore, V. Y. Lee et al. // Moll. Cell Biol. 2002. - Vol. 22, N 1. - P. 94-104.

158. Bcl-2 phosphorylation required for anti-apoptosis function / T. Ito, X. Deng, B. Can* et al. //J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 11671-11673.

159. Bcl-2 prevents Bax oligomerization in the mitochondrial outer membrane / V. Mikhailov, M. Mikhailova, D.J. Pulkrabek et al. // J. Biol. Chem.2001.-Vol. 276.-P. 18361-18374.

160. Bcl-2, Bcl-xL sequester BH3 domain-only molecules preventing Bax-and Bak-mediated mitochondrial apoptosis / E. H. Cheng, M. C. Wei, S. Weiler et al.//Mol. Cell.-2001.-Vol. 8.-P. 705-711.

161. Bcl-xL prevents apoptotic cell death of both primitive and definitive erythrocytes at the end of maturation / N. Motoyama, T. Kimura, T. Takahashi et al.//J. Exp. Med. 1999.-Vol. 189.-P. 1691-1698.

162. Beere, H. M. Death versus survival: functional interaction between the apoptotic and stress-inducible heat shock protein pathways / H. M. Beere // The Journal of Clinical Investigation. -2005. -Vol. 115,N 10.-P. 695-698.

163. Beroud C., The UMD-p53 database: new mutations and analysis tools / C. Beroud, T. Soussi // Hum. Mutat. 2003. -Vol. 3. - P. 176-181.

164. BH3 Domains of ВНЗ-Only Proteins Differentially Regulate Bax-Mediated Mitochondrial Membrane Permeabilization Both Directly and Indirectly / T. Kuwana, L. Bouchier-Hayes, С J.Ehipuk et al // Mol. Cell. 2005. - Vol. 17. -P. 525-535.

165. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes / P. Bouillet, J. F. Purton, D. I. Godfrey et al. // Nature.2002.-Vol. 415.-P. 922-9266.

166. ВНЗ-only proteins that bind pro-survival Bcl-2 family members fail to induce apoptosis in the absence of Bax and Bale / W. X. Zong, T. Lindsten, A. J. Ross etal.//Genes Dev.-2001.-Vol. 15.-P. 1481-1486.

167. BID regulation by p53 contributes to chemosensitivity / J. K. Sax, P. Fei, M. E. Murphy et al. // Nat. Cell Biol. 2002. - Vol. 4. - P .842-849.

168. Bid-deficient mice are resistant to Fas-induced hepatocellular apoptosis / X. M. Yin, K. Wang, A. Gross A et al. // Nature. 1999. - Vol. 400. -P. 886-891.

169. Block, E. Hydrogen peroxide alters the physical state and function of the plasma cell membrane of pulmonary artery endothelial cells / E. Block // J. Cell Physiol. 1991. - Vol. 146.-P. 362-369.

170. Bonizzi, G. The two NF-кВ activation pathways and their role in innate and adaptive immunity / G. Bonizzi, M. Karin // Trends Immunol. — 2004. -Vol. 25.-P. 280-288.

171. Borner, C. The Bcl-2 protein family: sensors and checkpoints for life-or-death decisions / C. Borner // Mol. Immunol. 2003. - Vol. 39. - P. 615-647.

172. Bouchier-Hayes, L. Mitochondria: pharmacological manipulation of cell death / L. Bouchier-Hayes, L. Lartigue // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115, N 10.-P. 649-652.

173. Bredesen, D. E. Apoptosis: overview and signal transduction pathways / D. E. Bredesen // J. Neurotrauma. 2000. - Vol. 17 - P. 801 -810.

174. Brodie, C. Regulation of cell apoptosis by protein kinase C8 / C. Brodie, P. M. Blumberg //Apoptosis. 2003. - Vol. 8. - P. 19-27.

175. Brookes, P. S. Mitochondria: regulators of signal transduction by reactive oxygen and nitrogen species / P. S. Brookes, A. L. Levonen, S. Shiva // Free Radical Biol. Med. 2002. - Vol. 33. - P. 755-764.

176. Brooks, C. L. Ubiquitination, phosphorylation and acetylation: the molecular basis for p53 regulation / C. L. Brooks, W. Gu // Curr. Opin. Cell Biol. -2003.-Vol. 15.-P. 164-171.

177. Burlacu, A. Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins / A. Burlacu // J. Cell. Mol. Med. 2003. - Vol. 7. - P. 249-257.

178. Byczkowski, J.Z. Biological role of superoxide ion-radical / J.Z. Byczkowski, T. Gessner // Int. J. Biochem. 1998. - Vol.20. - P.569-580.

179. Caelles, A. p53-Dependent apoptosis is not mediated by transcriptional activation of p53-target genes / A. Caelles, M. K. Helmberg // Nature. 1994. - Vol. 370. - P. 220-230.

180. Cain, K. The Apaf-1 apoptosome: a large caspase-activating complex (Review) / K. Cain, S. B. Bratton, G. M. Cohen // Biochimie. 2002. - N3. - P. 203-214.

181. Calcineurin activation protects T cells from glucocorticoid-induced apoptosis / Y. Zhao, Y. Tozawa, R. Iseki et al. // J. Immunol. 1995. - Vol. 154. -P. 6346-6354.

182. Campbell, K. J. Active repression of antiapoptotic gene expression by ReIA(p65) NF-kB / K. J. Campbell, S. Rocha, N. D. Perkins // Mol. Cell. 2004. -Vol. 13.-P. 853-865.

183. Campbell, K. J. Post-translational modification of RelA (p65) NF-kB / K. J. Campbell, N. D. Perkins // Biochem. Soc. Trans. 2004. - Vol. 32. - P. 1087-1089.

184. Campbell, K. J. Regulation of NF-kB function / K. J. Campbell, N. D. Perkins//Biochem. Soc. Symp. 2006. - Vol. 73.-P. 165-180.

185. CDK4 regulation by TNFR1 and JNK is required for NF-kB-mediated epidermal growth control / J. Y. Zhang, S. Tao, R. Kimmel et al. // J. Cell. Biol. -2005.-Vol. 168.-P. 561-566.

186. Cell-autonomous Fas (CD95)/Fas-ligand interaction mediates activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas / T. Brunner, R. J. Mogil, D. LaFace et al. //Nature. 1995. -N 2. - P. 441-444.

187. Ceramide accumulation precedes caspase-3 activation during apoptosis of A549 human lung adenocarcinoma cells / T. Ravid, A. Tsaba, P. Gee et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2003. - Vol. 284, N 6. - P. 1082-1092.

188. Characterization of the signal that directs Bcl-xL, but not Bcl-2, to the mitochondrial outer membrane / T. Kaufmann, S. Schlipf, J. Sanz et al. // J. Cell Biol. 2003. - Vol. 160. - P. 53-64.

189. Chen, L. Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their ВНЗ-only ligands allows complementary apoptotic function / L. Chen, S. N. Willis, A. Wei // Mol. Cell. 2005. - Vol. 17, N 3. - P. 393-403.

190. Chen, L. F. Shaping the nuclear action of NF-kappaB / L.F. Chen, W.C. Greene //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. - Vol. 5. - P. 392-401.

191. Comparison of HPV, p53 mutation and allelic losses in posttransplant and non-posttransplant oral squamous cell carcinomas / L. Zhang, J. B. Epstein, C. F. Poh et al. // J. Oral Path. Med. 2002. - Vol. 31. - P. 134-141.

192. Conditional deletion of the Bcl-x gene from erythroid cells results in hemolytic anemia and profound splenomegaly / K. U. Wagner, E. Claudio, E. B. Rucker 3rd et al. //Development. 2000. - Vol. 127. - P. 4949-4958.

193. Confocal microscopy of the mitochondrial permeability transition in necrotic cell killing, apoptosis and autophagy / J. J. Lemasters, T. Qian, S. P. Elmore et al. // Biofactors. -1998. -N8. P. 283-285.

194. Cory, S., The Bel -2 family: regulators of the cellular life-or-death switch / S. Cory, J. M. Adams // Nat. Rev. Cancer. 2002. - Vol. 2. - P. 647-656.

195. Crabtree, G.R. Generic signals and specific outcomes: signalingthrough Ca2+, calcineurin, and NFAT / G. R. Crabtree // Cell. 1999. -Vol. 96. -P. 611-614.

196. Crompton, M. The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death / M. Crompton // J. Biochem. 1999. - N 2. - P. 233-249.

197. Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade / P. Li, D. Nijhawan, I. Budihardjo et al.//Cell. 1997.- Vol. 91.-P. 479-489.

198. Davis, R. J. MAPKs: new JNK expands the group/ R. J. Davis// Trends Biochem.Sci. 1994. - Vol. 19. - P. 470-473.

199. De Zutter, G.S. Pro-apoptotic gene expression mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway / G. S. De Zutter, R. J. Davis//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98, N. 11.-P. 6168-6173.

200. Deficiency in Bak and Bax perturbs thymic selection and lymphoid homeostasis / J. C. Rathmell, T. Lindsten, W. X. Zong et al. // Nat. Immunol. -2002.-Vol.3.-P. 932-939.

201. Development and maintenance of В and T lymphocytes requires antiapoptotic Mcl-1 / J. T. Opferman, A. Letai, C. Beard et al. // Nature. 2003. — Vol. 426.-P. 671-676.

202. Dickinson, D. A. Curcumin alters EpRE and AP-1 binding complexes and elevates glutamate-cysteine ligase gene expression / D. A. Dickinson, К. E. lies, H. Zhang et al. // FASEB J. 2003. - Vol. 17. - P. 473-475.

203. Differential activation of transcription factors induced by Ca~ response amplitude and duration / R. E. Dolmetsch, R. S. Lewis, С. C. Goodnow, J. I. Healy // Nature. 1997. - Vol. 386. - P. 855-858.

204. Differential expression of p53 gene family members p63 and p73 in head and neck squamous tumorigenesis / A. Yang, M. Kagdah, Y. Wang et al. // Human Pathology. 2002. - Vol. 33.-P. 158-164.

205. Differential regulation of monocytic tumor necrosis factor-a and interleukin-10 expression / C. Meisel, K. Vogt, C. Platzer et al. // Eur. J. Immunol. 1996.-Vol. 26.-P. 1580.

206. Differential targeting of pro-survival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic function / L. Chen, S. N. Willis, A. Wei et al. //Mol. Cell.-2005.-Vol. 17.-P. 393-403.

207. Direct activation of mitochondrial apoptosis machinery by c-Jun N-terminal kinase in adult cardiac myocytes / Aolci H., Kang P.M., Hampe J. et al. // J. Biol. Chem . -2002.-Vol. 277.-P. 10244-10250.

208. Dissecting p53 tumor suppressor functions in vivo / C. A. Schmitt, J. S. Fridman, M. Yang et al/ // Cancer Cell. 2002. - Vol. 1. - P. 289-298.

209. Distelhorst, C. W. Role of Calcium in Glucocorticosteroid-Induced Apoptosis of Thymocytes and Lymphoma Cells: Resurrection of Old Theories by New Findings / C. W. Distelhorst, G. Dubyak // Blood. 1998. - Vol. 91, N 3. - P. 731-734.

210. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics / A. Letai, M. Bassik, L.Walensky et al. // Cancer Cell. 2002. - Vol. 2. - P. 183-192.

211. Distinct effects of thioredoxin and antioxidants on the activation of transcription factors NF-kB and AP-1 / H. Schenk, M. Klein, W. Erdbrugger et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -Vol. 91. - P. 1672-1676.

212. Dowd, D. R. Evidence that glucocorticoid- and cyclic AMP-induced apoptotic pathways in lymphocytes share distal events / D. R. Dowd, R. L. Miesfeld // Mol. Cell. Biol. 1992. - Vol. 12. - P. 3600-3608.

213. Dragovich, T. Signal transduction pathways that regulate cell survival and cell death / T. Dragovich, С. M. Rudin, С. B. Thompson // Oncogene. — 1998. -Vol.17.-P. 3207-3213.

214. Dumaz, N. p53-serine 15 phosphorylation stimulates the transactivation function of p53 but does not directly influence interaction with HDM2 / N. Dumaz, D. W. Meek // EMBO J. 1999. - Vol. 18. - P. 7002-7010.

215. Earnshaw, W. C. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis / W. C. Earnshaw, L. M. Martins, S. H. Kaufmann //Annu. Rev. Biochem. 1999. - Vol. 68. - P. 383-424.

216. Elion, E. Signal transduction: routing MAP Kinase cascades / E. Elion //Science. 1998.-Vol. 281.-P. 1625-1626.

217. Endogenous reactive oxygen intermediates activate tyrosine kinases in human neutrophils / J. H. Brumell, A. L. Burkhardt, J. B. Bolen, S. Grinsiein // J. Biol. Chem.- 1996.-Vol. 271-P. 1455-1461.

218. Epinephrine inhibits tumor necrosis factor-a and potentiates interleukin 10 pro- duction during human endotoxemia / T. van der Poll, S. M. Coyle, K. Barbosa, et al. // J. Clin. Invest. 1996. - Vol. 97. - P. 713-716.

219. Extraction and analysis of superoxide free radicals (.O2") from whole mammalian liver / A. R. Shoaf, A. U. Shaikh, R. D. Harbison, O. Hinojosa // J. Biolumin. Chemilumin. 1991. - Vol.6, N 2. - P. 87-96.

220. Eynott, P. R. Effect of an inhibitor of Jun N-terminal protein kinase, SP600125, in single allergen challenge in sensitizedrats / P. R. Eynott // Immunology. 2004. - Vol. 112. - P. 446-453.

221. Fan, M. Vinblastine-induced phosphorylation of Bcl-2 and Bcl-XL is mediated by JNK and occurs in parallel with inactivation of the Raf-l/MEK/ERK cascade / M. Fan, M. Goodwin, T. Vu // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 29980-29985.

222. Ferredoxin reductase affects p53-dependent, 5-fluorouracil-induced apoptosis in colorectal cancer cells / P. M. Hwang, F. Bunz, G. Yu et al. // Nat.Med. 2001. - Vol. 7. - P. 1111-1117.

223. Fridman, J. S. Control of apoptosis by p53 / J. S. Fridman, S. W. Lowe // Oncogene. 2003. - Vol. 22. - P. 930-940.

224. From the Cover: Antibodies have the intrinsic capacity to destroy antigens / A. D. Wentworth, L. H. Jones, P. Wentworth et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2000.-Vol. 97, N 20.-P. 10930-10935.

225. Gallo, K. A. Mixed-lineage kinase control of JNK and p38 МАРК pathways / K. A. Gallo, G. L. Johnson // Nature Reviews Molecular cell Biology. -2002. Vol. 3, N 9. - P. 663-672.

226. Garg, A. K. Reactive oxygen intermediates in TNF signaling / A. K. Garg, В. B. Aggarwal / Mol. Immunol. 2002. - Vol. 39. - P. 509-517.

227. Garrington, T. P. Organization and regulation of mitogen- activated protein kinase signaling pathways / T. P. Garrington, G. L. Johnson // Curr. Opin. Cell Biol. 1999.-Vol. 11.-P. 211-218.

228. Genome-wide comparison of human keratinocyte and squamous cell carcinoma responses to UVB irradiation: implications for skin and epithelial cancer / J. E. Dazard, H. Gal, N. Amariglio et al. // Oncogene. 2003. - Vol. 22. -P. 2993-3006.

229. Go, N. F. Inerleukin-10, a novel В cell stimulatory factor: unresponsiveness of X chromosomelinked immunodeficiency В cells / N. F. Go, B.E. Castle, R. Barrett//J. Exp. Med. 1990. - Vol. 172.-P. 1625-1631.

230. Gopala, K. R. Protein kinase С signaling and oxidative stress / K. R. Gopala, S. Jaken//Free Radic. Biol. Med. -2000. Vol.28. - P. 1349-1361.

231. Gottlieb, R. A. Mitochondria: execution central / R. A. Gottlieb // FEBS Lett. 2000. - Vol. 482. - P. 6-12.

232. Green, D. R. A matter of life and death / D. R. Green, G. I. Evan // Cancer Cell. -2002. -N 1.- P. 19-30.

233. Green, D. R. Mitochondria and apoptosis / D. R. Green, J. C. Reed // Science. 1998.-Vol. 281.-P. 1309-1312.

234. Green, D. R. The pathophysiology of mitochondrial cell death / D. R. Green, G. Kroemer // Science. 2004. - Vol. 305. - P. 626-629.

235. Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis / J. J. Lum, D. E. Bauer, M. Kong et al. // Cell. 2005. - Vol. 120. -P. 237-248.

236. Guardians of cell death: the Bcl-2 family proteins / P. T. Daniel, K. Schulze-Osthoff et al. // Essays Biochem. 2003. - Vol. 39. - P. 73-88.

237. Gudkov, A. V. The role of p53 in determining sensitivity to radiotherapy / A. V. Gudkov, E. A. Komarova // Nat. Rev. Cancer. — 2003. Vol. 3.-P. 117-129.

238. Н2Ог at physiological concentrations modulates Leydig cell function inducing oxidative stress and apoptosis / D. К Gautam, M. M. Misro, S. P. Chaki et al. // Apoptosis. 2005. - Vol. 12. - P. 405-409.

239. Hack, C. Interleukine-8 in sepsis: relation to shock and inflammatory mediators / C. Hack // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 2835-2842.

240. Haddad, J.J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology / J. J. Haddad // Respir. Res. 2002. - Vol.3, N 1. - P. 26-30.

241. Haddad, J.J. Pharmaco-redox regulation of cytolcine-related pathways: from receptor signaling to pharmacogenetics / J. J. Haddad // Free Radical Biol. Med. 2002. - Vol. 33. - P. 907-926.

242. Harada, C., Nakamura, K. Role of Apoptosis Signal-Regulating Kinase 1 Stress-Induced Neural Cell Apoptosis in Vivo / C. Harada, K. Nakamura// Am. J. Pathol. 2006. - Vol. 168, N 1. - P. 262-269.

243. Harris, S. L. The p53 pathway: positive and negative feedback loops / S. L. Harris, A. J. Levine // Oncogene. 2005. - Vol. 24. - P. 2899-2908.

244. Hayden, M. S. Signaling to NF-kB / M. S. Hayden, S. Ghosh // Genes Dev. 2004. - Vol. 18. - P. 2195-2224.

245. Hertog, J. D. Redox regulation of protein-tyro sine phosphatases / J. D. Hertog, A. Groen, T. van der Wijlc // Arch. Biochem. Biophys. 2005. - Vol. 434. -P. 11-15.

246. Flinds, M. G. Regulation of apoptosis: uncovering the binding determinants / M. G. Hinds, C. L. Day // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. - Vol. 15.-P. 690-699.

247. Hoffmann, A. Genetic analysis of NF-kB/Rel transcription factors defines functional specificities / A. Hoffmann, Т. H. Leung, D. Baltimore // EMBO J. 2003. - Vol. 22. - P. 5530-5539.

248. Hook, S. S. Ca" /СаМ-dependent kinases: from activation to function / S. S. Hook, A. R. Means // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001. - Vol. 41. - P. 471-505.

249. Hsu, Y. Т. Bax in murine thymus is a soluble monomeric protein that displays differential detergent-induced conformations / Y. T. Hsu, R. J. Youle // J. Biol Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 10777-10783.

250. Hsu, Y. Т. Cytosol-to-membrane redistribution of Bax and Bcl-X(L) during apoptosis / Y. T. Hsu, K. G. Wolter, R. J. Youle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94, N 8. - P. 3668-3672.

251. Huang, D. C. S. ВНЗ-only proteins — essential initiators of apoptotic cell death / D. C. S.Huang, A. Strasser//Cell. 2000. - Vol. 103.-P. 839-842.

252. Hydrogen peroxide induces tumor necrosis factor alpha-mediated cardiac injury by a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent mechanism / D. R. Meldrum, C. A. Dinarello, J. C. Cleveland et al. // Surgery. 1998. - Vol. 124.-P. 291-296.

253. Hypoxia, angiotensin-II, and norepinephrine mediated apoptosis is stimulus specific in canine failed cardiomyocytes: a role for p38 МАРК, Fas-L and cyclin D1 / V. G. Sharov, A. Todor, G. Suzuki et al. // Eur. J. Heart Fail. 2003. -Vol. 5.-P. 121-129.

254. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome с / X. Liu, C. Kim, J. Yang et al. // Cell. 1996. - Vol. 86, N l.-P. 147-157.

255. Inhibition of C-Jun N-terminal kinase 1, but not c-Jun N-terminal kinase 2, suppresses apoptosis induced by ischemia/reoxygenation in rat cardiac myocytes / D. Hreniuk, M. Garay, W. Gaarde et al. // Mol. Pharmacol. 2001. -Vol. 59.-P. 867-874.

256. Inhibition of p38 МАРК a/b reduces ischemic injury and does not block protective effects of preconditioning / S. Schneider, W. Chen, J. Hou et al. // Am J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2001. - Vol. 280. - P. H499-FI508.

257. Inhibition of the cardiac p38 МАРК pathway by SB203580 delays ischemic cell death / M. Barancik, P. Htun, C. Strohm et al. // J. Cardiovasc. Pharmacol. 2000. - Vol. 35. - P. 474-483.

258. Integral role of Noxa in p53-mediated apoptotic response / T. Shibue, K. Takeda, E. Oda et al. // Genes Dev. 2003. - Vol. 17. - P. 2233-2238.

259. Interleukin 10 (IL-10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an autoregulatory role of IL-10 produced by monocytes / R. de Waal Malefyt, J. Abrams, B. Bennett et al. // J. Exp. Med. 1991. - Vol. 174. - P. 1209.

260. Interleukin-10 protects activated human T lymphocytes against growth factor withdrawal-induced cell death / G. Pawelec, A. ITambrecht, A. Rehbein, M. Adibzadeh // Cytokine. 1996. - Vol. 8, N 12. - P. 877-881.

261. Interluekin-10 rescues T cells from apoptotic cell death: association with an up-regulation of Bcl-2 / S. B. Cohen, J. B. Crawley, M. C. Kahan et al. // Immunology. 1997. - Vol. 92, N 1. - P. 1-5.

262. Intracellular oxidation/reduction status in the regulation of transcription factor NF-kB and Ap-1/ D. Gius, A. Botero, S.Shah, H.A.Curry // Toxicol. Lett. 1999.-Vol. 106.-P. 93-106.

263. Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-interacting protease, in Fas/APOl and TNF receptor-induced cell death / M. Boldin, T. Goncharov, Y. V. Goltsev, D. Wallach//Cell. 1996.-Vol. 85, N6.-P. 803-815.

264. Involvement of p53 expression in cAMP-mediated apoptosis in immortalized granulosa cells / I. Keren-Tal, B. S. Suh, A. Dantes et al. // Exp Cell Res. 1995. - Vol. 218. - P. 283-295.

265. Ischemia/reperfusion injury at the intersection with cell death / S.E. Logue , A.B. Gustafsson, A. Samali , R.A. Gottlieb // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2005. - Vol. 38. - P. 21-33.

266. Jayadev, S. Elevated ceramide is downstream of altered calcium homeostasis in low serum-induced apoptosis / S. Jayadev, J. C. Barrett, E. Murphy // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2000. - Vol. 279, N 5. - P. 1640-1647.

267. Jenkins, J. K. The effects of interleukin-10 (IL-10) on interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 beta production in human monocytes and neutrophils / J. K. Jenkins, M. Malyak, W. P. Arend // Lymphokine Cytokine Res. 1994.-Vol. 13.-P. 47-49.

268. JNK1 physically interacts with WW domain-containing oxidoreductase (WOX1) and inhibits WOX1-mediated apoptosis / N. S. Chang, J. Doherty, A. Ensign et al. //J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 9195-9202.

269. JNK 1-dependent antimitotic activity of thiazolidin compounds in human non-small-cell lung and colon cancer cells / F. Teraishi, S. Wu, J. Sasaki, L. Zhang // CMLS Cellular and Molecular Life Sciences. 2005. - Vol. 62. - P. 2382-2389.

270. JNK2 is required for efficient T-cell activation and apoptosis but not for normal lymphocyte development / K. Sabapathy, Y. Ни, T. Kallunki et al. // Curr. Biol. 1999. - Vol. 9. - P. 116-125.

271. Johnson, G. L. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinase / G. L. Johnson, R. Lapadat. // Science. -1998.-Vol. 298.-P. 1911-1912.

272. Joza, N. Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death / N. Joza, S. A. Susin, E. Daugas // Nature. 2001. -Vol. 410.-P. 549-554.

273. Joza, N. Genetic analysis of the mammalian cell death machinery / N. Joza, G. Kroemer, J. M. Penninger // Trends Genet. 2002. - Vol. 18, N 3. - P. 142-149.

274. JSAP1, a novel Jun N-terminal protein kinase (JNK)-binding protein that functions as a scaffold factor in the JNK signaling pathway / M. Ito, K. Yoshioka, M. Akechi et al. // Mol. Cell. Biol. 1999. - Vol. 19. - P. 7539-7548.

275. Kim, M. S. Involvement of mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB activation in Ca** "induced IL-8 production in human mast cells / M. S. Kim, W. K. Lim, R. K. Park et al. // Cytokine. 2005. - Vol. 32, N 5. - P. 226233.

276. Kinyamu, H. K. Estrogen receptor-dependent proteasomal degradation of the glucocorticoid receptor is coupled to an increase in mdm2 protein expression / H. 1С. Kinyamu, Т. K. Archer // Mol. Cell. Biol. 2003. - Vol.23. - P. 58675881.

277. Klein, J. A. Oxidative stress, cell cycle, and neurodegeneration / J. A. Klein, S. L. Ackerman // J. Clin Invest. -2003. Vol. 111, N 6. - P. 785-793.

278. Kofler, R. The molecular basis of glucocorticoid-induced apoptosis of lymphoblastic leukemia cells / R. Kofler // Histochem. Cell Biol. 2000. - Vol. 114.-P. 1-7.

279. Kroemer, G. Mitochondrial control of apoptosis / G. Kroemar, N. Zamzani, S.A. Susin // Immunol. Today. 1997. - Vol. 18, N1.-P. 44-51.

280. Kroemer, G. Mitochondrial control of cell death / G. Kroemer, J. C. Reed//Nat. Med. 2000. - Vol. 6.-P. 513-519.

281. Lavrik, I. N. Caspases: pharmacological manipulation of cell death / I. N. Lavrik, A. Golks // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115, N 10. - P. 653-655.

282. Lei, K. JNK phosphorylation of Bim-related members of the Bcl2 family induces Bax-dependent apoptosis / K. Lei, R. J. Davis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - P. 2432-2439.

283. Levine, A. J. The P53 pathway: what questions remain to be explored? / A. J. Levine, W. Hu, Z. Feng // Cell Death and Diff. 2006. - Vol. 48. - P. 456462.

284. Li, L. F. Stretch-induced IL-8 depends on c-Jun NH2-terminal and nuclear factor-kappaB-inducing kinases / L. F. Li, B. Ouyang, G. Choukroun et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2003. - Vol. 285, N 2. - P. 464-475.

285. Li, L. Y. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria / L. Y. Li, X. Luo, X. Wang // Nature. 2001. - Vol. 412. - P. 9599.

286. Lin, M. T. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases / M. T. Lin, M. F. Beal //Nature. 2006. - Vol. 443, N 19.-P. 787-795.

287. Liochev, S. I. The effects of superoxide dismutase on H20? formation / S. I. Liochev, I. Fridovich // Free Radical Biol Med. 2007. - Vol. 42. - P. 14651469.

288. Little, S. A. Effects of hydrogen peroxide on basal and hormone-stimulated lipolysis in perifused rat fat cells in relation to the mechanism of action of insulin / S. A. Little, C. de Haen // J. Biol. Chem. 1980. - Vol. 255, N 22. - P. 10888-10895.

289. Lo, Y.Y. Involvement of reactive oxygen species in cytokine and growth factor induction of c-fos expression in chondrocytes / Y. Y. Lo, T. F. Cruz // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270, N 20. - P. 11727-11730.

290. Loss of the pro-apoptotic ВНЗ-only Bcl-2 family member Bim inhibits BCR stimulation-induced apoptosis and deletion of autoreative В cells / A. Enders, P. Bouillet, H. Puthalakath et al. // J. Exp. Med. 2003. - Vol. 198 - P. 1119-1126.

291. Lotem, J. Suppression or induction of apoptosis by opposing pathways downstream from calcium-activated calcineurin / J. Lotem, R. Kama, L. Sachs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 12016-1220.

292. Lowe, S.W. Apoptosis in cancer. / S. W. Lowe, A. W. Lin // Carcinogenesis.-2000.-Vol. 21.-P. 485-495.

293. Lynch, D. H. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses / D. H. Lynch, F. Ramsdell, M. R. Alderson // Immunol Today. 1995. -N 12.-P. 569-574.

294. Maintenance of the T lymphocyte pool by inhibition of apoptosis: a novel strategy of immunostimulation? / G. Kroemer, N. Zamzami, P. Marchetti et al. // Microbiol. Immunol. 1995. - Vol. 200. - P. 223-235.

295. MAP-1 is a mitochondrial effector of Вах / К. O. Tan, N. Y. Fu, S. K. Sukumaran et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 10. - P. 1462314628.

296. МАРК superfamily plays an important role in daunomycin-induced apoptosis of cardiac myocytes / W. Zhu., Y. Zou, R. Aikawa et al. // Circulation. — 1999. Vol. 100. -P. 2100-2107.

297. May, J. M. The insulin-like effect of hydrogen peroxide on pathways of lipid synthesis in rat adipocytes / J. M. May, C. de Наёп // J. Biol. Chem. -1979.-Vol. 254. N 18.-P. 9017-9021.

298. Mcl-1 deficiency results in peri-implantation embryonic lethality / J. L. Rinkenberger, S. Horning, B. Klocke et al. // Genes Dev. 2000. - Vol. 14. - P. 23-27.

299. Mechanical stress-induced DNA damage and rac-p38MAPK signal pathways mediate p53-dependent apoptosis in vascular smooth muscle cells / M. Mayr, Y. Ни, H. Hainaut, Q. Xu // FASEB J. 2002. - Vol. 16. - P. 1423-1425.

300. Mikhailov, V. Association of Bax and Bak homo-oligomers in mitochondria. Bax requirement for Bak reorganization and cytochrome с release / V. Mikhailov, M. Mikhailova, K. Degenhardt et al. // J. Biol Chem. 2003. - Vol. 278, N7.-P. 5367-5376.

301. Mikkelsen, R. B. Biological chemistry of reactive oxygen and nitrogen and radiation-induced signal transduction mechanisms / R. B. Mikkelsen, P. Wardman // Oncogene. 2003. - Vol. 22. - P. 5734-5754.

302. Mitochondrial dysfunction in the pathogenesis of necrotic and apoptotic cell death / J. J. Lemasters, T. Qian, C. A. Bradham et al. // J. Bioenerg. Biomembr.- 1999.-Vol. 31, N4.-P. 305-319.

303. Mitochondrial intermembrane junctional complexes and their involvement in cell death / M. Crompton, E. Barksby, N. Johnson, M. Capano // Biochimie.-2002.-Vol. 84.-P. 143-152.

304. Mitochondrial involvement in nitric oxide-induced cellular death in cortical neurons in culture / S. Figueroa, M. J. Oset-Gasque, C. Arce , C. J. Martinez-Honduvilla // J. Neurosci Res. 2006. - Vol. 5. - P. 100-104.

305. Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis / P. Marchetti, T. Hirsch, N. Zamzami et al. // J. Immunol. 1996. - N 11. - P. 4830-4836.

306. Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human./ C. Widmann, S. Gibson, M. B. Jarpe, G. L. Johnson //Physiol. Rev. -1999. -Vol. 79. P. 143-80.

307. MKK6 activates myocardial cell NF-kB and inhibits apoptosis in a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent manner/ D. Zechner., R. Craig, D. S. Hanford et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 8232-8239.

308. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology / К. K.

309. Griendling, D. Sorescu, B. Lassegue, M. Ushio-Fukai // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. - Vol. 20, N 10. - P. 2175-2183.

310. Moll, U.M. p53, p63 and p73—solos, alliances and feuds among family members / U. M. Moll // Biochim. Biophys. Acta. 2001 - Vol. 1552. - P. 47-59.

311. Moulton, P. J. NADPH oxidase of chondrocytes contains an isoform of the gp91phox subunit / P. J. Moulton, M. B. Goldring, J. T. Hancock // Biochem J. 1998.-Vol. 329. N3.-P. 449-541.

312. Multiple Bcl-2 family members demonstrate selective dimerizations with Вах / T. W. Sedlak, Z. N. Oltvai, E. Yang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 7834-7838.

313. Murrell, G. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals / G. Murrell, F.N. Bromley // Biochem. J. 1990. - Vol. 265. - P. 659665.

314. Myocardial dysfunction and ultrastructural alterations mediated by oxygeen metabolites./ S. Miki, M. Ashraf, S. Salka, N. Sperelakis// J. Mol Cell Cardiol. 1988.-Vol. 20.-P. 1009-1024.

315. Nagata, S. Apoptosis by death factor / S. Nagata // Cell. 1997. - Vol. 88.-P. 355-365.

316. Nakano, K. PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53 / K. Nakano, К. H. Vousden // Mol. Cell. 2001. - Vol. 7. - P. 683-694.

317. Newmeyer, D. D. Mitochondria: releasing power for life and unleashing the machineries of death / D. D. Newmeyer, S. Ferguson-Miller // Cell. -2003.-Vol. 112.-P. 481-490.

318. NF-kB and IaB are found in the mitochondria. Evidence for regulation of mitochondrial gene expression by NF-kB. / P. C. Cogswell, D. F. Kashatus, J. A. Keifer et al. // J. Biol. Chem 2003. - Vol. 278. - P. 2963-2968.

319. NF-kB and JNK: an intricate affair / C. Bubici, S. Papa, C. G. Pham // Cell Cycle.-2004.-Vol. 3.-P. 1524-1529.

320. NF-kB blockade and oncogenic Ras trigger invasive human epidermal neoplasia / M. Dajee, M. Lazarov, J. Y. Zhang et al. // Nature. 2003. - Vol. 421. -P. 639-643.

321. Nicholson, D. W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death/ D. W. Nicholson // Cell Death Differ. 1999. -Vol. 6.-P. 1028-1042.

322. Noxa, a ВНЗ-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis / E. Oda, R. Ohki, H. Murasawa et al. // Science. 2000. - Vol. 288. - P. 1053-1058.

323. Obligate role of anti-apoptotic Mcl-1 in the survival of hematopoietic stem cells / J. Opferman, H. Iwasaki, С. C. Ong et al. // Science. 2005. - Vol. 307. - P. 1101-1104.

324. Oligomeric Bax is a component of the putative cytochrome с release channel MAC, mitochondrial apoptosis-induced channel / L. M. Dejean, S. Martinez-Caballero, L. Guo et al. // Mol. Biol. Cell. 2005. - Vol. 16. - P. 24242432.

325. Oncogenic ras and p53 cooperate to induce cellular senescence / G. Ferbeyre, E. de Stanchina , A. W. Lin et al. // Mol. Cell. Biol. 2002. - Vol. 10. -P. 3497-3508.

326. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. / Z. Xia, M. Dickens, J. Raingeaud et al. //Science. -1995. Vol. 270. - P. 13261331.

327. Oren, M. Decision making by p53: life, death and cancer / M. Oren // Cell Death Differ. 2003. - Vol. 10. - P. 431-442.

328. Oscillations in NF-kB signaling control the dynamics of gene expression / D.E. Nelson, A.E. Ihekwaba, M. Elliott // Science. 2004. - Vol. 306. -P. 704-708.

329. Oscillatory and steady laminar shear stress differentially affect human endothelial redox state: role of a superoxide-producing NADH oxidase / G.W. Keulenaer, D. C. Chappell, N. Ishizaka et al. // Circ Res. 1998. - Vol. 82, N 10. -P. 1094-1101.

330. Oudin, S. Role of MAP kinase activation in interleukin-8 production by human BEAS-2B bronchial epithelial cells submitted to cyclic stretch / S. Oudin, J. Pugin // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2002. - Vol. 27. - P. 107-114.

331. Oxidants as stimulators of signal transduction / Y. I. Suzuki, H. S. Firman, A. Sevanian et al. // Free Radic.Biol.Med. 1997. - Vol. 22. - P. 269-285.

332. Pahl, H. L. Activators and target genes of Rel/NF-B transcription factors / H. L. Pahl // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 6853-6866.

333. Peers, C. Acute oxygen sensing: Diverse but convergent mechanisms in airway and arterial chemoreceptors / C. Peers, P. J. Kemp // Respir. Res. 2001. -Vol. 2.-P. 145-149.

334. Perkins, N. D. Achieving transcriptional specificity with NF-kB / N. D. Perkins // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1997. - Vol. 29. - P. 1433-1448.

335. Perkins, N. D. NF-kB: tumor promoter or suppressor? / N. D. Perkins // Trends Cell Biol. 2004. - Vol. 14. - P. 64-69.

336. Perkins, N. D. Good cop, bad cop: the different faces of NF-kappa В/ N. D. Perkins, T. D. Gilmore // Cell Death Differ. 2006. - Vol. 13, N 5.- P. 759772.

337. Peter, M. E. The CD95 (APO-l/Fas) DISC and beyond / M. E. Peter, P. H. Krammer //Cell Death Differ. 2003. - Vol. 10. - P. 26-35.

338. Phosphorylation of NF-kB and IkB proteins: implications in cancer and inflammation / P. Viatour, M. P. Merville, V. Bours et al. // Trends Biochem. Sci. 2005. - Vol. 30. - P. 43-52.

339. Possible new role for NF-kB in the resolution of inflammation / T. Lawrence, D. W. Gilroy, P. R. Colville-Nash et al. // Nat. Med. 2001. - Vol. 7. -P. 1291-1297.

340. Posttranslational modifications of p53 in replicative senescence overlapping but distinct from those induced by DNA damage / K. Webley, A. Jane, I. Bond et al. // Molecular and Cellular Biology. 2000. - Vol. 20. - P. 2803-2808.

341. Price, M. A. Comparative analysis of the ternary complex factors Elk-1, SAP-la and SAP-2 (ERP/NET) / M. A. Price, A. E. Rogers, R. Treisman // EMBO J. 1995. - Vol. 14.-P. 2589-2601.

342. Prives, C. The p53 pathway / C. Prives, P. A. Hall, // J. Path. 1999. -Vol. 187.-P. 112-126.

343. Pro-apoptotic Bak is sequestered by Mcl and Bcl-xL, but not Bcl-2, until displaced by ВНЗ-only proteins / S. N. Willis, L. Chen, G. Dewson et al. // Genes Dev.-2005.-Vol. 19.-P. 1294-1305.

344. Pro-apoptotic Bax and Bak: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death / M. C. Wei, W. X. Zong, E. H. Cheng et al. // Science. -2001. Vol. 292. - P. 727-730.

345. Pro-apoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses, leukocyte homeostasis, and to preclude autoimmunity / P. Bouillet, D. Metcalf, D. C. S. Huang et al. // Science. 1999. - Vol. 286. - P. 1735-1738.

346. Properties of the permeability transition pore in mitochondria devoid of cyclophilin D / E. Basso, L. Fante, J. Fowlkes et al. // J. Biol. Chem. 2005. -Vol. 280.-P. 18558-18561.

347. Protein kinase CK2 promotes aberrant activation of nuclear factor-kB, transformed phenotype, and survival of breast cancer cells / R. Romieu-Mourez, E.1.ndesman-Bollag, D. C. Seldin et al. // Cancer Res. 2002. - Vol. 62. - P. 67706778.

348. Protein kinase Ce interacts with Bax and promotes survival of human prostate cancer cells / M. A. McJilton, C. Van Sikes, G. G. Wescott et al. // Oncogene. 2003. - Vol. 22. - P. 7958-79568.

349. Protein kinase C-e promotes survival of lung cancer cells by suppressing apoptosis through dysregulation of the mitochondrial caspase pathway / L. Ding, H. Wang, W. Lang, L. Xiao //J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 35305-35313.

350. Puma induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells / J. Yu, L. Zhang, P.M. Hwang et al. //Mol. Cell. -2001. Vol. 7. - P. 673-682.

351. Puma is an essential mediator of p53-dependent and -independent apoptotic pathways / J. R. Jeffers, E. Parganas, Y. Lee et al. // Cancer Cell. — 2003. -Vol. 4.-P. 321-328.

352. Ranger, A. M. Mouse models of cell death / A. M. Ranger, B. A. Malynn, S. J. Korsmeyer // Nat. Gen.-2001. Vol.28. - P. 113-118.

353. Rationale for Bcl-xL/Bad peptide complex formation from structure, mutagenesis, and biophysical studies / A. M. Petros, D. G. Nettseheim, Y. Wang et al. // Protein Sci. 2000. - Vol. 9. - P. 2528-2534.

354. Reactive oxygen species promote TNFa-induced death and sustained INK activation by inhibiting MAP kinase phosphatases / H. Kamata, S. Honda, S. Maedaetal.// Cell. -2005. -Vol. 120.-P. 649-661.

355. Reciprocal inhibition of p53 and nuclear factor-kappaB transcriptional activities determines cell survival or death in neurons / C. Culmsee, J. Siewe, V. Junker et al. // J. Neurosci. 2003. - Vol. 23. - P. 8586-8595.

356. Redox regulation of interleukin-8 expression in MKN28 cells / T. Shimada, N. Watanabe, H. Hiraishi, A. Terano // Dig. Dis. Sci. 1999. -Vol. 44, N2.-P. 266-273.

357. Regula, К. M. Mitochondria-assisted cell suicide: a license to kill / K. M. Regula, K. Ens, L. A. Kirshenbaum // J. Mol. Cell. Cardiol. 2003. - Vol. 35. -P. 559-567.

358. Regulation of human airway epithelial cell IL-8 expression by MAP kinases / J. Li, S. Kartha, S. Iasvovskaia, A. Tan et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2002. - Vol. 283 - P. L690-L699.

359. Regulation of monocyte IL-10 synthesis by endogenous IL-1 and TNF-alpha: role of the p38 and p42/44 mitogen-activated protein kinases / A. D. Foey, S. L. Parry, L. M. Williams et al. // J. Immunol. 1998. - Vol. 160, N 2. - P. 920-928.

360. Regulation of NF-kB and p53 through activation of ATR and Chlcl by the ARF tumour suppressor / S. Rocha, M. D. Garrett, K. J. Campbell et al. // EMBO J. 2005. - Vol. 24. - P. 1157-1169.

361. Regulation of p53 by hypoxia: dissociation of transcriptional repression and apoptosis from p53-dependent transactivation / C. Koumenis, R. Alarcon, E. Hammond, P. Sutphin et al. // Mol. Cell Biol. 2001. - Vol. 21. - P. 1297-1310.

362. Regulation of p53 stability and p53-dependent apoptosis by NADH quinone oxidoreductase 1 / G. Asher, J Lotem, B.Cohen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.-Vol. 98.-P. 1188-1193.

363. Relationship between interleukin-8 and the oxidant-antioxidant system in end-stage renal failure patients / M. Aydin, E. Ozkok, O. Ozturk et al. // Exp. Clin. Transplant.-2007.-Vol.5, N 1 P. 610-613.

364. Requirement of JNK for stress-induced activation of the cytochrome c-mediated death pathway / C. Tournier, P. Hess, D. D. Yang et al. // Science. -2000. Vol. 288. - P. 870-874.

365. Rhabdomyosarcoma cell lines are resistant to Fas- and highly sensitive to TRAIL-induced apoptosis /1. Petalc, D. M. Tillman, F. G. Harwood et al. // Clin. Cancer Res. 2000. - Vol. 6. - P. 4432-4441.

366. Rincon, M. JNK and p38 MAP kinases in CD4+ and CD8+ T cells / M. Rincon, G. Pedraza-Alva // Immunol. Rev. 2003. - Vol. 192. - P. 131-142.

367. Rincon, V. The JNK and p38 MAP kinase signaling pathways in cell-mediated immune responses / V. Rincon, R. A. Flavell, R. A.Davis // Free Radic. Biol. Med.-2000.-Vol. 28.-P. 1328-1337.

368. Rocha, S. p53- and Mdm2-independent repression of NF-kB transactivation by the ARF tumor suppressor / S. Rocha, K. J. Campbell, N. D. Perkins//Mol. Cell. 2003. - Vol. 12.-P. 15-25.

369. Role of glutathione depletion and reactive oxygen species generation in apoptotic signaling in a human В lymphoma cell line / J. S. Armstrong, К. K. Ssteinayer, B. Hornung et al. // Cell Death Differ. 2002. - Vol. 9 - P. 252-263.

370. Role of redox potential and reactive oxygen species in stress signaling / V. Adler, Z. Yin, K. D. Tew, Z. Ronai // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 61046111.

371. Role of the stress-activated protein kinases in endothelin-induced cardiomyocyte hypertrophy / G. Choukroun, R. Hajjar, J. M. Kyriakis et al. // J. Clin. Investig. 1998. -Vol. 102.-P. 1311-1320.

372. Roles of nuclear factor kB in neuronal survival and plasticity // M. P. Mattson, C. Culmsee, Z. Yu, S. Camandola // Int. Soc. for Neurochem. 2000. -Vol. 5.-P. 238-247.

373. Saccani, S. Modulation of NF-kB activity by exchange of dimmers / S. Saccani, S. Pantano, G. Natoli//Mol. Cell.-2003.-N. 11.-P. 1563-1574.|

374. Saccani, S. p38-dependent marking of inflammatory genes for increased NF-kB recruitment / S. Saccani, S. Pantano, G. Natoli // Nat. Immunol. -2002.-N3.-P. 69-75.

375. Sawatzky, D. A. The Involvement of the Apoptosis-Modulating Proteins ERK 1/2, Bcl-xL and Bax in the Resolution of Acute Inflammation in Vivo / D. A. Sawatzky, D. A. Willoughby // Am. J. Path. 2006. - Vol. 168, N 1. -P. 33-41.

376. Schuler, S. Mechanisms of p53-dependent apoptosis / S. Schuler, D. Green//Biochem. Soc. Trans. 2001. - Vol. 29.-P. 684-688.

377. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors /S. Gupta, T. Barrett, A. J. Whitmarsh et al. // EMBO J. 1996. - Vol. 15. -P. 2760-2770.

378. Seoane, J. Мус suppression of the p21(Cipl) Cdk inhibitor influences the outcome of the p53 response to DNA damage / J. Seoane, H. V. Le, J. Massagu6 //Nature. 2002. - Vol. 419. - P. 729-734.

379. Shapiro, L. Osmotic regulation of cytokine synthesis in vitro / L. Shapiro, C. A. Dinarello // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92 - P. 12230-12234.

380. Shaulian, E. AP-1 as a regulator of cell life and death / E. Shaulian, M. Karin //Nat. Cell Biol. 2002. - Vol. 4. - P. E131-E136.

381. Shimizu, S. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome с by the mitochondrial channel VDAC / S. Shimizu, M. Narita, Y. Tsujimoto //Nature. 1999. - Vol. 399. - P. 483-487.

382. Shut down of an acute T cell immune response to viral infection is mediated by the pro-apoptotic Bcl-2 homology 3-only protein Bim / M. Pellegrini, G. Belz, P. Bouillet et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - P. 14175-14180.

383. Smac, a Mitochondrial Protein that promotes Cytochrome c-Dependent Caspase Activation by Eliminating IAP Inhibition / C. Du, M. Fang, Y. Li et al. // Cell. 2000. - Vol. 102. - P.33-42.

384. Soance, L. Mitochondrial mechanisms of oxidative stress and apoptosis / L. Soance, N. Solenski, G. Fiskum Handbook of neurochemistry, 2006.-p.20.

385. Solution structure of the anti-apoptotic protein Bcl-2 / A. M. Petros, A. Medelc, D. G. Nettesheim et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98.-P. 3012-3017.

386. Squamous cell carcinomas and increased apoptosis in skin with inhibited Rel/nuclear factor-kB signaling / M. van Hogerlinden, B. L. Rozell, L. Ahrlund-Richter // Cancer Res. 1999. - Vol. 59. - P. 3299-3303.

387. Stark, L. A. Nucleolar sequestration of RelA (p65) regulates NF-kB-driven transcription and apoptosis / L. A. Stark, M. G. Dunlop // Mol. Cell. Biol. -2005. Vol. 25. - P. 5985-6004.

388. Steinman, H. M. The Bcl-2 oncoprotein functions as a pro-oxidant. J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 3487-3490.

389. Strasser, A. Apoptosis signaling / A. Strasser, L. O'Connor, V. M. Dixit//Annu. Rev. Biochem. 2000. - Vol. 69. - P. 217-245.

390. Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO / G. Wu, J. Chai, T. L. Suber et al. // Nature. 2000. - Vol. 408. - P. 1008-1012.

391. Structure of Bcl-xL-Bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis / M. Sattler, H. Liang, D. Nettesheim et al. // Science. -1997. Vol. 275. - P. 983-986.

392. Sun, Y. Redox regulation of transcriptional activator/ Y. Sun, J.W. Oberley // Free Radic. Biol. Med. 1996. - Vol. 21. - P. 335-348.

393. Suppression by metallothionein of doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis through inhibition of p38 mitogen-activated protein kinases / Y. J. Kang, Z. X. Zhou, G. W. Wang et al. // J. Biol. Chem. 2000. -Vol. 275.-P. 13690-13698.

394. Susin, S. A. Mitochondria as regulators of apoptosis: doubt no more / S. A. Susin, N. Zamzami, G. Kroemer // Biochim. Biophys. Acta. 1998. — Vol. 1366.-P. 151-165.

395. Suzuki, M. Structure of Вах: coregulation of dimer formation and intracellular localization / M. Suzuki, R. J. Youle, N. Tjandra // Cell. 2000. -Vol. 103.-P. 645-654.

396. Teraishi, F. Identification of a Novel Synthetic Thiazolidin Compound Capable of Inducing c-Jun NH2-Terminal Kinase-Dependent Apoptosis in Human Colon Cancer Cells / F. Teraishi, S. Wu // Cancer Res. 2005. - Vol. 65, N 14. -P. 6380-6387.

397. Testicular degeneration in Bcl-w-deficient mice / A. J. Ross, K. G. Waymire, J. E. Moss et al. //Nat. Gen. 1998. - Vol. 18. - P. 251-256.

398. The ASK 1-MAP kinase cascades in mammalian stress response / J. Matskawa, A. Matsuzawa, K. Takeda, H. Ichijo // J. Biochem. 2004. - Vol. 136, N. 3.-P. 261-265.

399. The combined functions of pro-apoptotic Bcl-2 family members Bak and Bax are essential for normal development of multiple tissues / T. Lindsten, A. J. Ross, A. King et al. // Mol. Cell. 2000. - Vol. 6. - P. 1389-1399.

400. The model for p53-induced apoptosis / K. Polyak, Y. Xia, J.L. Zweier et al. // Nature. 1997. - Vol. 389. - P. 300-305.

401. The p53 MH algorithm and its application in detecting p53-responsive genes / J. Hoh, S. Jin, T. Parrado et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -Vol. 99.-P. 8467-8472.

402. The structure of a Bcl-xL/Bim fragment complex: Implications for Bim function / X. Liu, S. Dai, Y. Zhu et al. // Immunity. 2003 - Vol. 19. - P. 341-352.

403. The ubiquitin ligase COP1 is a critical negative regulator of p53 / D. Dornan, I. Wertz, H. Shimizu et al. // Nature. 2004. - Vol. 429. - P. 86-92.

404. Thornberry, N. A. Caspases: enemies within / N. A. Thornberry, Y. Lazebnik // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 1312-1316.

405. Tissue oxygen sensor function of NADPH oxidase isoforms, an unusual cytochrome aa3 and reactive oxygen species / T. Porwol, W. Ehleben, V. Brand, H. Acker // Respir. Physiol. 2001. - Vol. 128. - P. 331-348.

406. To be, or not to be: NF-kB is the answer role of Rel/NF-kB in the regulation of apoptosis / J. Kucharczak, M. J. Simmons, Y. J. Fan et al. // Oncogene. - 2003. - Vol. 22. - P. 8961-8982.

407. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. / P. G. Hogan, L. Chen, J. Nardone, A. Rao // Genes Dev. 2003. - Vol. 17. - P. 22052232.

408. Transcriptional regulation of lysophosphatidic acid-induced interleukin-8 expression and secretion by p38 МАРК and JNK in human bronchial epithelial cells / B. Saatian, Y. Zhao, D. Fie et al. // Biochem J. 2006. - Vol. 393. -P. 657-668.

409. Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type p53 / W. H. Hoffman, S. Biade, J. T. Zilfou et al. // Biol. Chem. 2002. -Vol. 277.-P. 3247-3257.

410. Transcription-independent pro-apoptotic functions of p53 / U. M. Moll, S. Wolff, D. Speidel, W. Deppert // Curr. Opin. Cell Biol. 2005. - Vol. 17. -P. 631-636.

411. Tsujimoto, Y. Role of Bcl-2 family proteins in apoptosis: apoptosomes or mitochondria? / Y. Tsujimoto // Genes to Cells 1998. - Vol. 3. -P. 697-707.

412. Tumor necrosis factor receptor 1-mediated signaling is required for skin cancer development induced by NF-kB inhibition / M. H. Lind, B. Rozell, R. P. Wallin et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2004. Vol. 101. - P. 4972-4977.

413. Tyrosine phosphorylation of IB-a activates NF-kB without proteolytic degradation of IkB-a / V. Imbert, R. A. Rupee, A. Livolsi, et.al. // Cell. 1996. -Vol. 86.-P. 787-798.

414. Up-regulation of monocytic IL-10 by tumor necrosis factor-alpha and cAMP elevating drugs / C. Platzer, C. Meisel, K. Vogt et al. // Int. Immunol. -1995.-Vol. 7.-P. 517-519.

415. VDAC2 inhibits ВАК activation and mitochondrial apoptosis / E. H. Cheng, Т. V. Sheiko, J. K. Fisher et al. // Science. 2003. - Vol. 301. - P. 513517.

416. Vlessis, A.A. New concepts in the pathophysiology of oxygen metabolism during sepsis / A. A. Vlessis, R. K. Goldman, D. D. Trunkey // Br. J. Surg. 1995. - Vol. 82, N 7. - P. 870-876.

417. Wang, S. TRAIL and apoptosis induction by TNF- family death receptors / S.Wang, W.S. El-Deiry // Oncogene. 2003. - Vol. 22. - P. 8628-8633.

418. Wenger, R.H. Mammalian oxygen sensing, signaling and gene regulation / R. H. Wenger // J. Exp. Biol. 2000. - Vol. 203, N 8. - P. 1253-1263.

419. Xia, L. p53 Activation in Chronic Radiation-Treated Breast Cancer Cells: Regulation of MDM2/pl4ARF / L. Xia, A. Paik, J. J. Li // Cancer Res. -2004.-Vol. 64.-P. 221-228.

420. Yamamoto, K. R. Bcl-2 is phosphorylated and inactivated by an ASKl/Jun N-terminal protein kinase pathway normally activated at G(2)/M. / K. R. Yamamoto, H. Ichijo, S.J. Korsmeyer // Mol. Cell Biol. 1999. - Vol. 19. - P. 8469-8478.

421. Yamamoto, K. R. Steroid receptor regulated transcription of specific genes and gene networks / K. R. Yamamoto // Annu. Rev. Genet. 1985. - Vol. 19.-P. 209-252.

422. Yeh, W.-C. FADD: essential for embryo development and signaling from some, but not all / W.-C. Yeh, J. L. Pompa, M. E. McCurrach // Science. -1998. Vol. 279,N 5358. -P. 1954-1958.

423. Zhou, J. Replication of damaged DNA in vitro is blocked by p53 / J. Zhou, C. Prives // Nucleic Acids Research. 2003. - Vol. 31. - P. 3881-3892.

424. Zhou, X. Up-regulation of IL-10 expression in dendritic cells is involved in Trichosanthin-induced immunosuppression / X. Zhou, N. Yang, L. Lu // Immunol. Lett. 2007. - Vol. 110, N 1. - P. 74-81.

425. Zhu, H. Signal transduction. How do cells sense oxygen? / H. Zhu, H. F. Bunn // Science. 2001. - Vol. 292. - P. 449-451.